Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

السابقين فيفو الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/63077
Automatic Translation
1, 1
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

Summary

نقدم هنا بروتوكولا يصف النقل الفيروسي لمناطق الدماغ المنفصلة ذات التركيبات البصرية الجينية للسماح بالتوصيف الكهروفسيولوجي الخاص بالمشابك العصبية في شرائح دماغ القوارض الحادة.

Abstract

تعد دراسة الخصائص الفسيولوجية لنقاط الاشتباك العصبي المحددة في الدماغ ، وكيفية خضوعها للتغيرات البلاستيكية ، تحديا رئيسيا في علم الأعصاب الحديث. تستخدم التقنيات الكهروفسيولوجية التقليدية في المختبر التحفيز الكهربائي لإثارة النقل المشبكي. العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو طبيعتها غير المحددة. سيتم تنشيط جميع المحاور العصبية في منطقة القطب المحفز ، مما يجعل من الصعب عزو تأثير إلى اتصال معين قريب. يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استبدال التحفيز الكهربائي بالتحفيز القائم على البصريات الوراثية. نحن نصف طريقة للجمع بين علم البصريات الوراثي وتسجيلات المشبك في المختبر . هذه أداة قوية لدراسة كل من الانتقال المشبكي القاعدي واللدونة المشبكية للروابط المشبكية المحددة تشريحيا بدقة وتنطبق على أي مسار تقريبا في الدماغ. هنا ، نصف إعداد ومعالجة بروتين ناقل فيروسي يشفر قناة رودوبسين للحقن الجراحي في منطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية (قشرة الفص الجبهي الإنسية) في دماغ القوارض وصنع شرائح حادة من المناطق المستهدفة في المصب (القشرة الأنفية الجانبية). كما يتم تقديم إجراء مفصل للجمع بين تسجيلات المشبك التصحيحي والتنشيط المشبكي عن طريق التحفيز الضوئي لدراسة اللدونة المشبكية على المدى القصير والطويل. نناقش أمثلة على التجارب التي تحقق خصوصية المسار والخلية من خلال الجمع بين علم البصريات الوراثي ووضع العلامات على الخلايا المعتمدة على Cre. وأخيرا ، يتم وصف التأكيد النسيجي للمنطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية جنبا إلى جنب مع وضع العلامات البيوسيتين للخلية ما بعد المشبكية ، للسماح بمزيد من التحديد للموقع الدقيق ونوع الخلية.

Introduction

إن فهم فسيولوجيا نقاط الاشتباك العصبي وكيفية خضوعها للتغيرات البلاستيكية أمر أساسي لفهم كيفية عمل شبكات الدماغ في الدماغ السليم1 ، وكيف تتعطل في اضطرابات الدماغ. يسمح استخدام شرائح الدماغ الحادة خارج الجسم الحي بتسجيل النشاط الكهربائي للمشابك العصبية من الخلايا العصبية المفردة ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية باستخدام تسجيلات مشبك رقعة الخلية الكاملة. يسمح التحكم في إمكانات الغشاء والتلاعب الدوائي المباشر بعزل الأنواع الفرعية للمستقبلات. يمكن إجراء هذه التسجيلات بخصوصية رائعة لتحديد الخلايا العصبية ما بعد المشبكي ، بما في ذلك الموضع الرقائقي ودون الإقليمي2 ، والمورفولوجيا الخلوية3 ، ووجود علامات جزيئية4 ، وإسقاطاتهاالقريبة 5 ، أو حتى إذا كانت نشطة مؤخرا6.

ومع ذلك ، فإن تحقيق خصوصية المدخلات قبل المشبكي هو أكثر تحديا إلى حد ما. استخدمت الطريقة التقليدية أقطاب التحفيز لإثارة المحاور العصبية التي تعمل في صفيحة معينة. مثال على ذلك هو في الحصين حيث يقوم التحفيز المحلي في الطبقة الراديوية بتنشيط نقاط الاشتباك العصبي التي تنتقل من CA3 إلى الحقل الفرعي CA17. في هذه الحالة ، يتم تحقيق خصوصية ما قبل المشبكي حيث يمثل إدخال CA3 الإدخال المثير الوحيد الموجود داخل الطبقة المشعة التي تعرض على الخلايا الهرمية CA18. ومع ذلك ، فإن هذه الدرجة العالية من خصوصية المدخلات التي يمكن تحقيقها من خلال التنشيط الكهربائي التقليدي قبل المشبكي لمحاور CA3-CA1 هي استثناء ينعكس في الدراسة المكثفة التي خضع لها هذا المشبك. في مناطق الدماغ الأخرى ، تتعايش المحاور العصبية من مسارات متعددة في نفس الصفيحة ، على سبيل المثال ، في الطبقة 1 من القشرة المخية الجديدة9 ، مما يجعل التحفيز قبل المشبكي الخاص بالمدخلات مستحيلا مع أقطاب التحفيز التقليدية. هذا أمر إشكالي لأن المدخلات المشبكية المختلفة قد يكون لها خصائص فسيولوجية متباينة. لذلك ، قد يؤدي التحفيز المشترك إلى سوء توصيف علم وظائف الأعضاء المتشابك.

سمح ظهور علم البصريات الوراثي ، وهو الترميز الجيني لبروتينات الغشاء الحساسة للضوء (opsins) مثل channelrhodopsin-2 (ChR2) ، بتوسيع واسع في إمكانيات دراسة الإسقاطات المشبكية المعزولة بين مناطق الدماغ10,11. هنا نصف حلا قابلا للتعميم ومنخفض التكلفة لدراسة فسيولوجيا المشبكية طويلة المدى واللدونة. يتم تسليم التركيبات البصرية الجينية بطريقة محددة للغاية باستخدام ناقلات فيروسية تسمح بالتحكم الدقيق للغاية في المنطقة ما قبل المشبكي ذات الاهتمام. سوف تعبر الإسقاطات الساطعة عن القناة المنشطة بالضوء مما يسمح بتنشيط هذه الألياف في المنطقة المستهدفة. وبالتالي ، يمكن دراسة المسارات طويلة المدى والمنتشرة تشريحيا والتي لا يمكن تنشيطها بشكل مستقل عن طريق التحفيز الكهربائي التقليدي غير المحدد.

نحن نصف ، على سبيل المثال المسار ، نقل قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) مع الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAVs) التي تشفر opsins قناة الكاتيون المثيرة. ثم نصف إعداد شرائح حادة من القشرة الداخلية الجانبية (LEC) ، وتسجيلات المشبك الرقعة من الخلايا العصبية الهرمية LEC من الطبقة 5 ، والتنشيط الخفيف لإسقاطات mPFC-LEC الغلوتاماتية (الشكل 1). كما نصف التقييم النسيجي لموقع الحقن لتأكيد موقع المنطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية وتحديد مورفولوجيا الخلايا ما بعد المشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة (1986) والمبادئ التوجيهية المرتبطة به فضلا عن المبادئ التوجيهية المؤسسية المحلية.

1. الحقن الفيروسي المجسمة

ملاحظة: يتطلب البروتوكول الحالي خصوصية تشريحية، ولكن ليس نوع الخلية ما بعد المشبكي.

  1. اختر الحيوان المناسب. تم استخدام ذكور الفئران المقنعة من النوع البري Lister في هذا البروتوكول (300-350 جم ، حوالي 3 أشهر من العمر).
  2. اختر البنية الفيروسية المناسبة. هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها (انظر المناقشة). يستخدم البروتوكول الحالي فيروسا للتعبير عن القناة البصرية الجينية ChETATC 12 ، لنقل الخلايا العصبية المثيرة (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (E123T / T159C) - mCherry ؛ العيار: 3.3 × 10 13 الجينوم الفيروسي / مل).
  3. حدد إحداثيات وحجم الحقن باستخدام أطلس الدماغ كما هو موضح سابقا35.
  4. الحقن المجسمة للتحضير الفيروسي
    ملاحظة: ينبغي اتباع جميع المبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية ذات الصلة لاستخدام الحيوانات ورعايتها. يتم حقن النواقل الفيروسية بشكل نمطي كما هو موضح سابقا13 مع التعديلات التالية.
    1. الحفاظ على التحضير الفيروسي على الجليد أثناء التخدير وإعداد الحيوان.
    2. الحث على التخدير في غرفة تحريض مخدرة مع 4٪ isoflurane. راقب مستوى التخدير المشار إليه من خلال تباطؤ معدل التنفس المنتظم (1 هرتز) وغياب ردود الفعل على الدواسة والقرنية (اختبار عن طريق قرص أصابع القدم ولمس زاوية العين برفق ، على التوالي ؛ يجب عدم اكتشاف أي استجابة).
    3. إدارة مسكن ما قبل الجراحة مثل ميلوكسيكام قبل 30 دقيقة على الأقل من الإجراء الغازي.
    4. عندما يتم تخدير الحيوان بالكامل ، استخدم المقصات لإزالة الفراء من فروة الرأس. قم بتبديل تدفق الأيزوفلوران إلى مخروط الأنف للإطار المجسمة وقم بتركيب الفئران في الإطار. ضع جل العين المزلق على العينين لمنع الجفاف أثناء العملية.
    5. يجب إجراء الجراحة في ظروف معقمة. استخدم قفازات وأدوات معقمة طوال العملية. ضع مرهم ليدوكائين (5٪ ث / ث) قبل تطهير فروة الرأس بمحلول الكلورهيكسيدين بنسبة 4٪ ث / ف ، ثم قم بتغطية الجسم بستارة معقمة. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق طولي يبلغ طوله حوالي 15 مم على فروة الرأس لفضح البريما.
    6. قم بتحميل حقنة هاميلتون في مضخة حقنة حقن مجهرية متصلة بذراع متحركة مثبتة على الإطار المجسم.
    7. ضع أليكوت 5 ميكرولتر من الفيروس في أنبوب 0.2 مل وقم بالدوران لبضع ثوان حتى يصبح كل الحجم في قاع الأنبوب. ماصة 2 ميكرولتر من التحضير الفيروسي في غطاء الأنبوب.
    8. املأ المحقنة بالتحضير الفيروسي عن طريق عرض طرف الإبرة أولا باستخدام مجهر جراحي ، ثم ضع بلعة الفيروس يدويا عند طرف الإبرة واسحب مكبس المحقنة باستخدام عناصر التحكم في المضخة.
    9. اضبط حجم حقن المضخة على 300 نانولتر ومعدل التدفق على 100 نانولتر / دقيقة. قم بتشغيل المضخة وتأكيد التدفق السليم من خلال مراقبة قطرة الفيروس عند طرف الإبرة. امتصاص الفيروس على برعم القطن وتنظيف الإبرة بلطف مع 70 ٪ من الإيثانول.
    10. باستخدام مسامير الضبط على الإطار المجسم، انتقل بطرف الإبرة إلى bregma (النقطة الموجودة على الجمجمة حيث تلتقي الغرز الإكليلية والسهمية) ولاحظ القياسات المجسمة التي لوحظت على المقاييس الثلاثة على الإطار. الإحداثيات المتعلقة ب bregma من الفئران mPFC هي الأمامية والخلفية + 3.1 ملم ، ± المتوسطة 0.7 ملم ، الظهرية البطنية - 4.5 ملم ؛ إضافة / طرح (كما هو موضح) هذه المسافات من إحداثيات bregma ، ثم انتقل الإبرة إلى الإحداثيات الأمامية والخلفية والمتوسطة-الجانبية وخفض الإبرة بلطف على سطح الجمجمة.
      ملاحظة: إحداثيات mPFC الواردة أعلاه مناسبة للفئران المقنعة من الذكور من 300 إلى 350 جم؛ التغييرات في سلالة الفئران ، قد يتطلب الحجم تعديلات على هذه الإحداثيات (انظر المناقشة).
    11. ارفع الإبرة عن سطح الجمجمة وحدد هذه النقطة بقلم تحديد دائم ذو طرف رفيع. قم بعمل ثقب نتوء في هذه المرحلة باستخدام مثقاب صغير مثبت على الذراع المجسم.
    12. أدخل الإبرة في الدماغ عند الإحداثيات الظهرية البطنية المحددة مسبقا وقم ببث حجم محدد مسبقا (ل mPFC: 300 nL). اترك الإبرة في الموقع لمدة 10 دقائق للسماح بانتشار البلعة. عند إزالة الإبرة، قم بتشغيل المضخة لضمان عدم انسداد الإبرة.
      ملاحظة: أدخل الإبرة وأزلها ببطء (~ 3 مم / دقيقة) لتقليل الضرر الذي يلحق بأنسجة المخ والتدفق العكسي للفيروس إلى قناة الإبرة.
    13. إدارة 2.5 مل من كلوريد الصوديوم الدافئ (0.9٪ ث / ف) والجلوكوز (5٪ ث / ف) محلول تحت الجلد للحفاظ على الترطيب.
    14. كرر الخطوة 1.4.12. لنصف الكرة الثاني.
    15. قم بخياطة شق فروة الرأس وعند الانتهاء من الإجراء ، قم بإدارة 2.5 مل من كلوريد الصوديوم ومحلول الجلوكوز ومسكن مناسب ومعتمد مؤسسيا لإدارة الألم ، على سبيل المثال ، البوبرينورفين أو الميلوكسيكام. لا تترك الحيوان دون مراقبة أثناء فقدان الوعي. ضع الفئران في صندوق استرداد ساخن حتى يستعيد وعيه بالكامل. العودة فقط إلى قفص المنزل مع الحيوانات الأخرى بمجرد استردادها بالكامل.
    16. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للرعاية بعد العملية الجراحية وإجراءات الإسكان للقوارض المنقولة الفيروسية. انتظر لمدة 2 أسابيع على الأقل حتى يعبر الجين الترانسجين opsin بشكل كاف قبل بدء التجربة.
      ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم للنقل على مسافة وقوة الاتصال بين المناطق قبل وبعد المشبكي. بالنسبة ل mPFC إلى LEC ، يلزم 4-6 أسابيع.

2. إعداد شرائح الدماغ الحادة

ملاحظة: هنا نصف طريقة بسيطة لإعداد شرائح الدماغ التي في أيدينا كافية لتحقيق شرائح القشرية عالية الجودة والحصين والمهاد من الفئران والجرذان البالغة.

  1. إعداد الحلول للتشريح.
    1. املأ دورقا سعة 250 مل بحوالي 200 مل من محلول قطع السكروز المثلج البارد (189 ملم سكروز ، 26 ملليمتر ناهكو 3 ، 10 ملليمتر د-جلوكوز ، 5 ملليمتر MgSO 4 ،3 مللي متر KCl ، 1.25 مللي متر NaH 2 PO4 ، و 0.2 ملم كاكل 2 مصنوع في ماء فائق النقاء (UPW) مع مقاومة 18.2 MΩ سم عند 25 درجة مئوية) أو حجم كاف لملء غرفة الأنسجة الاهتزازية. فقاعة مع carbogen (95٪ O 2 ، 5٪ CO2) والحفاظ على الجليد.
    2. املأ غرفة جمع الشرائح بالسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (aCSF ؛ 124 mM NaCl ، 26 mM NaHCO 3 ، 10 mM D-glucose ،3 mM KCl ، 2 mM CaCl 2 ، 1.25 mM NaH2 PO 4 ، و1 mM MgSO4 المصنوع في UPW) في درجة حرارة الغرفة ، فقاعة مع الكربوجين. غرفة جمع الشرائح14 مصنوعة خصيصا من رف أنبوب الطرد المركزي الدقيق الملصقة على ورقة من شبكة النايلون ووضعها في كوب حيث يتم غمرها في aCSF (الشكل 2A).
    3. املأ أنبوبا سعة 50 مل ب 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في المخزن المؤقت للفوسفات (PB ؛ 75.4 mM Na 2 HPO 4.7H 2 O و24.6 mM NaH2PO4. H2O).
      تحذير: PFA سامة. استخدم في غطاء الدخان.
  2. تشريح الدماغ.
    1. تخدير الفئران في غرفة الحث باستخدام 5٪ من الأيزوفلوران حتى يكون التنفس بطيئا ومنتظما (~ 1 هرتز). لضمان مستوى كاف من اختبار التخدير لعدم وجود ردود فعل دواسة والقرنية.
    2. قطع رأس الحيوان باستخدام المقصلة.
    3. تشريح الدماغ بأكمله بسرعة كما هو موضح سابقا15 ونقله إلى محلول قطع السكروز. أكمل الخطوة في غضون 90 ثانية من قطع الرأس للحصول على جودة شريحة جيدة وتسجيل ناجح للخلية بأكملها.
    4. باستخدام ملعقة صغيرة معدنية ، التقط الدماغ ، وتخلص من محلول القطع الزائد ، وضعه على قطعة من ورق الترشيح على سطح الطاولة.
    5. باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة ، قم بإزالة المخيخ بسرعة وقطع الدماغ في المستوى الإكليلي في منتصف طوله تقريبا ؛ النصف الخلفي هو كتلة الأنسجة TEC. تأكد من تضمين بعض الأنسجة الزائدة بالإضافة إلى المنطقة المراد تقطيعها إلى شرائح للخطوات التالية. أعد كل من كتلة الأنسجة هذه وبقية الدماغ إلى محلول قطع السكروز.
    6. ضع قطرة من غراء سيانواكريليت على مرحلة الأنسجة الاهتزازية. انشره في طبقة رقيقة مع مساحة أكبر قليلا من كتلة الأنسجة التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة.
    7. التقط كتلة أنسجة LEC باستخدام ملعقة صغيرة ، وتخلص من المحلول الزائد ، وانقلها إلى رقعة الغراء بحيث يلتصق القطع الإكليلي الأمامي.
    8. تثبيت المرحلة في غرفة الأنسجة الاهتزازية وصب بسرعة كمية كافية من محلول قطع السكروز لغمر الأنسجة ؛ فقاعة هذا الحل مع الكربوجين. قم بتوجيه كتلة أنسجة LEC مع السطح البطني نحو الشفرة. في حين أن إضاءة الغرفة المحيطة غير كافية لتنشيط الأوبسين، تجنب استخدام مصادر إضاءة إضافية قد تكون موجودة على الاهتزاز.
    9. اقطع شرائح بسماكة 350 ميكرومتر من البطني إلى الظهري باستخدام سرعة تذبذب شفرة عالية (100 هرتز) وسرعة تقدم شفرة بطيئة (0.06 مم / ثانية). عادة ، يمكن الحصول على سبع شرائح LEC لكل نصف الكرة الأرضية.
    10. انقل الشرائح إلى غرفة جمع الشرائح. عند الانتهاء من جمع الشرائح ، انقل غرفة التجميع إلى حمام مائي 34 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل العودة إلى درجة حرارة الغرفة. فقاعة مع كاربوجين باستمرار. ستكون الشرائح صحية بما يكفي للتسجيل لمدة 6 ساعات على الأقل.
    11. ضع ما تبقى من الدماغ في PFA لمدة 48 ساعة للفحص اللاحق لموقع الحقن (انظر القسم 4).

3. الفيزيولوجيا الكهربية والتحفيز البصري الوراثي

  1. تحديد الخلية المستهدفة.
    1. ضع الشريحة في غرفة تسجيل مغمورة عند 34 درجة مئوية مزودة ب aCSF بمعدل 2 مل / دقيقة بواسطة مضخة تمعجية. شل حركة الشريحة باستخدام مرساة شريحة.
    2. تحت هدف التكبير المنخفض (4x) لمجهر واسع المجال باستخدام إضاءة الأشعة تحت الحمراء المائلة ، انتقل إلى طبقة LEC 5. قم بقياس المسافة من سطح الحفرة إلى الطبقة المطلوبة.
      ملاحظة: تم تحقيق إضاءة الأشعة تحت الحمراء المائلة عن طريق وضع مؤشر LED قريب من الأشعة تحت الحمراء على بعد حوالي 3 مم أسفل غطاء غرفة التسجيل بزاوية ~ 55 درجة إلى مستوى الغطاء (الشكل 2B). تباين التداخل التفاضلي هو تقنية تصوير بديلة وشائعة الاستخدام للفيزيولوجيا الكهربية الشريحة.
    3. قم بالتغيير إلى هدف غمر الماء عالي التكبير (40x) وتحديد الخلايا العصبية الهرمية. حدد موضع الخلية على شاشة الكمبيوتر بشريط.
      ملاحظة: الخلايا العصبية الهرمية لها مورفولوجيا مثلثية الشكل تقريبا مع تشعبات قمية بارزة تسقط نحو السطح الدائري للشريحة (الشكل 3A). يمكن تقييم صحة الخلية من خلال عدم وجود نواة مكثفة ومرئية وفحص غشاء البلازما الذي يجب أن يبدو سلسا. من غير المحتمل أن يكون وضع العلامات الفلورية الواضحة للمحاور العصبية بواسطة بروتين اندماج opsin-fluorophore مرئيا عند استخدام مجهر فلوري واسع المجال. لتصور الإسقاطات المحورية، قم بإجراء كيمياء نسيجية مناعية بعد التخصيص باستخدام جسم مضاد أولي ضد فلوروفور الأوبسين وتضخيمه باستخدام جسم مضاد ثانوي مقترن بفلوروفور من نفس الطول الموجي أو ما شابهه.
  2. تشكيل مشبك رقعة الخلية الكاملة.
    1. قم بتصنيع ماصة زجاجية من البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة واملأها بمحلول تسجيل داخل الخلايا مصفى (120 mM k-gluconate ، 40 mM HEPES ، 10 mM KCl ، 2 mM NaCl ، 2 mM MgATP ، 1 mM MgCl ، 0.3 mM NaGTP ، 0.2 mM EGTA ، و 0.25٪ biocytin المصنوع في UPW ، الرقم الهيدروجيني 7.25 ، 285-300 mOsm). ضع الماصة الدقيقة المملوءة في حامل القطب الكهربائي على منصة مضخم الصوت المشبك لضمان اتصال سلك القطب الكهربائي بالمحلول داخل الخلايا.
    2. قم بتطبيق ضغط إيجابي عن طريق الفم عن طريق النفخ بقوة في لسان حال (مثل حقنة 1 مل مع إزالة المكبس) متصلة عن طريق الأنابيب إلى المنفذ الجانبي لحامل القطب الكهربائي والحفاظ على الضغط عن طريق إغلاق صمام ثلاثي الاتجاهات في الخط. رفع هدف المجهر بحيث يتشكل الغضروف المفصلي وأدخل القطب الكهربائي في الغضروف المفصلي حتى يمكن رؤيته على المجهر.
    3. افتح نافذة اختبار الختم في WinLTP16 (أو برامج الاستحواذ / الذبذبات الأخرى) ومع مكبر الصوت في وضع مشبك الجهد ، قم بتطبيق نبضة مربعة 5 mV لتحديد ما إذا كانت مقاومة الماصة هي 3-6 MΩ.
    4. اقترب ولمس الخلية المحددة بطرف الماصة ؛ يجب أن يؤدي ذلك إلى مسافة بادئة في غشاء الخلية (الشكل 3A ؛ اللوحة اليمنى) وزيادة صغيرة في مقاومة الماصة (0.1 MΩ).
    5. تحرير الضغط الإيجابي وتطبيق الضغط السلبي عن طريق تطبيق شفط معتدل في لسان الحال. هذا يجب أن يؤدي إلى زيادة كبيرة في مقاومة ماصة (>1000 MΩ). يمكن الآن ترك الضغط محايدا. ضع ضغطا سلبيا في منحدر متزايد تدريجيا حتى يتمزق غشاء الخلية مما يؤدي إلى عبور سعة الخلية بالكامل.
  3. سجل الأحداث المتشابكة التي تم استثارتها بصريا.
    1. أدخل تكوين المشبك الحالي.
      ملاحظة: في معظم الحالات يكون الانتقال المشبكي بعيد المدى هو الغلوتاماترجيك، وبالتالي فإن التسجيل عند إمكانات غشائية قريبة من إمكانات انعكاس الكلوريد سيؤدي إلى عزل الانتقال بوساطة مستقبلات AMPA (AMPAR) بشكل أفضل وتقليل قياس أي تثبيط للتغذية الأمامية (FFI) يتم استثارته. يعتمد انعكاس الكلوريد على تكوين محلول التسجيل داخل الخلايا و aCSF ويمكن حسابه باستخدام معادلة Goldman-Hodgkin-Katz ؛ بالنسبة للحلول المذكورة أعلاه ، كان هذا -61.3 mV. كان للخلايا العصبية الهرمية من الطبقة 5 LEC متوسط إمكانات غشاء الراحة -62 mV ، وعند الضرورة ، تم الحفاظ عليها عند هذه الإمكانات عن طريق حقن التيار الثابت. بدلا من ذلك ، يمكن تثبيت الخلايا بالجهد على الجهد المطلوب. لتسجيل الإسقاطات المثبطة طويلة المدى16 أو لتسجيل FFI ، مشبك الجهد عند إمكانات انعكاس الكاتيون لعزل توصيل كلوريد GABAergic. عندما تكون الخلايا العصبية المثبتة للجهد عند إمكانات غشائية أعلى من عتبة جهد العمل ، يتم استخدام محلول داخل الخلايا قائم على السيزيوم يحتوي على حاصرات قنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد لتحسين مشبك الجهد ومنع بدء إمكانات العمل (130 mM CsMeSO 4 ، 10 mM HEPES ، 8 mM NaCl ، 5 mM QX 314 chloride ،4 mM MgATP ، 0.5 mM EGTA ، 0.3 mM NaGTP ، 0.25٪ biocytin المصنوع في UPW ، الرقم الهيدروجيني 7.25 ، 285-300 mOsm).
    2. باستخدام برنامج الحصول على البيانات، أرسل إشارات منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) إلى برنامج تشغيل LED لتنشيط مصباح LED مثبت بقوة 470 نانومتر. يتم توجيه مؤشر LED المثبت إلى مسار ضوء المجهر باستخدام مكعبات المرشح والبصريات المناسبة (الشكل 2B) لتطبيق نبضات الضوء على الشريحة عبر هدف 40x لاستحضار إمكانات ما بعد التشابك البصري الوراثي (oEPSPs).
      ملاحظة: يمكن تطبيق نبضات الضوء حول الجسد / فوق التشعبات ، مما سيؤدي إلى تنشيط opsins في المحاور العصبية و bouton قبل المشبكي ، أو يمكن للمحقق نقل الهدف إلى محاور عصبية بعيدا عن الخلية المسجلة لتجنب التحفيز المفرط للبوتون (انظر المناقشة). تعتمد سعة oEPSP القصوى على قوة الإسقاط المشبكي ، وفعالية الحقن الفيروسية ، و opsin المستخدمة. يمكن معايرة oEPSPs إلى السعة المطلوبة عن طريق اختلاف شدة الضوء و / أو المدة18 ؛ تغيير مدة نبضات الضوء (المدة النموذجية بين 0.2-5 مللي ثانية عند الحد الأقصى لخرج طاقة LED ، مما يؤدي إلى كثافة ضوء 4.4 ميجاوات / مم19) يعطي سعات oEPSP أكثر اتساقا من تغيير خرج الطاقة من LED.
    3. التحقيق في خصائص الإطلاق قبل المشبكي (التغير في الجهد) عن طريق توصيل قطارات من نبضات ضوئية متعددة مع فترات مختلفة بين المحفزات (الشكل 3E) ؛ وينبغي توخي الحذر عند تفسير انتقال العدوى المستحثة بصريا (انظر المناقشة).
    4. التحقيق في اللدونة على المدى الطويل إما عن طريق استحضار oEPSPs19 بشكل متكرر أو تطبيق الأربطة. راقب سعة oEPSP لمدة 5-10 دقائق لضمان الاستقرار قبل تحريض اللدونة ، ثم راقب حتى يتم الوصول إلى سعة مستقرة (عادة 30-40 دقيقة).
      ملاحظة: معظم الأوبسينات الحالية غير قادرة على استحضار إمكانات عمل متعددة بشكل موثوق به عند ترددات عالية، على سبيل المثال، 100 محفز يتم تسليمه عند 100 هرتز، كما هو مستخدم عادة للحث على LTP.
    5. للتأكد من أن oEPSPs أحادية المشبكية ، قم بإجراء تنشيط فوق البوتون للمسار المحول عن طريق وضع الهدف فوق الشجرة المتغصنة والتحفيز في وجود 0.5 ميكرومتر من التترودوتوكسين و 100 ميكرومتر أمينوبيريدين. وسيؤدي تطبيق التيترودوتوكسين إلى إلغاء الإرسال إذا كانت الاستجابات تعتمد على إمكانات العمل، وسيؤدي الإدراج اللاحق للأمينوبيريدين إلى استعادة الانتقال جزئيا إذا تم توليد ال oEPSPs بشكل أحادي المشبك19,20.
    6. للسماح للبيوسيتين بملء الخلايا العصبية ، انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد الدخول في تكوين الخلية بأكملها. في مشبك الجهد ، راقب سعة الغشاء ومقاومة الإدخال.
    7. اسحب الماصة ببطء على طول زاوية الاقتراب بعيدا عن سوما الخلية ، مع ملاحظة الاختفاء البطيء لعابرات السعة وتيار الغشاء مما يشير إلى إعادة إغلاق غشاء الخلية وتشكيل رقعة خارجية عند طرف الماصة. لاحظ اتجاه الشريحة وموقع الخلية (الخلايا) داخل الشريحة. ضع الشريحة في PFA في صفيحة من 24 بئرا واحتضنها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، ثم انقلها إلى 0.1 M PB.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح لمدة تصل إلى أسبوع. إذا كانت هناك حاجة إلى تخزين أطول ، فقم بتغيير PB بانتظام أو استخدم PB الذي يحتوي على أزيد الصوديوم (0.02٪ -0.2٪ من أزيد الصوديوم).

4. علم الأنسجة

  1. موقع حقن التقطيع
    1. بعد التثبيت ، قم بحماية الأنسجة بالتبريد في 30٪ من السكروز (w / v) في PB حتى يغرق (سوف يطفو في البداية في محلول السكروز) ، عادة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو 24-48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    2. باستخدام وسط درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، قم بتوصيل كتلة من الأنسجة بقرص عينة cryostat. قم بتجميد كتلة الأنسجة باتباع الخطوات من 4.1.3 إلى 4.1.4.
    3. ضع الأيزوبنتان في حاوية مناسبة. قم بغمر قرص العينة فقط ، مما يضمن أن الأنسجة أعلى من مستوى الأيزوبنتان. اخفض حاوية الأيزوبنتان إلى نيتروجين سائل (أو ثلج جاف) واسمح للأنسجة بالتجمد.
    4. بمجرد تجميدها تماما (تصبح كتلة الأنسجة بأكملها شاحبة وصلبة) ، اترك كتلة الأنسجة في غرفة cryostat عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح لدرجة حرارة الكتلة بالتوازن.
    5. قطع 40 ميكرومتر أقسام سميكة في cryostat عند -20 درجة مئوية. استخدم فرشاة طلاء دقيقة لتوجيه الأقسام خارج الشفرة. التزم الأقسام المجمدة بدرجة حرارة الغرفة ، وشريحة المجهر الزجاجي المطلية بالبولي إل ليسين عن طريق لمس الشريحة إلى الأقسام.
    6. أضف حوالي 150 ميكرولتر من وسط التركيب إلى كل شريحة وقم بتغطيتها بغطاء ؛ قم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق الضغط برفق على الغطاء. قم بتغطية الشرائح للحماية من التبييض الضوئي وتجفيفها في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة على الأقل (أو طوال الليل). باستخدام المجهر الفلوري ، افحص موقع موقع الحقن الفيروسي.
  2. بروتوكول تلطيخ البيوسيتين
    ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أقسام سميكة. لا تحتاج الشرائح إلى إعادة تقسيمها.
    1. اغسل شرائح الدماغ بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ 137 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 10 mM Na 2 HPO 4 ، و 1.8mM KH2PO4) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة. استخدم ماصة نقل لإفراغ الآبار بعد كل خطوة.
    2. احتضن الشرائح في 3٪ H 2 O2(w / v) في PBS لمدة 30 دقيقة لمنع أي نشاط بيروكسيديز داخلي. هذا يولد فقاعات الأكسجين.
    3. اغسل شرائح الدماغ باستخدام PBS ست مرات لمدة 10 دقائق لكل غسل أو حتى لا تظهر فقاعات أكسجين أخرى. احتضان شرائح الدماغ في محلول مركب HRP ثنائي الأفيدين-البيوتينيل (ABC) بنسبة 1٪ (v/v) في PBS الذي يحتوي على 0.1٪ (v/v) Triton X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
    4. اغسل شرائح الدماغ باستخدام PBS ست مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
    5. احتضن كل شريحة في محلول 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) لعدة دقائق حتى يصبح تلطيخ البيوسيتين للهياكل العصبية مرئيا (يستغرق حوالي 5-10 دقائق).
      تحذير: DAB سامة. استخدم في غطاء الدخان.
      ملاحظة: يمكن أن تكون أوقات حضانة DAB غير متوقعة ، ومراقبة الأنسجة عن كثب مع تطور اللون.
    6. أوقف التفاعل عن طريق نقل الشرائح إلى PBS البارد (4 درجات مئوية). اغسل شرائح الدماغ باستخدام PBS ست مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة. استخدم فرشاة لتركيب شرائح الدماغ على شرائح المجهر الزجاجية المطلية بالبولي إل-ليسين.
    7. إزالة كل PBS الزائدة مع نسيج نظيف. قم بتغطية كل شريحة بحوالي 200 ميكرولتر من وسط التركيب ؛ قم بتغطيتها بأغطية واضغط برفق على الغطاء لدفع فقاعات الهواء للخارج. يجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة على الأقل (أو طوال الليل). باستخدام المجهر الضوئي ، افحص الموقع والتفاصيل المورفولوجية للخلية (الخلايا).
      ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك تصور البيوسيتين باستخدام الستربتافيدين المترافق مع الفلوروفور. ومع ذلك ، قد يتطلب التصوير استئصال أو استخدام المجهر البؤري21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية دراسة فسيولوجيا المشبكية طويلة المدى واللدونة باستخدام التسليم الفيروسي للبنى البصرية الوراثية. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة أي اتصال طويل المدى تقريبا في الدماغ. على سبيل المثال ، نصف حقن AAVs التي تشفر opsin في mPFC الفئران ، وإعداد شرائح حادة من LEC ، وتسجيلات المشبك الرقعة من الخلايا العصبية الهرمية LEC من الطبقة 5 ، والتنشيط الخفيف لمحطات mPFC في LEC (الشكل 1).

تم تحديد موقع خلية هرمية سليمة وترقيعها (على سبيل المثال ، الشكل 3A). في المثال الحالي mPFC إلى LEC ، لم يتم تصنيف الخلايا ما بعد المشبكي ؛ إذا كانت هناك حاجة إلى تحديد الخلية بعد المشبكي ، فيجب توطين خلية تعبر عن علامة الفلورسنت باستخدام بصريات واسعة المجال (على سبيل المثال ، الشكل 3B). يجب تقييم صحة الخلية بواسطة بصريات الأشعة تحت الحمراء قبل التجريب. لتنشيط محاور mPFC في LEC ، تم وضع LED مباشرة فوق سوما خلية الطبقة 5 والتشعبات القريبة عبر هدف المجهر (الشكل 1) ، وأدت نبضات الضوء المفردة التي تبلغ 2 مللي ثانية إلى oEPSPs بسيطة الشكل الموجي (الشكل 3C) ؛ يمكن قياس سعة الذروة ل oEPSP. لفحص اللدونة قصيرة الأجل للمشبك العصبي ، تم تطبيق قطارات 5 و 10 و 20 هرتز للتحفيز الضوئي (الشكل 3E). للتحقيق في اللدونة على المدى الطويل ، بعد مراقبة سعة oEPSP الأساسية لمدة 10 دقائق ، تمت إضافة ناهض الكوليني ، carbachol ، إلى aCSF المنتشر لمدة 10 دقائق. تسبب هذا في اكتئاب طويل الأجل كان لا يزال واضحا بعد 40 دقيقة من إزالة الرباط (الشكل 3D).

بعد تجارب التسجيل الكهروفسيولوجية، تم تقسيم أنسجة المخ التي تحتوي على موقع الحقن الفيروسي وتم فحص طول موقع الحقن (الشكل 4A). يتم توطين مراسل الفلورسنت ، mCherry ، إلى الطبقات العميقة من القشرة الأمامية وتحت الحليمية (المناطق المكونة للقوارض mPFC). تم استهداف هذه الطبقات حيث ثبت أن الإسقاط على LEC ينشأ في الغالب من الطبقات القشرية العميقة22. يمكن أيضا رؤية الألياف الإيجابية mCherry تنضم إلى مسار المادة البيضاء. في تجربة تجريبية لتحسين وضع الحقن الفيروسي ، تم أخذ وفحص أقسام 40 ميكرومتر من LEC ؛ يمكن رؤية الألياف الإيجابية mCherry في الطبقة 5 من LEC (الشكل 4B). وأخيرا ، كانت الخلية المملوءة بالبيوسيتين ملطخة ، مما سمح بتأكيد موقعها ومورفولوجيتها (الشكل 4C ، D).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تجريبية. (أ) مخطط حقن النواقل الفيروسية في قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC)، ونقل خلايا mPFC ذات البنية البصرية الوراثية، ونقل البناء إلى المحطات الطرفية في القشرة الأنفية الأنفية الجانبية (LEC). (ب) التمثيل التخطيطي لتسجيل الخلايا الكاملة من الخلايا العصبية الهرمية من الطبقة 5 في شريحة LEC حادة والتنشيط الضوئي لأطراف mPFC عبر هدف المجهر. الاختصارات: CA = القرنية الأمونية; PERI = القشرة المحيطة بالأنف. TR = المنطقة الانتقالية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: غرفة جمع الشرائح والتكوين البصري لتسجيلات الخلايا الكاملة المرئية ، والإثارة البصرية الجينية ، وتحديد الخلايا العصبية الإيجابية tdTomato. (A) غرفة جمع الشرائح 14 مصنوعة خصيصا من رف أنبوب الطرد المركزي الدقيق الملصقة على ورقة من شبكة النايلون ووضعها في كوب حيث يتم غمرها في aCSF (B ) يتم توجيه مصابيح LED لإثارة ChR2 (470 نانومتر) و tdTomato (565 نانومتر) من خلال عدسة مكثف غير كروية لتجميع الضوء ، ويتم بث ضوء 565 نانومتر من خلال مرشح تمرير النطاق لتحقيق الفصل الطيفي لإثارة tdTomato وأطياف الانبعاثات. يتم دمجها مع مرآة ثنائية اللون طويلة التمرير وموجهة نحو الشريحة مع مرآة ثنائية اللون ثانية طويلة التمرير ذات طول موجي أطول. ثم يتم تركيز الضوء على الشريحة عبر العدسة الموضوعية. في التجارب التي توجد فيها خلايا عصبية تحمل علامة tdTomato ، يمر الضوء الفلوري المنبعث عبر المرآة ثنائية اللون ومرشح الانبعاثات ويركز على مستشعر الكاميرا بواسطة عدسة لونية. يتم تصور الميزات غير الفلورية للشريحة بواسطة الضوء المنكسر المائل بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (NIR) المطبق من تحت غرفة الشريحة. يمرر هذا الضوء البصريات إلى الكاميرا مما يلغي الحاجة إلى تغيير مكعبات المرشح بين التصوير الفلوري وتصوير NAR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تصور الخلايا العصبية تحت التصوير NIR / الفلورسنت وأمثلة تمثيلية ل oEPSPs. (A) اليسار: مثال على الخلايا العصبية ذات المورفولوجيا الهرمية المرئية بضوء NIR. على اليمين: نفس الخلية العصبية مع تشكيل الدمل المقعر الناجم عن الضغط الإيجابي من ماصة التصحيح. (ب) التعبير المعتمد على Cre-recombinase من tdTomato في خلية عصبية واحدة. (ج) ممثل oEPSP من الطبقة 5 من LEC في الخلية الهرمية. (د) مثال على تجربة اللدونة الطويلة الأجل التي ترصد oEPSP بمرور الوقت بعد إضافة 10 ميكرومتر كارباتشول (CCh). يشير الخط المنقط إلى متوسط سعة oEPSP خلال فترة خط الأساس قبل إضافة الدواء. (ه) الآثار التمثيلية لقطارات التحفيز عند 5 و 10 و 20 هرتز. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحقق النسيجي من موقع الحقن واستعادة الخلية المملوءة بالبيوسيتين . (أ) التصوير المجهري الإكليلي الذي يظهر موقع الحقن الفيروسي في mPFC ، +3.00 مم من bregma. (ب) مقطع إكليلي رقيق من LEC يوضح ألياف mCherry +. (ج) صورة منخفضة الطاقة لشريحة حادة سميكة بسمك 350 ميكرومتر، -6.2 مم من البريجما، مع خلية هرمية مملوءة بالبيوسيتين في LEC. يظهر المربع المتقطع عند تكبير أعلى في الخلية الهرمية D. (D) LEC ؛ يمكن رؤية التشعبات القمية على يمين الصورة متجهة نحو الطبقة 1. تشير الخطوط المتقطعة إلى الحدود الإقليمية. الاختصارات: IL = القشرة تحت الطرفية; PL = القشرة المخية التمهيدية. wm = المادة البيضاء. أشرطة المقياس = 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة لاستكشاف إسقاطات متشابكة طويلة المدى محددة للغاية باستخدام مزيج من الجراحة المجسمة لتقديم AAVs التي تشفر التركيبات البصرية الجينية ، والفيزيولوجيا الكهربية في شرائح الدماغ الحادة (الشكل 1). توفر هذه التقنيات مجتمعة أدوات لتوصيف فسيولوجيا ومرونة دوائر الدماغ بدقة عالية في مسارات طويلة المدى ومنتشرة تشريحيا لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا باستخدام التحفيز الكهربائي التقليدي غير المحدد. يسمح الجمع بين العلامات الجزيئية الخاصة بالخلية بتوصيف الإسقاطات من منطقة دماغية واحدة إلى مجموعات خلايا محددة مختلفة في منطقة أخرى23.

للاستفادة الكاملة من الطبيعة الدقيقة للغاية لهذه التقنية ، من الضروري التحقق من خصوصية المسار. يتم ذلك في عدة خطوات. أثناء التسجيل ، تأكد من أن المشبك قيد التحقيق أحادي المتشابك (الخطوة 3.3.5). بعد ذلك ، فحص موقع الحقن من الناحية النسيجية للتأكد من أن الفيروس يقتصر على المنطقة المقصودة قبل المشبكي ذات الأهمية وتقييم موقع ومورفولوجيا الخلية الملطخة بالبيوسيتين بعد المشبكي للتأكد من أنها كما هو متوقع.

اختيار الفيروسات وتحقيق الخصوصية الخلوية
هذه التقنية قابلة للتكيف للغاية ومناسبة للاستخدام في كل من الفئران والجرذان. يمكن إجراء التجارب التي تتطلب خصوصية تشريحية باستخدام القوارض البرية. قد تتطلب التجارب التي تتطلب خصوصية نوع الخلية ما بعد المشبكي سلالة قوارض معدلة وراثيا إذا لم يكن من الممكن التعرف على الخلايا بناء على التشكل أو الموقع. على سبيل المثال ، لاستهداف البارفالبومين (PV) الذي يعبر عن الخلايا العصبية الداخلية ، يمكن استخدام خط الماوس المعدل وراثيا PV-Cre الذي يتم فيه التعبير عن Cre-recombinase في الخلايا العصبية المعبرة عن PV. لتصور هذه الخلايا ، يمكن عبور خط PV-Cre بخط ماوس مراسل للتعبير عن بروتين الفلورسنت بعد إعادة التركيب بوساطة Cre. بدلا من ذلك ، يمكن إدخال جين مراسل الفلورسنت المعتمد على Cre فيروسيا. تقتصر بروتينات الاندماج ChR2-fluorophore على غشاء الخلية وقد تظهر كمخطط تفصيلي للخلية العصبية عند النظر إليها باستخدام الفحص المجهري واسع المجال في الشرائح الحادة مما يجعل تحديد الخلايا لتسجيل الخلايا بأكملها أكثر تحديا من استخدام الفلوروفورات الخلوية. إذا تم استخدام ChR2 لتحديد الخلايا ، فيمكن تحقيق فصل ChR2 والفلوروفور باستخدام ناقلات bicistronic24. إذا كنت تستخدم مراسلا فلوريا لتحديد الخلايا العصبية المستهدفة لتسجيل الخلية بأكملها ، فيجب ألا يتداخل الطول الموجي للإثارة بشكل مثالي مع الطول الموجي للتنشيط للأوبسين ؛ سيؤدي ذلك إلى تجنب التنشيط المطول للكائنات الحية المحولة أثناء البحث عن الخلايا العصبية للتسجيل منها. وبالمثل، ينبغي أن يكون الصحفيون قبل وبعد التشابك العصبي منفصلين طويا. الصحفيون الشائعون هم mCherry وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) وبروتين الفلورسنت الأصفر المحسن (eYFP).

يحتوي البناء الفيروسي المستخدم على عدة مكونات مختلفة ، يمكن لكل منها التأثير على نجاح التجربة ، وبالتالي يجب إيلاء الاعتبار لكل عنصر. وينبغي إيلاء أهمية قصوى لاختيار أوبسين. بالنسبة للتنشيط قبل المشبكي ، يحتوي opsin المثالي على تيارات ضوئية كبيرة (لجلب المحاور العصبية بشكل موثوق إلى عتبة إمكانات العمل) ، والحركية السريعة داخل وخارج ، ومعدل بطيء لإزالة الحساسية للسماح بالتحفيز المتكرر عالي التردد. وكقاعدة عامة ، غالبا ما تأتي الحركيات السريعة على حساب التيارات الضوئية الأصغر25 ؛ ومع ذلك ، فقد زود الفحص الجزيئي والهندسة opsins مع التيارات الضوئية الكبيرة. يستخدم البروتوكول الحالي ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12 ، ولكن Chronos 26 و CheRiff 27 و oChIEFAC28 و ChRmine 29 مناسبة أيضا. بالإضافة إلى ذلك، توجد أوبسينات مثيرة ذات أطوال موجية للتنشيط ذات إزاحة حمراء (ChrimsonR)26 أو بنفسجية (CheRiff)، والتي قد تكون مطلوبة لتجنب التداخل مع أطياف الإثارة من الفلوروفورات المستخدمة لتحديد الخلايا (انظر أعلاه).

يمكن أن يؤثر النمط المصلي ل AAVs على قدرة المتجه على نقل مناطق الدماغ المختلفة وأنواع الخلايا وكذلك مدى النقل المحوري في كل من الاتجاهين الأمامي والرجعي30. الأنماط المصلية المستخدمة عادة لنقل الخلايا العصبية هي 1 و 2 و 5 و 8 و 9. قد يعطي البحث في الأدبيات مؤشرا على النمط المصلي الذي تم استخدامه بنجاح في أي منطقة معينة. على سبيل المثال ، تمت التوصية ب AAV9 لنقل الخلايا العصبية القشرية31.

يسمح المحرك الأولي بمواصفات نوع الخلية التي سيتم التعبير عنها opsin. تنقسم Promotors إلى عدة فئات. تؤدي المحركات العامة ، على سبيل المثال ، CAG أو EF1a ، إلى التعبير في معظم أنواع الخلايا. المحركات الأولية الخاصة بالخلايا العصبية ، على سبيل المثال ، المشبك العصبي ، تولد التعبير في جميع أنواع الخلايا العصبية. يستخدم CaMKIIa بشكل شائع لتقييد التعبير عن الخلايا العصبية المثيرة على الرغم من أنه ثبت أنه متسرب - وقد لوحظ بعض التعبير في الخلايا العصبية الداخلية32. يحد عنصر محسن mDlx من التعبير إلى الخلايا العصبية الداخلية GABAergic33. يمكن تحقيق خصوصية نوع الخلية قبل المشبكي باستخدام خط كري ماوس (كما هو موضح أعلاه للخلية ما بعد المشبكية). في هذه الحالة ، ستكون هناك حاجة إلى بنية وراثية تعتمد على Cre للحد من التعبير عن opsin إلى الخلايا المعبرة عن Cre.

Titre هو عدد الجسيمات الفيروسية في المستحضر الفيروسي. ومرة أخرى، قد يعطي البحث في الأدبيات مؤشرا على عيار أدى إلى توليد نقل كاف في منطقة معينة. عند استخدام نظام يعتمد على Cre ، قد يكون العيار مهما بشكل خاص لأن العيار الفيروسي العالي يمكن أن يحول التعبير في الخلايا غير المعبرة عن Cre34.

تحسين تسليم الفيروسات
ويكتسي التوصيل الدقيق للفيروسات إلى المنطقة ذات الأهمية الحاسمة لهذا النهج. يمكن تقدير إحداثيات الحقن للمنطقة ما قبل المشبكي من خلال الرجوع إلى الأدبيات و / أو أطلس الدماغ للأنواع المناسبة35,36. يجب أن يستغرق المجرب بعد ذلك بعض الوقت لتحسين وتحسين إحداثيات الحقن الدقيقة والحجم المستخدم لضمان أن الحقن الفيروسي يقتصر على المنطقة التي تهمه قبل المشبكي. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص عندما تقوم المناطق المجاورة أيضا بالعرض على موقع التسجيل. نوصي باستخدام كميات صغيرة من الفيروس كوسيلة فعالة للقيام بذلك. إذا كانت هناك حاجة إلى موقع حقن صغير بشكل خاص ، فقد يكون استخدام الماصات الدقيقة الزجاجية بدلا من المحقنة والإبرة مفيدا13. إن ترك إبرة الحقن في الموقع لفترة كافية والانسحاب البطيء لإبرة الحقن أمر بالغ الأهمية لمنع الفيروس من الهروب إلى قناة الإبرة. وللتأكد من دقة الحقن، من أفضل الممارسات التحقق من موقع الحقن النسيجي لكل يستخدم من خلال الفيزيولوجيا الكهربية حيثما أمكن ذلك، واستبعاد البيانات التي يكون فيها النقل الفيروسي خارج الهدف. في أيدينا ، أثبت البروتوكول الموصوف أعلاه أنه قابل للتعميم على العديد من الاتصالات المختلفة بعيدة المدى ، بما في ذلك التوقعات من نوى المهاد البطنية في خط الوسط ، والحصين ، والمهاد المتوسط ، و LEC إلى PFC ؛ التوقعات من PFC إلى LEC والمهاد mediodorsal ؛ إسقاطات من LEC ونوى المهاد البطنية في خط الوسط إلى الحصين (مختبر ظافر بشير ، جامعة بريستول ، ملاحظات غير منشورة19). لم يتطلب وضع العلامات البصرية الجينية لهذه المسارات المختلفة سوى تحسين إحداثيات الحقن وأحجامه.

قيود البروتوكول
يعد التشريح السريع للدماغ والتقطيع الدقيق أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذه التجارب. ينتج عن بروتوكول التقطيع الموصوف هنا شرائح حادة صحية دون التكيف مع مناطق الدماغ المختلفة. ومع ذلك، فقد أبلغ عن وجود تباين في درجة حرارة حضانة التقطيع المتوسطة وما بعد التقطيع الموصوفة في مكان آخر28 لتحسين صحة الشرائح بشكل أكبر. علاوة على ذلك ، تمكنا أيضا من أخذ شرائح حادة من منطقتين في الدماغ بعد النقل الفيروسي لمنطقة واحدة ، وبالتالي تقليل عدد الحيوانات المستخدمة. لقد وجدنا أنه في المسارات الكثيفة تشريحيا ، تكون الفترات القصيرة التي تصل إلى 7 أيام بين النقل الفيروسي والتسجيل كافية لاستحضار oEPSPs قوية ذات حجم مناسب لتسجيلات مشبك التصحيح للخلايا الكاملة. في الإسقاطات طويلة المدى أو الأكثر تناثرا ، تكون التأخيرات الأطول مفيدة.

وينبغي توخي الحذر عند تفسير نتائج النشاط المستحضر بصريا، ولا سيما فيما يتعلق باللدونة القصيرة الأجل. وقد أظهرت النتائج السابقة أن الإرسال المستحضر بصريا قد يخضع لاكتئاب متشابك أكثر وضوحا عند التحفيز المتكرر من التحفيز الكهربائي ، والذي قد ينشأ بسبب عدد من العوامل. أولا ، قد يؤدي إزالة حساسية opsin25 إلى انخفاض عدد المحاور العصبية قبل المشبكي ، مما يؤدي إلى انخفاض الاستجابات بعد المشبكي. وقد قطعت حركية القنوات المحسنة للأوبسينات المكتشفة حديثا وتلك التي خضعت للهندسة الجزيئية (انظر أعلاه) شوطا كبيرا في التخفيف من آثار إزالة الحساسية؛ ومع ذلك ، لا يزال التحفيز 100 هرتز بعيدا عن متناول العديد من opsins ، مما قد يعوق استخدام بعض بروتوكولات تحريض اللدونة طويلة الأجل (على الرغم من أن انظر37). ثانيا، قد تؤدي الحركية البطيئة للأوبسينات إلى توسيع إمكانات العمل18 مما يؤدي إلى إطلاق جهاز الإرسال لفترات طويلة واستنزاف الحويصلات؛ قد ينتج هذا أيضا عن نفاذية الكالسيوم للأوبسينات المثيرة11 ؛ يمكن تخفيف هذه المشكلات عن طريق تجنب التنشيط الضوئي المفرطللبوتون 38. ثالثا ، قد يؤدي نقل الخلايا العصبية باستخدام ناقلات AAV أيضا إلى تغيير خصائص الإطلاق قبل المشبكي في بعض نقاط الاشتباك العصبي. ومع ذلك ، يمكن تخفيف هذا باستخدام النمط المصلي AAV938. على الرغم من هذه القيود ، مع الاستخدام الدقيق ، يمكن للتنشيط البصري الوراثي أن يحاكي التحفيز الكهربائي19,38 ، وبالتالي فهو أداة لا تقدر بثمن في التحقيق في فسيولوجيا المسارات المشبكية غير المدروسة. نلاحظ أيضا أن البيانات الموضحة في الشكل 3E تقيم اللدونة قصيرة الأجل في المشبك الحالي ، وبالتالي فهي تخضع لتفاعل الإمكانات المشبكية وخصائص الغشاء الجوهري ، ويمكن تجنب ذلك عن طريق إجراء تجارب مكافئة في مشبك الجهد.

التوجهات المستقبلية
وقد أثار صندوق الأدوات البصري الوراثي المتوسع باستمرار إمكانية تطبيق هذه التكنولوجيا في مسارين متشابكين في نفس المستحضر، باستخدام زوج من الأوبسينات مع أطياف الإثارة المتباينة. أصبح هذا ممكنا باستخدام opsin ChrimsonR26 ، والذي ، على عكس ChR2 ، يتم تنشيطه ضوئيا بواسطة ضوء الطول الموجي الأحمر. يحتفظ ChrimsonR بحساسية منخفضة للضوء الأزرق ، وبالتالي لتجنب تنشيط المسار المتقاطع ، يمكن استخدامه مع opsins الأحمر غير الحساس ، والذي يتم إزاحته باللون البنفسجي (CheRiff 27) و / أو لديه حساسية أعلى للضوء الأزرق (Chronos26). هذا يسمح باستخدام محفزات الضوء الأزرق / البنفسجي التي هي أضعف من أن تنشط ChrimsonR بشكل كبير وبالتالي تسمح بتنشيط مسارين39,40 ، مما قد يزيد من الإنتاجية التجريبية ، ويسمح بفحص تفاعلات المسار المتقارب ، ويسمح بإطلاق المعدلات العصبية من المصادر الداخلية 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منحة Wellcome 206401 / Z / 17 / Z. نود أن نشكر ظفر بشير على إرشاده الخبير والدكتورة كلير بوث على المساعدة التقنية والتعليقات على المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL tube Fisher Scientific Ltd 12134102
10 µL pipette Gilson FD10001
24 well plate SARSTEDT 83.3922
3 way luer valve Cole-Parmer WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate Vector Laboratories SK-4105
40x objective Olympus LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine Hello Bio HB1073
4x objective Olympus PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry Addgene 35512 Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lens Edmund Optics 49363 Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge Benchmark Scientific C1005*
Biocytin Sigma-Aldrich B4261
Borosillicate glass capillary Warner Instruments G150F-6
Burr Fine science tools 19008-07
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Camera - Qimaging Retiga Electro Photometrics 01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol Tocris 2810
Chlorhexidine surgical scrub Vetasept XHG008
Clippers Andis 22445 AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens ThorLabs ACL2520-A
Coverslips Fisher Scientific Ltd 10011913
Cryostat Leica CM3050 S
CsMeSO4 Sigma-Aldrich C1426
Cyanoacrylate glue Rapid Electronics Ltd 84-4557
Data acquisition device National Instruments USB-6341 BNC
D-glucose Sigma-Aldrich G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass Edmund Optics 69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass Edmund Optics 69901
Dichroic mirror cube ThorLabs CM1-DCH/M
EGTA Millpore 324626
Electrode holder with side port HEKA 895150
Emission filter Chroma 59022m
Excitation filter Chroma ET570/20x
Eye gel Dechra Lubrithal
Fine paint brush Scientific Laboratory Supplies BRU2052
Guillotine World Precision Instruments DCAP
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich H1009 30% (w/w)
Isoflurane Henry Schein 988-3245
Isopentane Sigma-Aldrich M32631
KCl Sigma-Aldrich P3911
k-gluconate Sigma-Aldrich G4500
Kinematic fluorescence filter cube ThorLabs DFM1T1
LED driver ThorLabs LEDD1B
Lidocaine ointment Teva 80007150
MgATP Sigma-Aldrich A9187
MgCl Sigma-Aldrich M2670
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Micro drill Harvard Apparatus 75-1887
Microelectrode puller Sutter instruments P-87
Microinjection syringe Hamilton 7634-01/00
Microinjection syringe needle Hamilton 7803-05 Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pump World Precision Instruments UMP3T-1
Mounted blue LED ThorLabs M470L5
Mounted green LED ThorLabs M565L3
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich S9390
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
NaH2PO4.H2O Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
NIR LED OSRAM SFH4550 Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium VWR International RAYLLAMB/OCT Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch clamp amplifier Molecular Devices 700A
Peristaltic pump World Precision Instruments Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides Fisher Scientific Ltd 23-769-310
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Scalpel blade Swann Morton #24
Slice anchor Warner Instruments SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame Kopf Model 902
Stereotaxic holder for micro drill Harvard Apparatus 75-1874
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Surgical Microscope Carl Zeiss OPMI 1 FR pro
Suture Ethicon W577H
Syringe filter for intracellular recording solution Thermo Scientific Nalgene 171-0020
Tetrodotoxin citrate Hello Bio HB1035
Transfer pipettes Fisher Scientific Ltd 10458842
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Upright fluorescence microscope Leica DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit Vector Laboratories PK-4000
Vibratome Campden Instruments 7000smz-2
WinLTP https://www.winltp.com/ Version 2.32 Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
  3. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
  4. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  5. Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
  6. Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
  7. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  8. van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
  9. Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  12. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  13. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  14. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
  15. Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  16. Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
  17. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  18. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  19. Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
  20. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  21. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
  22. Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
  23. Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
  24. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  25. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
  26. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  27. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  29. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  30. Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
  32. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  33. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  34. Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
  35. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
  36. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
  37. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  38. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  39. Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
  40. Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
  41. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 180 ، الفيزيولوجيا الكهربية ، علم البصريات ، الانتقال المشبكي ، اللدونة المشبكية ، الجرذان ، الفئران ، الخلايا العصبية
<em>السابقين فيفو</em> الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex… More

Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex. J. Vis. Exp. (180), e63077, doi:10.3791/63077 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter