Summary
Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.
Abstract
Het bestuderen van de fysiologische eigenschappen van specifieke synapsen in de hersenen, en hoe ze plastische veranderingen ondergaan, is een belangrijke uitdaging in de moderne neurowetenschappen. Traditionele in vitro elektrofysiologische technieken gebruiken elektrische stimulatie om synaptische transmissie op te roepen. Een groot nadeel van deze methode is het niet-specifieke karakter; alle axonen in het gebied van de stimulerende elektrode worden geactiveerd, waardoor het moeilijk is om een effect toe te schrijven aan een bepaalde afferente verbinding. Dit probleem kan worden ondervangen door elektrische stimulatie te vervangen door optogenetische stimulatie. We beschrijven een methode om optogenetica te combineren met in vitro patch-clamp opnames. Dit is een krachtig hulpmiddel voor de studie van zowel basale synaptische transmissie als synaptische plasticiteit van precieze anatomisch gedefinieerde synaptische verbindingen en is van toepassing op bijna elke route in de hersenen. Hier beschrijven we de voorbereiding en behandeling van een virale vector die codeert voor channelrhodopsine-eiwit voor chirurgische injectie in een pre-synaptisch gebied van belang (mediale prefrontale cortex) in de hersenen van knaagdieren en het maken van acute plakjes stroomafwaartse doelgebieden (laterale entorhinale cortex). Een gedetailleerde procedure voor het combineren van patch-clamp opnames met synaptische activering door lichtstimulatie om synaptische plasticiteit op korte en lange termijn te bestuderen, wordt ook gepresenteerd. We bespreken voorbeelden van experimenten die pathway- en celspecificiteit bereiken door optogenetica en Cre-afhankelijke celetikettering te combineren. Ten slotte wordt histologische bevestiging van het pre-synaptische gebied van belang beschreven samen met biocytine-etikettering van de post-synaptische cel, om verdere identificatie van de precieze locatie en het celtype mogelijk te maken.
Introduction
Het begrijpen van de fysiologie van synapsen en hoe ze plastische veranderingen ondergaan, is van fundamenteel belang om te begrijpen hoe hersennetwerken functioneren in de gezonde hersenen1 en hoe ze niet goed functioneren bij hersenaandoeningen. Het gebruik van acute ex vivo hersensegmenten maakt het mogelijk om de elektrische activiteit van synapsen van afzonderlijke neuronen met een hoge signaal-ruisverhouding te registreren met behulp van patchklemopnamen voor hele cellen. Controle van membraanpotentiaal en eenvoudige farmacologische manipulatie maakt isolatie van receptorsubtypen mogelijk. Deze opnames kunnen met voortreffelijke specificiteit worden gemaakt om het post-synaptische neuron te identificeren, inclusief laminaire en subregionale positie2, cellulaire morfologie3, aanwezigheid van moleculaire markers4, de afferente projecties5, of zelfs als het onlangs actief was6.
Het bereiken van specificiteit van pre-synaptische inputs is echter iets uitdagender. De conventionele methode heeft stimulatie-elektroden gebruikt om de axonen te exciteren die in een bepaalde lamina lopen. Een voorbeeld hiervan is in de hippocampus waar lokale stimulatie in het stratum radiatum synapsen activeert die van de CA3 naar het CA1-subveld7 projecteren. In dit geval wordt presynaptische specificiteit bereikt omdat CA3-input de enige exciterende input vertegenwoordigt die zich in stratum radiatum bevindt en projecteert op CA1 piramidale cellen8. Deze hoge mate van inputspecificiteit die haalbaar is met conventionele elektrische presynaptische activering van CA3-CA1-axonen is echter een uitzondering die wordt weerspiegeld in de intense studie waaraan deze synaps is onderworpen. In andere hersengebieden bestaan axonen van meerdere afferente paden naast elkaar in dezelfde lamina, bijvoorbeeld in laag 1 van neocortex9, waardoor inputspecifieke presynaptische stimulatie onmogelijk wordt met conventionele stimulerende elektroden. Dit is problematisch omdat verschillende synaptische inputs uiteenlopende fysiologische eigenschappen kunnen hebben; daarom kan hun co-stimulatie leiden tot verkeerde karakterisering van synaptische fysiologie.
De komst van optogenetica, de genetische codering van lichtgevoelige membraaneiwitten (opsins) zoals channelrhodopsine-2 (ChR2), heeft een enorme uitbreiding van de mogelijkheden mogelijk gemaakt voor het bestuderen van geïsoleerde synaptische projecties tussen hersengebieden10,11. Hier beschrijven we een generaliseerbare en goedkope oplossing voor het bestuderen van synaptische fysiologie en plasticiteit op lange afstand. De optogenetische constructen worden op een zeer specifieke manier geleverd met behulp van virale vectoren die een uiterst nauwkeurige controle van het pre-synaptische gebied van belang mogelijk maken. Efferente projecties zullen het door licht geactiveerde kanaal uitdrukken, waardoor deze vezels in een doelgebied kunnen worden geactiveerd. Zo kunnen langeafstands-, anatomisch diffuse paden worden bestudeerd die niet onafhankelijk kunnen worden geactiveerd door traditionele, niet-specifieke, elektrische stimulatie.
We beschrijven, als voorbeeldroute, transductie van mediale prefrontale cortex (mPFC) met adeno-geassocieerde virussen (AAV's) die coderen voor exciterende kationkanaalopsinen. Vervolgens beschrijven we de bereiding van acute plakjes uit de laterale entorhinale cortex (LEC), patch-clamp opnames van laag 5 LEC piramidale neuronen en lichtgevooleerde activering van glutamaterge mPFC-LEC projecties (Figuur 1). We beschrijven ook de histologische beoordeling van de injectieplaats om de locatie van het pre-synaptische gebied van belang en identificatie van post-synaptische celmorfologie te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Britse Animals Scientific Procedures Act (1986) en bijbehorende richtlijnen en lokale institutionele richtlijnen.
1. Stereotaxische virale injectie
OPMERKING: Het huidige protocol vereist anatomische, maar niet post-synaptische celtype, specificiteit.
- Kies het juiste dier. Mannelijke wild-type Lister hooded ratten werden gebruikt in dit protocol (300-350 g, ongeveer 3 maanden oud).
- Kies de juiste virale constructie. Er zijn verschillende factoren om rekening mee te houden (zie Discussie). Het huidige protocol gebruikt een virus om het optogenetische kanaal ChETATC12 tot expressie te brengen, om exciterende neuronen te transduceren (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; titer: 3,3 x 1013 virale genomen/ml).
- Stel de coördinaten en het volume van de injectie vast met behulp van een hersenatlas zoals eerder beschreven35.
- Stereotaxische injectie van het virale preparaat
OPMERKING: Alle relevante nationale en institutionele richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren moeten worden gevolgd. De virale vectoren worden stereotaxisch geïnjecteerd zoals eerder beschreven13 met de volgende wijzigingen.- Houd het virale preparaat op ijs tijdens de verdoving en voorbereiding van het dier.
- Induceer anesthesie in een anesthetische inductiekamer met 4% isofluraan. Controleer het niveau van anesthesie dat wordt aangegeven door een langzamere regelmatige ademhalingsfrequentie (1 Hz) en afwezigheid van pedaal- en corneareflexen (test door respectievelijk in de tenen te knijpen en de ooghoek licht aan te raken; er mag geen reactie worden gedetecteerd).
- Dien preoperatieve analgeticum zoals meloxicam ten minste 30 minuten vóór de invasieve procedure toe.
- Wanneer het dier volledig verdoofd is, gebruik dan tondeuses om de vacht van de hoofdhuid te verwijderen. Schakel de isofluraanstroom naar de neuskegel van het stereotaxische frame en monteer de rat in het frame. Breng bevochtigende ooggel aan op de ogen om uitdroging tijdens de procedure te voorkomen.
- De operatie moet worden uitgevoerd in aseptische omstandigheden. Gebruik steriele handschoenen en instrumenten tijdens de procedure. Breng lidocaïnezalf (5% w / w) aan voordat u de hoofdhuid desinfecteert met 4% w / v chloorhexidine-oplossing en bedek vervolgens het lichaam met een steriel gordijn. Maak met behulp van een scalpel een longitudinale incisie van ongeveer 15 mm lang op de hoofdhuid om bregma bloot te leggen.
- Laad een Hamilton-spuit in een pomp met micro-injectiespuit die is bevestigd aan een beweegbare arm die op het stereotaxische frame is gemonteerd.
- Plaats een aliquot van 5 μL van het virus in een buis van 0,2 ml en draai gedurende een paar seconden totdat al het volume zich in de bodem van de buis bevindt. Pipetteer 2 μL van het virale preparaat in het deksel van de buis.
- Vul de spuit met het virale preparaat door eerst de naaldpunt te bekijken met een chirurgische microscoop en plaats vervolgens handmatig de bolus van het virus aan de punt van de naald en trek de zuiger van de spuit op met behulp van de pompbedieningen.
- Stel het injectievolume van de pomp in op 300 nL en het debiet op 100 nL/min. Laat de pomp draaien en bevestig de juiste stroom door de druppel van het virus aan de naaldpunt te observeren. Absorbeer het virus op een wattenstaafje en reinig de naald voorzichtig met 70% ethanol.
- Navigeer met behulp van de stelschroeven op het stereotaxische frame de naaldpunt naar bregma (het punt op de schedel waar de coronale en sagittale hechtingen elkaar ontmoeten) en let op de stereotaxische metingen die zijn waargenomen op de drie vernier-schalen op het frame. De coördinaten ten opzichte van bregma van rat mPFC zijn anterieur-posterior + 3,1 mm, middellateraal ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; tel deze afstanden van bregmacoördinaten op/trek deze af (zoals aangegeven) en navigeer vervolgens met de naald naar de voorste-achterste en middelmatige coördinaten en laat de naald voorzichtig op het schedeloppervlak zakken.
OPMERKING: De hierboven gegeven mPFC-coördinaten zijn geschikt voor mannelijke lister hooded ratten van 300-350 g; veranderingen in rattenstam, grootte kunnen wijzigingen in deze coördinaten vereisen (zie discussie). - Til de naald van het schedeloppervlak en markeer dit punt met een permanente markeerpen met fijne punt. Maak op dit punt een braamgat met behulp van een microboor die op de stereotaxische arm is gemonteerd.
- Steek de naald in de hersenen bij de vooraf bepaalde dorsoventrale coördinaat en infundeer een vooraf bepaald volume (voor mPFC: 300 nL). Laat de naald 10 minuten in situ om de diffusie van de bolus mogelijk te maken. Laat bij het verwijderen van de naald de pomp draaien om ervoor te zorgen dat de naald niet wordt geblokkeerd.
OPMERKING: Plaats en verwijder de naald langzaam (~ 3 mm / min) om de schade aan het hersenweefsel en de terugstroom van het virus in het naaldkanaal te minimaliseren. - Dien 2,5 ml verwarmd natriumchloride (0,9% m/v) en glucose (5% w/v) oplossing subcutaan toe om de hydratatie te behouden.
- Herhaal stap 1.4.12. voor het tweede halfrond.
- Hecht de hoofdhuidincisie en dien na voltooiing van de procedure 2,5 ml natriumchloride en glucoseoplossing en een geschikt, institutioneel aanbevolen, analgeticum toe voor pijnbestrijding, bijvoorbeeld buprenorfine of meloxicam. Laat het dier niet onbeheerd achter terwijl het bewusteloos is. Plaats de rat in een verwarmde herstelbox totdat hij weer volledig bij bewustzijn is. Keer alleen terug naar de thuiskooi met andere dieren als ze volledig zijn hersteld.
- Volg de institutionele richtlijnen voor postoperatieve zorg- en huisvestingsprocedures voor virale getransfecteerde knaagdieren. Wacht ten minste 2 weken totdat het opsinetransgen voldoende tot expressie is gebracht voordat u met het experiment begint.
OPMERKING: De tijd die nodig is voor transductie is afhankelijk van de afstand en sterkte van de verbinding tussen de pre- en post-synaptische regio's. Voor mPFC tot LEC is 4-6 weken nodig.
2. Bereiding van acute hersenplakken
OPMERKING: Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de bereiding van hersenplakken die in onze handen voldoende is om corticale, hippocampale en thalamische plakjes van hoge kwaliteit van volwassen muizen en ratten te bereiken.
- Bereid de oplossingen voor dissectie voor.
- Vul een bekerglas van 250 ml met ~200 ml ijskoude sucrosesnijdoplossing (189 mM sucrose, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-glucose, 5 mM MgSO4, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 en 0,2 mM CaCl2 gemaakt in ultrapuur water (UPW) met een weerstand van 18,2 MΩ cm bij 25 °C) of een voldoende volume om de vibratomweefselkamer te vullen. Bubbel met carbogen (95% O2, 5% CO2) en houd op ijs.
- Vul een plakverzamelkamer met kunstmatige hersenvocht (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-glucose, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4 en 1 mM MgSO4 gemaakt in UPW) bij kamertemperatuur, bubbeld met carbogen. De snijcollectiekamer14 is op maat gemaakt van een microcentrifugebuisrek dat op een vel nylon gaas is gelijmd en in een bekerglas is geplaatst waarin het wordt ondergedompeld in aCSF (figuur 2A).
- Vul een buis van 50 ml met 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatbuffer (PB; 75,4 mM Na2HPO 4,7H2O en 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
LET OP: PFA is giftig. Te gebruiken in zuurkast.
- Dissectie van de hersenen.
- Verdoof de rat in een inductiekamer met 5% isofluraan totdat de ademhaling langzaam en regelmatig is (~ 1 Hz). Om een voldoende niveau van anesthesietest te garanderen voor de afwezigheid van pedaal- en hoornvliesreflexen.
- Onthoofd het dier met behulp van een guillotine.
- Ontleed snel de hele hersenen zoals eerder beschreven15 en breng over in sucrose-snijoplossing. Voltooi de stap binnen 90 s na onthoofding voor een goede plakkwaliteit en succesvolle opname van de hele cel.
- Pak met een metalen theelepel de hersenen op, gooi overtollige snijoplossing weg en plaats het op een stuk filterpapier op het bankje.
- Gebruik een scalpel of scheermesje, verwijder snel het cerebellum en snijd het cerebrum in het coronale vlak ongeveer halverwege de lengte; de achterste helft is het LEC-weefselblok. Zorg ervoor dat u wat overtollig weefsel opneemt naast het gebied dat moet worden gesneden voor de volgende stappen. Breng zowel dit weefselblok als de rest van de hersenen terug naar de sucrose-snijoplossing.
- Plaats een druppel cyanoacrylaatlijm op een vibratoomweefselstadium. Verdeel het in een dunne laag met een gebied dat iets groter is dan het weefselblok dat in de vorige stap is gemaakt.
- Pak het LEC-weefselblok op met een theelepel, gooi overtollige oplossing weg en breng het over op de lijmpleister zodat de voorste coronale snee zich heeft gehecht.
- Installeer het podium in de vibratome weefselkamer en giet snel een voldoende hoeveelheid sucrose-snijoplossing om het weefsel onder te dompelen; bubbel deze oplossing met carbogen. Richt het LEC-weefselblok met het ventrale oppervlak naar het blad. Hoewel de verlichting van de omgevingsruimte onvoldoende is om de opsin te activeren, vermijdt u het gebruik van extra lichtbronnen die mogelijk op het vibratoom aanwezig zijn.
- Snijd plakjes van 350 μm dikte van ventraal tot dorsaal met behulp van een hoge bladoscillatiesnelheid (100 Hz) en een langzame bladvoortgangssnelheid (0,06 mm / s). Doorgaans kunnen zeven LEC-plakjes per halfrond worden verkregen.
- Breng de segmenten over naar de segmentverzamelingskamer. Breng na voltooiing van het verzamelen van de plakjes de verzamelkamer gedurende 1 uur over naar een waterbad van 34 °C voordat u terugkeert naar kamertemperatuur. Bubbel met carbogen continu. Plakjes zijn voldoende gezond om minstens 6 uur te registreren.
- Plaats de rest van de hersenen gedurende 48 uur in PFA voor post-hoc onderzoek van de injectieplaats (zie rubriek 4).
3. Elektrofysiologie en optogenetische stimulatie
- Identificatie van de doelcel.
- Plaats de plak in een ondergedompelde opnamekamer bij 34 °C doordrenkt met aCSF met een snelheid van 2 ml/min door een peristaltische pomp. Immobiliseer het segment met een segmentanker.
- Navigeer onder het lage vergrotingsobjectief (4x) van een widefieldmicroscoop met behulp van schuine infraroodverlichting naar LEC-laag 5. Meet de afstand van het pialoppervlak tot de benodigde laag.
OPMERKING: Schuine infraroodverlichting werd bereikt door een bijna infrarood LED ongeveer 3 mm onder de coverslip van de opnamekamer te plaatsen onder een hoek van ~ 55 ° ten opzichte van het vlak van de coverslip (figuur 2B). Differentiële interferentiecontrast is een alternatieve en veelgebruikte beeldvormingstechniek voor slice-elektrofysiologie. - Verander naar een wateronderdompelingsdoel met een hoge vergroting (40x) en identificeer piramidale neuronen. Markeer de positie van de cel op het computerscherm met tape.
OPMERKING: De piramidale neuronen hebben een ruwweg driehoekige morfologie met prominente apicale dendrieten die naar het piale oppervlak van de plak projecteren (figuur 3A). De gezondheid van de cellen kan worden beoordeeld door de afwezigheid van een gecondenseerde, zichtbare kern en inspectie van het plasmamembraan dat er glad uit zou moeten zien. Het is onwaarschijnlijk dat duidelijke fluorescerende etikettering van axonen door het opsine-fluorofoor fusie-eiwit zichtbaar zal zijn bij gebruik van een breedveld fluorescentiemicroscoop. Om axonale projecties te visualiseren, voert u immunohistochemie post-hoc uit met behulp van een primair antilichaam tegen de fluorofoor van de opsine en versterkt u met een secundair antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor van dezelfde of vergelijkbare golflengte.
- Vorming van hele-cel patch-klem.
- Fabriceer een micropipette van borosilicaatglas met behulp van een pipettrekker en vul met gefilterde intracellulaire opnameoplossing (120 mM k-gluconaat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA en 0,25% biocytine gemaakt in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Plaats de gevulde micropipette in de elektrodehouder op de hoofdtrap van de patchklemversterker, zodat de elektrodedraad in contact komt met de intracellulaire oplossing.
- Oefen positieve druk uit via de mond door hard in een mondstuk te blazen (zoals een spuit van 1 ml met de zuiger verwijderd) die door slang is aangesloten op de zijpoort van de elektrodehouder en de druk te handhaven door een in-line driewegklep te sluiten. Verhoog het microscoopdoel zodanig dat zich een meniscus vormt en steek de elektrode in de meniscus totdat deze op de microscoop te zien is.
- Open het venster Afdichtingstest in WinLTP16 (of andere acquisitiesoftware/oscilloscoop) en breng met de versterker in de spanningsklemmodus een vierkante puls van 5 mV aan om te bepalen of de pipetweerstand 3-6 MΩ is.
- Benader en raak de geïdentificeerde cel aan met de pipetpunt; dit moet resulteren in een inkeping in het celmembraan (figuur 3A; rechterpaneel) en een kleine toename van de pipetweerstand (0,1 MΩ).
- Laat positieve druk los en oefen negatieve druk uit door matige zuigkracht op het mondstuk toe te passen; dit zou moeten resulteren in een enorme toename van de pipetweerstand (>1000 MΩ). Druk kan nu neutraal worden gelaten. Oefen negatieve druk uit in een geleidelijk toenemende helling totdat het celmembraan scheurt, wat resulteert in transiënten voor de capaciteit van de hele cel.
- Noteer optogenetisch opgeroepen synaptische gebeurtenissen.
- Voer de stroom-klemconfiguratie in.
OPMERKING: In de meeste gevallen is synaptische transmissie over lange afstand glutamaterge, daarom zal registratie op membraanpotentialen dicht bij het chlorideomkeerpotentieel het beste AMPA-receptor (AMPAR) -gemedieerde transmissie isoleren en de meting van eventuele feed-forward inhibitie (FFI) geërfd minimaliseren. Chlorideomkering is afhankelijk van de samenstelling van intracellulaire opnameoplossing en aCSF en kan worden berekend met behulp van de Goldman-Hodgkin-Katz-vergelijking; voor bovenstaande oplossingen was dit -61,3 mV. Laag 5 LEC piramidale neuronen hadden een gemiddeld rustmembraanpotentiaal van -62 mV en werden, waar nodig, op deze potentiaal gehouden door injectie van constante stroom. Als alternatief kunnen cellen worden vastgeklemd aan de gewenste potentiaal. Om langeafstandsremmende projecties16 te registreren of om FFI te registreren, spanningsklem bij kationomkeringspotentiaal om GABAerge chloridegeleiding te isoleren. Wanneer spanningsklemende neuronen op membraanpotentialen boven de actiepotentiaaldrempel liggen, wordt een op cesium gebaseerde intracellulaire oplossing met spanningsafhankelijke natriumkanaalblokkers gebruikt om de spanningsklem te verbeteren en het initiëren van actiepotentialen te voorkomen (130 mM CsMeSO4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 chloride, 4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocytine gemaakt in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). - Met behulp van data-acquisitiesoftware stuurt u transistor-transistorlogica (TTL) -signalen naar een LED-driver om een gemonteerde 470 nm LED te activeren. De gemonteerde LED wordt in het microscooplichtpad geleid met behulp van filterkubussen en geschikte optica (figuur 2B) om lichtpulsen op het segment aan te brengen via het 40x-objectief om optogenetische excitatorische post-synaptische potentialen (oEPSP's) op te roepen.
OPMERKING: Lichtpulsen kunnen perisomatisch /over de dendrieten worden toegepast, wat zal resulteren in activering van opsins in de axonen en presynaptische bouton, of de onderzoeker kan het doel verplaatsen naar axonen weg van de opgenomen cel om over-boutonstimulatie te voorkomen (zie Discussie). Maximale oEPSP-amplitude hangt af van de sterkte van de synaptische projectie, de werkzaamheid van virale injecties en de gebruikte opsine. oEPSP's kunnen worden getitreerd tot de gewenste amplitude door de lichtintensiteit en/of duur18 te variëren; het variëren van de duur van lichtpulsen (typische duur tussen 0,2-5 ms bij maximaal LED-uitgangsvermogen, wat resulteert in 4,4 mW / mm lichtdichtheid19) geeft consistentere oEPSP-amplitudes dan het wijzigen van het uitgangsvermogen van de LED. - Onderzoek presynaptische afgifte-eigenschappen (verandering in spanning) door treinen van meerdere lichtpulsen met verschillende interstimulusintervallen te leveren (figuur 3E); voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van optogenetisch opgewekte overdracht (zie Discussie).
- Onderzoek plasticiteit op lange termijn door herhaaldelijk oEPSP's19 op te roepen of door liganden toe te passen. Controleer de oEPSP-amplitude gedurende 5-10 minuten om stabiliteit te garanderen voordat de plasticiteit wordt geïnduceerd en controleer vervolgens totdat een stabiele amplitude is bereikt (meestal 30-40 minuten).
OPMERKING: De meeste huidige opsins zijn niet in staat om op betrouwbare wijze meerdere actiepotentialen op hoge frequenties op te roepen, bijvoorbeeld 100 stimuli die worden geleverd bij 100 Hz, zoals meestal wordt gebruikt om LTP te induceren. - Om te bevestigen dat oEPSP's monosynaptisch zijn, voert u over-boutonactivering van de getransduceerde route uit door het doel boven het dendritische prieel te plaatsen en te stimuleren in aanwezigheid van 0,5 μM tetrodotoxine en 100 μM aminopyridine. Toepassing van tetrodotoxine zal de transmissie afschaffen als de reacties actiepotentiaalafhankelijk zijn en de daaropvolgende opname van aminopyridine zal de transmissie gedeeltelijk herstellen als de oEPSP's monosynaptisch worden gegenereerd19,20.
- Om biocytine in staat te stellen het neuron te vullen, wacht u ten minste 15 minuten na het invoeren van de configuratie van de hele cel. In spanningsklem, monitor membraancapaciteit en ingangsweerstand.
- Trek de pipet langzaam terug langs de naderingshoek weg van de soma van de cel, waarbij de langzame verdwijning van capaciteitstransiënten en membraanstroom wordt waargenomen, wat wijst op de herafdichting van het celmembraan en de vorming van een buitenste pleister aan de pipetpunt. Noteer de richting van het segment en de locatie van de cel(en) in het segment. Doe de plak in PFA in een 24-wells plaat en incubeer een nacht bij 4 °C en breng vervolgens over naar 0,1 M PB.
OPMERKING: Plakjes kunnen maximaal een week worden bewaard. Als langere opslag nodig is, vervang dan de PB regelmatig of gebruik PB met natriumazide (0,02% -0,2% natriumazide).
- Voer de stroom-klemconfiguratie in.
4. Histologie
- Snij-injectieplaats
- Na fixatie cryoprotecteert u het weefsel in 30% sucrose (w/v) in PB totdat het zinkt (het zal in eerste instantie drijven in de sucrose-oplossing), meestal 's nachts bij kamertemperatuur of 24-48 uur bij 4 °C.
- Bevestig met behulp van een optimaal snijtemperatuur (OCT) medium een blok weefsel aan de cryostat monsterschijf. Vries het weefselblok in volgens de stappen 4.1.3 tot en met 4.1.4.
- Plaats isopentane in een geschikte verpakking. Dompel alleen de monsterschijf onder en zorg ervoor dat het weefsel zich boven het niveau van het isopentaan bevindt. Laat de container met isopentane zakken tot vloeibare stikstof (of droogijs) en laat het weefsel bevriezen.
- Eenmaal volledig bevroren (het hele weefselblok wordt bleek en hard), laat u het weefselblok gedurende 30 minuten in de cryostaatkamer bij -20 °C om de temperatuur van het blok in evenwicht te brengen.
- Snijd 40 μm dikke secties in de cryostaat bij -20 °C. Gebruik een fijne kwast om de secties van het mes te leiden. Hecht bevroren secties aan een kamertemperatuur, poly-L-lysine gecoat, glazen microscoopglaasje door de dia aan de secties aan te raken.
- Voeg ongeveer 150 μL montagemedium toe aan elke dia en dek af met een coverslip; verwijder eventuele luchtbellen door zachtjes op de coverslip te drukken. Bedek de dia's ter bescherming tegen fotobleaching en droog aan de lucht bij kamertemperatuur gedurende ten minste 12 uur (of een nacht). Onderzoek met behulp van een fluorescentiemicroscoop de locatie van de virale injectieplaats.
- Biocytine kleuring protocol
OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast op dikke secties; plakjes hoeven niet opnieuw te worden gesneden.- Was de hersenschijfjes zes keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4) gedurende 10 minuten per wasbeurt. Gebruik een transferpipet om de putjes na elke stap te legen.
- Incubeer de plakjes in 3% H2O2 (w/v) in PBS gedurende 30 minuten om eventuele endogene peroxidase-activiteit te blokkeren. Hierdoor ontstaan zuurstofbellen.
- Was de hersenschijfjes zes keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt of totdat er geen zuurstofbellen meer zichtbaar zijn. Incubeer de hersenschijfjes in 1% (v/v) avidine-gebiotinyleerde HRP complex (ABC) oplossing in PBS met 0,1% (v/v) Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
- Was de hersenschijfjes zes keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt.
- Incubeer elke plak in 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) oplossing gedurende enkele minuten totdat de biocytinekleuring van neuronale structuren zichtbaar wordt (duurt ongeveer 5-10 min).
LET OP: DAB is giftig. Te gebruiken in zuurkast.
OPMERKING: DAB-incubatietijden kunnen onvoorspelbaar zijn, houd het weefsel nauwlettend in de gaten terwijl de kleur zich ontwikkelt. - Stop de reactie door de plakjes over te brengen naar koud (4 °C) PBS. Was de hersenschijfjes zes keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Gebruik een borstel om de hersenplakken op poly-L-lysine gecoate glazen microscoopglaasjes te monteren.
- Verwijder alle overtollige PBS met een schone tissue. Bedek elke plak met ongeveer 200 μL montagemedium; dek af met coverslips en druk zachtjes op de coverslip om luchtbellen naar buiten te duwen. Droog aan de lucht bij kamertemperatuur gedurende ten minste 12 uur (of een nacht). Onderzoek met behulp van een lichtmicroscoop de locatie en morfologische details van de cel (en).
OPMERKING: Biocytine kan ook worden gevisualiseerd met behulp van fluorofoor-geconjugeerde streptavidin; beeldvorming kan echter resectie of het gebruik van een confocale microscoop vereisen21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol beschrijven we hoe we synaptische fysiologie en plasticiteit op lange afstand kunnen bestuderen met behulp van virale afgifte van optogenetische constructen. Het protocol kan heel gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van bijna elke langeafstandsverbinding in de hersenen. Als voorbeeld beschrijven we de injectie van AAV's die coderen voor een opsine in rat mPFC, de bereiding van acute plakjes van LEC, patch-clamp opnames van laag 5 LEC piramidale neuronen en lichtgevoceerde activering van mPFC-terminals in LEC (figuur 1).
Een gezonde piramidale cel werd gelokaliseerd en gepatcht (bijv . Figuur 3A). In het huidige mPFC tot LEC voorbeeld werden de post-synaptische cellen niet gelabeld; als post-synaptische celidentificatie vereist is, moet een cel die de fluorescerende marker tot expressie brengt, worden gelokaliseerd met behulp van widefield-optica (bijv . Figuur 3B). De gezondheid van de cel moet worden beoordeeld door infraroodoptiek voordat er wordt geëxperimenteerd. Om mPFC-axonen in LEC te activeren, werd een LED direct over laag 5-cel soma en proximale dendrieten geplaatst via het microscoopobjectief (figuur 1), enkele lichtpulsen van 2 ms resulteerden in eenvoudige golfvorm oEPSP's (figuur 3C); de piekamplitude van de oEPSP kan worden gemeten. Om de plasticiteit van de synaps op korte termijn te onderzoeken, werden 5, 10 en 20 Hz treinen van lichtstimulatie toegepast (figuur 3E). Om de plasticiteit op lange termijn te onderzoeken, werd na controle van de baseline oEPSP-amplitude gedurende 10 minuten de cholinerge agonist, carbachol, gedurende 10 minuten aan de circulerende aCSF toegevoegd. Dit veroorzaakte langdurige depressie die 40 minuten na verwijdering van het ligand nog steeds duidelijk was (figuur 3D).
Na elektrofysiologische registratie-experimenten werd het hersenweefsel met de virale injectieplaats doorsneden en werd de lengte van de injectieplaats onderzocht (figuur 4A). De fluorescerende verslaggever, mCherry, is gelokaliseerd in de diepere lagen van de prelimbische en infralimbische cortex (samenstellende gebieden van knaagdier mPFC). Deze lagen waren gericht omdat is aangetoond dat de projectie naar LEC voornamelijk afkomstig is van de diepere corticale lagen22. mCherry positieve vezels kunnen ook worden gezien die zich bij het witte stofkanaal voegen. In een proefexperiment om de plaatsing van virale injecties te optimaliseren, werden 40 μm-secties van LEC genomen en onderzocht; mCherry positieve vezels zijn te zien in laag 5 van LEC (figuur 4B). Ten slotte werd de met biocytine gevulde cel gekleurd, waardoor de locatie en morfologie konden worden bevestigd (figuur 4C, D).
Figuur 1: Experimenteel overzicht. (A) Schematische van virale vectorinjectie in de mediale prefrontale cortex (mPFC), transductie van mPFC-cellen met optogenetisch construct en transport van construct naar terminals in de laterale entorhinale cortex (LEC). (B) Schematische weergave van hele celregistratie van laag 5 piramidale neuronen in een acute LEC-plak en lichtactivering van mPFC-terminals via microscoopdoel. Afkortingen: CA = cornu ammonis; PERI = perirhinale cortex; TR = overgangsgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Snijverzamelingskamer en optische configuratie voor gevisualiseerde opnames van hele cellen, optogenetische excitatie en identificatie van tdTomato-positieve neuronen. (A) De snijverzamelingskamer14 is op maat gemaakt van een microcentrifugebuisrek dat op een vel nylon gaas is gelijmd en in een bekerglas is geplaatst waarin het wordt ondergedompeld in aCSF (B) ) LED's voor excitatie van ChR2 (470 nm) en tdTomato (565 nm) worden door een asferische condensorlens naar collimate licht geleid, 565 nm licht wordt door een band-pass filter gestraald om spectrale scheiding van tdTomato excitatie en emissiespectra te bereiken. Deze worden gecombineerd met een langdoorlaatse dichroïsche spiegel en gericht op de plak met een tweede langdoorlaat dichroïsche spiegel van een langere golflengte. Licht wordt vervolgens via de objectieflens op de slice gericht. In experimenten waarbij tdTomato-gelabelde neuronen aanwezig zijn, gaat het uitgezonden fluorescerend licht door de dichroïsche spiegel en het emissiefilter en wordt het door een achromatische lens op de camerasensor gericht. Niet-fluorescerende kenmerken van de plak worden gevisualiseerd door schuin gebroken nabij infrarood (NIR) licht dat van onder de snijkamer wordt aangebracht; dit licht geeft de optiek door aan de camera, waardoor het niet nodig is om filterkubussen te veranderen tussen fluorescerende en NIR-beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van neuronen onder NIR/fluorescentie beeldvorming en representatieve voorbeelden van oEPSP's. (A) Links: Voorbeeld van neuron met piramidale morfologie gevisualiseerd met NIR-licht. Rechts: Hetzelfde neuron met de vorming van concaaf kuiltje veroorzaakt door positieve druk van de patchpipet. (B) Cre-recombinase afhankelijke expressie van tdTomato in een enkel neuron. (C) Representatieve oEPSP van LEC laag 5 in de piramidale cel. (D) Voorbeeld van langetermijnplasticiteitsexperimenten die oEPSP in de loop van de tijd monitoren na toevoeging van 10 μm carbachol (CCh). De stippellijn geeft de gemiddelde oEPSP-amplitude aan tijdens de basislijnperiode vóór de toevoeging van het geneesmiddel. (E) Representatieve sporen van stimulatietreinen bij 5, 10 en 20 Hz. Blauwe pijlen duiden op lichtactivering. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Histologische verificatie van de injectieplaats en herstel van met biocytine gevulde cel. (A) Coronale fotomicrografie met virale injectieplaats in mPFC, +3,00 mm van bregma. (B) Dunne coronale sectie van LEC ter illustratie van mCherry + vezels. (C) Low power beeld van 350 μm dikke acute plak, -6,2 mm van bregma, met biocytine gevulde piramidale cel in LEC. Het onderbroken vak wordt weergegeven bij een hogere vergroting in de piramidale cel D. (D) LEC; de apicale dendriet is rechts van de afbeelding te zien in de richting van laag 1. Stippellijnen geven regionale grenzen aan. Afkortingen: IL = infralimbic cortex; PL = prelimbische cortex; wm = witte stof. Schaalbalken = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode om zeer specifieke synaptische projecties op lange afstand te onderzoeken met behulp van een combinatie van stereotaxische chirurgie om AAV's te leveren die coderen voor optogenetische constructies, en elektrofysiologie in acute hersensegmenten (figuur 1). Samen bieden deze technieken hulpmiddelen om de fysiologie en plasticiteit van hersencircuits met hoge precisie te karakteriseren in langeafstands- en anatomisch diffuse paden die voorheen ontoegankelijk waren met behulp van traditionele, niet-specifieke, elektrische stimulatie. Combinatie met celspecifieke moleculaire markers maakt karakterisering van projecties van het ene hersengebied naar verschillende gedefinieerde celpopulaties in een ander gebiedmogelijk 23.
Om ten volle te profiteren van de zeer nauwkeurige aard van deze techniek, is het essentieel om de specificiteit van het pad te verifiëren. Dit gebeurt in verschillende stappen; zorg er tijdens de opname voor dat de onderzochte synaps mono-synaptisch is (stap 3.3.5). Hierna histologisch onderzoek de injectieplaats om ervoor te zorgen dat het virus beperkt is tot het beoogde pre-synaptische gebied van belang en beoordeel de locatie en morfologie van de biocytine-gekleurde post-synaptische cel om ervoor te zorgen dat deze is zoals verwacht.
Virusselectie en het bereiken van cellulaire specificiteit
De techniek is zeer aanpasbaar en geschikt voor gebruik bij zowel muizen als ratten. Experimenten die anatomische specificiteit vereisen, kunnen worden uitgevoerd met knaagdieren van het wilde type. Experimenten die post-synaptische celtypespecificiteit vereisen, kunnen een genetisch gemodificeerde knaagdierstam vereisen als cellen niet identificeerbaar zijn op basis van morfologie of locatie. Om bijvoorbeeld parvalbumine (PV) te richten dat interneuronen tot expressie brengt, zou een PV-Cre knock-in transgene muislijn kunnen worden gebruikt waarin Cre-recombinase tot expressie komt in PV-expresserende neuronen. Om deze cellen te visualiseren, kan de PV-Cre-lijn worden gekruist met een reportermuislijn om een fluorescerend eiwit tot expressie te brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Als alternatief kan een Cre-afhankelijk fluorescerend reportergen viraal worden geïntroduceerd. ChR2-fluorofoor fusie-eiwitten zijn beperkt tot het celmembraan en kunnen verschijnen als een omtrek van het neuron wanneer ze worden bekeken met widefield-microscopie in acute plakjes, waardoor identificatie van cellen voor registratie van hele cellen uitdagender is dan het gebruik van cytosolische fluoroforen. Als ChR2 wordt gebruikt om cellen te identificeren, kan scheiding van ChR2 en fluorofoor worden bereikt met behulp van bicistronische vectoren24. Als u een fluorescerende reporter gebruikt om doelneuronen te identificeren voor opname van hele cellen, moet de excitatiegolflengte idealiter niet overlappen met de activeringsgolflengte van de opsine; dit voorkomt langdurige activering van getransduceerde afferente stoffen tijdens het zoeken naar neuronen om op te nemen. Evenzo moeten pre- en post-synaptische verslaggevers spectraal gescheiden zijn. Veel voorkomende verslaggevers zijn mCherry, groen fluorescerend eiwit (GFP) en verbeterd geel fluorescerend eiwit (eYFP).
Het gebruikte virale construct heeft verschillende componenten, elk kan van invloed zijn op het succes van het experiment en dus moet er rekening worden gehouden met elk element. Primair belang moet worden gehecht aan de keuze van opsin. Voor presynaptische activering heeft de ideale opsine grote fotostromen (om axonen betrouwbaar tot actie te brengen potentiële drempel), snelle aan- en uit-kinetiek en een langzame snelheid van desensibilisatie om hoogfrequente herhaalde stimulatie mogelijk te maken. In de regel gaat snelle kinetiek vaak ten koste van kleinere fotostromen25; moleculaire screening en engineering hebben opsins echter voorzien van grote fotostromen. Het huidige protocol maakt gebruik van ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12, maar Chronos26, CheRiff27, oChIEFAC28 en ChRmine29 zijn ook geschikt. Bovendien bestaan er exciterende opsins met rood verschoven (ChrimsonR)26 of violet-shifted (CheRiff) activeringsgolflengten, die nodig kunnen zijn om overlapping met excitatiespectra van fluoroforen die worden gebruikt voor celidentificatie te voorkomen (zie hierboven).
Het serotype van AAV's kan van invloed zijn op het vermogen van de vector om verschillende hersengebieden en celtypen te transduceren, evenals de mate van axonaal transport in zowel de anterograde als retrograderichtingen 30. Serotypen die vaak worden gebruikt voor neuronale transductie zijn 1, 2, 5, 8 en 9. Een literatuuronderzoek kan een indicatie geven van welk serotype met succes is gebruikt in een bepaald gebied. AAV9 is bijvoorbeeld aanbevolen voor de transductie van corticale neuronen31.
De promotor maakt de specificatie mogelijk van het celtype waarin de opsin zal worden uitgedrukt. Promotors vallen in verschillende klassen. Algemene promotors, bijvoorbeeld CAG of EF1a, resulteren in expressie in de meeste celtypen. Neuron-specifieke promotoren, bijvoorbeeld synapsine, genereren expressie in alle neurontypen. CaMKIIa wordt vaak gebruikt om expressie te beperken tot exciterende neuronen, hoewel is aangetoond dat het lek is - enige expressie is waargenomen in interneuronen32. Het mDlx enhancer element beperkt de expressie tot GABAerge interneuronen33. Pre-synaptische celtypespecificiteit kan worden bereikt met behulp van een Cre-muislijn (zoals hierboven beschreven voor de post-synaptische cel). In dit geval zal een Cre-afhankelijk genetisch construct nodig zijn om opsine-expressie te beperken tot Cre-expresserende cellen.
Titer is het aantal virale deeltjes in het virale preparaat. Nogmaals, een literatuuronderzoek kan een indicatie geven van een titer die voldoende transductie in een bepaald gebied heeft gegenereerd. Bij gebruik van een Cre-afhankelijk systeem kan de titer bijzonder belangrijk zijn omdat hoge virale titers expressie kunnen transduceren in niet-Cre-tot expressie brengende cellen34.
Optimalisatie van virusafgifte
Nauwkeurige virale levering aan de regio van belang is van cruciaal belang voor deze aanpak. Injectiecoördinaten van het pre-synaptische gebied kunnen worden geschat door de literatuur en/of een hersenatlas voor de juiste soort35,36 te raadplegen. De experimentator moet vervolgens de tijd nemen om de precieze injectiecoördinaten en het gebruikte volume te optimaliseren en te verfijnen om ervoor te zorgen dat de virale injectie beperkt blijft tot hun presynaptische interessegebied. Dit is vooral van cruciaal belang wanneer naburige regio's ook projecteren op de opnamelocatie. We raden aan om kleine hoeveelheden van het virus te gebruiken als een effectieve methode om dit te doen. Als een bijzonder kleine injectieplaats nodig is, kan het gebruik van glazen micropipettes in plaats van een spuit en naald voordelig zijn13. Het laten van de injectienaald gedurende een adequate periode in situ en het langzaam terugtrekken van de injectienaald is van cruciaal belang om te voorkomen dat het virus in het naaldkanaal ontsnapt. Om de nauwkeurigheid van injecties te bevestigen, is het het beste om de injectieplaats van elk dier dat wordt gebruikt, waar mogelijk histologisch te verifiëren door middel van elektrofysiologie en gegevens uit te sluiten wanneer virale transductie buiten het doel ligt. In onze handen heeft het hierboven beschreven protocol bewezen generaliseerbaar te zijn naar veel verschillende langeafstandsverbindingen, waaronder projecties van ventrale midline thalamische kernen, hippocampus, mediodorsale thalamus en LEC naar PFC; projecties van PFC tot LEC en mediodorsale thalamus; projecties van LEC en ventrale midline thalamische kernen naar hippocampus (Zafar Bashir lab, Universiteit van Bristol, ongepubliceerde waarnemingen19). Optogenetische etikettering van deze verschillende routes heeft alleen verfijning van injectiecoördinaten en volumes vereist.
Protocol beperkingen
Snelle dissectie van de hersenen en zorgvuldig snijden zijn van cruciaal belang voor het succes van deze experimenten. Het hier beschreven snijprotocol levert gezonde acute plakjes op zonder aanpassing voor verschillende hersengebieden; variatie in snijmedium en post-slicing incubatietemperatuur zoals elders beschreven28 zijn echter gemeld om de gezondheid van de plak verder te verbeteren. Bovendien hebben we ook acute plakjes uit twee hersengebieden kunnen nemen na virale transductie van een enkel gebied, waardoor het aantal gebruikte dieren is verminderd. We hebben ontdekt dat in anatomisch dichte paden perioden van slechts 7 dagen tussen virale transductie en opname voldoende zijn om robuuste oEPSP's van geschikte grootte op te roepen voor patchklemopnamen van hele cellen. Bij langere of spaarzamere projecties zijn langere vertragingen voordelig.
Voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van de resultaten van optogenetisch opgewekte activiteit, met name met betrekking tot plasticiteit op korte termijn. Eerdere resultaten hebben aangetoond dat optogenetisch opgewekte transmissie meer uitgesproken synaptische depressie kan ondergaan bij herhaalde stimulatie dan elektrische stimulatie, die kan ontstaan als gevolg van een aantal factoren. Ten eerste kan opsinedesensibilisatie25 leiden tot een verminderd aantal presynaptische axonen spiking, wat leidt tot verminderde postsynaptische reacties. De verbeterde kanaalkinetiek van recent ontdekte opsins en degenen die moleculaire engineering hebben ondergaan (zie hierboven) hebben een aanzienlijke weg afgelegd om de effecten van desensibilisatie te verminderen; stimulatie van 100 Hz blijft echter buiten het bereik van veel opsins, wat het gebruik van bepaalde langdurige plasticiteitsinductieprotocollen kan belemmeren (zieechter 37). Ten tweede kan de langzame kinetiek van opsins de actiepotentialen verbreden18, wat leidt tot langdurige zenderafgifte en vesiculaire uitputting; dit kan ook het gevolg zijn van de calciumdoorlaatbaarheid van exciterende opsinen11; deze problemen kunnen worden verzacht door over-bouton foto-activiteit te vermijden38. Ten derde kan transductie van neuronen met behulp van AAV-vectoren ook leiden tot veranderde presynaptische afgifte-eigenschappen in bepaalde synapsen; dit kan echter worden verzacht door het gebruik van het AAV9-serotype38. Ondanks deze beperkingen kan optogenetische activering bij zorgvuldig gebruik elektrische stimulatie19,38 nabootsen en is daarom een waardevol hulpmiddel bij het onderzoeken van de fysiologie van niet-bestudeerde synaptische routes. We merken ook op dat de gegevens in figuur 3E de plasticiteit op korte termijn in de stroomklem beoordelen en daarom onderhevig zijn aan interactie van synaptische potentialen en intrinsieke membraaneigenschappen, dit kan worden vermeden door gelijkwaardige experimenten uit te voeren in spanningsklem.
Toekomstige richtingen
De steeds groter wordende optogenetische toolbox heeft de mogelijkheid verhoogd om deze technologie toe te passen in twee synaptische paden in hetzelfde preparaat, door een paar opsins met divergente excitatiespectra te gebruiken. Dit wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van een opsin ChrimsonR26, die, in tegenstelling tot ChR2, wordt gefotoactiveerd door rood golflengtelicht. ChrimsonR behoudt een lage gevoeligheid voor blauw licht, dus om cross-pathway activering te voorkomen, kan het worden gebruikt in combinatie met rood-ongevoelige opsins, die violet verschoven zijn (CheRiff 27) en / of ordes van grootte hogere gevoeligheid voor blauw licht hebben (Chronos26). Dit maakt het gebruik mogelijk van blauw/violette lichtprikkels die te zwak zijn om ChrimsonR significant te activeren en daarom activering van twee routes39,40 mogelijk maken, wat de experimentele doorvoer kan verhogen, onderzoek van convergente pathway-interacties mogelijk maakt en de afgifte van neuromodulatoren uit endogene bronnen mogelijk maakt41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door Wellcome grant 206401/Z/17/Z. We willen Zafar Bashir bedanken voor zijn deskundige mentorschap en Dr. Clair Booth voor technische assistentie en commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
