Summary
Her præsenterer vi en protokol, der beskriver viral transduktion af diskrete hjerneområder med optogenetiske konstruktioner for at muliggøre synapsespecifik elektrofysiologisk karakterisering i akutte gnaverhjerneskiver.
Abstract
At studere de fysiologiske egenskaber ved specifikke synapser i hjernen, og hvordan de gennemgår plastiske ændringer, er en central udfordring i moderne neurovidenskab. Traditionelle in vitro elektrofysiologiske teknikker bruger elektrisk stimulering til at fremkalde synaptisk transmission. En stor ulempe ved denne metode er dens uspecifikke karakter; Alle axoner i området af den stimulerende elektrode aktiveres, hvilket gør det vanskeligt at tildele en effekt til en bestemt afferent forbindelse. Dette problem kan løses ved at erstatte elektrisk stimulering med optogenetisk baseret stimulering. Vi beskriver en metode til at kombinere optogenetik med in vitro patch-clamp optagelser. Dette er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af både basal synaptisk transmission og synaptisk plasticitet af præcise anatomisk definerede synaptiske forbindelser og gælder for næsten enhver vej i hjernen. Her beskriver vi forberedelsen og håndteringen af et viralt vektorkodningskanalrhodopsinprotein til kirurgisk injektion i et præsynaptisk interesseområde (medial præfrontal cortex) i gnaverhjernen og fremstilling af akutte skiver af nedstrøms målregioner (lateral entorhinal cortex). En detaljeret procedure til kombination af patch-clamp-optagelser med synaptisk aktivering ved lysstimulering for at studere kort- og langsigtet synaptisk plasticitet præsenteres også. Vi diskuterer eksempler på eksperimenter, der opnår vej- og cellespecificitet ved at kombinere optogenetik og Cre-afhængig cellemærkning. Endelig beskrives histologisk bekræftelse af det præsynaptiske område af interesse sammen med biocytinmærkning af den postsynaptiske celle for at muliggøre yderligere identifikation af den nøjagtige placering og celletype.
Introduction
At forstå synapsernes fysiologi og hvordan de gennemgår plastiske ændringer er grundlæggende for at forstå, hvordan hjernenetværk fungerer i den sunde hjerne1, og hvordan de fungerer i hjernesygdomme. Brugen af akutte ex vivo hjerneskiver gør det muligt at registrere den elektriske aktivitet af synapser fra enkelte neuroner med et højt signal-støj-forhold ved hjælp af helcelle-patch-clamp-optagelser. Kontrol af membranpotentiale og ligetil farmakologisk manipulation tillader isolering af receptorundertyper. Disse optagelser kan foretages med udsøgt specificitet for at identificere det postsynaptiske neuron, herunder laminær og subregional position2, cellulær morfologi3, tilstedeværelse af molekylære markører4, dets afferente fremskrivninger5, eller endda hvis det for nylig var aktivt6.
At opnå specificitet af præsynaptiske input er dog noget mere udfordrende. Den konventionelle metode har brugt stimuleringselektroder til at ophidse axonerne, der løber i en bestemt lamina. Et eksempel på dette er i hippocampus, hvor lokal stimulering i stratum radiatum aktiverer synapser, der projicerer fra CA3 til CA1-underfeltet7. I dette tilfælde opnås præsynaptisk specificitet, da CA3-input repræsenterer det eneste excitatoriske input placeret inden for stratum radiatum, der projicerer til CA1 pyramideceller8. Denne høje grad af inputspecificitet, der kan opnås med konventionel elektrisk præsynaptisk aktivering af CA3-CA1-axoner, er imidlertid en undtagelse, der afspejles i den intense undersøgelse, som denne synapse har været udsat for. I andre hjerneområder eksisterer axoner fra flere afferente veje sammen i den samme lamina, for eksempel i lag 1 af neocortex9, hvilket gør inputspecifik præsynaptisk stimulering umulig med konventionelle stimulerende elektroder. Dette er problematisk, da forskellige synaptiske input kan have divergerende fysiologiske egenskaber; Derfor kan deres co-stimulering føre til fejlkarakterisering af synaptisk fysiologi.
Fremkomsten af optogenetik, den genetiske kodning af lysfølsomme membranproteiner (opsiner) såsom channelrhodopsin-2 (ChR2), har muliggjort en enorm udvidelse af mulighederne for at studere isolerede synaptiske fremskrivninger mellem hjerneområder10,11. Her beskriver vi en generaliserbar og billig løsning til at studere langtrækkende synaptisk fysiologi og plasticitet. De optogenetiske konstruktioner leveres på en meget specifik måde ved hjælp af virale vektorer, der giver mulighed for ekstremt præcis kontrol af det præsynaptiske område af interesse. Efferente fremskrivninger vil udtrykke den lysaktiverede kanal, der muliggør aktivering af disse fibre i en målregion. Således kan langtrækkende, anatomisk diffuse veje, der ikke kan aktiveres uafhængigt af traditionel, ikke-specifik, elektrisk stimulering, studeres.
Vi beskriver, som et eksempel vej, transduktion af mediale præfrontale cortex (mPFC) med adeno-associerede vira (AAV'er), der koder for excitatoriske kation-kanal opsiner. Vi beskriver derefter forberedelsen af akutte skiver fra lateral entorhinal cortex (LEC), patch-clamp-optagelser fra lag 5 LEC pyramidale neuroner og let fremkaldt aktivering af glutamatergiske mPFC-LEC-fremskrivninger (figur 1). Vi beskriver også den histologiske vurdering af injektionsstedet for at bekræfte placeringen af det præsynaptiske område af interesse og identifikation af postsynaptisk cellemorfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med United Kingdom Animals Scientific Procedures Act (1986) og tilhørende retningslinjer samt lokale institutionelle retningslinjer.
1. Stereotaxisk viral injektion
BEMÆRK: Den nuværende protokol kræver anatomisk, men ikke postsynaptisk celletype, specificitet.
- Vælg det passende dyr. Mandlige vildtype Lister hætteklædte rotter blev brugt i denne protokol (300-350 g, ca. 3 måneder gamle).
- Vælg den passende virale konstruktion. Der er flere faktorer at overveje (se Diskussion). Den nuværende protokol bruger en virus til at udtrykke den optogenetiske kanal ChETATC 12 til at transducere excitatoriske neuroner (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (E123T / T159C) - mCherry; titer: 3,3 x 10 13 virale genomer / ml).
- Fastlæg koordinaterne og injektionsvolumen ved hjælp af et hjerneatlas som tidligere beskrevet35.
- Stereotaxisk injektion af det virale præparat
BEMÆRK: Alle relevante nationale og institutionelle retningslinjer for brug og pasning af dyr bør følges. De virale vektorer injiceres stereotaxisk som tidligere beskrevet13 med følgende ændringer.- Hold det virale præparat på is under anæstesiering og forberedelse af dyret.
- Inducer anæstesi i et bedøvelsesinduktionskammer med 4% isofluran. Overvåg niveauet af anæstesi indikeret ved langsommere regelmæssig vejrtrækningshastighed (1 Hz) og fravær af pedal- og hornhindereflekser (test ved henholdsvis klemning af tæer og let berøring af øjenkrogen; der skal ikke opdages noget svar).
- Administrer præoperativ analgetikum såsom meloxicam mindst 30 minutter før den invasive procedure.
- Når dyret er fuldt bedøvet, skal du bruge klippere til at fjerne pels fra hovedbunden. Skift isofluranstrømmen til næsekeglen på den stereotaxiske ramme, og monter rotten i rammen. Påfør smørende øjengel på øjnene for at forhindre tørhed under proceduren.
- Operationen skal udføres under aseptiske forhold. Brug sterile handsker og instrumenter under hele proceduren. Påfør lidokainsalve (5% w / w), før du desinficerer hovedbunden med 4% w / v chlorhexidinopløsning, og dæk derefter kroppen med en steril drapering. Brug en skalpel til at lave et langsgående snit på ca. 15 mm i længden i hovedbunden for at udsætte bregma.
- Læg en Hamilton-sprøjte i en mikroinjektionssprøjtepumpe, der er fastgjort til en bevægelig arm monteret på den stereotaktiske ramme.
- Anbring en 5 μL aliquot af virussen i et 0,2 ml rør og drej i et par sekunder, indtil alt volumen er i bunden af røret. Pipette 2 μL af det virale præparat i rørets låg.
- Fyld sprøjten med det virale præparat ved først at se nålespidsen med et kirurgisk mikroskop, og placer derefter virusets bolus manuelt på spidsen af nålen, og træk sprøjtestemplet ud ved hjælp af pumpekontrollerne.
- Indstil pumpens indsprøjtningsvolumen til 300 nL og strømningshastigheden til 100 nL/min. Kør pumpen og bekræft korrekt strømning ved at observere virusets dråbe ved nålespidsen. Absorber virussen på en bomuldsknop og rengør nålen forsigtigt med 70% ethanol.
- Brug justeringsskruerne på den stereotaxiske ramme til at navigere nålespidsen til bregma (det punkt på kraniet, hvor koronale og sagittale suturer mødes) og notere de stereotaxiske målinger, der observeres på de tre vernierskalaer på rammen. Koordinaterne i forhold til bregma af rotte mPFC er anterior-posterior + 3,1 mm, middelmådig ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; Tilføj/træk (som angivet) disse afstande fra Bregma-koordinater, og naviger derefter nålen til de forreste og middelmådige koordinater og sænk forsigtigt nålen ned på kraniets overflade.
BEMÆRK: De ovenfor angivne mPFC-koordinater er egnede til hanrotter med hætte på 300-350 g; ændringer i rottestamme, størrelse kan kræve ændringer af disse koordinater (se Diskussion). - Løft nålen af kraniets overflade, og marker dette punkt med en finspidset permanent markørpen. Lav et burrhul på dette tidspunkt ved hjælp af en mikroboremaskine monteret på den stereotaxiske arm.
- Indsæt nålen i hjernen ved den forudbestemte dorsoventrale koordinat og tilsæt et forudbestemt volumen (for mPFC: 300 nL). Lad nålen stå på stedet i 10 minutter for at muliggøre diffusion af bolus. Når nålen er fjernet, skal du køre pumpen for at sikre, at nålen ikke er blokeret.
BEMÆRK: Indsæt og fjern nålen langsomt (~ 3 mm / min) for at minimere skaden på hjernevævet og tilbagestrømningen af virussen i nålekanalen. - Administrer 2,5 ml opvarmet natriumchlorid (0,9% w / v) og glucose (5% w / v) opløsning subkutant for at opretholde hydrering.
- Gentag trin 1.4.12. for den anden halvkugle.
- Sutur hovedbunden snittet og efter afslutningen af proceduren administrere 2,5 ml natriumchlorid og glucoseopløsning og et passende, institutionelt anbefalet analgetikum til smertebehandling, fx buprenorphin eller meloxicam. Efterlad ikke dyret uden opsyn, mens det er bevidstløst. Placer rotten i en opvarmet genopretningskasse, indtil den kommer helt til bevidsthed. Vend kun tilbage til hjemmeburet med andre dyr, når de er helt genoprettet.
- Følg de institutionelle retningslinjer for postoperative pleje- og boligprocedurer for viral-transficerede gnavere. Vent i mindst 2 uger på, at opsintransgenet udtrykker sig tilstrækkeligt, før eksperimentet påbegyndes.
BEMÆRK: Den tid, der kræves til transduktion, afhænger af afstanden og styrken af forbindelsen mellem de præ- og postsynaptiske regioner. For mPFC til LEC kræves 4-6 uger.
2. Forberedelse af akutte hjerneskiver
BEMÆRK: Her beskriver vi en simpel metode til fremstilling af hjerneskiver, som i vores hænder er tilstrækkelig til at opnå kortikale, hippocampale og thalamiske skiver af høj kvalitet fra voksne mus og rotter.
- Forbered opløsningerne til dissektion.
- Fyld et 250 ml bægerglas med ~200 ml iskold saccharoseskæreopløsning (189 mM saccharose, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucose, 5 mM MgSO 4,3 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO4 og 0,2 mM CaCl 2 fremstillet i ultrarent vand (UPW) med resistivitet på 18,2 MΩ cm ved 25 °C) eller et tilstrækkeligt volumen til at fylde vibrationsvævskammeret. Boble med carbogen (95% O 2, 5% CO2) og hold dig på is.
- Fyld et skiveopsamlingskammer med kunstig cerebrospinalvæske (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucose,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2PO 4 og 1 mM MgSO4 fremstillet i UPW) ved stuetemperatur, boblet med carbogen. Udsnitsopsamlingskammeret14 er specialfremstillet af et mikrocentrifugerørstativ, der er limet på et ark nylonnet og anbragt i et bægerglas, hvori det er nedsænket i aCSF (figur 2A).
- Fyld et 50 ml rør med 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffer (PB; 75,4 mM Na2HPO4,7H 2 O og 24,6 mMNaH2PO4. H2O).
FORSIGTIG: PFA er giftigt. Brug i røghætte.
- Dissektion af hjernen.
- Anæstetiser rotten i et induktionskammer ved hjælp af 5% isofluran, indtil vejrtrækningen er langsom og regelmæssig (~ 1 Hz). For at sikre et tilstrækkeligt niveau af anæstesitest for fravær af pedal- og hornhindereflekser.
- Afhug dyret ved hjælp af en guillotine.
- Dissekere hurtigt hele hjernen som tidligere beskrevet15 og overføres til saccharoseskæringsopløsning. Gennemfør trinnet inden for 90 s halshugning for god skivekvalitet og vellykket helcelleoptagelse.
- Brug en metalteskefuld til at samle hjernen op, kassere overskydende skæreopløsning og læg den på et stykke filterpapir på bordpladen.
- Brug en skalpel eller barberblad til hurtigt at fjerne cerebellum og skære cerebrum i koronaplanet cirka halvvejs langs dens længde; den bageste halvdel er LEC-vævsblokken. Sørg for at inkludere noget overskydende væv ud over regionen, der skal skæres til de næste trin. Returner både denne vævsblok og resten af hjernen til saccharoseskæringsopløsningen.
- Placer en dråbe cyanoacrylatlim på et vibrerende vævsstadium. Spred det i et tyndt lag med et område, der er lidt større end vævsblokken, der blev oprettet i det foregående trin.
- Tag LEC-vævsblokken op ved hjælp af en teskefuld, kassér overskydende opløsning, og overfør til limplasteret, så det forreste koronale snit har klæbet.
- Installer scenen i vibratomvævskammeret og hæld hurtigt en tilstrækkelig mængde saccharoseskæringsopløsning til at nedsænke vævet; Boble denne opløsning med Carbogen. Orienter LEC-vævsblokken med den ventrale overflade mod bladet. Mens omgivende rumbelysning er utilstrækkelig til at aktivere opsin, skal du undgå at bruge yderligere lyskilder, der kan være til stede på vibratomet.
- Skær skiver af 350 μm tykkelse fra ventral til dorsal ved hjælp af en høj vingesvingningshastighed (100 Hz) og en langsom bladfremgangshastighed (0,06 mm/s). Typisk kan der opnås syv LEC-skiver pr. Halvkugle.
- Overfør skiverne til skiveopsamlingskammeret. Efter afslutning af skiveopsamlingen overføres opsamlingskammeret til et 34 °C vandbad i 1 time, før det vender tilbage til stuetemperatur. Boble med carbogen kontinuerligt. Skiver vil være tilstrækkeligt sunde til optagelse i mindst 6 timer.
- Resten af hjernen placeres i PFA i 48 timer til post-hoc undersøgelse af injektionsstedet (se punkt 4).
3. Elektrofysiologi og optogenetisk stimulering
- Identifikation af målcelle.
- Skiven anbringes i et nedsænket optagekammer ved 34 °C perfunderet med aCSF med en hastighed på 2 ml/min ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Immobiliser skiven ved hjælp af et skiveanker.
- Under målet om lav forstørrelse (4x) for et widefield-mikroskop ved hjælp af skrå infrarød belysning skal du navigere til LEC lag 5. Mål afstanden fra pialoverfladen til det krævede lag.
BEMÆRK: Skrå infrarød belysning blev opnået ved at placere en nær infrarød LED ca. 3 mm under optagekammerets dæksel i en vinkel på ~ 55 ° til dækslipens plan (figur 2B). Differentiel interferenskontrast er en alternativ og almindeligt anvendt billeddannelsesteknik til skiveelektrofysiologi. - Skift til et højt forstørrelsesvandsnedsænkningsmål (40x) og identificer pyramidale neuroner. Marker cellens position på computerskærmen med tape.
BEMÆRK: De pyramidale neuroner har en omtrent trekantet morfologi med fremtrædende apikale dendritter, der rager ud mod skivens piale overflade (figur 3A). Cellesundhed kan vurderes ved fravær af en kondenseret, synlig kerne og inspektion af plasmamembranen, som skal virke glat. Det er usandsynligt, at klar fluorescerende mærkning af axoner af opsin-fluoroforfusionsproteinet vil være synlig, når der anvendes et bredfeltsfluorescensmikroskop. For at visualisere aksonale fremskrivninger skal du udføre immunohistokemi post-hoc ved hjælp af et primært antistof mod opsinens fluorophore og forstærke med et sekundært antistof konjugeret til en fluorophore med samme eller lignende bølgelængde.
- Dannelse af helcelleplaster.
- Fremstil en borosilikatglasmikropipette ved hjælp af en pipettetrækker og fyld med filtreret intracellulær optagelsesopløsning (120 mM k-gluconat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA og 0,25% biocytin fremstillet i UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Placer den fyldte mikropipette i elektrodeholderen på patch-clamp-forstærkerens headstage, hvilket sikrer, at elektrodetråd er i kontakt med den intracellulære opløsning.
- Påfør positivt tryk gennem munden ved at blæse hårdt ind i et mundstykke (såsom en 1 ml sprøjte med stemplet fjernet), der er forbundet med slanger til elektrodeholderens sideport, og oprethold trykket ved at lukke en trevejsventil i rækken. Hæv mikroskopmålet, så der dannes en menisk, og indsæt elektroden i menisken, indtil den kan ses på mikroskopet.
- Åbn seal test-vinduet i WinLTP16 (eller anden anskaffelsessoftware/oscilloskop), og med forstærkeren i spændingsklemmetilstand skal du anvende en 5 mV kvadratpuls for at bestemme, om pipettemodstanden er 3-6 MΩ.
- Gå til og rør ved den identificerede celle med pipettespidsen; dette bør resultere i en fordybning i cellemembranen (figur 3A; højre panel) og en lille stigning i pipettemodstanden (0,1 MΩ).
- Slip positivt tryk og påfør negativt tryk ved at anvende moderat sugning ved mundstykket; dette skulle resultere i en enorm stigning i pipettemodstanden (>1000 MΩ). Trykket kan nu forblive neutralt. Påfør undertryk i en gradvist stigende rampe, indtil cellemembranen brister, hvilket resulterer i helcellekapacitanstransienter.
- Optag optogenetisk fremkaldte synaptiske begivenheder.
- Indtast nuværende klemmekonfiguration.
BEMÆRK: I de fleste tilfælde er langtrækkende synaptisk transmission glutamatergisk, derfor vil registrering ved membranpotentialer tæt på chloridreverseringspotentialet bedst isolere AMPA-receptor (AMPAR) -medieret transmission og minimere måling af enhver fremkaldt feed-forward hæmning (FFI). Kloridvending er afhængig af sammensætningen af intracellulær registreringsopløsning og aCSF og kan beregnes ved hjælp af Goldman-Hodgkin-Katz-ligningen; for ovenstående løsninger var dette -61,3 mV. Lag 5 LEC pyramideneuroner havde et gennemsnitligt hvilemembranpotentiale på -62 mV og blev om nødvendigt opretholdt ved dette potentiale ved injektion af konstant strøm. Alternativt kan celler spændingsfastgøres til det ønskede potentiale. For at registrere langtrækkende hæmmende fremskrivninger16 eller for at registrere FFI, spændingsklemme ved kationreverseringspotentiale for at isolere GABAergisk chloridkonduktans. Når spændingsspændeneuroner ved membranpotentialer over aktionspotentialetærsklen anvendes en cæsiumbaseret intracellulær opløsning indeholdende spændingsstyrede natriumkanalblokkere til at forbedre spændingsklemmen og forhindre initiering af handlingspotentialer (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314chlorid,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocytin fremstillet i UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). - Brug dataindsamlingssoftware til at sende transistor-transistor logik (TTL) signaler til en LED-driver for at aktivere en monteret 470 nm LED. Den monterede LED er rettet ind i mikroskoplysbanen ved hjælp af filterterninger og passende optik (figur 2B) for at påføre lysimpulser på skiven via 40x-målet for at fremkalde optogenetiske excitatoriske postsynaptiske potentialer (oEPSP'er).
BEMÆRK: Lysimpulser kan påføres perisomatisk / over dendritterne, hvilket vil resultere i aktivering af opsiner i axonerne og præsynaptisk bouton, eller efterforskeren kan flytte målet til axoner væk fra den registrerede celle for at undgå over-boutonstimulering (se Diskussion). Maksimal oEPSP-amplitude afhænger af styrken af den synaptiske projektion, effektiviteten af virale injektioner og den anvendte opsin. oEPSP'er kan titreres til den ønskede amplitude ved varierende lysintensitet og/eller varighed18; varierende varighed af lysimpulser (typisk varighed mellem 0,2-5 ms ved maksimal LED-effekt, hvilket resulterer i 4,4 mW/mm lystæthed19) giver mere konsistente oEPSP-amplituder end at ændre LED'ens effekt. - Undersøg præsynaptiske frigivelsesegenskaber (ændring i spænding) ved at levere tog med flere lysimpulser med forskellige interstimulusintervaller (figur 3E); man bør være forsigtig med at fortolke optogenetisk fremkaldt transmission (se Diskussion).
- Undersøg langsigtet plasticitet enten ved gentagne gange at fremkalde oEPSP'er19 eller anvendelse af ligander. Overvåg oEPSP-amplitude i 5-10 minutter for at sikre stabilitet før induktion af plasticitet, og overvåg derefter, indtil en stabil amplitude er nået (typisk 30-40 min).
BEMÆRK: De fleste nuværende opsiner er ikke i stand til pålideligt at fremkalde flere handlingspotentialer ved høje frekvenser, f.eks. 100 stimuli leveret ved 100 Hz, som typisk bruges til at inducere LTP. - For at bekræfte, at oEPSP'er er monosynaptiske, skal du udføre over-boutonaktivering af den transducerede vej ved at placere målet over dendritisk arbor og stimulere i nærværelse af 0,5 μM tetrodotoxin og 100 μM aminopyridin. Anvendelse af tetrodotoxin vil afskaffe transmissionen, hvis reaktionerne er handlingspotentialeafhængige, og efterfølgende inkludering af aminopyridin vil delvist genoprette transmissionen, hvis oEPSP'erne genereres monosynaptisk19,20.
- For at tillade biocytin at fylde neuronen skal du vente i mindst 15 minutter efter at have indtastet helcellekonfigurationen. I spændingsklemme, monitor membran kapacitans og input modstand.
- Træk langsomt pipetten langs indflyvningsvinklen væk fra cellens soma, idet man observerer den langsomme forsvinden af kapacitanstransienter og membranstrøm, der indikerer genforsegling af cellemembranen og dannelse af et udvendigt plaster ved pipettespidsen. Bemærk udsnittets retning og placeringen af cellen/cellerne i udsnittet. Skiven lægges i PFA i en 24-brønds plade og inkuberes natten over ved 4 °C, og overføres derefter til 0,1 M PB.
BEMÆRK: Udsnit kan opbevares i op til en uge. Hvis der kræves længere opbevaring, skal du ændre PB regelmæssigt eller bruge PB indeholdende natriumazid (0,02% -0,2% natriumazid).
- Indtast nuværende klemmekonfiguration.
4. Histologi
- Udskæring af injektionssted
- Efter fiksering kryobeskytter kryobeskytte vævet i 30% saccharose (w/v) i PB, indtil det synker (det vil oprindeligt flyde i saccharoseopløsningen), normalt natten over ved stuetemperatur eller 24-48 timer ved 4 °C.
- Ved hjælp af optimal skæretemperatur (OCT) medium fastgøres en vævsblok til kryostatprøveskiven. Vævsblokken fryses i trin 4.1.3 til 4.1.4.
- Anbring isopentan i en passende beholder. Nedsænk kun prøveskiven, hvilket sikrer, at vævet er over niveauet for isopentan. Sænk beholderen med isopentan i flydende nitrogen (eller tøris) og lad vævet fryse.
- Når den er helt frossen (hele vævsblokken bliver bleg og hård), skal du lade vævsblokken stå i kryostatkammeret ved -20 ° C i 30 minutter for at lade blokkens temperatur balancere.
- Skær 40 μm tykke sektioner i kryostaten ved -20 °C. Brug en fin pensel til at lede sektionerne af bladet. Fastgør frosne sektioner til en stuetemperatur, poly-L-lysinbelagt, glasmikroskopglas ved at røre diaset til sektionerne.
- Tilsæt ca. 150 μL monteringsmedium til hvert dias og dæk med en dæksel; Fjern eventuelle luftbobler ved forsigtigt at trykke på dækslippen. Dæk diasene for at beskytte mod fotoblegning og lufttørring ved stuetemperatur i mindst 12 timer (eller natten over). Brug et fluorescensmikroskop til at undersøge placeringen af det virale injektionssted.
- Biocytin farvning protokol
BEMÆRK: Denne protokol kan anvendes på tykke sektioner; skiver behøver ikke at blive omskåret.- Hjerneskiverne vaskes med fosfatbufferet saltvand (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 og 1,8 mM KH2PO4) seks gange i 10 minutter pr. vask. Brug en overførselspipette til at tømme brøndene efter hvert trin.
- Udrug skiverne i 3% H2O2(w/v) i PBS i 30 minutter for at blokere enhver endogen peroxidaseaktivitet. Dette genererer iltbobler.
- Vask hjerneskiverne med PBS seks gange i 10 minutter pr. vask, eller indtil der ikke er yderligere iltbobler synlige. Inkubere hjerneskiverne i 1% (v/v) avidin-biotinyleret HRP-kompleks (ABC) opløsning i PBS indeholdende 0,1% (v/v) Triton X-100 ved stuetemperatur i 3 timer.
- Vask hjerneskiverne med PBS seks gange i 10 minutter pr. vask.
- Inkuber hver skive i 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) opløsning i flere minutter, indtil biocytinfarvningen af neuronale strukturer bliver synlig (tager ca. 5-10 minutter).
FORSIGTIG: DAB er giftig. Brug i røghætte.
BEMÆRK: DAB-inkubationstider kan være uforudsigelige, overvåge vævet nøje, når farven udvikler sig. - Reaktionen stoppes ved at overføre skiverne til koldt (4 °C) PBS. Vask hjerneskiverne med PBS seks gange i 10 minutter pr. vask. Brug en børste til at montere hjerneskiverne på poly-L-lysinbelagte glasmikroskopglas.
- Fjern al overskydende PBS med et rent væv. Dæk hver skive med ca. 200 μL monteringsmedium; Dæk med dækslip, og tryk forsigtigt på dækslippet for at skubbe luftbobler ud. Lufttørret ved stuetemperatur i mindst 12 timer (eller natten over). Ved hjælp af et lysmikroskop undersøges placeringen og morfologiske detaljer i cellen /cellerne.
BEMÆRK: Biocytin kan alternativt visualiseres ved hjælp af fluorophorekonjugeret streptavidin; billeddannelse kan dog kræve resektion eller brug af et konfokalmikroskop21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol beskriver vi, hvordan man studerer langtrækkende synaptisk fysiologi og plasticitet ved hjælp af viral levering af optogenetiske konstruktioner. Protokollen kan meget let tilpasses til at studere næsten enhver langdistanceforbindelse i hjernen. Som et eksempel beskriver vi injektion af AAV'er, der koder for en opsin i rotte mPFC, fremstilling af akutte skiver fra LEC, patch-clamp-optagelser fra lag 5 LEC pyramidale neuroner og let fremkaldt aktivering af mPFC-terminaler i LEC (figur 1).
En sund pyramidecelle blev lokaliseret og lappet (f.eks. Figur 3A). I det nuværende mPFC til LEC-eksempel blev de postsynaptiske celler ikke mærket; hvis postsynaptisk celleidentifikation er påkrævet, skal en celle, der udtrykker den fluorescerende markør, lokaliseres ved hjælp af widefieldoptik (f.eks. figur 3B). Cellens sundhed skal vurderes ved infrarød optik inden forsøg. For at aktivere mPFC-axoner i LEC blev en LED placeret direkte over lag 5-celle soma og proksimale dendritter via mikroskopmålet (figur 1), enkeltlysimpulser på 2 ms resulterede i enkle bølgeform oEPSP'er (figur 3C); den maksimale amplitude af oEPSP kan måles. For at undersøge kortsigtet plasticitet af synapsen blev 5, 10 og 20 Hz tog af lysstimulering anvendt (figur 3E). For at undersøge langsigtet plasticitet blev den kolinerge agonist, carbachol, efter overvågning af baseline oEPSP-amplitude i 10 minutter tilsat til den cirkulerende aCSF i 10 minutter. Dette forårsagede langvarig depression, der stadig var tydelig 40 minutter efter fjernelse af liganden (figur 3D).
Efter elektrofysiologiske optagelsesforsøg blev hjernevævet indeholdende virusinjektionsstedet snittet, og injektionsstedets længde blev undersøgt (figur 4A). Den fluorescerende reporter, mCherry, er lokaliseret til de dybere lag af den prælimbiske og infralimbiske cortex (bestanddele af gnaver mPFC). Disse lag blev målrettet, da projektionen til LEC har vist sig overvejende at stamme fra de dybere kortikale lag22. mCherry positive fibre kan også ses sammen med den hvide stofkanal. I et pilotforsøg for at optimere viral injektionsplacering blev 40 μm sektioner af LEC taget og undersøgt; mCherry positive fibre kan ses i lag 5 af LEC (figur 4B). Endelig blev den biocytinfyldte celle farvet, hvilket gjorde det muligt at bekræfte dens placering og morfologi (figur 4C, D).
Figur 1: Eksperimentel oversigt. (A) Skematisk af viral vektorinjektion i medial præfrontal cortex (mPFC), transduktion af mPFC-celler med optogenetisk konstruktion og transport af konstruktion til terminaler i lateral entorhinal cortex (LEC). (B) Skematisk repræsentation af helcelleoptagelse fra lag 5 pyramideneuroner i en akut LEC-skive og lysaktivering af mPFC-terminaler via mikroskopmål. Forkortelser: CA = cornu ammonis; PERI = perirhinal cortex; TR = overgangsregion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skiveopsamlingskammer og optisk konfiguration til visualiserede helcelleoptagelser, optogenetisk excitation og identifikation af tdTomat-positive neuroner. (A) Udsnitsopsamlingskammeret14 er specialfremstillet af et mikrocentrifugerørstativ, der er limet på et ark nylonnet og anbragt i et bægerglas, hvori det er nedsænket i aCSF (B ) LED'er til excitation af ChR2 (470 nm) og tdTomato (565 nm) ledes gennem en asfærisk kondensatorlinse for at kollidere lys, 565 nm lys stråles gennem et båndpasfilter for at opnå spektral adskillelse af tdTomato excitation og emissionsspektre. Disse kombineres med et langpasseret dikroisk spejl og rettes mod skiven med et andet langpasseret dikroisk spejl med en længere bølgelængde. Lys fokuseres derefter på skiven via objektivlinsen. I eksperimenter, hvor tdTomato-mærkede neuroner er til stede, passerer udsendt fluorescerende lys gennem det dikroiske spejl og emissionsfilter og fokuseres på kamerasensoren af en akromatisk linse. Ikke-fluorescerende træk ved skiven visualiseres ved skråt brudt nær infrarødt (NIR) lys påført under skivekammeret; dette lys sender optikken til kameraet og negerer dermed behovet for at skifte filterterninger mellem fluorescerende og NIR-billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Visualisering af neuroner under NIR/fluorescerende billeddannelse og repræsentative eksempler på oEPSP'er. (A) Til venstre: Eksempel på neuron med pyramidemorfologi visualiseret med NIR-lys. Til højre: Samme neuron med dannelse af konkav fordybning forårsaget af positivt tryk fra plasterpipetten. (B) Cre-rekombinaseafhængig ekspression af tdTomato i en enkelt neuron. (C) Repræsentativ oEPSP fra LEC lag 5 i pyramidecellen. D) Eksempel på langtidsplastisk eksperiment, der overvåger oEPSP over tid efter tilsætning af 10 μm carbachol (CCh). Den stiplede linje indikerer gennemsnitlig oEPSP-amplitude i baselineperioden før lægemiddeltilsætning. (E) Repræsentative spor af stimuleringstog ved 5, 10 og 20 Hz. Blå pile angiver lysaktivering. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histologisk verifikation af injektionssted og genvinding af biocytinfyldt celle . (A) Koronal fotomikrograf, der viser viral injektionssted i mPFC, +3,00 mm fra bregma. (B) Tynd koronal sektion af LEC, der illustrerer mCherry + fibre. (C) Billede med lav effekt af 350 μm tyk akut skive, -6,2 mm fra bregma, med biocytinfyldt pyramidecelle i LEC. Den stiplede boks er vist ved højere forstørrelse i D. (D) LEC pyramidecelle; Den apikale dendrit kan ses til højre på billedet på vej mod lag 1. Stiplede linjer angiver regionale grænser. Forkortelser: IL = infralimbisk cortex; PL = prælimbisk cortex; wm = hvidt stof. Skalabjælker = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, beskriver en metode til at udforske meget specifikke langtrækkende synaptiske fremskrivninger ved hjælp af en kombination af stereotaxisk kirurgi til at levere AAV'er, der koder for optogenetiske konstruktioner og elektrofysiologi i akutte hjerneskiver (figur 1). Sammen tilbyder disse teknikker værktøjer til at karakterisere fysiologien og plasticiteten af hjernekredsløb med høj præcision i langtrækkende og anatomisk diffuse veje, der tidligere var utilgængelige ved hjælp af traditionel, ikke-specifik, elektrisk stimulering. Kombination med cellespecifikke molekylære markører muliggør karakterisering af fremskrivninger fra en hjerneregion til forskellige definerede cellepopulationer i en anden region23.
For at drage fuld fordel af den meget præcise karakter af denne teknik er det vigtigt at kontrollere pathway specificitet. Dette gøres i flere trin; Under optagelsen skal det sikres, at den synapse, der undersøges, er monosynaptisk (trin 3.3.5). Herefter skal injektionsstedet histologisk undersøges for at sikre, at virussen er begrænset til det tilsigtede præsynaptiske område af interesse, og vurdere placeringen og morfologien af den biocytinfarvede postsynaptiske celle for at sikre, at den er som forventet.
Virusvalg og opnåelse af cellulær specificitet
Teknikken er meget tilpasningsdygtig og velegnet til brug i både mus og rotter. Eksperimenter, der kræver anatomisk specificitet, kan udføres med vildtype gnavere. Eksperimenter, der kræver postsynaptisk celletypespecificitet, kan kræve en genetisk modificeret gnaverstamme, hvis celler ikke kan identificeres baseret på morfologi eller placering. For eksempel, for at målrette parvalbumin (PV), der udtrykker interneuroner, kan en PV-Cre knock-in transgen muselinje, hvor Cre-rekombinase udtrykkes i PV-ekspressive neuroner, anvendes. For at visualisere disse celler kan PV-Cre-linjen krydses med en reportermuslinje for at udtrykke et fluorescerende protein efter Cre-medieret rekombination. Alternativt kan et Cre-afhængig fluorescerende reportergen introduceres viralt. ChR2-fluoroforfusionsproteiner er begrænset til cellemembranen og kan forekomme som en kontur af neuronen, når de ses med widefieldmikroskopi i akutte skiver, hvilket gør identifikation af celler til helcelleoptagelse mere udfordrende end ved anvendelse af cytosoliske fluorophorer. Hvis ChR2 bruges til at identificere celler, kan adskillelse af ChR2 og fluorophore opnås ved hjælp af bicistroniske vektorer24. Hvis man bruger en fluorescerende reporter til at identificere målneuroner til helcelleoptagelse, bør dens excitationsbølgelængde ideelt set ikke overlappe med opsinens aktiveringsbølgelængde; Dette vil undgå langvarig aktivering af transducerede afferenter, mens du søger efter neuroner at optage fra. På samme måde bør præ- og postsynaptiske journalister være spektralt adskilt. Almindelige journalister er mCherry, grønt fluorescerende protein (GFP) og forbedret gult fluorescerende protein (eYFP).
Den anvendte virale konstruktion har flere forskellige komponenter, hver kan påvirke eksperimentets succes, og derfor skal der tages hensyn til hvert element. Primær betydning bør gives til valget af opsin. Til præsynaptisk aktivering har den ideelle opsin store fotostrømme (for pålideligt at bringe axoner til handlingspotentialetærskel), hurtig on- og off-kinetik og en langsom desensibiliseringshastighed for at tillade højfrekvent gentagen stimulering. Som regel kommer hurtig kinetik ofte på bekostning af mindre fotostrømme25; Imidlertid har molekylær screening og teknik givet Opsins med store fotostrømme. Den nuværende protokol bruger ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12, men Chronos 26, CheRiff 27, oChIEFAC28 og ChRmine 29 er også egnede. Derudover findes der excitatoriske opsiner med enten rødforskudte (ChrimsonR)26 eller violetforskudte (CheRiff) aktiveringsbølgelængder, hvilket kan være nødvendigt for at undgå overlapning med excitationsspektre af fluorophorer, der anvendes til celleidentifikation (se ovenfor).
Serotypen af AAV'er kan påvirke vektorens evne til at transducere forskellige hjerneområder og celletyper samt omfanget af aksonal transport i både anterograd og retrograd retning30. Serotyper, der almindeligvis anvendes til neuronal transduktion, er 1, 2, 5, 8 og 9. En litteratursøgning kan give en indikation af, hvilken serotype der er blevet anvendt med succes i en given region. For eksempel er AAV9 blevet anbefalet til transduktion af kortikale neuroner31.
Promotoren giver mulighed for specifikation af den celletype, hvor opsinen vil blive udtrykt. Promotorer falder i flere klasser. Generelle promotorer, f.eks. CAG eller EF1a, resulterer i ekspression i de fleste celletyper. Neuronspecifikke promotorer, fx synapsin, genererer ekspression i alle neurontyper. CaMKIIa bruges almindeligvis til at begrænse ekspression til excitatoriske neuroner, selvom det har vist sig at være utæt - noget udtryk er blevet observeret i interneuroner32. mDlx-forstærkerelementet begrænser ekspressionen til GABAergiske interneuroner33. Pre-synaptisk celletype specificitet kan opnås ved hjælp af en Cre-mus linje (som beskrevet ovenfor for den post-synaptiske celle). I dette tilfælde kræves en Cre-afhængig genetisk konstruktion for at begrænse opsinekspression til Cre-ekspressive celler.
Titre er antallet af virale partikler i det virale præparat. Igen kan en litteratursøgning give en indikation af en titer, der har genereret tilstrækkelig transduktion i en bestemt region. Ved anvendelse af et Cre-afhængigt system kan titeren være særlig vigtig, da høje virale titre kan transducere ekspression i ikke-Cre-ekspressive celler34.
Optimering af viruslevering
Præcis viral levering til interesseregionen er af afgørende betydning for denne tilgang. Injektionskoordinater for det præsynaptiske område kan estimeres ved at konsultere litteraturen og / eller et hjerneatlas for den relevante art35,36. Eksperimentatoren skal derefter tage sig tid til at optimere og forfine de nøjagtige injektionskoordinater og det anvendte volumen for at sikre, at den virale injektion er begrænset til deres præsynaptiske interesseområde. Dette er især kritisk, når naboregioner også projicerer til optagelsesstedet. Vi anbefaler at bruge små mængder af virussen som en effektiv metode til at gøre dette. Hvis der kræves et særligt lille injektionssted, kan det være en fordel at anvende glasmikropipetter i stedet for en sprøjte og kanyle13. At lade kanylen stå på stedet i en passende periode og langsom tilbagetrækning af kanylen er afgørende for at forhindre virussen i at slippe ud i nålekanalen. For at bekræfte nøjagtigheden af injektioner er det bedste praksis at histologisk verificere injektionsstedet for hvert dyr, der anvendes gennem elektrofysiologi, hvor det er muligt, og udelukke data, hvor viral transduktion er off-target. I vores hænder har protokollen beskrevet ovenfor vist sig at være generaliserbar til mange forskellige langtrækkende forbindelser, herunder fremskrivninger fra ventrale midterlinje thalamiske kerner, hippocampus, mediodorsal thalamus og LEC til PFC; fremskrivninger fra PFC til LEC og mediodorsal thalamus; fremskrivninger fra LEC og ventrale midterlinje thalamiske kerner til hippocampus (Zafar Bashir lab, University of Bristol, upublicerede observationer19). Optogenetisk mærkning af disse forskellige veje har blot krævet forfining af injektionskoordinater og volumener.
Begrænsninger i protokollen
Hurtig dissektion af hjernen og omhyggelig udskæring er kritisk vigtige for succesen med disse eksperimenter. Udskæringsprotokollen, der er beskrevet her, giver sunde akutte skiver uden tilpasning til forskellige hjerneområder; Imidlertid er variation i udskæringsmedium og inkubationstemperatur efter udskæring beskrevet andetsteds28 rapporteret at forbedre skivesundheden yderligere. Desuden har vi også været i stand til at tage akutte skiver fra to hjerneområder efter viral transduktion af et enkelt område, hvilket reducerer antallet af anvendte dyr. Vi har fundet ud af, at i anatomisk tætte veje er perioder så korte som 7 dage mellem viral transduktion og optagelse tilstrækkelige til at fremkalde robuste oEPSP'er af passende størrelse til helcelle patch-clamp-optagelser. I længere rækkevidde eller mere sparsomme fremskrivninger er længere forsinkelser fordelagtige.
Der bør udvises forsigtighed ved fortolkningen af resultaterne af optogenetisk fremkaldt aktivitet, især med hensyn til kortvarig plasticitet. Tidligere resultater har vist, at optogenetisk fremkaldt transmission kan gennemgå mere udtalt synaptisk depression ved gentagen stimulering end elektrisk stimulering, som kan opstå på grund af en række faktorer. For det første kan opsindesensibilisering25 føre til et reduceret antal præsynaptiske axoner, der spidser, hvilket fører til reducerede postsynaptiske reaktioner. Den forbedrede kanalkinetik af nyligt opdagede opsiner og dem, der har gennemgået molekylær teknik (se ovenfor) har gået en betydelig måde at afbøde virkningerne af desensibilisering; 100 Hz-stimulering forbliver dog uden for rækkevidde af mange opsiner, hvilket kan hindre brugen af visse langsigtede plasticitetsinduktionsprotokoller (sedog 37). For det andet kan den langsomme kinetik af opsiner udvide handlingspotentialer18, hvilket fører til langvarig transmitterfrigivelse og vesikulær udtømning; dette kan også skyldes calciumpermeabiliteten af excitatoriske opsiner11; Disse problemer kan afhjælpes ved at undgå over-bouton fotoaktivering38. For det tredje kan transduktion af neuroner ved hjælp af AAV-vektorer også føre til ændrede præsynaptiske frigivelsesegenskaber i visse synapser; Dette kan dog afhjælpes ved at bruge AAV9 serotype38. På trods af disse begrænsninger kan optogenetisk aktivering med omhyggelig brug efterligne elektrisk stimulering19,38 og er derfor et uvurderligt værktøj til at undersøge fysiologien af ikke-studerede synaptiske veje. Vi bemærker også, at dataene vist i figur 3E vurderer kortsigtet plasticitet i strømklemme og derfor er underlagt interaktion mellem synaptiske potentialer og iboende membranegenskaber, dette kan undgås ved at udføre ækvivalente eksperimenter i spændingsklemme.
Fremtidige retninger
Den stadigt voksende optogenetiske værktøjskasse har øget muligheden for at anvende denne teknologi i to synaptiske veje i samme præparat ved at bruge et par opsiner med divergerende excitationsspektre. Dette er muliggjort ved brug af en opsin ChrimsonR26, som i modsætning til ChR2 er fotoaktiveret af rødt bølgelængdelys. ChrimsonR bevarer lav følsomhed over for blåt lys, så for at undgå aktivering af tværvej kan det bruges i kombination med rød-ufølsomme opsiner, som er violetforskudte (CheRiff 27) og / eller har størrelsesordener højere følsomhed over for blåt lys (Chronos26). Dette giver mulighed for brug af blå / violette lysstimuli, der er for svage til signifikant at aktivere ChrimsonR og derfor tillader aktivering af to veje39,40, hvilket kan øge eksperimentel gennemstrømning, tillade undersøgelse af konvergente vejinteraktioner og tillade frigivelse af neuromodulatorer fra endogene kilder41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af Wellcome-bevillingen 206401/Z/17/Z. Vi vil gerne takke Zafar Bashir for hans ekspertmentorskab og Dr. Clair Booth for teknisk bistand og kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
