Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver viral transduktion av diskreta hjärnregioner med optogenetiska konstruktioner för att möjliggöra synapsspecifik elektrofysiologisk karakterisering i akuta gnagarhjärnskivor.
Abstract
Att studera de fysiologiska egenskaperna hos specifika synapser i hjärnan, och hur de genomgår plastiska förändringar, är en viktig utmaning inom modern neurovetenskap. Traditionella in vitro elektrofysiologiska tekniker använder elektrisk stimulering för att framkalla synaptisk överföring. En stor nackdel med denna metod är dess ospecifika natur; Alla axoner i området för den stimulerande elektroden kommer att aktiveras, vilket gör det svårt att tillskriva en effekt till en viss afferent anslutning. Denna fråga kan övervinnas genom att ersätta elektrisk stimulering med optogenetisk-baserad stimulering. Vi beskriver en metod för att kombinera optogenetik med in vitro-patch-clamp-inspelningar. Detta är ett kraftfullt verktyg för studier av både basal synaptisk överföring och synaptisk plasticitet av exakt anatomiskt definierade synaptiska anslutningar och är tillämplig på nästan vilken väg som helst i hjärnan. Här beskriver vi beredningen och hanteringen av en viral vektor som kodar för kanalrhodopsinprotein för kirurgisk injektion i en pre-synaptisk region av intresse (medial prefrontal cortex) i gnagarhjärnan och tillverkning av akuta skivor av nedströms målregioner (lateral entorhinal cortex). En detaljerad procedur för att kombinera patch-clamp-inspelningar med synaptisk aktivering genom ljusstimulering för att studera kort- och långsiktig synaptisk plasticitet presenteras också. Vi diskuterar exempel på experiment som uppnår väg- och cellspecificitet genom att kombinera optogenetik och Cre-beroende cellmärkning. Slutligen beskrivs histologisk bekräftelse av den pre-synaptiska regionen av intresse tillsammans med biocytinmärkning av den postsynaptiska cellen för att möjliggöra ytterligare identifiering av den exakta platsen och celltypen.
Introduction
Att förstå synapsernas fysiologi och hur de genomgår plastiska förändringar är grundläggande för att förstå hur hjärnans nätverk fungerar i den friska hjärnan1, och hur de inte fungerar vid hjärnsjukdomar. Användningen av akuta ex vivo-hjärnskivor möjliggör inspelning av den elektriska aktiviteten hos synapser från enskilda neuroner med ett högt signal-brusförhållande med hjälp av helcellspatch-kläminspelningar. Kontroll av membranpotential och enkel farmakologisk manipulation möjliggör isolering av receptorundertyper. Dessa inspelningar kan göras med utsökt specificitet för att identifiera den postsynaptiska neuronen, inklusive laminär och subregional position2, cellulär morfologi3, närvaro av molekylära markörer4, dess afferenta projektioner5, eller till och med om den nyligen var aktiv6.
Att uppnå specificitet av pre-synaptiska ingångar är dock något mer utmanande. Den konventionella metoden har använt stimuleringselektroder för att excitera axonerna som löper i en viss lamina. Ett exempel på detta är i hippocampus där lokal stimulering i stratum radiatum aktiverar synapser som projicerar från CA3 till CA1-underfältet7. I detta fall uppnås presynaptisk specificitet eftersom CA3-indata representerar den enda excitatoriska ingången belägen inom stratum radiatum som projicerar till CA1-pyramidala celler8. Denna höga grad av ingångsspecificitet som kan uppnås med konventionell elektrisk presynaptisk aktivering av CA3-CA1-axoner är dock ett undantag som återspeglas i den intensiva studie som denna synaps har varit föremål för. I andra hjärnregioner samexisterar axoner från flera afferenta vägar i samma lamina, till exempel i lager 1 av neocortex9, vilket gör ingångsspecifik presynaptisk stimulering omöjlig med konventionella stimulerande elektroder. Detta är problematiskt eftersom olika synaptiska ingångar kan ha divergerande fysiologiska egenskaper; Därför kan deras samstimulering leda till felkarakterisering av synaptisk fysiologi.
Tillkomsten av optogenetik, den genetiska kodningen av ljuskänsliga membranproteiner (opsiner) såsom channelrhodopsin-2 (ChR2), har möjliggjort en stor utvidgning av möjligheterna att studera isolerade synaptiska projektioner mellan hjärnregioner10,11. Här beskriver vi en generaliserbar och billig lösning för att studera långväga synaptisk fysiologi och plasticitet. De optogenetiska konstruktionerna levereras på ett mycket specifikt sätt med hjälp av virala vektorer som möjliggör extremt exakt kontroll av den pre-synaptiska regionen av intresse. Efferenta projektioner kommer att uttrycka den ljusaktiverade kanalen vilket möjliggör aktivering av dessa fibrer i ett målområde. Således kan långväga, anatomiskt diffusa vägar som inte kan aktiveras oberoende av traditionell, icke-specifik, elektrisk stimulering studeras.
Vi beskriver, som en exempelväg, transduktion av medial prefrontal cortex (mPFC) med adenoassocierade virus (AAV) som kodar för excitatoriska katjonkanalopsiner. Vi beskriver sedan beredningen av akuta skivor från lateral entorhinal cortex (LEC), patch-clamp-inspelningar från lager 5 LEC pyramidala neuroner och ljusframkallad aktivering av glutamaterga mPFC-LEC-projektioner (Figur 1). Vi beskriver också den histologiska bedömningen av injektionsstället för att bekräfta placeringen av den pre-synaptiska regionen av intresse och identifiering av postsynaptisk cellmorfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med United Kingdom Animals Scientific Procedures Act (1986) och tillhörande riktlinjer samt lokala institutionella riktlinjer.
1. Stereotaxisk viral injektion
OBS: Det nuvarande protokollet kräver anatomisk, men inte postsynaptisk celltyp, specificitet.
- Välj lämpligt djur. Manliga vildtyp Lister hooded råttor användes i detta protokoll (300-350 g, ungefär 3 månader gammal).
- Välj lämplig viral konstruktion. Det finns flera faktorer att tänka på (se Diskussion). Det nuvarande protokollet använder ett virus för att uttrycka den optogenetiska kanalen ChETATC 12, för att transducera excitatoriska neuroner (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (E123T / T159C) - mCherry; titer: 3,3 x10 13 virala genom / ml).
- Upprätta koordinaterna och volymen av injektionen med hjälp av en hjärnatlas som tidigare beskrivits35.
- Stereotaxisk injektion av viruspreparatet
OBS: Alla relevanta nationella och institutionella riktlinjer för användning och skötsel av djur bör följas. Virusvektorerna injiceras stereotaxiskt som tidigare beskrivits13 med följande ändringar.- Håll viruspreparatet på is under bedövning och beredning av djuret.
- Inducera anestesi i en bedövningsinduktionskammare med 4% isofluran. Övervaka anestesinivån som indikeras av långsammare regelbunden andningsfrekvens (1 Hz) och frånvaro av pedal- och hornhinnereflexer (test genom att klämma tårna och lätt vidröra ögonvrån, inget svar ska detekteras).
- Administrera preoperativt smärtstillande medel såsom meloxikam minst 30 minuter före det invasiva förfarandet.
- När djuret är helt bedövat, använd klippare för att ta bort päls från hårbotten. Byt isofluranflödet till noskonen på den stereotaxiska ramen och montera råttan i ramen. Applicera smörjande ögongel på ögonen för att förhindra torrhet under proceduren.
- Operationen bör utföras under aseptiska förhållanden. Använd sterila handskar och instrument under hela proceduren. Applicera lidokainsalva (5% w/w) innan du desinficerar hårbotten med 4% w/v klorhexidinlösning och täck sedan kroppen med ett sterilt draperi. Använd en skalpell, gör ett längsgående snitt som är cirka 15 mm långt i hårbotten för att exponera bregma.
- Ladda en Hamilton-spruta i en mikroinjektionssprutpump fäst vid en rörlig arm monterad på stereotaxramen.
- Placera en alikvot på 5 μL av viruset i ett 0,2 ml rör och snurra i några sekunder tills all volym är i botten av röret. Pipettera 2 μL av viruspreparatet i rörets lock.
- Fyll sprutan med viruspreparatet genom att först titta på nålspetsen med ett kirurgiskt mikroskop och placera sedan virusets bolus manuellt vid nålspetsen och dra tillbaka sprutkolven med hjälp av pumpkontrollerna.
- Ställ in pumpens insprutningsvolym på 300 nL och flödeshastigheten på 100 nL/min. Kör pumpen och bekräfta korrekt flöde genom att observera virusdroppen vid nålspetsen. Absorbera viruset på en bomullsknopp och rengör försiktigt nålen med 70% etanol.
- Med hjälp av justeringsskruvarna på den stereotaxiska ramen navigerar du nålspetsen till bregma (den punkt på skallen där koronal och sagittal suturer möts) och notera de stereotaxiska mätningarna som observerats på de tre vernierskalorna på ramen. Koordinaterna i förhållande till bregma hos råtta mPFC är främre-bakre + 3,1 mm, mediolaterala ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; Addera/subtrahera (som angivit) dessa avstånd från Bregma-koordinaterna och navigera sedan nålen till de främre-bakre och mediolaterala koordinaterna och sänk försiktigt nålen på skalleytan.
OBS: mPFC-koordinaterna ovan är lämpliga för hanråttor med huva på 300–350 g. förändringar i råttstammen, storlek kan kräva ändringar av dessa koordinater (se Diskussion). - Lyft nålen från skallytan och markera denna punkt med en permanent markörpenna med fin spets. Gör ett burrhål vid denna tidpunkt med en mikroborr monterad på stereotaxarmen.
- För in nålen i hjärnan vid den förutbestämda dorsoventrala koordinaten och infusera en förutbestämd volym (för mPFC: 300 nL). Låt nålen sitta kvar i 10 minuter för att möjliggöra diffusion av bolusen. När nålen har tagits bort, kör pumpen för att säkerställa att nålen inte är blockerad.
OBS: Sätt in och ta bort nålen långsamt (~ 3 mm / min) för att minimera skadorna på hjärnvävnaden och återflödet av viruset i nålkanalen. - Administrera 2,5 ml uppvärmd natriumkloridlösning (0,9% w/v) och glukoslösning (5% w/v) subkutant för att bibehålla hydrering.
- Upprepa steg 1.4.12. för andra halvklotet.
- Suturera snittet i hårbotten och administrera 2,5 ml natriumklorid och glukoslösning och ett lämpligt, institutionellt rekommenderat, smärtstillande medel för smärtlindring, t.ex. buprenorfin eller meloxikam. Lämna inte djuret obevakat medan det är medvetslöst. Placera råttan i en uppvärmd återhämtningslåda tills den helt återfår medvetandet. Återvänd bara till hemburet med andra djur när de är helt återställda.
- Följ de institutionella riktlinjerna för postoperativ vård och boendeprocedurer för virustransfekterade gnagare. Vänta i minst 2 veckor tills opsintransgenen uttrycker sig tillräckligt innan du startar experimentet.
OBS: Den tid som krävs för transduktion är beroende av avståndet och styrkan i anslutningen mellan de pre- och postsynaptiska regionerna. För mPFC till LEC krävs 4-6 veckor.
2. Förberedelse av akuta hjärnskivor
OBS: Här beskriver vi en enkel metod för beredning av hjärnskivor som i våra händer är tillräcklig för att uppnå kortikala, hippocampala och thalamiska skivor av hög kvalitet från vuxna möss och råttor.
- Förbered lösningarna för dissektion.
- Fyll en 250 ml bägare med ~ 200 ml iskall sackarosskärningslösning (189 mM sackaros, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukos, 5 mM MgSO4,3 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO4 och 0,2 mM CaCl 2 gjord i ultrarent vatten (UPW) med resistivitet på 18,2 MΩ cm vid 25 ° C) eller en tillräcklig volym för att fylla vibratomvävnadskammaren. Bubbla med kälke (95% O2, 5%CO2) och håll på is.
- Fyll en skivuppsamlingskammare med konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukos,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2PO 4 och 1 mM MgSO4 tillverkad i UPW) vid rumstemperatur, bubblad med karbogen. Skivuppsamlingskammaren14 är specialtillverkad av ett mikrocentrifugrörställ limmat på ett ark nylonnät och placerat i en bägare där den är nedsänkt i aCSF (figur 2A).
- Fyll ett 50 ml rör med 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffert (PB; 75,4 mMNa2HPO 4,7H 2 O och 24,6 mM NaH2PO 4. H2O).
VARNING: PFA är giftigt. Använd i dragskåp.
- Dissektion av hjärnan.
- Bedöva råttan i en induktionskammare med 5% isofluran tills andningen är långsam och regelbunden (~ 1 Hz). För att säkerställa en tillräcklig nivå av anestesitest för frånvaro av pedal- och hornhinnereflexer.
- Halshugga djuret med en guillotin.
- Dissekera snabbt ut hela hjärnan som tidigare beskrivits15 och överför till sackarosskärningslösning. Slutför steget inom 90 s efter halshuggning för god skivkvalitet och framgångsrik helcellsinspelning.
- Använd en tesked av metall, plocka upp hjärnan, kassera överflödig skärlösning och placera den på en bit filterpapper på bänkskivan.
- Använd en skalpell eller rakblad, ta snabbt bort lillhjärnan och skär storhjärnan i koronalplanet ungefär halvvägs längs dess längd; den bakre halvan är LEC-vävnadsblocket. Var noga med att inkludera lite överflödig vävnad utöver regionen som ska skivas för nästa steg. Återför både detta vävnadsblock och resten av hjärnan till sackarosskärningslösningen.
- Placera en droppe cyanoakrylatlim på ett vibratomvävnadsstadium. Sprid det i ett tunt lager med ett område som är något större än vävnadsblocket som skapades i föregående steg.
- Plocka upp LEC-vävnadsblocket med en tesked, kassera överflödig lösning och överför på limplåstret så att det främre koronasnittet har fäst.
- Installera scenen i vibratomvävnadskammaren och häll snabbt en tillräcklig mängd sackarosskärlösning för att sänka ner vävnaden; bubbla denna lösning med carbogen. Orientera LEC-vävnadsblocket med den ventrala ytan mot bladet. Medan omgivande rumsbelysning är otillräcklig för att aktivera opsin, undvik att använda ytterligare ljuskällor som kan finnas på vibratomet.
- Skär skivor med en tjocklek på 350 μm från ventral till dorsal med en hög bladoscillationshastighet (100 Hz) och en långsam bladhastighet (0,06 mm/s). Vanligtvis kan sju LEC-skivor erhållas per halvklot.
- Överför skivorna till skivuppsamlingskammaren. När skivuppsamlingen är klar överför du uppsamlingskammaren till ett vattenbad på 34 °C i 1 timme innan du återgår till rumstemperatur. Bubbla med karbog kontinuerligt. Skivorna kommer att vara tillräckligt friska för inspelning i minst 6 timmar.
- Placera resten av hjärnan i PFA i 48 timmar för post-hoc-undersökning av injektionsstället (se avsnitt 4).
3. Elektrofysiologi och optogenetisk stimulering
- Identifiering av målcell.
- Placera skivan i en nedsänkt inspelningskammare vid 34 °C perfuserad med aCSF med en hastighet av 2 ml/min av en peristaltisk pump. Immobilisera segmentet med hjälp av ett segmentankare.
- Under målet låg förstoring (4x) för ett widefieldmikroskop med sned infraröd belysning, navigera till LEC-lager 5. Mät avståndet från pialytan till önskat lager.
OBS: Sned infraröd belysning uppnåddes genom att placera en nära infraröd lysdiod ungefär 3 mm under inspelningskammarens täckglas i en vinkel på ~ 55 ° mot täckbladets plan (figur 2B). Differentiell interferenskontrast är en alternativ och vanligt förekommande avbildningsteknik för skivelektrofysiologi. - Byt till ett mål med nedsänkning av vatten med hög förstoring (40x) och identifiera pyramidala neuroner. Markera cellens position på datorskärmen med tejp.
OBS: De pyramidala neuronerna har en ungefär triangulär morfologi med framträdande apikala dendriter som skjuter ut mot skivans piala yta (figur 3A). Cellhälsa kan bedömas genom frånvaro av en kondenserad, synlig kärna och inspektion av plasmamembranet som bör verka smidigt. Det är osannolikt att tydlig fluorescerande märkning av axoner av opsin-fluoroforfusionsproteinet kommer att synas vid användning av ett bredfältfluorescensmikroskop. För att visualisera axonala projektioner, utför immunohistokemi post-hoc med hjälp av en primär antikropp mot opsinens fluorofor och förstärka med en sekundär antikropp konjugerad till en fluorofor med samma eller liknande våglängd.
- Bildning av helcellspatchklämma.
- Tillverka en borosilikatglasmikropipett med hjälp av en pipettdragare och fyll med filtrerad intracellulär inspelningslösning (120 mM k-glukonat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA och 0,25% biocytin tillverkat i UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Placera den fyllda mikropipetten i elektrodhållaren på patch-clamp-förstärkarens huvudsteg så att elektrodtråden är i kontakt med den intracellulära lösningen.
- Applicera positivt tryck genom munnen genom att blåsa hårt in i ett munstycke (t.ex. en 1 ml spruta med kolven borttagen) ansluten med slang till elektrodhållarens sidoport och bibehålla trycket genom att stänga en in-line trevägsventil. Höj mikroskopmålet så att en menisk bildas och sätt in elektroden i menisken tills den kan ses på mikroskopet.
- Öppna fönstret Tätningstest i WinLTP16 (eller annan förvärvsprogramvara / oscilloskop) och med förstärkaren i spänningsklämläge, applicera en 5 mV fyrkantig puls för att avgöra om pipettmotståndet är 3-6 MΩ.
- Tillvägagångssätt och beröring på den identifierade cellen med pipettspetsen; Detta bör resultera i en indragning i cellmembranet (figur 3A; höger panel) och en liten ökning av pipettmotståndet (0,1 MΩ).
- Släpp positivt tryck och applicera negativt tryck genom att applicera måttlig sugning vid munstycket; Detta bör resultera i en kraftig ökning av pipettresistensen (>1000 MΩ). Trycket kan nu lämnas neutralt. Applicera undertryck i en gradvis ökande ramp tills cellmembranet brister vilket resulterar i kapacitanstransienter i hela cellen.
- Spela in optogenetiskt framkallade synaptiska händelser.
- Ange konfiguration för strömklämma.
OBS: I de flesta fall är långdistanssynaptisk överföring glutamaterg, därför kommer inspelning vid membranpotentialer nära kloridomvandlingspotentialen bäst att isolera AMPA-receptorn (AMPAR) -medierad överföring och minimera mätningen av eventuell feed-forward-hämning (FFI) som framkallas. Kloridomvandling är beroende av sammansättningen av intracellulär inspelningslösning och aCSF och kan beräknas med hjälp av Goldman-Hodgkin-Katz-ekvationen; för ovanstående lösningar var detta -61,3 mV. Skikt 5 LEC pyramidala neuroner hade en genomsnittlig vilomembranpotential på -62 mV och bibehölls vid behov vid denna potential genom injektion av konstant ström. Alternativt kan celler spänningsklämmas fast till önskad potential. För att registrera långdistanshämmande projektioner16 eller för att registrera FFI, spänningsklämma vid katjonomvandlingspotential för att isolera GABAergic kloridkonduktans. När spänningsklämmande neuroner vid membranpotentialer över åtgärdspotentialtröskeln används en cesiumbaserad intracellulär lösning innehållande spänningsstyrda natriumkanalblockerare för att förbättra spänningsklämman och förhindra initiering av åtgärdspotentialer (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 klorid,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocytin tillverkat i UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). - Med hjälp av datainsamlingsprogramvara skickar du TTL-signaler (Transistor-Transistor Logic) till en LED-drivrutin för att aktivera en monterad 470 nm LED. Den monterade lysdioden riktas in i mikroskopets ljusväg med hjälp av filterkuber och lämplig optik (figur 2B) för att applicera ljuspulser på skivan via 40x-målet för att framkalla optogenetiska excitatoriska postsynaptiska potentialer (oEPSP).
OBS: Ljuspulser kan appliceras perisomatiskt / över dendriterna, vilket kommer att resultera i aktivering av opsiner i axonerna och presynaptisk bouton, eller så kan utredaren flytta målet till axoner bort från den inspelade cellen för att undvika över-boutonstimulering (se Diskussion). Maximal oEPSP-amplitud beror på styrkan hos den synaptiska projektionen, effekten av virala injektioner och opsin som används. oEPSP kan titreras till önskad amplitud genom att variera ljusintensitet och/eller varaktighet18; att variera varaktigheten av ljuspulser (typisk varaktighet mellan 0,2-5 ms vid maximal LED-effekt, vilket resulterar i 4,4 mW / mm ljustäthet19) ger mer konsekventa oEPSP-amplituder än att ändra lysdiodens uteffekt. - Undersöka presynaptiska frisättningsegenskaper (förändring i spänning) genom att leverera tåg med flera ljuspulser med olika interstimulansintervall (figur 3E); försiktighet bör iakttas vid tolkning av optogenetiskt framkallad överföring (se Diskussion).
- Undersök långsiktig plasticitet antingen genom att upprepade gånger framkalla oEPSPs19 eller applicering av ligander. Övervaka oEPSP-amplituden i 5-10 minuter för att säkerställa stabilitet före induktion av plasticitet och övervaka sedan tills en stabil amplitud uppnås (vanligtvis 30-40 min).
OBS: De flesta nuvarande opsiner kan inte på ett tillförlitligt sätt framkalla flera åtgärdspotentialer vid höga frekvenser, t.ex. 100 stimuli levererade vid 100 Hz, som vanligtvis används för att inducera LTP. - För att bekräfta att oEPSP är monosynaptiska, utför over-boutonaktivering av den transducerade vägen genom att placera målet över dendritiska trädborrningen och stimulera i närvaro av 0,5 μM tetrodotoxin och 100 μM aminopyridin. Applicering av tetrodotoxin kommer att avskaffa överföringen om svaren är åtgärdspotentialberoende och efterföljande inkludering av aminopyridin kommer delvis att återställa överföringen om oEPSP: erna genereras monosynaptiskt19,20.
- För att tillåta biocytin att fylla neuronen, vänta i minst 15 minuter efter att ha gått in i helcellskonfigurationen. I spänningsklämma, övervaka membrankapacitans och ingångsmotstånd.
- Dra långsamt ut pipetten längs inflygningsvinkeln bort från cellens soma, observera den långsamma försvinnandet av kapacitanstransienter och membranström som indikerar återförslutning av cellmembranet och bildning av en utvändig ut lapp vid pipettspetsen. Observera segmentets orientering och placeringen av cellen/cellerna i segmentet. Lägg skivan i PFA i en 24-brunnsplatta och inkubera över natten vid 4 °C och överför sedan till 0,1 M PB.
OBS: Skivor kan lagras i upp till en vecka. Om längre lagring krävs, byt PB regelbundet eller använd PB som innehåller natriumazid (0,02% -0,2% natriumazid).
- Ange konfiguration för strömklämma.
4. Histologi
- Skivningsstället för injektion
- Efter fixering kryoskyddar du vävnaden i 30% sackaros (w / v) i PB tills den sjunker (den kommer initialt att flyta i sackaroslösningen), vanligtvis över natten vid rumstemperatur eller 24-48 timmar vid 4 ° C.
- Använd optimalt skärtemperaturmedium (OCT) och fäst ett vävnadsblock på kryostatprovskivan. Frys vävnadsblocket enligt steg 4.1.3 till 4.1.4.
- Placera isopentan i en lämplig behållare. Sänk ner bara provskivan och se till att vävnaden ligger över isopentannivån. Sänk behållaren med isopentan till flytande kväve (eller torris) och låt vävnaden frysa.
- När det är helt fruset (hela vävnadsblocket blir blekt och hårt), lämna vävnadsblocket i kryostatkammaren vid -20 ° C i 30 minuter så att blockets temperatur kan balanseras.
- Skär 40 μm tjocka sektioner i kryostaten vid -20 °C. Använd en fin pensel för att styra bort sektionerna från bladet. Fäst frysta sektioner till en rumstemperatur, poly-L-lysinbelagd, glasmikroskopglas genom att röra bilden till sektionerna.
- Tillsätt cirka 150 μL monteringsmedium till varje bild och täck med ett täckglas; Ta bort eventuella luftbubblor genom att försiktigt trycka på täckglaset. Täck objektsglasen för att skydda mot fotoblekning och lufttorka vid rumstemperatur i minst 12 timmar (eller över natten). Använd ett fluorescensmikroskop, undersök platsen för det virala injektionsstället.
- Biocytin färgning protokoll
OBS: Detta protokoll kan tillämpas på tjocka sektioner; skivor behöver inte delas om.- Tvätta hjärnskivorna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 och 1,8 mM KH2PO4) sex gånger i 10 min per tvätt. Använd en överföringspipett för att tömma brunnarna efter varje steg.
- Inkubera skivorna i 3%H2O2(w/v) i PBS i 30 min för att blockera eventuell endogen peroxidasaktivitet. Detta genererar syrebubblor.
- Tvätta hjärnskivorna med PBS sex gånger i 10 min per tvätt eller tills inga ytterligare syrebubblor är synliga. Inkubera hjärnskivorna i 1% (v/v) avidin-biotinylerat HRP-komplex (ABC) lösning i PBS innehållande 0,1% (v/v) Triton X-100 vid rumstemperatur i 3 timmar.
- Tvätta hjärnskivorna med PBS sex gånger i 10 min per tvätt.
- Inkubera varje skiva i 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) lösning i flera minuter tills biocytinfärgningen av neuronala strukturer blir synlig (tar cirka 5-10 min).
VARNING: DAB är giftigt. Använd i dragskåp.
OBS: DAB-inkubationstider kan vara oförutsägbara, övervaka vävnaden noggrant när färgen utvecklas. - Stoppa reaktionen genom att överföra skivorna till kallt (4 °C) PBS. Tvätta hjärnskivorna med PBS sex gånger i 10 min per tvätt. Använd en borste för att montera hjärnskivorna på poly-L-lysinbelagda glasmikroskopglas.
- Ta bort allt överskott av PBS med en ren vävnad. Täck varje skiva med cirka 200 μL monteringsmedium; Täck med täckglas och tryck försiktigt på täckglaset för att trycka ut luftbubblor. Lufttorka vid rumstemperatur i minst 12 timmar (eller över natten). Använd ett ljusmikroskop för att undersöka cellens/cellernas placering och morfologiska detaljer.
OBS: Biocytin kan alternativt visualiseras med hjälp av fluoroforkonjugerat streptavidin; Avbildning kan dock kräva resektion eller användning av ett konfokalmikroskop21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll beskriver vi hur man studerar långväga synaptisk fysiologi och plasticitet med hjälp av viral leverans av optogenetiska konstruktioner. Protokollet kan mycket enkelt anpassas för att studera nästan alla långdistansanslutningar i hjärnan. Som ett exempel beskriver vi injektionen av AAV som kodar för ett opsin i råtta mPFC, beredningen av akuta skivor från LEC, patch-kläminspelningar från lager 5 LEC-pyramidala neuroner och ljusframkallad aktivering av mPFC-terminaler i LEC (Figur 1).
En frisk pyramidcell lokaliserades och lappades (t.ex. figur 3A). I det nuvarande mPFC till LEC-exemplet var de postsynaptiska cellerna inte märkta; Om postsynaptisk cellidentifiering krävs bör en cell som uttrycker den fluorescerande markören lokaliseras med hjälp av widefieldoptik (t.ex. figur 3B). Cellens hälsa bör bedömas med infraröd optik före experiment. För att aktivera mPFC-axoner i LEC placerades en LED direkt över lager 5-cellsoma och proximala dendriter via mikroskopmålet (figur 1), enstaka ljuspulser på 2 ms resulterade i enkla vågform-oEPSPs (figur 3C); oEPSP:s toppamplitud kan mätas. För att undersöka synapsens kortsiktiga plasticitet applicerades 5, 10 och 20 Hz tåg av ljusstimulering (figur 3E). För att undersöka långsiktig plasticitet, efter övervakning av oEPSP-amplituden vid baslinjen i 10 minuter, tillsattes den kolinerga agonisten, karbachol, till den cirkulerande aCSF i 10 minuter. Detta orsakade långvarig depression som fortfarande var uppenbar 40 min efter avlägsnande av liganden (figur 3D).
Efter elektrofysiologiska registreringsexperiment sektionerades hjärnvävnaden som innehöll det virala injektionsstället och injektionsställets längd undersöktes (figur 4A). Den fluorescerande reportern, mCherry, är lokaliserad till de djupare skikten i den prelimbiska och infralimbiska cortexen (beståndsdelar i gnagare mPFC). Dessa lager riktades eftersom projektionen till LEC har visat sig härröra huvudsakligen från de djupare kortikala lagren22. mCherry positiva fibrer kan också ses gå med i den vita substanskanalen. I ett pilotexperiment för att optimera viral injektionsplacering togs och undersöktes 40 μm sektioner av LEC; mCherry positiva fibrer kan ses i lager 5 av LEC (Figur 4B). Slutligen färgades den biocytinfyllda cellen, vilket gjorde att dess placering och morfologi kunde bekräftas (figur 4C,D).
Figur 1: Experimentell översikt. (A) Schematisk för viral vektorinjektion i medial prefrontal cortex (mPFC), transduktion av mPFC-celler med optogenetisk konstruktion och transport av konstruktion till terminaler i lateral entorhinal cortex (LEC). (B) Schematisk representation av helcellsinspelning från pyramidala nervceller i lager 5 i en akut LEC-skiva och ljusaktivering av mPFC-terminaler via mikroskopmål. Förkortningar: CA = cornu ammonis; PERI = perirhinal cortex; TR = övergångsregion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Skivuppsamlingskammare och optisk konfiguration för visualiserade helcellsinspelningar, optogenetisk excitation och identifiering av tdTomato-positiva neuroner. (A) Skivuppsamlingskammaren 14 är specialtillverkad av ett mikrocentrifugrörställ limmat på ett ark nylonnät och placerat i en bägare där den är nedsänkt i aCSF (B ) lysdioder för excitering av ChR2 (470 nm) och tdTomato (565 nm) riktas genom en asfärisk kondensorlins för att kollimera ljus, 565 nm ljus strålas genom ett bandpassfilter för att uppnå spektralseparation av tdTomato excitations- och emissionsspektra. Dessa kombineras med en långpass dikroisk spegel och riktas mot skivan med en andra långpass dikroisk spegel med längre våglängd. Ljuset fokuseras sedan på skivan via objektivlinsen. I experiment där tdTomato-märkta neuroner är närvarande passerar utemitterat fluorescerande ljus genom dikroisk spegel och emissionsfilter och fokuseras på kamerasensorn med en akromatisk lins. Icke-fluorescerande egenskaper hos skivan visualiseras av snett brytning nära infrarött (NIR) ljus applicerat under skivkammaren; detta ljus överför optiken till kameran och förnekar därmed behovet av att byta filterkuber mellan fluorescerande och NIR-avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Visualisering av neuroner under NIR/fluorescerande avbildning och representativa exempel på oEPSP. (A) Vänster: Exempel på neuron med pyramidal morfologi visualiserad med NIR-ljus. Höger: Samma neuron med bildandet av konkav grop orsakad av positivt tryck från plåstretpipetten. (B) Cre-rekombinasberoende uttryck av tdTomato i en enda neuron. (C) Representativ oEPSP från LEC lager 5 i pyramidcellen. D) Exempel på långtidsövervakning av plasticitetsexperiment med oEPSP över tid efter tillsats av 10 μm karbachol (CCh). Den streckade linjen indikerar genomsnittlig oEPSP-amplitud under baslinjeperioden före läkemedelstillsats. (E) Representativa spår av stimuleringståg vid 5, 10 och 20 Hz. Blå pilar betecknar ljusaktivering. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histologisk verifiering av injektionsstället och återvinning av biocytinfyllda celler . (A) Koronafotomikrograf som visar viralt injektionsställe i mPFC, +3,00 mm från bregma. (B) Tunn koronal sektion av LEC som illustrerar mCherry+ fibrer. (C) Lågeffektbild av 350 μm tjock akut skiva, -6,2 mm från bregma, med biocytinfylld pyramidcell i LEC. Den streckade rutan visas vid högre förstoring i D. (D) LEC pyramidcell; Den apikala dendriten kan ses till höger om bilden på väg mot lager 1. Streckade linjer betecknar regionala gränser. Förkortningar: IL = infralimbisk cortex; PL = prelimbisk cortex; wm = vit substans. Skalstänger = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver en metod för att utforska mycket specifika synaptiska projektioner med lång räckvidd med hjälp av en kombination av stereotaxisk kirurgi för att leverera AAV som kodar för optogenetiska konstruktioner och elektrofysiologi i akuta hjärnskivor (Figur 1). Tillsammans erbjuder dessa tekniker verktyg för att karakterisera fysiologin och plasticiteten hos hjärnkretsar med hög precision i långväga och anatomiskt diffusa vägar som tidigare var otillgängliga med traditionell, ospecifik, elektrisk stimulering. Kombination med cellspecifika molekylära markörer möjliggör karakterisering av projektioner från en hjärnregion till olika definierade cellpopulationer i en annan region23.
För att dra full nytta av den mycket exakta karaktären hos denna teknik är det viktigt att verifiera vägspecificitet. Detta görs i flera steg; Under inspelningen ska du se till att synapsen som undersöks är monosynaptisk (steg 3.3.5). Efter detta undersöker du histologiskt injektionsstället för att säkerställa att viruset är begränsat till den avsedda pre-synaptiska regionen av intresse och bedömer platsen och morfologin hos den biocytinfärgade postsynaptiska cellen för att säkerställa att den är som förväntat.
Virusval och uppnå cellulär specificitet
Tekniken är mycket anpassningsbar och lämplig för användning hos både möss och råttor. Experiment som kräver anatomisk specificitet kan utföras med gnagare av vild typ. Experiment som kräver postsynaptisk celltypspecificitet kan kräva en genetiskt modifierad gnagarstam om cellerna inte kan identifieras baserat på morfologi eller plats. Till exempel, för att rikta parvalbumin (PV) som uttrycker interneuroner, kan en PV-Cre knock-in transgen muslinje där Cre-rekombinas uttrycks i PV-uttryckande neuroner användas. För att visualisera dessa celler kan PV-Cre-linjen korsas med en reportermuslinje för att uttrycka ett fluorescerande protein efter Cre-medierad rekombination. Alternativt kan en Cre-beroende fluorescerande reportergen introduceras viralt. ChR2-fluoroforfusionsproteiner är begränsade till cellmembranet och kan visas som en kontur av neuronen när de ses med widefieldmikroskopi i akuta skivor vilket gör identifiering av celler för helcellsinspelning mer utmanande än att använda cytosoliska fluoroforer. Om ChR2 används för att identifiera celler kan separation av ChR2 och fluorofor uppnås med hjälp av bicistroniska vektorer24. Om man använder en fluorescerande reporter för att identifiera målneuroner för helcellsregistrering, bör dess excitationsvåglängd helst inte överlappa med opsinets aktiveringsvåglängd; Detta kommer att undvika långvarig aktivering av transducerade afferenter medan du söker efter nervceller att spela in från. På samma sätt bör pre- och postsynaptiska reportrar vara spektralt separata. Vanliga reportrar är mCherry, grönt fluorescerande protein (GFP) och förbättrat gult fluorescerande protein (eYFP).
Den virala konstruktionen som används har flera olika komponenter, var och en kan påverka experimentets framgång och därför måste hänsyn tas till varje element. Primär vikt bör ges till valet av opsin. För presynaptisk aktivering har det ideala opsinet stora fotoströmmar (för att på ett tillförlitligt sätt få axoner till åtgärdspotentialtröskel), snabb on- och off-kinetik och en långsam desensibiliseringshastighet för att möjliggöra högfrekvent upprepad stimulering. Som regel kommer snabb kinetik ofta på bekostnad av mindre fotoströmmar25; molekylär screening och teknik har dock försett opsiner med stora fotoströmmar. Det nuvarande protokollet använder ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12, men Chronos 26, CheRiff 27, oChIEFAC28 och ChRmine 29 är också lämpliga. Dessutom finns excitatoriska opsiner med antingen rödförskjutna (ChrimsonR)26 eller violettförskjutna (CheRiff) aktiveringsvåglängder, vilket kan krävas för att undvika överlappning med excitationsspektra av fluoroforer som används för cellidentifiering (se ovan).
Serotypen av AAV kan påverka vektorns förmåga att transducera olika hjärnregioner och celltyper samt omfattningen av axonal transport i både anterograd och retrograd riktning30. Serotyper som vanligtvis används för neuronal transduktion är 1, 2, 5, 8 och 9. En litteratursökning kan ge en indikation på vilken serotyp som har använts framgångsrikt i en viss region. Till exempel har AAV9 rekommenderats för transduktion av kortikala neuroner31.
Promotorn möjliggör specifikationen av celltypen där opsin kommer att uttryckas. Promotors faller i flera klasser. Allmänna promotorer, t.ex. CAG eller EF1a, resulterar i uttryck i de flesta celltyper. Neuronspecifika promotorer, t.ex. synapsin, genererar uttryck i alla neurontyper. CaMKIIa används ofta för att begränsa uttrycket till excitatoriska nervceller även om det har visat sig vara läckande – vissa uttryck har observerats i interneuroner32. mDlx-förstärkarelementet begränsar uttrycket till GABAergic interneurons33. Pre-synaptisk celltypspecificitet kan uppnås med hjälp av en Cre-muslinje (som beskrivits ovan för den postsynaptiska cellen). I detta fall krävs en Cre-beroende genetisk konstruktion för att begränsa opsinuttryck till Cre-uttryckande celler.
Titre är antalet viruspartiklar i viruspreparatet. Återigen kan en litteratursökning ge en indikation på en titer som har genererat tillräcklig transduktion i ett visst område. Vid användning av ett Cre-beroende system kan titern vara särskilt viktig eftersom höga virala titrar kan transducera uttryck i icke-Cre-uttryckande celler34.
Optimering av virusleverans
Exakt viral leverans till regionen av intresse är av avgörande betydelse för detta tillvägagångssätt. Injektionskoordinater för den presynaptiska regionen kan uppskattas genom att konsultera litteraturen och/eller en hjärnatlas för lämplig art35,36. Experimentören bör sedan ta sig tid att optimera och förfina de exakta injektionskoordinaterna och volymen som används för att säkerställa att virusinjektionen är begränsad till deras presynaptiska region av intresse. Detta är särskilt kritiskt när grannregioner också projicerar till inspelningsplatsen. Vi rekommenderar att du använder små volymer av viruset som en effektiv metod för att göra detta. Om ett särskilt litet injektionsställe krävs kan det vara fördelaktigt att använda glasmikropipetter i stället för en spruta och nål13. Att lämna injektionsnålen på plats under en tillräcklig period och långsamt dra tillbaka injektionsnålen är avgörande för att förhindra att viruset släpper ut i nålkanalen. För att bekräfta injektionernas noggrannhet är det bästa praxis att histologiskt verifiera injektionsstället för varje djur som används genom elektrofysiologi där det är möjligt och utesluta data där viral transduktion är utanför målet. I våra händer har protokollet som beskrivs ovan visat sig vara generaliserbart till många olika långdistansanslutningar, inklusive utsprång från ventrala mittlinje thalamiska kärnor, hippocampus, mediodorsal thalamus och LEC till PFC; utsprång från PFC till LEC och mediodorsal thalamus; projektioner från LEC och ventrala mittlinje thalamiska kärnor till hippocampus (Zafar Bashir lab, University of Bristol, opublicerade observationer19). Optogenetisk märkning av dessa olika vägar har bara krävt förfining av injektionskoordinater och volymer.
Begränsningar av protokoll
Snabb dissektion av hjärnan och noggrann skivning är kritiskt viktiga för framgången för dessa experiment. Skivningsprotokollet som beskrivs här ger friska akuta skivor utan anpassning för olika hjärnregioner; Variationer i skivmedium och inkubationstemperatur efter skivning som beskrivs någon annanstans28 har dock rapporterats förbättra skivans hälsa ytterligare. Dessutom har vi också kunnat ta akuta skivor från två hjärnregioner efter viral transduktion av ett enda område, vilket minskar antalet djur som används. Vi har funnit att i anatomiskt täta vägar är perioder så korta som 7 dagar mellan viral transduktion och inspelning tillräckliga för att framkalla robusta oEPSP: er av lämplig storlek för helcelliga patch-clamp-inspelningar. I längre eller glesa prognoser är längre förseningar fördelaktiga.
Försiktighet bör iakttas vid tolkning av resultaten av optogenetiskt framkallad aktivitet, särskilt med avseende på kortvarig plasticitet. Tidigare resultat har visat att optogenetiskt framkallad överföring kan genomgå mer uttalad synaptisk depression vid upprepad stimulering än elektrisk stimulering, vilket kan uppstå på grund av ett antal faktorer. För det första kan opsindesensibilisering25 leda till ett minskat antal presynaptiska axoner, vilket leder till minskade postsynaptiska svar. Den förbättrade kanalkinetiken hos nyligen upptäckta opsiner och de som har genomgått molekylär teknik (se ovan) har gått ett betydande sätt att mildra effekterna av desensibilisering; 100 Hz-stimulering förblir dock utom räckhåll för många opsin, vilket kan hindra användningen av vissa långsiktiga plasticitetsinduktionsprotokoll (se dock37). För det andra kan opsinernas långsamma kinetik bredda åtgärdspotentialerna18 vilket leder till långvarig frisättning av sändare och vesikulär utarmning; Detta kan också bero på kalciumpermeabiliteten hos excitatoriska opsiner11; Dessa problem kan mildras genom att undvika over-bouton fotoaktivering38. För det tredje kan transduktion av neuroner med hjälp av AAV-vektorer också leda till förändrade presynaptiska frisättningsegenskaper i vissa synapser; Detta kan dock mildras genom att använda AAV9 serotyp38. Trots dessa begränsningar, med noggrann användning, kan optogenetisk aktivering efterlikna elektrisk stimulering19,38 och är därför ett ovärderligt verktyg för att undersöka fysiologin hos outforskade synaptiska vägar. Vi noterar också att de data som visas i figur 3E bedömer kortvarig plasticitet i strömklämma och därför är föremål för interaktion mellan synaptiska potentialer och inneboende membranegenskaper, detta kan undvikas genom att utföra ekvivalenta experiment i spänningsklämma.
Framtida inriktningar
Den ständigt växande optogenetiska verktygslådan har ökat möjligheten att tillämpa denna teknik i två synaptiska vägar i samma preparat, genom att använda ett par opsiner med divergerande excitationsspektra. Detta möjliggörs genom användning av en opsin ChrimsonR26, som, till skillnad från ChR2, fotoaktiveras av rött våglängdsljus. ChrimsonR behåller låg känslighet för blått ljus, så för att undvika aktivering av korsvägar kan den användas i kombination med rödokänsliga opsiner, som är violettförskjutna (CheRiff 27) och / eller har storleksordningar högre känslighet för blått ljus (Chronos26). Detta möjliggör användning av blå/violetta ljusstimuli som är för svaga för att signifikant aktivera ChrimsonR och därför tillåter aktivering av två vägar39,40, vilket kan öka experimentell genomströmning, möjliggöra undersökning av konvergenta väginteraktioner och tillåta frisättning av neuromodulatorer från endogena källor 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Wellcome grant 206401/Z/17/Z. Vi vill tacka Zafar Bashir för hans expertmentorskap och Dr. Clair Booth för tekniskt stöd och kommentarer till manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
