Summary
Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.
Abstract
Estudiar las propiedades fisiológicas de sinapsis específicas en el cerebro y cómo sufren cambios plásticos es un desafío clave en la neurociencia moderna. Las técnicas electrofisiológicas in vitro tradicionales utilizan la estimulación eléctrica para evocar la transmisión sináptica. Un inconveniente importante de este método es su naturaleza inespecífica; Todos los axones en la región del electrodo estimulante se activarán, lo que dificulta atribuir un efecto a una conexión aferente particular. Este problema se puede superar reemplazando la estimulación eléctrica con estimulación basada en la optogenética. Describimos un método para combinar la optogenética con registros in vitro de patch-clamp. Esta es una herramienta poderosa para el estudio tanto de la transmisión sináptica basal como de la plasticidad sináptica de conexiones sinápticas precisas definidas anatómicamente y es aplicable a casi cualquier vía en el cerebro. Aquí, describimos la preparación y el manejo de un vector viral que codifica la proteína canalrodopsina para la inyección quirúrgica en una región presináptica de interés (corteza prefrontal medial) en el cerebro de roedores y la fabricación de cortes agudos de regiones diana aguas abajo (corteza entorrinal lateral). También se presenta un procedimiento detallado para combinar las grabaciones de patch-clamp con la activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica a corto y largo plazo. Discutimos ejemplos de experimentos que logran la especificidad de la vía y la célula combinando optogenética y etiquetado celular dependiente de Cre. Finalmente, se describe la confirmación histológica de la región presináptica de interés junto con el etiquetado de biocitina de la célula postsináptica, para permitir una mayor identificación de la ubicación precisa y el tipo de célula.
Introduction
Comprender la fisiología de las sinapsis y cómo sufren cambios plásticos es fundamental para comprender cómo funcionan las redes cerebrales en el cerebro sano1 y cómo funcionan mal en los trastornos cerebrales. El uso de cortes cerebrales agudos ex vivo permite el registro de la actividad eléctrica de las sinapsis de neuronas individuales con una alta relación señal-ruido utilizando grabaciones de pinza de parche de células enteras. El control del potencial de membrana y la manipulación farmacológica directa permiten el aislamiento de los subtipos de receptores. Estos registros pueden realizarse con exquisita especificidad para identificar la neurona postsináptica, incluyendo la posición laminar y subregional2, la morfología celular3, la presencia de marcadores moleculares4, sus proyecciones aferentes5, o incluso si estuvo activa recientemente6.
Sin embargo, lograr la especificidad de las entradas presinápticas es algo más difícil. El método convencional ha utilizado electrodos de estimulación para excitar los axones que corren en una lámina particular. Un ejemplo de esto es en el hipocampo donde la estimulación local en el estrato radiático activa sinapsis que se proyectan desde el CA3 hasta el subcampoCA1 7. En este caso, la especificidad presináptica se logra ya que la entrada CA3 representa la única entrada excitatoria ubicada dentro del estrato radiátum que se proyecta a las células piramidales CA18. Este alto grado de especificidad de entrada alcanzable con la activación presináptica eléctrica convencional de los axones CA3-CA1 es, sin embargo, una excepción que se refleja en el intenso estudio al que ha sido sometida esta sinapsis. En otras regiones del cerebro, los axones de múltiples vías aferentes coexisten en la misma lámina, por ejemplo, en la capa 1 del neocórtex9, lo que hace imposible la estimulación presináptica específica de entrada con electrodos estimulantes convencionales. Esto es problemático ya que diferentes entradas sinápticas pueden tener propiedades fisiológicas divergentes; Por lo tanto, su coestimulación puede conducir a una caracterización errónea de la fisiología sináptica.
El advenimiento de la optogenética, la codificación genética de proteínas de membrana fotosensibles (opsinas) como la canalrodopsina-2 (ChR2), ha permitido una gran expansión de las posibilidades para estudiar proyecciones sinápticas aisladas entre regiones cerebrales10,11. Aquí describimos una solución generalizable y de bajo costo para estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad. Las construcciones optogenéticas se entregan de una manera altamente específica utilizando vectores virales que permiten un control extremadamente preciso de la región presináptica de interés. Las proyecciones eferentes expresarán el canal activado por la luz que permite la activación de estas fibras en una región objetivo. Por lo tanto, se pueden estudiar vías anatómicamente difusas de largo alcance que no pueden activarse independientemente mediante la estimulación eléctrica tradicional no específica.
Describimos, como vía de ejemplo, la transducción de la corteza prefrontal medial (mPFC) con virus adenoasociados (AAV) que codifican opsinas excitatorias de canales catiónicos. Luego describimos la preparación de cortes agudos de la corteza entorrinal lateral (LEC), registros de parche y pinza de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de proyecciones glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). También describimos la evaluación histológica del lugar de inyección para confirmar la ubicación de la región presináptica de interés y la identificación de la morfología celular postsináptica.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido (1986) y las directrices asociadas, así como las directrices institucionales locales.
1. Inyección viral estereotáxica
NOTA: El protocolo actual requiere especificidad anatómica, pero no de tipo celular postsináptico.
- Elige el animal apropiado. En este protocolo se utilizaron ratas con capucha Lister macho de tipo salvaje (300-350 g, aproximadamente 3 meses de edad).
- Elija la construcción viral adecuada. Hay varios factores a considerar (ver Discusión). El protocolo actual utiliza un virus para expresar el canal optogenético ChETATC 12, para transducir neuronas excitadoras (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; título: 3.3 x10 13 genomas virales/mL).
- Establecer las coordenadas y el volumen de inyección utilizando un atlas cerebral como se describió anteriormente35.
- Inyección estereotáxica de la preparación viral
NOTA: Deben seguirse todas las directrices nacionales e institucionales pertinentes para el uso y cuidado de los animales. Los vectores virales se inyectan estereotaxicamente como se describió anteriormente13 con las siguientes modificaciones.- Mantenga la preparación viral en hielo durante la anestesia y la preparación del animal.
- Inducir anestesia en una cámara de inducción anestésica con isoflurano al 4%. Controle el nivel de anestesia indicado por una frecuencia respiratoria regular más lenta (1 Hz) y la ausencia de reflejos pedaleales y corneales (prueba pellizcando los dedos de los pies y tocando ligeramente la esquina del ojo, respectivamente; no se debe detectar respuesta).
- Administrar analgésico preoperatorio como meloxicam al menos 30 minutos antes del procedimiento invasivo.
- Cuando el animal esté completamente anestesiado, use tijeras para eliminar el pelaje del cuero cabelludo. Cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz del marco estereotáxico y monte la rata en el marco. Aplique gel lubricante para los ojos en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento.
- La cirugía debe realizarse en condiciones asépticas. Use guantes e instrumentos estériles durante todo el procedimiento. Aplique ungüento de lidocaína (5% p/p) antes de desinfectar el cuero cabelludo con solución de clorhexidina al 4% p/v, y luego cubra el cuerpo con un paño estéril. Usando un bisturí, haga una incisión longitudinal de aproximadamente 15 mm de longitud en el cuero cabelludo para exponer el bregma.
- Cargue una jeringa Hamilton en una bomba de jeringa de microinyección conectada a un brazo móvil montado en el marco estereotáxico.
- Coloque una alícuota de 5 μL del virus en un tubo de 0,2 ml y gire durante unos segundos hasta que todo el volumen esté en el fondo del tubo. Pipetear 2 μL de la preparación viral en la tapa del tubo.
- Llene la jeringa con la preparación viral observando primero la punta de la aguja con un microscopio quirúrgico, y luego coloque manualmente el bolo del virus en la punta de la aguja y retire el émbolo de la jeringa usando los controles de la bomba.
- Ajuste el volumen de inyección de la bomba a 300 nL y el caudal a 100 nL/min. Haga funcionar la bomba y confirme el flujo adecuado observando la gota del virus en la punta de la aguja. Absorba el virus en un bastoncillo de algodón y limpie suavemente la aguja con etanol al 70%.
- Usando los tornillos del ajustador en el marco estereotáxico, navegue por la punta de la aguja hasta bregma (el punto en el cráneo donde se encuentran las suturas coronal y sagital) y tome nota de las mediciones estereotáxicas observadas en las tres escalas vernier en el marco. Las coordenadas relativas al bregma de mPFC de rata son anterior-posterior + 3,1 mm, mediolateral ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; Sume/reste (como se indica) estas distancias desde las coordenadas Bregma, y luego navegue la aguja hasta las coordenadas anterior-posterior y mediolateral y baje suavemente la aguja sobre la superficie del cráneo.
NOTA: Las coordenadas mPFC dadas anteriormente son apropiadas para ratas macho con capucha de 300-350 g; los cambios en la cepa de rata, el tamaño pueden requerir alteraciones en estas coordenadas (ver Discusión). - Levante la aguja de la superficie del cráneo y marque este punto con un rotulador permanente de punta fina. Haga un orificio de rebabas en este punto usando un micro taladro montado en el brazo estereotáxico.
- Inserte la aguja en el cerebro en la coordenada dorsoventral predeterminada e infunda un volumen predeterminado (para mPFC: 300 nL). Deje la aguja in situ durante 10 minutos para permitir la difusión del bolo. Al retirar la aguja, encienda la bomba para asegurarse de que la aguja no esté bloqueada.
NOTA: Inserte y retire la aguja lentamente (~ 3 mm / min) para minimizar el daño al tejido cerebral y el reflujo del virus hacia el tracto de la aguja. - Administrar 2,5 ml de solución calentada de cloruro de sodio (0,9% p/v) y glucosa (5% p/v) por vía subcutánea para mantener la hidratación.
- Repita el paso 1.4.12. para el segundo hemisferio.
- Suture la incisión del cuero cabelludo y, al finalizar el procedimiento, administre 2,5 ml de solución de cloruro de sodio y glucosa y un analgésico apropiado, recomendado institucionalmente, para el manejo del dolor, por ejemplo, buprenorfina o meloxicam. No deje al animal desatendido mientras esté inconsciente. Coloque la rata en una caja de recuperación calentada hasta que recupere completamente la conciencia. Solo regrese a la jaula de la casa con otros animales una vez que esté completamente recuperado.
- Siga las pautas institucionales para el cuidado postoperatorio y los procedimientos de alojamiento para roedores transfectados por virus. Espere al menos 2 semanas para que el transgén opsina se exprese adecuadamente antes de comenzar el experimento.
NOTA: El tiempo requerido para la transducción depende de la distancia y la fuerza de la conexión entre las regiones pre y post-sináptica. Para mPFC a LEC, se requieren 4-6 semanas.
2. Preparación de cortes cerebrales agudos
NOTA: Aquí describimos un método simple para la preparación de cortes de cerebro que en nuestras manos es suficiente para lograr cortes corticales, hipocampales y talámicos de alta calidad de ratones y ratas adultos.
- Preparar las soluciones para la disección.
- Llene un vaso de precipitados de 250 ml con ~200 ml de solución de corte de sacarosa helada (189 mM de sacarosa, 26 mM NaHCO 3, 10 mM de D-glucosa, 5 mM de MgSO 4,3 mM de KCl, 1,25 mM deNaH2PO4 y 0,2 mM de CaCl 2 fabricados en agua ultrapura (UPW) con resistividad de 18,2 MΩ cm a 25 °C) o un volumen suficiente para llenar la cámara de tejido del vibratomo. Burbuja con carbógeno (95% O2, 5%CO2) y mantener en hielo.
- Llene una cámara de recolección de cortes con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucosa,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1.25 mM NaH2 PO 4 y 1 mM MgSO4 fabricado en UPW) a temperatura ambiente, burbujeado con carbogen. La cámara de recolección de rodajas14 está hecha a medida de una rejilla de tubos de microcentrífuga pegada a una lámina de malla de nylon y colocada en un vaso de precipitados en el que se sumerge en un CSF (Figura 2A).
- Llene un tubo de 50 ml con paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón fosfato (PB; 75,4 mM Na2 HPO 4,7H2O y 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
PRECAUCIÓN: PFA es tóxico. Usar en campana extractora.
- Disección del cerebro.
- Anestesiar a la rata en una cámara de inducción usando isoflurano al 5% hasta que la respiración sea lenta y regular (~1 Hz). Asegurar un nivel suficiente de prueba de anestesia para la ausencia de pedales y reflejos corneales.
- Decapitar al animal usando una guillotina.
- Diseccionar rápidamente todo el cerebro como se describió anteriormente15 y transferirlo a una solución de corte de sacarosa. Complete el paso dentro de los 90 s posteriores a la decapitación para obtener una buena calidad de corte y una grabación exitosa de células completas.
- Con una cucharadita de metal, levante el cerebro, deseche el exceso de solución de corte y colóquelo en un pedazo de papel de filtro en la mesa de trabajo.
- Con un bisturí o una cuchilla de afeitar, retire rápidamente el cerebelo y corte el cerebro en el plano coronal aproximadamente a la mitad de su longitud; la mitad posterior es el bloque de tejido LEC. Asegúrese de incluir un poco de exceso de tejido además de la región a cortar para los próximos pasos. Devuelva tanto este bloque de tejido como el resto del cerebro a la solución de corte de sacarosa.
- Coloque una gota de pegamento de cianoacrilato sobre una etapa de tejido de vibratomo. Extiéndalo en una capa delgada con un área ligeramente más grande que el bloque de tejido creado en el paso anterior.
- Recoja el bloque de tejido LEC con una cucharadita, deseche el exceso de solución y transfiéralo al parche de pegamento de manera que el corte coronal anterior se haya adherido.
- Instale la etapa en la cámara de tejido de vibratomo y vierta rápidamente una cantidad suficiente de solución de corte de sacarosa para sumergir el tejido; Burbuja esta solución con Carbogen. Oriente el bloque de tejido LEC con la superficie ventral hacia la cuchilla. Si bien la iluminación ambiental de la habitación es insuficiente para activar la opsina, evite usar fuentes de luz adicionales que puedan estar presentes en el vibratomo.
- Corte cortes de 350 μm de espesor de ventral a dorsal utilizando una alta velocidad de oscilación de la hoja (100 Hz) y una velocidad de avance lenta de la hoja (0,06 mm/s). Típicamente, se pueden obtener siete rebanadas LEC por hemisferio.
- Transfiera las rodajas a la cámara de recolección de rebanadas. Una vez finalizada la recolección de rodajas, transfiera la cámara de recolección a un baño de agua a 34 °C durante 1 h antes de volver a la temperatura ambiente. Burbuja con carbogen continuamente. Las rodajas estarán lo suficientemente sanas para grabar durante al menos 6 h.
- Colocar el resto del cerebro en PFA durante 48 h para el examen post-hoc del lugar de inyección (ver sección 4).
3. Electrofisiología y estimulación optogenética
- Identificación de la célula diana.
- Colocar el corte en una cámara de grabación sumergida a 34 °C perfundida con aCSF a una velocidad de 2 mL/min mediante una bomba peristáltica. Inmovilice la rebanada con un anclaje de rebanada.
- Bajo el objetivo de bajo aumento (4x) de un microscopio de campo amplio que utiliza iluminación infrarroja oblicua, navegue hasta la capa 5 de LEC. Mida la distancia desde la superficie pial hasta la capa requerida.
NOTA: La iluminación infrarroja oblicua se logró colocando un LED infrarrojo cercano aproximadamente 3 mm por debajo del cubreobjetos de la cámara de grabación en un ángulo de ~55° con respecto al plano del cubreobjetos (Figura 2B). El contraste de interferencia diferencial es una técnica de imagen alternativa y comúnmente utilizada para la electrofisiología de corte. - Cambiar a un objetivo de inmersión en agua de alto aumento (40x) e identificar neuronas piramidales. Marque la posición de la celda en el monitor de la computadora con cinta adhesiva.
NOTA: Las neuronas piramidales tienen una morfología aproximadamente triangular con dendritas apicales prominentes que se proyectan hacia la superficie pial del corte (Figura 3A). La salud celular puede evaluarse mediante la ausencia de un núcleo condensado y visible y la inspección de la membrana plasmática que debe aparecer lisa. Es poco probable que el marcado fluorescente claro de los axones por la proteína de fusión opsina-fluoróforo sea visible cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Para visualizar proyecciones axonales, realice inmunohistoquímica post-hoc utilizando un anticuerpo primario contra el fluoróforo de la opsina y amplíe con un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo de la misma longitud de onda o similar.
- Formación de patch-clamp de células enteras.
- Fabricar una micropipeta de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de pipeta y llenar con una solución de registro intracelular filtrada (120 mM k-gluconato, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA y 0,25% de biocitina producida en UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Coloque la micropipeta llena en el soporte del electrodo en el cabezal del amplificador de abrazadera de conexión, asegurándose de que el cable del electrodo esté en contacto con la solución intracelular.
- Aplique presión positiva por la boca soplando con fuerza en una boquilla (como una jeringa de 1 ml sin émbolo) conectada por un tubo al puerto lateral del soporte del electrodo y mantenga la presión cerrando una válvula de tres vías en línea. Eleve el objetivo del microscopio de tal manera que se forme un menisco e inserte el electrodo en el menisco hasta que se pueda ver en el microscopio.
- Abra la ventana Prueba de sellado en WinLTP16 (u otro software de adquisición/osciloscopio) y con el amplificador en el modo de pinza de voltaje, aplique un pulso cuadrado de 5 mV para determinar si la resistencia de la pipeta es de 3-6 MΩ.
- Acérquese y toque la celda identificada con la punta de la pipeta; esto debería dar lugar a una hendidura en la membrana celular (Figura 3A; panel derecho) y un pequeño aumento de la resistencia de la pipeta (0,1 MΩ).
- Libere la presión positiva y aplique presión negativa aplicando succión moderada en la boquilla; esto debería resultar en un gran aumento en la resistencia de la pipeta (>1000 MΩ). La presión ahora se puede dejar neutral. Aplique presión negativa en una rampa que aumente gradualmente hasta que la membrana celular se rompa, lo que resulta en transitorios de capacitancia de células enteras.
- Registrar eventos sinápticos evocados optogenéticamente.
- Introduzca la configuración de abrazadera de corriente.
NOTA: En la mayoría de los casos, la transmisión sináptica de largo alcance es glutamatérgica, por lo tanto, el registro en potenciales de membrana cercanos al potencial de reversión del cloruro aislará mejor la transmisión mediada por el receptor AMPA (AMPAR) y minimizará la medición de cualquier inhibición de alimentación (FFI) evocada. La reversión del cloruro depende de la composición de la solución de registro intracelular y del LCRa y se puede calcular mediante la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz; para las soluciones anteriores, esto fue de -61.3 mV. Las neuronas piramidales LEC de capa 5 tenían un potencial de membrana en reposo promedio de -62 mV y, cuando fue necesario, se mantuvieron en este potencial mediante inyección de corriente constante. Alternativamente, las celdas se pueden sujetar al voltaje al potencial deseado. Para registrar proyecciones inhibitorias de largo alcance16 o para registrar FFI, pinza de voltaje en el potencial de reversión catiónica para aislar la conductancia del cloruro GABAérgico. Cuando las neuronas de pinzamiento de voltaje en potenciales de membrana por encima del umbral de potencial de acción, se utiliza una solución intracelular a base de cesio que contiene bloqueadores de los canales de sodio dependientes de voltaje para mejorar la pinza de voltaje y prevenir el inicio de potenciales de acción (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloruro,4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, 0.25% biocitina producida en UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm). - Usando el software de adquisición de datos, envíe señales de lógica de transistor-transistor (TTL) a un controlador LED para activar un LED de 470 nm montado. El LED montado se dirige a la trayectoria de la luz del microscopio utilizando cubos de filtro y óptica apropiada (Figura 2B) para aplicar pulsos de luz a la rebanada a través del objetivo 40x para evocar potenciales postsinápticos excitatorios optogenéticos (oEPSP).
NOTA: Los pulsos de luz se pueden aplicar perisomáticamente / sobre las dendritas, lo que resultará en la activación de opsinas en los axones y el bouton presináptico, o el investigador puede mover el objetivo a los axones lejos de la célula registrada para evitar la estimulación excesiva (ver Discusión). La amplitud máxima de oEPSP depende de la fuerza de la proyección sináptica, la eficacia de las inyecciones virales y la opsina utilizada. Los oEPSP pueden ajustarse a la amplitud deseada variando la intensidad de la luz y/o la duración18; variar la duración de los pulsos de luz (duración típica entre 0,2-5 ms a la potencia máxima de salida del LED, lo que resulta en una densidad de luz de 4,4 mW / mm19) proporciona amplitudes oEPSP más consistentes que alterar la potencia de salida del LED. - Investigar las propiedades de liberación presináptica (cambio en el voltaje) mediante la entrega de trenes de múltiples pulsos de luz con diferentes intervalos interestímulo (Figura 3E); Se debe tener cuidado al interpretar la transmisión optogenéticamente evocada (ver Discusión).
- Investigar la plasticidad a largo plazo, ya sea evocando repetidamente oEPSPs19 o aplicando ligandos. Monitoree la amplitud de oEPSP durante 5-10 min para garantizar la estabilidad antes de la inducción de la plasticidad, y luego monitoree hasta que se alcance una amplitud estable (típicamente 30-40 min).
NOTA: La mayoría de las opsinas actuales no son capaces de evocar de manera confiable múltiples potenciales de acción a altas frecuencias, por ejemplo, 100 estímulos entregados a 100 Hz, como se usa típicamente para inducir LTP. - Para confirmar que los oEPSP son monosinápticos, realice la activación por encima de la vía transducida posicionando el objetivo sobre el cenador dendrítico y estimulando en presencia de tetrodotoxina 0,5 μM y aminopiridina 100 μM. La aplicación de tetrodotoxina abolirá la transmisión si las respuestas son dependientes del potencial de acción y la inclusión posterior de aminopiridina restaurará parcialmente la transmisión si los oEPSP se generan monosinápticamente19,20.
- Para permitir que la biocitina llene la neurona, espere al menos 15 minutos después de ingresar a la configuración de células completas. En voltaje-abrazadera, monitoree la capacitancia de la membrana y la resistencia de entrada.
- Retire lentamente la pipeta a lo largo del ángulo de aproximación lejos del soma de la célula, observando la lenta desaparición de los transitorios de capacitancia y la corriente de membrana que indica el nuevo sellado de la membrana celular y la formación de un parche de afuera hacia afuera en la punta de la pipeta. Tenga en cuenta la orientación del sector y la ubicación de las celdas dentro del sector. Poner la rodaja en PFA en una placa de 24 pocillos e incubar durante la noche a 4 °C, y luego transferir a 0,1 M PB.
NOTA: Las rebanadas se pueden almacenar hasta por una semana. Si se requiere un almacenamiento más prolongado, cambie el PB regularmente o use PB que contenga azida de sodio (0.02% -0.2% de azida de sodio).
- Introduzca la configuración de abrazadera de corriente.
4. Histología
- Lugar de inyección de corte
- Después de la fijación, crioproteger el tejido en sacarosa al 30% (p/v) en PB hasta que se hunda (inicialmente flotará en la solución de sacarosa), generalmente durante la noche a temperatura ambiente o 24-48 h a 4 °C.
- Usando un medio de temperatura de corte óptima (OCT), conecte un bloque de tejido al disco de la muestra de criostato. Congelar el bloque de tejido siguiendo los pasos 4.1.3 a 4.1.4.
- Coloque el isopentano en un recipiente apropiado. Sumerja solo el disco de la muestra, asegurándose de que el tejido esté por encima del nivel del isopentano. Baje el recipiente de isopentano en nitrógeno líquido (o hielo seco) y permita que el tejido se congele.
- Una vez completamente congelado (todo el bloque de tejido se vuelve pálido y duro), deje el bloque de tejido en la cámara de criostato a -20 ° C durante 30 minutos para permitir que la temperatura del bloque se equilibre.
- Cortar secciones de 40 μm de espesor en el criostato a -20 °C. Use un pincel fino para guiar las secciones de la hoja. Adhiera las secciones congeladas a un portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de poli-L-lisina a temperatura ambiente tocando el portaobjetos con las secciones.
- Agregue alrededor de 150 μL de medio de montaje a cada diapositiva y cubra con un cubreobjetos; Retire cualquier burbuja de aire presionando suavemente el cubreobjetos. Cubra los portaobjetos para protegerlos contra el fotoblanqueo y seque al aire a temperatura ambiente durante al menos 12 h (o durante la noche). Usando un microscopio de fluorescencia, examine la ubicación del sitio de inyección viral.
- Protocolo de tinción de biocitina
NOTA: Este protocolo se puede aplicar a secciones gruesas; No es necesario volver a seccionar los sectores.- Lave las rodajas de cerebro con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4y 1.8 mM KH2PO4) seis veces durante 10 minutos por lavado. Utilice una pipeta de transferencia para vaciar los pocillos después de cada paso.
- Incubar las rodajas en 3%H2O2(p/v) en PBS durante 30 min para bloquear cualquier actividad peroxidasa endógena. Esto genera burbujas de oxígeno.
- Lave las rebanadas de cerebro con PBS seis veces durante 10 minutos por lavado o hasta que no se vean más burbujas de oxígeno. Incubar las rodajas de cerebro en una solución de complejo HRP (ABC) de avidina-biotinilada al 1% (v/v) en PBS que contenga 0,1% (v/v) de Triton X-100 a temperatura ambiente durante 3 h.
- Lave las rebanadas de cerebro con PBS seis veces durante 10 minutos por lavado.
- Incubar cada rodaja en solución de 3,3′-diaminobencidina (DAB) durante varios minutos hasta que se haga visible la tinción biocitina de las estructuras neuronales (toma alrededor de 5-10 min).
PRECAUCIÓN: DAB es tóxico. Usar en campana extractora.
NOTA: Los tiempos de incubación de DAB pueden ser impredecibles, monitoree el tejido de cerca a medida que se desarrolla el color. - Detenga la reacción transfiriendo las rodajas a PBS frío (4 °C). Lave las rebanadas de cerebro con PBS seis veces durante 10 minutos por lavado. Use un cepillo para montar las rodajas de cerebro en portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de poli-L-lisina.
- Retire todo el exceso de PBS con un pañuelo limpio. Cubra cada rodaja con aproximadamente 200 μL de medio de montaje; Cubra con cubreobjetos y presione suavemente el cubreobjetos para expulsar las burbujas de aire. Secar al aire a temperatura ambiente durante al menos 12 h (o durante la noche). Usando un microscopio óptico, examine la ubicación y los detalles morfológicos de la(s) célula(s).
NOTA: La biocitina se puede visualizar alternativamente utilizando estreptavidina conjugada con fluoróforos; Sin embargo, las imágenes pueden requerir resección o el uso de un microscopio confocal21.
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Representative Results
En este protocolo, describimos cómo estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad utilizando la administración viral de construcciones optogenéticas. El protocolo se puede adaptar muy fácilmente para estudiar casi cualquier conexión de largo alcance en el cerebro. Como ejemplo, describimos la inyección de AAV que codifican una opsina en mPFC de rata, la preparación de cortes agudos de LEC, registros de patch-clamp de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de terminales mPFC en LEC (Figura 1).
Se localizó y parcheó una célula piramidal sana (por ejemplo, Figura 3A). En el presente ejemplo de mPFC a LEC, las células postsinápticas no fueron marcadas; si se requiere la identificación celular postsináptica, una célula que exprese el marcador fluorescente debe localizarse utilizando óptica de campo amplio (por ejemplo, Figura 3B). La salud de la célula debe ser evaluada por óptica infrarroja antes de la experimentación. Para activar los axones mPFC en LEC, se colocó un LED directamente sobre soma de células de capa 5 y dendritas proximales a través del objetivo del microscopio (Figura 1), pulsos de luz individuales de 2 ms dieron como resultado oEPSP de forma de onda simple (Figura 3C); se puede medir la amplitud máxima del oEPSP. Para examinar la plasticidad a corto plazo de la sinapsis, se aplicaron trenes de estimulación lumínica de 5, 10 y 20 Hz (Figura 3E). Para investigar la plasticidad a largo plazo, después de monitorizar la amplitud basal de la EPSP durante 10 min, el agonista colinérgico, carbacol, se añadió al aCSF circulante durante 10 min. Esto causó depresión a largo plazo que todavía era evidente 40 minutos después de la eliminación del ligando (Figura 3D).
Después de los experimentos de registro electrofisiológico, se seccionó el tejido cerebral que contenía el sitio de inyección viral y se examinó la longitud del sitio de inyección (Figura 4A). El reportero fluorescente, mCherry, se localiza en las capas más profundas de la corteza prelímbica e infralímbica (regiones constituyentes de mPFC de roedores). Estas capas fueron atacadas ya que se ha demostrado que la proyección a LEC se origina predominantemente en las capas corticales más profundas22. También se pueden ver fibras positivas de mCherry uniéndose al tracto de la sustancia blanca. En un experimento piloto para optimizar la colocación de inyecciones virales, se tomaron y examinaron secciones de 40 μm de LEC; Las fibras positivas de mCherry se pueden ver en la capa 5 de LEC (Figura 4B). Finalmente, se tiñó la célula llena de biocitina, lo que permitió confirmar su localización y morfología (Figura 4C, D).
Figura 1: Visión general experimental. (A) Esquema de inyección de vectores virales en la corteza prefrontal medial (mPFC), transducción de células mPFC con construcción optogenética y transporte de constructo a terminales en la corteza entorrinal lateral (LEC). (B) Representación esquemática del registro de células completas de neuronas piramidales de capa 5 en un corte LEC agudo y activación de luz de terminales mPFC a través de un objetivo de microscopio. Abreviaturas: CA = cornu ammonis; PERI = corteza perirrinal; TR = región de transición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cámara de recolección de cortes y configuración óptica para registros visualizados de células completas, excitación optogenética e identificación de neuronas tdTomato positivas. (A) La cámara de recolección de rodajas14 está hecha a medida de un estante de tubos de microcentrífuga pegado a una lámina de malla de nylon y colocado en un vaso de precipitados en el que se sumerge en aCSF (B ) Los LED para la excitación de ChR2 (470 nm) y tdTomato (565 nm) se dirigen a través de una lente de condensador asférica para colimar la luz, la luz de 565 nm se emite a través de un filtro de paso de banda para lograr la separación espectral de los espectros de excitación y emisión de tdTomato. Estos se combinan con un espejo dicroico de paso largo y se dirigen hacia la rebanada con un segundo espejo dicroico de paso largo de una longitud de onda más larga. La luz se enfoca en la rebanada a través de la lente del objetivo. En experimentos donde las neuronas marcadas con tdTomato están presentes, la luz fluorescente emitida pasa a través del espejo dicroico y el filtro de emisión y se enfoca en el sensor de la cámara mediante una lente acromática. Las características no fluorescentes de la rebanada se visualizan mediante luz infrarroja cercana refractada oblicua (NIR) aplicada desde debajo de la cámara de corte; esta luz pasa la óptica a la cámara, lo que elimina la necesidad de cambiar los cubos de filtro entre imágenes fluorescentes y NIR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización de neuronas bajo imágenes NIR/fluorescentes y ejemplos representativos de oEPSP. (A) Izquierda: Ejemplo de neurona con morfología piramidal visualizada con luz NIR. Derecha: Misma neurona con la formación de hoyuelos cóncavos causada por la presión positiva de la pipeta del parche. (B) Cre-recombinasa dependiente de la expresión de tdTomato en una sola neurona. (C) OEPSP representativo de LEC capa 5 en la célula piramidal. (D) Ejemplo de experimento de plasticidad a largo plazo monitoreando oEPSP a lo largo del tiempo después de la adición de carbachol (CCh) de 10 μm. La línea punteada indica la amplitud promedio de oEPSP durante el período basal antes de la adición del fármaco. (E) Trazas representativas de trenes de estimulación a 5, 10 y 20 Hz. Las flechas azules denotan activación de la luz. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Verificación histológica del lugar de inyección y recuperación de células llenas de biocita. (A) Fotomicrografía coronal que muestra el sitio de inyección viral en mPFC, +3.00 mm de bregma. (B) Sección coronal delgada de LEC que ilustra fibras mCherry+. (C) Imagen de baja potencia de corte agudo de 350 μm de espesor, -6,2 mm de bregma, con célula piramidal llena de biocitina en LEC. El cuadro discontinuo se muestra con mayor aumento en D. (D) celda piramidal LEC; La dendrita apical se puede ver a la derecha de la imagen que se dirige hacia la capa 1. Las líneas discontinuas denotan fronteras regionales. Abreviaturas: IL = corteza infralímbica; PL = corteza prelímbica; wm = materia blanca. Barras de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado aquí describe un método para explorar proyecciones sinápticas de largo alcance altamente específicas utilizando una combinación de cirugía estereotáxica para administrar AAV que codifican construcciones optogenéticas y electrofisiología en cortes cerebrales agudos (Figura 1). Juntas, estas técnicas ofrecen herramientas para caracterizar la fisiología y la plasticidad de los circuitos cerebrales con alta precisión en vías de largo alcance y anatómicamente difusas que antes eran inaccesibles utilizando la estimulación eléctrica tradicional, no específica. La combinación con marcadores moleculares específicos de células permite caracterizar proyecciones de una región del cerebro a diferentes poblaciones celulares definidas en otra región23.
Para aprovechar al máximo la naturaleza altamente precisa de esta técnica, es esencial verificar la especificidad de la vía. Esto se hace en varios pasos; Durante la grabación, asegúrese de que la sinapsis bajo investigación es monosináptica (paso 3.3.5). Después de esto, examine histológicamente el sitio de inyección para asegurarse de que el virus esté confinado a la región presináptica de interés prevista y evalúe la ubicación y morfología de la célula postsináptica teñida de biocitina para asegurarse de que sea como se anticipó.
Selección de virus y logro de la especificidad celular
La técnica es altamente adaptable y adecuada para su uso tanto en ratones como en ratas. Los experimentos que requieren especificidad anatómica se pueden realizar con roedores de tipo salvaje. Los experimentos que requieren especificidad de tipo de célula postsináptica pueden requerir una cepa de roedor genéticamente modificada si las células no son identificables en función de la morfología o la ubicación. Por ejemplo, para dirigirse a las interneuronas que expresan parvalbúmina (PV), se podría usar una línea de ratón transgénico PV-Cre en la que la Cre-recombinasa se expresa en neuronas que expresan PV. Para visualizar estas células, la línea PV-Cre se puede cruzar con una línea de ratón reportero para expresar una proteína fluorescente después de la recombinación mediada por Cre. Alternativamente, un gen reportero fluorescente dependiente de Cre puede introducirse viralmente. Las proteínas de fusión ChR2-fluoróforo están restringidas a la membrana celular y pueden aparecer como un contorno de la neurona cuando se observan con microscopía de campo amplio en cortes agudos, lo que hace que la identificación de células para el registro de células completas sea más difícil que el uso de fluoróforos citosólicos. Si ChR2 está siendo utilizado para identificar células, la separación de ChR2 y fluoróforo puede lograrse utilizando vectores bicistrónicos24. Si se utiliza un reportero fluorescente para identificar neuronas diana para el registro de células completas, su longitud de onda de excitación idealmente no debería superponerse con la longitud de onda de activación de la opsina; Esto evitará la activación prolongada de aferentes transducidos mientras se buscan neuronas para registrar. Del mismo modo, los reporteros pre y post-sinápticos deben estar espectralmente separados. Los reporteros comunes son mCherry, proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP).
La construcción viral utilizada tiene varios componentes diferentes, cada uno puede afectar el éxito del experimento y, por lo tanto, se debe considerar cada elemento. Se debe dar una importancia primordial a la elección de la opsina. Para la activación presináptica, la opsina ideal tiene grandes fotocorrientes (para llevar de manera confiable los axones al umbral de potencial de acción), cinética rápida de encendido y apagado, y una tasa lenta de desensibilización para permitir la estimulación repetida de alta frecuencia. Como regla general, la cinética rápida a menudo tiene el costo de fotocorrientes más pequeñas25; Sin embargo, el cribado molecular y la ingeniería han proporcionado a las opsinas grandes fotocorrientes. El protocolo actual utiliza ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12, sin embargo, Chronos 26, CheRiff27, oChIEFAC28 y ChRmine29 también son adecuados. Además, existen opsinas excitatorias con longitudes de onda de activación desplazadas al rojo (ChrimsonR)26 o violetas (CheRiff), que pueden ser necesarias para evitar la superposición con los espectros de excitación de los fluoróforos utilizados para la identificación celular (ver arriba).
El serotipo de los AAV puede afectar la capacidad del vector para transducir diferentes regiones cerebrales y tipos de células, así como la extensión del transporte axonal tanto en la dirección anterógrada como retrógrada30. Los serotipos comúnmente utilizados para la transducción neuronal son 1, 2, 5, 8 y 9. Una búsqueda bibliográfica puede dar una indicación de qué serotipo se ha utilizado con éxito en una región determinada. Por ejemplo, AAV9 ha sido recomendado para la transducción de neuronas corticales31.
El promotor permite la especificación del tipo de célula en la que se expresará la opsina. Los promotores se dividen en varias clases. Los promotores generales, por ejemplo, CAG o EF1a, dan como resultado la expresión en la mayoría de los tipos de células. Los promotores específicos de neuronas, por ejemplo, la sinapsina, generan expresión en todos los tipos de neuronas. CaMKIIa se usa comúnmente para restringir la expresión a las neuronas excitadoras, aunque se ha demostrado que tiene fugas; se ha observado cierta expresión en las interneuronas32. El elemento potenciador mDlx limita la expresión a las interneuronas GABAérgicas33. La especificidad del tipo de célula presináptica se puede lograr utilizando una línea Cre-ratón (como se describió anteriormente para la célula postsináptica). En este caso, se requerirá una construcción genética dependiente de Cre para limitar la expresión de opsinas a las células que expresan Cre.
El título es el número de partículas virales en la preparación viral. Una vez más, una búsqueda bibliográfica puede dar una indicación de un título que ha generado suficiente transducción en una región particular. Cuando se utiliza un sistema dependiente de Cre, el título puede ser particularmente importante ya que los títulos virales altos pueden transducir la expresión en células que no expresan Cre34.
Optimización de la entrega de virus
La administración viral precisa a la región de interés es de importancia crítica para este enfoque. Las coordenadas de inyección de la región presináptica pueden estimarse consultando la literatura y/o un atlas cerebral para las especies apropiadas35,36. El experimentador debe tomarse el tiempo para optimizar y refinar las coordenadas precisas de inyección y el volumen utilizado para garantizar que la inyección viral se restrinja a su región presináptica de interés. Esto es especialmente crítico cuando las regiones vecinas también proyectan al sitio de grabación. Recomendamos usar pequeños volúmenes del virus como un método efectivo para hacer esto. Si se requiere un lugar de inyección particularmente pequeño, el uso de micropipetas de vidrio en lugar de una jeringa y una aguja puede ser ventajoso13. Dejar la aguja de inyección in situ durante un período adecuado y la extracción lenta de la aguja de inyección es fundamental para evitar que el virus se escape al tracto de la aguja. Para confirmar la exactitud de las inyecciones, es una buena práctica verificar histológicamente el lugar de inyección de cada animal utilizado a través de electrofisiología cuando sea posible y excluir los datos en los que la transducción viral está fuera del objetivo. En nuestras manos, el protocolo descrito anteriormente ha demostrado ser generalizable a muchas conexiones diferentes de largo alcance, incluidas las proyecciones de núcleos talámicos de la línea media ventral, el hipocampo, el tálamo mediodorsal y LEC a PFC; proyecciones de PFC a LEC y tálamo mediodorsal; proyecciones de LEC y núcleos talámicos de la línea media ventral al hipocampo (laboratorio Zafar Bashir, Universidad de Bristol, observaciones no publicadas19). El etiquetado optogenético de estas diferentes vías simplemente ha requerido el refinamiento de las coordenadas y volúmenes de inyección.
Limitaciones del protocolo
La disección rápida del cerebro y el corte cuidadoso son de importancia crítica para el éxito de estos experimentos. El protocolo de corte descrito aquí produce cortes agudos sanos sin adaptación para diferentes regiones del cerebro; Sin embargo, se ha informado que la variación en el medio de corte y la temperatura de incubación posterior al corte descrita en otra parte28 mejora aún más la salud del corte. Además, también hemos podido tomar cortes agudos de dos regiones cerebrales después de la transducción viral de una sola área, reduciendo así el número de animales utilizados. Hemos encontrado que en vías anatómicamente densas, períodos tan cortos como 7 días entre la transducción viral y el registro son suficientes para evocar oEPSP robustos de magnitud adecuada para registros de pinzas de parche de células enteras. En proyecciones de mayor alcance o más dispersas, los retrasos más largos son ventajosos.
Se debe tener cuidado al interpretar los resultados de la actividad optogenéticamente evocada, particularmente con respecto a la plasticidad a corto plazo. Resultados anteriores han demostrado que la transmisión optogenéticamente evocada puede sufrir una depresión sináptica más pronunciada tras la estimulación repetida que la estimulación eléctrica, que puede surgir debido a una serie de factores. En primer lugar, la desensibilización de opsinas25 puede conducir a un número reducido de axones presinápticos que aumentan, lo que lleva a una reducción de las respuestas postsinápticas. La cinética mejorada del canal de las opsinas recientemente descubiertas y las que se han sometido a ingeniería molecular (véase más arriba) han contribuido considerablemente a mitigar los efectos de la desensibilización; sin embargo, la estimulación de 100 Hz permanece fuera del alcance de muchas opsinas, lo que puede impedir el uso de ciertos protocolos de inducción de plasticidad a largo plazo (aunque ver37). En segundo lugar, la cinética lenta de las opsinas puede ampliar los potenciales de acción18 lo que lleva a la liberación prolongada del transmisor y al agotamiento vesicular; Esto también puede resultar de la permeabilidad al calcio de las opsinas excitatorias11; Estos problemas pueden mitigarse evitando la fotoactivación de Over-Bouton38. En tercer lugar, la transducción de neuronas utilizando vectores AAV también puede conducir a propiedades de liberación presináptica alteradas en ciertas sinapsis; sin embargo, esto puede mitigarse mediante el uso del serotipo AAV938. A pesar de estas limitaciones, con un uso cuidadoso, la activación optogenética puede imitar la estimulación eléctrica19,38 y, por lo tanto, es una herramienta invaluable para investigar la fisiología de las vías sinápticas no estudiadas. También observamos que los datos mostrados en la Figura 3E evalúan la plasticidad a corto plazo en la pinza de corriente y, por lo tanto, están sujetos a la interacción de los potenciales sinápticos y las propiedades intrínsecas de la membrana, esto puede evitarse realizando experimentos equivalentes en pinza de voltaje.
Orientaciones futuras
La caja de herramientas optogenéticas en constante expansión ha planteado la posibilidad de aplicar esta tecnología en dos vías sinápticas en la misma preparación, mediante el uso de un par de opsinas con espectros de excitación divergentes. Esto es posible gracias al uso de una opsina ChrimsonR26, que, a diferencia de ChR2, es fotoactivada por la luz de longitud de onda roja. ChrimsonR retiene baja sensibilidad a la luz azul, por lo que para evitar la activación de la vía cruzada se puede usar en combinación con opsinas insensibles al rojo, que están desplazadas en violeta (CheRiff 27) y / o tienen órdenes de magnitud más sensibilidad a la luz azul (Chronos26). Esto permite el uso de estímulos de luz azul/violeta que son demasiado débiles para activar significativamente ChrimsonR y, por lo tanto, permiten la activación de dos vías39,40, lo que puede aumentar el rendimiento experimental, permitir el examen de las interacciones de la vía convergente y permitir la liberación de neuromoduladores de fuentes endógenas 41.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención Wellcome 206401/Z/17/Z. Nos gustaría agradecer a Zafar Bashir por su tutoría experta y al Dr. Clair Booth por su asistencia técnica y comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
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