Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

एक्स वीवो मिडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से लेटरल एंटोरिनल कॉर्टेक्स तक लंबी दूरी के सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और प्लास्टिसिटी की ऑप्टोजेनेटिक पूछताछ

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/63077
Automatic Translation
1, 1
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

Summary

यहां हम तीव्र कृंतक मस्तिष्क स्लाइस में सिनैप्स-विशिष्ट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं के साथ असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के वायरल ट्रांसडक्शन का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मस्तिष्क में विशिष्ट सिनैप्स के शारीरिक गुणों का अध्ययन करना, और वे प्लास्टिक परिवर्तनों से कैसे गुजरते हैं, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। पारंपरिक इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीक सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को जगाने के लिए विद्युत उत्तेजना का उपयोग करती है। इस विधि का एक बड़ा दोष इसकी निरर्थक प्रकृति है; उत्तेजक इलेक्ट्रोड के क्षेत्र में सभी अक्षतंतु सक्रिय हो जाएंगे, जिससे किसी विशेष अभिवाही कनेक्शन को प्रभाव देना मुश्किल हो जाएगा। ऑप्टोजेनेटिक-आधारित उत्तेजना के साथ विद्युत उत्तेजना को बदलकर इस मुद्दे को दूर किया जा सकता है। हम इन विट्रो पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स के संयोजन के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह सटीक शारीरिक रूप से परिभाषित सिनैप्टिक कनेक्शन के बेसल सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी दोनों के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और मस्तिष्क में लगभग किसी भी मार्ग पर लागू होता है। यहां, हम कृंतक मस्तिष्क में रुचि के पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र (मेडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स) में सर्जिकल इंजेक्शन के लिए एक वायरल वेक्टर एन्कोडिंग चैनलरोडोप्सिन प्रोटीन की तैयारी और हैंडलिंग का वर्णन करते हैं और डाउनस्ट्रीम लक्ष्य क्षेत्रों (पार्श्व एंटोरिनल कॉर्टेक्स) के तीव्र स्लाइस बनाते हैं। लघु और दीर्घकालिक सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए प्रकाश उत्तेजना द्वारा सिनैप्टिक सक्रियण के साथ पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के संयोजन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया भी प्रस्तुत की गई है। हम उन प्रयोगों के उदाहरणों पर चर्चा करते हैं जो ऑप्टोजेनेटिक्स और क्रे-निर्भर सेल लेबलिंग के संयोजन से मार्ग- और सेल-विशिष्टता प्राप्त करते हैं। अंत में, पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र की हिस्टोलॉजिकल पुष्टि को पोस्ट-सिनैप्टिक सेल के बायोसाइटिन लेबलिंग के साथ वर्णित किया गया है, ताकि सटीक स्थान और सेल प्रकार की और पहचान की जा सके।

Introduction

सिनैप्स के शरीर विज्ञान को समझना और वे प्लास्टिक परिवर्तनों से कैसे गुजरते हैं, यह समझने के लिए मौलिक है कि स्वस्थ मस्तिष्क1 में मस्तिष्क नेटवर्क कैसे कार्य करते हैं, और वे मस्तिष्क विकारों में कैसे खराबी करते हैं। तीव्र एक्स विवो मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ एकल न्यूरॉन्स से सिनैप्स की विद्युत गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। झिल्ली क्षमता और सीधे औषधीय हेरफेर का नियंत्रण रिसेप्टर उपप्रकारों के अलगाव की अनुमति देता है। इन रिकॉर्डिंग को पोस्ट-सिनैप्टिक न्यूरॉन की पहचान करने के लिए उत्तम विशिष्टता के साथ बनाया जा सकता है, जिसमें लैमिनार और उप-क्षेत्रीय स्थिति2, सेलुलर आकृति विज्ञान3, आणविक मार्कर4 की उपस्थिति, इसके अभिवाही अनुमान5, या भले ही यह हाल ही में सक्रियथा।

प्री-सिनैप्टिक इनपुट की विशिष्टता प्राप्त करना, हालांकि, कुछ अधिक चुनौतीपूर्ण है। पारंपरिक विधि ने एक विशेष लैमिना में चलने वाले अक्षतंतु को उत्तेजित करने के लिए उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग किया है। इसका एक उदाहरण हिप्पोकैम्पस में है जहां स्ट्रेटम रेडिएटम में स्थानीय उत्तेजना सिनैप्स को सक्रिय करती है जो सीए 3 से सीए 1 उपक्षेत्र 7 तक प्रोजेक्ट करतीहै। इस उदाहरण में, प्रीसिनेप्टिक विशिष्टता प्राप्त की जाती है क्योंकि सीए 3 इनपुट स्ट्रेटम रेडिएटम के भीतर स्थित एकमात्र उत्तेजक इनपुट का प्रतिनिधित्व करता है जो सीए 1 पिरामिड कोशिकाओं 8 को प्रोजेक्ट करताहै। सीए 3-सीए 1 अक्षतंतु के पारंपरिक विद्युत प्रीसिनेप्टिक सक्रियण के साथ प्राप्त इनपुट विशिष्टता की यह उच्च डिग्री, हालांकि, एक अपवाद है जो गहन अध्ययन में परिलक्षित होता है जो इस सिनैप्स के अधीन है। अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में, कई अभिवाही मार्गों से अक्षतंतु एक ही लैमिना में सह-अस्तित्व में होते हैं, उदाहरण के लिए, नियोकॉर्टेक्स9 की परत 1 में, इस प्रकार पारंपरिक उत्तेजक इलेक्ट्रोड के साथ इनपुट-विशिष्ट प्रीसिनेप्टिक उत्तेजना असंभव हो जाती है। यह समस्याग्रस्त है क्योंकि विभिन्न सिनैप्टिक इनपुट में भिन्न शारीरिक गुण हो सकते हैं; इसलिए, उनकी सह-उत्तेजना से सिनैप्टिक फिजियोलॉजी का गलत लक्षण वर्णन हो सकता है।

ऑप्टोजेनेटिक्स के आगमन, फोटोसेंसिटिव झिल्ली प्रोटीन (ऑप्सिन) जैसे चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) के आनुवंशिक एन्कोडिंग ने मस्तिष्क क्षेत्रों10,11 के बीच पृथक सिनैप्टिक अनुमानों का अध्ययन करने के लिए संभावनाओं के विशाल विस्तार की अनुमति दी है। यहां हम लंबी दूरी के सिनैप्टिक फिजियोलॉजी और प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक सामान्य और कम लागत वाले समाधान का वर्णन करते हैं। ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं को वायरल वैक्टर का उपयोग करके अत्यधिक विशिष्ट तरीके से वितरित किया जाता है जो रुचि के पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र के अत्यंत सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है। अपवाही अनुमान प्रकाश-सक्रिय चैनल को व्यक्त करेंगे जो एक लक्ष्य क्षेत्र में इन तंतुओं के सक्रियण की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, लंबी दूरी, शारीरिक रूप से फैलाने वाले मार्ग जिन्हें पारंपरिक, गैर-विशिष्ट, विद्युत उत्तेजना द्वारा स्वतंत्र रूप से सक्रिय नहीं किया जा सकता है, का अध्ययन किया जा सकता है।

हम एक उदाहरण मार्ग के रूप में, एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) एन्कोडिंग उत्तेजक केशन-चैनल ऑप्सिन के साथ मेडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी) के पारगमन का वर्णन करते हैं। फिर हम पार्श्व एंटोरिनल कॉर्टेक्स (एलईसी) से तीव्र स्लाइस की तैयारी, परत 5 एलईसी पिरामिड न्यूरॉन्स से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग, और ग्लूटामेटर्जिक एमपीएफसी-एलईसी अनुमानों के प्रकाश-उत्पन्न सक्रियण का वर्णन करते हैं (चित्रा 1)। हम रुचि के पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र के स्थान और पोस्ट-सिनैप्टिक सेल आकृति विज्ञान की पहचान की पुष्टि करने के लिए इंजेक्शन साइट के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन का भी वर्णन करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को यूनाइटेड किंगडम पशु वैज्ञानिक प्रक्रिया अधिनियम (1986) और संबंधित दिशानिर्देशों के साथ-साथ स्थानीय संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. स्टीरियोटैक्सिक वायरल इंजेक्शन

नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल को शारीरिक, लेकिन पोस्ट-सिनैप्टिक सेल प्रकार, विशिष्टता की आवश्यकता नहीं है।

  1. उपयुक्त जानवर चुनें। इस प्रोटोकॉल (300-350 ग्राम, लगभग 3 महीने पुराने) में नर जंगली-प्रकार के लिस्टर हुड वाले चूहों का उपयोग किया गया था।
  2. उपयुक्त वायरल निर्माण चुनें। विचार करने के लिए कई कारक हैं (चर्चा देखें)। वर्तमान प्रोटोकॉल उत्तेजक न्यूरॉन्स (AAV9 - CaMKIIa - CHR2 (E123T / T159C) - mCherry; टिटर: 3.3 x 10 13 वायरल जीनोम / एमएल) को ट्रांसड्यूस करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक चैनल ChETATC12 को व्यक्त करने के लिए एक वायरस का उपयोग करता है।
  3. मस्तिष्क एटलस का उपयोग करके इंजेक्शन के निर्देशांक और मात्रा स्थापित करें जैसा कि पहले वर्णित35 है।
  4. वायरल तैयारी का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन
    नोट: जानवरों के उपयोग और देखभाल के लिए सभी प्रासंगिक राष्ट्रीय और संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन किया जाना चाहिए। वायरल वैक्टर को स्टीरियोटैक्सिक रूप से इंजेक्ट किया जाता है जैसा कि पहले वर्णित है13 निम्नलिखित संशोधनों के साथ।
    1. एनेस्थेटाइजेशन और जानवर की तैयारी के दौरान बर्फ पर वायरल तैयारी रखें।
    2. 4% आइसोफ्लुरेन के साथ एक एनेस्थेटिक प्रेरण कक्ष में संज्ञाहरण को प्रेरित करें। धीमी नियमित श्वास दर (1 हर्ट्ज) और पेडल और कॉर्नियल रिफ्लेक्सिस की अनुपस्थिति द्वारा इंगित संज्ञाहरण के स्तर की निगरानी करें (क्रमशः पैर की उंगलियों को चुटकी मारकर और हल्के से आंख के कोने को छूकर परीक्षण करें; कोई प्रतिक्रिया का पता नहीं लगाया जाना चाहिए)।
    3. इनवेसिव प्रक्रिया से कम से कम 30 मिनट पहले मेलोक्सिकैम जैसे प्री-ऑपरेटिव एनाल्जेसिक का प्रबंधन करें।
    4. जब जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है, तो खोपड़ी से फर को हटाने के लिए क्लिपर का उपयोग करें। स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के नाक शंकु में आइसोफ्लुरेन प्रवाह को स्विच करें और चूहे को फ्रेम में माउंट करें। प्रक्रिया के दौरान सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर स्नेहन आंखों जेल लागू करें।
    5. सर्जरी सड़न रोकनेवाली स्थितियों में की जानी चाहिए। पूरी प्रक्रिया में बाँझ दस्ताने और उपकरणों का उपयोग करें। 4% डब्ल्यू / वी क्लोरहेक्सिडीन समाधान के साथ खोपड़ी को कीटाणुरहित करने से पहले लिडोकेन मलहम (5% डब्ल्यू / डब्ल्यू) लागू करें, और फिर शरीर को बाँझ ड्रेप के साथ कवर करें। स्केलपेल का उपयोग करके, ब्रेग्मा को उजागर करने के लिए खोपड़ी पर लगभग 15 मिमी लंबाई में एक अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं।
    6. हैमिल्टन सिरिंज को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर लगाए गए एक मूवेबल आर्म से जुड़े एक माइक्रोइंजेक्शन सिरिंज पंप में लोड करें।
    7. 0.2 एमएल ट्यूब में वायरस का 5 μL एलिकोट रखें और कुछ सेकंड के लिए स्पिन करें जब तक कि सभी मात्रा ट्यूब के तल में न हो। ट्यूब के ढक्कन में वायरल तैयारी का पिपेट 2 μL।
    8. सिरिंज को वायरल तैयारी के साथ भरें पहले एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के साथ सुई की नोक को देखकर, और फिर मैन्युअल रूप से सुई की नोक पर वायरस के बोलस रखें और पंप नियंत्रण का उपयोग करके सिरिंज प्लंजर को वापस लें।
    9. पंप इंजेक्शन की मात्रा 300 nL और प्रवाह दर 100 nL / min पर सेट करें। पंप चलाएं और सुई की नोक पर वायरस की बूंद को देखकर उचित प्रवाह की पुष्टि करें। कपास की कली पर वायरस को अवशोषित करें और धीरे से सुई को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें।
    10. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर एडजस्टर स्क्रू का उपयोग करके सुई की नोक को ब्रेग्मा (खोपड़ी पर वह बिंदु जहां कोरोनल और धनु सीवन मिलते हैं) पर नेविगेट करें और फ्रेम पर तीन वर्नियर स्केल पर देखे गए स्टीरियोटैक्सिक मापों पर ध्यान दें। चूहे एमपीएफसी के ब्रेग्मा के सापेक्ष निर्देशांक पूर्ववर्ती-पश्चवर्ती + 3.1 मिमी, मेडियोलेटरल ± 0.7 मिमी, डोरसोवेंट्रल - 4.5 मिमी; ब्रेग्मा निर्देशांक से इन दूरियों को जोड़ें/ घटाएं (जैसा कि संकेत दिया गया है), और फिर सुई को पूर्ववर्ती-पीछे और मेडियोलेटरल निर्देशांक पर नेविगेट करें और धीरे से सुई को खोपड़ी की सतह पर कम करें।
      नोट: ऊपर दिए गए एमपीएफसी निर्देशांक 300-350 ग्राम के पुरुष लिस्टर हुड वाले चूहों के लिए उपयुक्त हैं; चूहे के तनाव, आकार में परिवर्तन के लिए इन निर्देशांकों में परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है ( चर्चा देखें)।
    11. सुई को खोपड़ी की सतह से ऊपर उठाएं और इस बिंदु को एक बारीक-टिप स्थायी मार्कर पेन से चिह्नित करें। स्टीरियोटैक्सिक बांह पर लगे माइक्रो ड्रिल का उपयोग करके इस बिंदु पर एक बुर छेद बनाएं।
    12. पूर्व-निर्धारित डोरसोवेंट्रल समन्वय पर मस्तिष्क में सुई डालें और पूर्व-निर्धारित मात्रा (एमपीएफसी: 300 एनएल के लिए) डालें। बोलस के प्रसार की अनुमति देने के लिए सुई को 10 मिनट के लिए सीटू में छोड़ दें। सुई को हटाने पर, यह सुनिश्चित करने के लिए पंप चलाएं कि सुई अवरुद्ध नहीं है।
      नोट: मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान और सुई पथ में वायरस के बैकफ्लो को कम करने के लिए सुई को धीरे-धीरे (~ 3 मिमी / मिनट) डालें और हटा दें।
    13. हाइड्रेशन बनाए रखने के लिए 2.5 एमएल गर्म सोडियम क्लोराइड (0.9% डब्ल्यू / वी) और ग्लूकोज (5% डब्ल्यू / वी) घोल को चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
    14. चरण 1.4.12 दोहराएँ। दूसरे गोलार्ध के लिए।
    15. खोपड़ी चीरा लगाने और प्रक्रिया के पूरा होने पर, 2.5 एमएल सोडियम क्लोराइड और ग्लूकोज समाधान और दर्द प्रबंधन के लिए एक उपयुक्त, संस्थागत रूप से अनुशंसित, एनाल्जेसिक का प्रबंधन करें, उदाहरण के लिए, ब्यूप्रेनोर्फिन या मेलोक्सिकैम। बेहोश होने पर जानवर को लावारिस न छोड़ें। चूहे को एक गर्म रिकवरी बॉक्स में रखें जब तक कि वह पूरी तरह से होश में न आ जाए। पूरी तरह से ठीक होने के बाद केवल अन्य जानवरों के साथ घर के पिंजरे में लौटें।
    16. वायरल-ट्रांसक्रिप्टेड कृन्तकों के लिए पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल और आवास प्रक्रियाओं के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें। प्रयोग शुरू करने से पहले ऑप्सिन ट्रांसजेन को पर्याप्त रूप से व्यक्त करने के लिए कम से कम 2 सप्ताह तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: पारगमन के लिए आवश्यक समय पूर्व और बाद के सिनैप्टिक क्षेत्रों के बीच कनेक्शन की दूरी और ताकत पर निर्भर है। एमपीएफसी से एलईसी के लिए, 4-6 सप्ताह की आवश्यकता होती है।

2. तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

नोट: यहां हम मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं जो हमारे हाथों में वयस्क चूहों और चूहों से उच्च गुणवत्ता वाले कॉर्टिकल, हिप्पोकैम्पल और थैलेमिक स्लाइस प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है।

  1. विच्छेदन के लिए समाधान तैयार करें।
    1. 250 एमएल बीकर को ~ 200 एमएल बर्फ-ठंडा सुक्रोज काटने के घोल (189 एमएम सुक्रोज, 26 एमएम एनएएचसीओ3, 10 एमएम डी-ग्लूकोज, 5 एमएम एमजीएसओ4, 3 एमएम केसीएल, 1.25 एमएम एनएएच2पीओ4, और 0.2 एमएम सीएसीएल2 के साथ अल्ट्राप्योर पानी (यूपीडब्ल्यू) में बनाया गया है। कार्बोजेन के साथ बुलबुला (95% ओ2, 5% सीओ2) और बर्फ पर रखें।
    2. कमरे के तापमान पर कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ; 124 एमएम एनएसीएल, 26 एमएम एनएएचसीओ 3, 10 एमएम डी-ग्लूकोज,3 एमएम केसीएल, 2 एमएम सीएसीएल 2,1.25 एमएम एनएएच2पीओ4, और यूपीडब्ल्यू में बने 1 एमएम एमजीएसओ4 ) के साथ एक स्लाइस संग्रह कक्ष भरें, कार्बोजेन के साथ बुलबुला। स्लाइस संग्रह कक्ष14 एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रैक से बनाया गया है जिसे नायलॉन जाल की शीट पर चिपकाया जाता है और एक बीकर में रखा जाता है जिसमें यह एसीएसएफ (चित्रा 2 ए) में डूबा होता है।
    3. फॉस्फेट बफर (पीबी; 75.4 एमएम एनए 2 एचपीओ 4.7एच2 ओ और24.6एमएमएनएएच2पीओ 4) में4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ एक 50 एमएल ट्यूब भरें। एच2ओ)।
      चेतावनी: पीएफए विषाक्त है। फ्यूम हुड में उपयोग करें।
  2. मस्तिष्क का विच्छेदन।
    1. 5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके एक प्रेरण कक्ष में चूहे को एनेस्थेटाइज करें जब तक कि सांस धीमी और नियमित न हो (~ 1 हर्ट्ज)। पेडल और कॉर्नियल रिफ्लेक्सिस की अनुपस्थिति के लिए एनेस्थीसिया परीक्षण का पर्याप्त स्तर सुनिश्चित करना।
    2. गिलोटिन का उपयोग करके जानवर का सिर काट दें।
    3. पहले वर्णित15 के रूप में पूरे मस्तिष्क को तेजी से विच्छेदित करें और सुक्रोज काटने के समाधान में स्थानांतरित करें। अच्छी स्लाइस गुणवत्ता और सफल पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए 90 सेकंड के भीतर चरण पूरा करें।
    4. धातु चम्मच का उपयोग करके, मस्तिष्क को उठाएं, अतिरिक्त काटने के घोल को त्याग दें, और इसे बेंचटॉप पर फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर रखें।
    5. एक स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग करके, जल्दी से सेरिबैलम को हटा दें और कोरोनल विमान में सेरेब्रम को इसकी लंबाई के साथ लगभग आधे रास्ते में काट लें; पीछे का आधा हिस्सा एलईसी ऊतक ब्लॉक है। अगले चरणों के लिए कटा हुआ क्षेत्र के अलावा कुछ अतिरिक्त ऊतक शामिल करना सुनिश्चित करें। इस ऊतक ब्लॉक और मस्तिष्क के शेष दोनों को सुक्रोज काटने के समाधान में वापस करें।
    6. एक विब्राटोम ऊतक चरण पर साइनोएक्रिलेट गोंद की एक बूंद रखें। इसे पिछले चरण में बनाए गए ऊतक ब्लॉक की तुलना में थोड़ा बड़ा क्षेत्र के साथ एक पतली परत में फैलाएं।
    7. एक चम्मच का उपयोग करके एलईसी ऊतक ब्लॉक उठाएं, अतिरिक्त घोल को छोड़ दें, और गोंद पैच पर स्थानांतरित करें ताकि पूर्ववर्ती कोरोनल कट का पालन किया गया हो।
    8. मंच को वाइब्रेटोम ऊतक कक्ष में स्थापित करें और ऊतक को जलमग्न करने के लिए जल्दी से पर्याप्त मात्रा में सुक्रोज काटने का घोल डालें; कार्बोजेन के साथ इस घोल को बुलबुला करें। एलईसी ऊतक ब्लॉक को उदर सतह के साथ ब्लेड की ओर उन्मुख करें। जबकि परिवेश कक्ष प्रकाश ऑप्सिन को सक्रिय करने के लिए अपर्याप्त है, अतिरिक्त प्रकाश स्रोतों का उपयोग करने से बचें जो वाइब्रेटोम पर मौजूद हो सकते हैं।
    9. उच्च ब्लेड दोलन गति (100 हर्ट्ज) और धीमी ब्लेड उन्नति गति (0.06 मिमी / सेकंड) का उपयोग करके उदर से पृष्ठीय तक 350 μm मोटाई के स्लाइस काटें। आमतौर पर, प्रति गोलार्ध सात एलईसी स्लाइस प्राप्त किए जा सकते हैं।
    10. स्लाइस को स्लाइस संग्रह कक्ष में स्थानांतरित करें। स्लाइस संग्रह के पूरा होने पर, कमरे के तापमान पर लौटने से पहले संग्रह कक्ष को 1 घंटे के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित करें। कार्बोजेन के साथ लगातार बुलबुला। स्लाइस कम से कम 6 घंटे के लिए रिकॉर्डिंग के लिए पर्याप्त रूप से स्वस्थ होंगे।
    11. इंजेक्शन साइट की पोस्ट-हॉक परीक्षा के लिए मस्तिष्क के शेष भाग को 48 घंटे के लिए पीएफए में रखें (अनुभाग 4 देखें)।

3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना

  1. लक्ष्य सेल की पहचान।
    1. स्लाइस को एक पेरिस्टालिक पंप द्वारा 2 एमएल / मिनट की दर से एसीएसएफ के साथ 34 डिग्री सेल्सियस पर एक जलमग्न रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें। स्लाइस एंकर का उपयोग करके स्लाइस को स्थिर करें।
    2. तिरछी अवरक्त रोशनी का उपयोग करके एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप के कम आवर्धन (4x) उद्देश्य के तहत, एलईसी परत 5 पर नेविगेट करें। पाईल सतह से आवश्यक परत तक की दूरी को मापें।
      नोट: कवरस्लिप के तल पर ~ 55 ° के कोण पर रिकॉर्डिंग कक्ष कवरस्लिप के लगभग 3 मिमी नीचे इन्फ्रा-लाल एलईडी को रखकर तिरछी अवरक्त रोशनी हासिल की गई थी (चित्रा 2 बी)। विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट स्लाइस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए एक वैकल्पिक और आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली इमेजिंग तकनीक है।
    3. एक उच्च आवर्धन जल विसर्जन उद्देश्य (40x) में परिवर्तन करें और पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान करें। टेप के साथ कंप्यूटर मॉनिटर पर सेल की स्थिति चिह्नित करें।
      नोट: पिरामिड न्यूरॉन्स में लगभग त्रिकोणीय आकृति विज्ञान होता है जिसमें प्रमुख एपिकल डेंड्राइट स्लाइस की पियाल सतह की ओर प्रोजेक्ट करते हैं (चित्रा 3 ए)। कोशिका स्वास्थ्य का मूल्यांकन संघनित, दृश्य नाभिक की अनुपस्थिति और प्लाज्मा झिल्ली के निरीक्षण से किया जा सकता है जो चिकनी दिखाई देनी चाहिए। यह संभावना नहीं है कि ओप्सिन-फ्लोरोफोरे संलयन प्रोटीन द्वारा अक्षतंतु की स्पष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग एक विस्तृत क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय दिखाई देगी। अक्षीय अनुमानों की कल्पना करने के लिए, ऑप्सिन के फ्लोरोफोरे के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री पोस्ट-हॉक करें और एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक ही या समान तरंग दैर्ध्य के फ्लोरोफोरे में संयुग्मित करें।
  2. पूरे सेल पैच-क्लैंप का गठन।
    1. पिपेट पुलर का उपयोग करके एक बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रोपिपेट बनाएं और फ़िल्टर किए गए इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग समाधान (120 एमएम के-ग्लूकोनेट, 40 एमएम एचईपीईएस, 10 एमएम केसीएल, 2 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम एमजीएटीपी, 1 एमएम एमजीसीएल, 0.3 एमएम एनएजीटीपी, 0.2 एमएम ईजीटीए, और यूपीडब्ल्यू में बने 0.25% बायोसाइटिन, पीएच 7.25, 285-300 एमओएसएम) से भरें। पैच-क्लैंप एम्पलीफायर हेडस्टेज पर इलेक्ट्रोड धारक में भरे हुए माइक्रोपिपेट रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि इलेक्ट्रोड तार इंट्रासेल्युलर समाधान के संपर्क में है।
    2. इलेक्ट्रोड होल्डर साइड पोर्ट पर ट्यूबिंग द्वारा जुड़े माउथपीस (जैसे प्लंजर के साथ 1 एमएल सिरिंज) में जोर से उड़ाकर मुंह से सकारात्मक दबाव लागू करें और इन-लाइन थ्री-वे वाल्व को बंद करके दबाव बनाए रखें। माइक्रोस्कोप उद्देश्य को इस तरह उठाएं कि एक मेनिस्कस बनता है और इलेक्ट्रोड को मेनिस्कस में डालें जब तक कि इसे माइक्रोस्कोप पर नहीं देखा जा सके।
    3. WinLTP16 (या अन्य अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर / ऑसिलोस्कोप) में सील टेस्ट विंडो खोलें और वोल्टेज-क्लैंप मोड में एम्पलीफायर के साथ, यह निर्धारित करने के लिए 5 mV वर्ग पल्स लागू करें कि पिपेट प्रतिरोध 3-6 MH है या नहीं।
    4. पिपेट टिप के साथ पहचाने गए सेल पर संपर्क करें और स्पर्श करें; इसके परिणामस्वरूप कोशिका झिल्ली (चित्रा 3 ए; दाएं पैनल) में एक इंडेंटेशन और पिपेट प्रतिरोध (0.1 एम) में थोड़ी वृद्धि होनी चाहिए।
    5. सकारात्मक दबाव छोड़ें और मुखपत्र पर मध्यम चूषण लागू करके नकारात्मक दबाव लागू करें; इसके परिणामस्वरूप पिपेट प्रतिरोध (>1000 एमई) में भारी वृद्धि होनी चाहिए। दबाव को अब तटस्थ छोड़ा जा सकता है। धीरे-धीरे बढ़ते रैंप में नकारात्मक दबाव लागू करें जब तक कि कोशिका झिल्ली टूट न जाए जिसके परिणामस्वरूप पूरे सेल कैपेसिटेंस क्षणिक होते हैं।
  3. रिकॉर्ड ऑप्टोजेनेटिक रूप से सिनैप्टिक घटनाओं को जन्म दिया।
    1. वर्तमान-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन दर्ज करें.
      नोट: ज्यादातर मामलों में लंबी दूरी का सिनैप्टिक ट्रांसमिशन ग्लूटामेटर्जिक है, इसलिए क्लोराइड रिवर्सल क्षमता के करीब झिल्ली क्षमता पर रिकॉर्डिंग एएमपीए रिसेप्टर (एएमपीएआर) -मध्यस्थता संचरण को सबसे अच्छा अलग करेगी और किसी भी फीड-फॉरवर्ड अवरोध (एफएफआई) के माप को कम करेगी। क्लोराइड रिवर्सल इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग समाधान और एसीएसएफ की संरचना पर निर्भर है और इसकी गणना गोल्डमैन-हॉजकिन-काट्ज़ समीकरण का उपयोग करके की जा सकती है; उपरोक्त समाधानों के लिए, यह -61.3 एमवी था। लेयर 5 एलईसी पिरामिड न्यूरॉन्स में -62 एमवी की औसत आराम झिल्ली क्षमता थी और, जहां आवश्यक हो, निरंतर प्रवाह के इंजेक्शन द्वारा इस क्षमता को बनाए रखा गया था। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को वांछित क्षमता तक वोल्टेज दिया जा सकता है। लंबी दूरी के निरोधात्मक अनुमानों को रिकॉर्ड करने के लिएया एफएफआई रिकॉर्ड करने के लिए, केशन रिवर्सल क्षमता पर वोल्टेज-क्लैंप जीएबीर्जिक क्लोराइड चालकता को अलग करने के लिए। जब एक्शन पोटेंशियल थ्रेशोल्ड से ऊपर झिल्ली क्षमता पर वोल्टेज-क्लैंपिंग न्यूरॉन्स होते हैं, तो वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल ब्लॉकर्स युक्त सीज़ियम-आधारित इंट्रासेल्युलर समाधान का उपयोग वोल्टेज-क्लैंप में सुधार करने और एक्शन पोटेंशिअल (130 एमएम सीएसएमईएसओ4, 10 एमएम एचईपीईएस, 8 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम क्यूएक्स 314 क्लोराइड, 4 एमएम एमजीएटीपी, 0.5 एमएम ईजीटीए, 0.3 एमएम एनएजीटीपी, 0.25% बायोसाइटिन) को रोकने के लिए किया जाता है। पीएच 7.25, 285-300 एमओएसएम)।
    2. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, माउंटेड 470 एनएम एलईडी को सक्रिय करने के लिए एलईडी ड्राइवर को ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर लॉजिक (टीटीएल) सिग्नल भेजें। माउंटेड एलईडी को फिल्टर क्यूब्स और उपयुक्त ऑप्टिक्स (चित्रा 2 बी) का उपयोग करके माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ में निर्देशित किया जाता है ताकि ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजक पोस्ट-सिनैप्टिक पोटेंशिअल (ओईपीएसपी) पैदा करने के उद्देश्य से 40x उद्देश्य के माध्यम से स्लाइस पर हल्की दालें लागू की जा सकें।
      नोट: हल्की दालों को डेंड्राइट पर पेरिसोमैटिक रूप से लागू किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अक्षतंतु और प्रीसिनेप्टिक बाउटन में ऑप्सिन की सक्रियता होगी, या अन्वेषक ओवर-बाउटन उत्तेजना से बचने के लिए उद्देश्य को रिकॉर्ड किए गए सेल से दूर अक्षतंतु में स्थानांतरित कर सकता है ( चर्चा देखें)। अधिकतम ओईपीएसपी आयाम सिनैप्टिक प्रक्षेपण की ताकत, वायरल इंजेक्शन की प्रभावकारिता और उपयोग किए गए ऑप्सिन पर निर्भर करता है। ओईपीएसपी को अलग-अलग प्रकाश तीव्रता और / या अवधि18 द्वारा वांछित आयाम तक सीमित किया जा सकता है; प्रकाश दालों की अवधि को बदलना (अधिकतम एलईडी पावर आउटपुट पर 0.2-5 एमएस के बीच विशिष्ट अवधि, जिसके परिणामस्वरूप 4.4 एमडब्ल्यू / मिमी प्रकाश घनत्व19 होता है) एलईडी के बिजली उत्पादन को बदलने की तुलना में अधिक सुसंगत ओईपीएसपी आयाम देता है।
    3. अलग-अलग अंतर-उत्तेजना अंतराल (चित्रा 3 ई) के साथ कई हल्की दालों की ट्रेनों को वितरित करके प्रीसिनेप्टिक रिलीज गुणों (वोल्टेज में परिवर्तन) की जांच करें; ऑप्टोजेनेटिक रूप से उत्पन्न संचरण की व्याख्या करते समय सावधानी बरतनी चाहिए ( चर्चा देखें)।
    4. ओईपीएसपी19 या लिगेंड के आवेदन को बार-बार उजागर करके दीर्घकालिक प्लास्टिसिटी की जांच करें। प्लास्टिसिटी के प्रेरण से पहले स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए 5-10 मिनट के लिए ओईपीएसपी आयाम की निगरानी करें, और फिर स्थिर आयाम (आमतौर पर 30-40 मिनट) तक पहुंचने तक निगरानी करें।
      नोट: अधिकांश वर्तमान ऑप्सिन उच्च आवृत्तियों पर कई एक्शन पोटेंशिअल को मज़बूती से उत्पन्न करने में सक्षम नहीं हैं, उदाहरण के लिए, 100 हर्ट्ज पर वितरित 100 उत्तेजनाएं, जैसा कि आमतौर पर एलटीपी को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है।
    5. ओईपीएसपी मोनोसिनेप्टिक हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए, डेंड्राइटिक आर्बर पर उद्देश्य को रखकर और 0.5 μM टेट्रोडोटॉक्सिन और 100 μM एमिनोपाइरिडाइन की उपस्थिति में उत्तेजित करके ट्रांसड्यूस्ड मार्ग का ओवर-बाउटन सक्रियण करें। टेट्रोडोटॉक्सिन का आवेदन संचरण को समाप्त कर देगा यदि प्रतिक्रियाएं कार्रवाई क्षमता-निर्भर हैं और बाद में एमिनोपाइरिडाइन को शामिल करने से आंशिक रूप से संचरण बहाल हो जाएगा यदि ओईपीएसपी मोनोसिनेप्टिक रूप सेउत्पन्न होते हैं।
    6. बायोसाइटिन को न्यूरॉन भरने की अनुमति देने के लिए, पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन में प्रवेश करने के बाद कम से कम 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें। वोल्टेज-क्लैंप में, झिल्ली धारिता और इनपुट प्रतिरोध की निगरानी करें।
    7. धीरे-धीरे कोशिका के सोमा से दूर पहुंच कोण के साथ पिपेट को वापस ले लें, यह देखते हुए कि धारिता क्षणिकता और झिल्ली प्रवाह का धीमा गायब होना कोशिका झिल्ली के पुन: सीलिंग और पिपेट सिरे पर एक बाहरी पैच के गठन का संकेत देता है। स्लाइस के अभिविन्यास और स्लाइस के भीतर सेल (ओं) के स्थान पर ध्यान दें। स्लाइस को 24-वेल प्लेट में पीएफए में डालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें, और फिर 0.1 एम पीबी में स्थानांतरित करें।
      नोट: स्लाइस को एक सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि लंबे भंडारण की आवश्यकता है, तो पीबी को नियमित रूप से बदलें या सोडियम एज़ाइड युक्त पीबी का उपयोग करें (सोडियम एज़ाइड का 0.02% -0.2%)।

4. हिस्टोलॉजी

  1. स्लाइसिंग इंजेक्शन साइट
    1. निर्धारण के बाद, क्रायो क्रायो पीबी में 30% सुक्रोज (डब्ल्यू / वी) में ऊतक की रक्षा करता है जब तक कि यह डूब न जाए (यह शुरू में सुक्रोज समाधान में तैरेगा), आमतौर पर रात भर कमरे के तापमान पर या 24-48 घंटे 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) माध्यम का उपयोग करके, क्रायोस्टैट नमूना डिस्क में ऊतक का एक ब्लॉक संलग्न करें। चरण 4.1.3 से 4.1.4 का पालन करते हुए ऊतक ब्लॉक को फ्रीज करें।
    3. एक उपयुक्त कंटेनर में आइसोपेंटेन रखें। केवल नमूना डिस्क को डुबोएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऊतक आइसोपेंटेन के स्तर से ऊपर है। आइसोपेंटेन के कंटेनर को तरल नाइट्रोजन (या सूखी बर्फ) में कम करें और ऊतक को जमने दें।
    4. एक बार पूरी तरह से जम जाने के बाद (पूरा ऊतक ब्लॉक पीला और कठोर हो जाता है), ब्लॉक के तापमान को बराबर करने की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए क्रायोस्टेट कक्ष में ऊतक ब्लॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    5. -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट में 40 μm मोटे खंडों को काटें। ब्लेड से अनुभागों को निर्देशित करने के लिए एक अच्छा पेंटब्रश का उपयोग करें। एक कमरे के तापमान पर जमे हुए खंडों का पालन करें, पॉली-एल-लाइसिन लेपित, ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड को अनुभागों में स्लाइड को छूकर।
    6. प्रत्येक स्लाइड में लगभग 150 μL माउंटिंग माध्यम जोड़ें और एक कवरस्लिप के साथ कवर करें; कवरस्लिप पर धीरे से दबाकर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। कम से कम 12 घंटे (या रात भर) के लिए कमरे के तापमान पर फोटोब्लीचिंग और एयर-ड्राई से बचाने के लिए स्लाइड्स को कवर करें। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, वायरल इंजेक्शन साइट के स्थान की जांच करें।
  2. बायोसाइटिन धुंधला प्रोटोकॉल
    नोट: यह प्रोटोकॉल मोटे वर्गों पर लागू किया जा सकता है; स्लाइस को फिर से विभाजित करने की आवश्यकता नहीं है।
    1. फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस; 137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 10 एमएम एनए 2 एचपीओ4, और 1.8 एमएमकेएच 2पीओ4) के साथ मस्तिष्क स्लाइसको10 मिनट प्रति धोने के लिए छह बार धोएं। प्रत्येक चरण के बाद कुओं को खाली करने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें।
    2. किसी भी अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिएपीबीएसमें 3% एच2 ओ 2 (डब्ल्यू / वी) में स्लाइस को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह ऑक्सीजन बुलबुले उत्पन्न करता है।
    3. मस्तिष्क स्लाइस को पीबीएस के साथ छह बार 10 मिनट प्रति धोने के लिए धोएं या जब तक कोई और ऑक्सीजन बुलबुले दिखाई न दें। मस्तिष्क स्लाइस को पीबीएस में 1% (वी / वी) एविडिन-बायोटिनिलेटेड एचआरपी कॉम्प्लेक्स (एबीसी) समाधान में इनक्यूबेट करें जिसमें 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 0.1% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 होता है।
    4. मस्तिष्क स्लाइस को पीबीएस के साथ 10 मिनट प्रति धोने के लिए छह बार धोएं।
    5. प्रत्येक स्लाइस को 3,3'-डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) समाधान में कई मिनटों के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि न्यूरोनल संरचनाओं का बायोसाइटिन धुंधला दिखाई न दे (लगभग 5-10 मिनट लगता है)।
      चेतावनी: डीएबी विषाक्त है। फ्यूम हुड में उपयोग करें।
      नोट: डीएबी इनक्यूबेशन समय अप्रत्याशित हो सकता है, रंग विकसित होने पर ऊतक की बारीकी से निगरानी करें।
    6. स्लाइस को ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस में स्थानांतरित करके प्रतिक्रिया को रोकें। मस्तिष्क स्लाइस को पीबीएस के साथ 10 मिनट प्रति धोने के लिए छह बार धोएं। पॉली-एल-लाइसिन लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइस को माउंट करने के लिए ब्रश का उपयोग करें।
    7. एक साफ ऊतक के साथ सभी अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें। प्रत्येक स्लाइस को लगभग 200 μL माउंटिंग माध्यम के साथ कवर करें; कवरलिप्स के साथ कवर करें और हवा के बुलबुले को बाहर धकेलने के लिए कवरस्लिप पर धीरे से दबाएं। कम से कम 12 घंटे (या रात भर) के लिए कमरे के तापमान पर हवा-सूखी। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सेल (ओं) के स्थान और रूपात्मक विवरणों की जांच करें।
      नोट: बायोसाइटिन को वैकल्पिक रूप से फ्लोरोफोरे-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग करके देखा जा सकता है; हालांकि, इमेजिंग को रिसेक्शन या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप21 के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन करते हैं कि ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं के वायरल वितरण का उपयोग करके लंबी दूरी के सिनैप्टिक फिजियोलॉजी और प्लास्टिसिटी का अध्ययन कैसे करें। प्रोटोकॉल को मस्तिष्क में लगभग किसी भी लंबी दूरी के कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए बहुत आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, हम चूहे एमपीएफसी में एक ऑप्सिन को एन्कोडिंग करने वाले एएवी के इंजेक्शन, एलईसी से तीव्र स्लाइस की तैयारी, लेयर 5 एलईसी पिरामिड न्यूरॉन्स से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और एलईसी में एमपीएफसी टर्मिनलों के प्रकाश-उत्पन्न सक्रियण का वर्णन करते हैं (चित्रा 1)।

एक स्वस्थ पिरामिड सेल स्थित और पैच किया गया था (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 ए)। वर्तमान एमपीएफसी से एलईसी उदाहरण में, पोस्ट-सिनैप्टिक कोशिकाओं को लेबल नहीं किया गया था; यदि पोस्ट-सिनैप्टिक सेल पहचान की आवश्यकता होती है, तो फ्लोरोसेंट मार्कर को व्यक्त करने वाले सेल को वाइडफील्ड ऑप्टिक्स (जैसे, चित्रा 3 बी) का उपयोग करके स्थानीयकृत किया जाना चाहिए। प्रयोग से पहले सेल के स्वास्थ्य का मूल्यांकन इन्फ्रारेड ऑप्टिक्स द्वारा किया जाना चाहिए। एलईसी में एमपीएफसी अक्षतंतु को सक्रिय करने के लिए, माइक्रोस्कोप उद्देश्य (चित्रा 1) के माध्यम से एक एलईडी को सीधे परत 5 सेल सोमा और समीपस्थ डेंड्राइट पर रखा गया था, जिसके परिणामस्वरूप 2 एमएस की एकल प्रकाश दालों के परिणामस्वरूप सरल वेवफॉर्म ओईपीएसपी (चित्रा 3 सी) हुआ; ओईपीएसपी के चरम आयाम को मापा जा सकता है। सिनैप्स की अल्पकालिक प्लास्टिसिटी की जांच करने के लिए, प्रकाश उत्तेजना की 5, 10 और 20 हर्ट्ज ट्रेनों को लागू किया गया था (चित्रा 3 ई)। दीर्घकालिक प्लास्टिसिटी की जांच करने के लिए, 10 मिनट के लिए बेसलाइन ओईपीएसपी आयाम की निगरानी के बाद कोलीनर्जिक एगोनिस्ट, कार्बाचोल को 10 मिनट के लिए परिसंचारी एसीएसएफ में जोड़ा गया था। इसने दीर्घकालिक अवसाद का कारण बना जो लिगैंड को हटाने के 40 मिनट बाद भी स्पष्ट था (चित्रा 3 डी)।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग प्रयोगों के बाद, वायरल इंजेक्शन साइट वाले मस्तिष्क के ऊतकों को वर्गीकृत किया गया था और इंजेक्शन साइट की लंबाई की जांच की गई थी (चित्रा 4 ए)। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर, एमचेरी, प्रीलिम्बिक और इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स (कृंतक एमपीएफसी के घटक क्षेत्रों) की गहरी परतों के लिए स्थानीयकृत है। इन परतों को लक्षित किया गया था क्योंकि एलईसी के प्रक्षेपण को मुख्य रूप से गहरी कॉर्टिकल परतों से उत्पन्न दिखाया गयाहै। एमचेरी पॉजिटिव फाइबर को सफेद पदार्थ पथ में शामिल होते हुए भी देखा जा सकता है। वायरल इंजेक्शन प्लेसमेंट को अनुकूलित करने के लिए एक पायलट प्रयोग में, एलईसी के 40 μm अनुभागों को लिया गया और जांच की गई; एमचेरी पॉजिटिव फाइबर को एलईसी की परत 5 में देखा जा सकता है (चित्रा 4 बी)। अंत में, बायोसाइटिन से भरे सेल को दाग दिया गया था, जिससे इसके स्थान और आकृति विज्ञान की पुष्टि की जा सके (चित्रा 4 सी, डी)।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक अवलोकन। (ए) वायरल वेक्टर इंजेक्शन को मेडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी) में बदलना, ऑप्टोजेनेटिक निर्माण के साथ एमपीएफसी कोशिकाओं का पारगमन, और पार्श्व एंटोरिनल कॉर्टेक्स (एलईसी) में टर्मिनलों तक निर्माण का परिवहन। (बी) एक तीव्र एलईसी स्लाइस में परत 5 पिरामिड न्यूरॉन्स से पूरे सेल रिकॉर्डिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के माध्यम से एमपीएफसी टर्मिनलों का प्रकाश सक्रियण। संक्षेप: सीए = कॉर्नू एम्मोनिस; पेरी = पेरिरिनल कॉर्टेक्स; TR = संक्रमण क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: पूरे सेल रिकॉर्डिंग, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना और टीडीटोमेटो पॉजिटिव न्यूरॉन्स की पहचान के लिए स्लाइस संग्रह कक्ष और ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन। (A) स्लाइस संग्रह कक्ष14 एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रैक से बनाया गया है जो नायलॉन जाल की शीट पर चिपका हुआ है और एक बीकर में रखा गया है जिसमें यह एसीएसएफ (B) में डूबा हुआ है सीएचआर 2 (470 एनएम) और टीडीटोमेटो (565 एनएम) की उत्तेजना के लिए एलईडी को एक गोलाकार कंडेनसर लेंस के माध्यम से निर्देशित किया जाता है ताकि प्रकाश को मिलान किया जा सके, टीडीटोमैटो उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के वर्णक्रमीय पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए बैंड-पास फिल्टर के माध्यम से 565 एनएम प्रकाश बीम किया जाता है। इन्हें एक लंबे-पास डाइक्रोइक दर्पण के साथ जोड़ा जाता है और लंबी तरंग दैर्ध्य के दूसरे लंबे-पास डाइक्रोइक दर्पण के साथ स्लाइस की ओर निर्देशित किया जाता है। प्रकाश तब उद्देश्य लेंस के माध्यम से स्लाइस पर केंद्रित होता है। प्रयोगों में जहां टीडीटोमेटो लेबल न्यूरॉन्स मौजूद होते हैं, उत्सर्जित फ्लोरोसेंट प्रकाश डाइक्रोइक दर्पण और उत्सर्जन फिल्टर से गुजरता है और एक अक्रोमैटिक लेंस द्वारा कैमरा सेंसर पर केंद्रित होता है। स्लाइस की गैर-फ्लोरोसेंट विशेषताओं को स्लाइस कक्ष के नीचे से लागू इन्फ्रा-रेड (एनआईआर) प्रकाश के पास तिरछे अपवर्तित द्वारा कल्पना की जाती है; यह प्रकाश प्रकाशिकी को कैमरे से गुजरता है और इस प्रकार फ्लोरोसेंट और एनआईआर इमेजिंग के बीच फ़िल्टर-क्यूब्स को बदलने की आवश्यकता को नकारता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
फ्लोरोसेंट इमेजिंग के तहत न्यूरॉन्स का विज़ुअलाइज़ेशन और ओईपीएसपी के प्रतिनिधि उदाहरण। (ए) बाएं: एनआईआर प्रकाश के साथ पिरामिड आकृति विज्ञान के साथ न्यूरॉन का उदाहरण। दाएं: पैच पिपेट से सकारात्मक दबाव के कारण अवतल डिंपल के गठन के साथ एक ही न्यूरॉन। (बी) एक एकल न्यूरॉन में टीडीटोमैटो की क्रे-रिकोम्बिनेस निर्भर अभिव्यक्ति। (सी) पिरामिड सेल में एलईसी परत 5 से प्रतिनिधि ओईपीएसपी। (डी) 10 μm carbachol (CCh) को जोड़ने के बाद समय के साथ OEPSP की निगरानी करने वाले दीर्घकालिक प्लास्टिसिटी प्रयोग का उदाहरण। डॉटेड लाइन दवा जोड़ने से पहले बेसलाइन अवधि के दौरान औसत ओईपीएसपी आयाम को इंगित करती है। (E) 5, 10 और 20 हर्ट्ज पर उत्तेजना की ट्रेनों के प्रतिनिधि निशान। नीले तीर प्रकाश सक्रियण को दर्शाते हैं। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: इंजेक्शन साइट का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन और बायोसाइटिन भरे सेल की वसूली। (ए) कोरोनल फोटोमाइक्रोग्राफ एमपीएफसी में वायरल इंजेक्शन साइट दिखाता है, ब्रेग्मा से +3.00 मिमी। (बी) एलईसी का पतला कोरोनल खंड जो एमचेरी + फाइबर को दर्शाता है। (सी) एलईसी में बायोसाइटिन भरे पिरामिड सेल के साथ, ब्रेग्मा से -6.2 मिमी मोटी तीव्र स्लाइस की कम शक्ति छवि। डैश्ड बॉक्स को डी (डी) एलईसी पिरामिड सेल में उच्च आवर्धन पर दिखाया गया है; एपिकल डेंड्राइट को परत 1 की ओर जाने वाली छवि के दाईं ओर देखा जा सकता है। धराशायी रेखाएं क्षेत्रीय सीमाओं को दर्शाती हैं। संक्षेप: आईएल = इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स; पीएल = प्रीलिम्बिक कॉर्टेक्स; डब्ल्यूएम = सफेद पदार्थ। स्केल पट्टियाँ = 250 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एएवी एन्कोडिंग ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रदान करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के संयोजन का उपयोग करके अत्यधिक विशिष्ट लंबी दूरी के सिनैप्टिक अनुमानों का पता लगाने की एक विधि का वर्णन किया गया है (चित्रा 1)। साथ में ये तकनीकें लंबी दूरी और शारीरिक रूप से फैलाने वाले मार्गों में उच्च परिशुद्धता के साथ मस्तिष्क सर्किटरी के शरीर विज्ञान और प्लास्टिसिटी को चिह्नित करने के लिए उपकरण प्रदान करती हैं जो पहले पारंपरिक, गैर-विशिष्ट, विद्युत उत्तेजना का उपयोग करके दुर्गम थे। सेल-विशिष्ट आणविक मार्करों के साथ संयोजन एक मस्तिष्क क्षेत्र से दूसरे क्षेत्र में विभिन्न परिभाषित सेल आबादी के लिए अनुमानों के लक्षण वर्णन की अनुमतिदेता है।

इस तकनीक की अत्यधिक सटीक प्रकृति का पूरा लाभ उठाने के लिए, मार्ग विशिष्टता को सत्यापित करना आवश्यक है। यह कई चरणों में किया जाता है; रिकॉर्डिंग के दौरान, सुनिश्चित करें कि जांच के तहत सिनैप्स मोनो-सिनैप्टिक (चरण 3.3.5) है। इसके बाद, हिस्टोलॉजिकल रूप से इंजेक्शन साइट की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वायरस रुचि के इच्छित पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र तक ही सीमित है और बायोसाइटिन दाग वाले पोस्ट-सिनैप्टिक सेल के स्थान और आकृति विज्ञान का आकलन करता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह अपेक्षित है।

वायरस चयन और सेलुलर विशिष्टता प्राप्त करना
तकनीक चूहों और चूहों दोनों में उपयोग के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय और उपयुक्त है। शारीरिक विशिष्टता की आवश्यकता वाले प्रयोग जंगली प्रकार के कृन्तकों के साथ किए जा सकते हैं। पोस्ट-सिनैप्टिक सेल प्रकार विशिष्टता की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित कृंतक तनाव की आवश्यकता हो सकती है यदि कोशिकाएं आकृति विज्ञान या स्थान के आधार पर पहचान योग्य नहीं हैं। उदाहरण के लिए, इंटरन्यूरॉन व्यक्त करने वाले पार्वलबुमिन (पीवी) को लक्षित करने के लिए, एक पीवी-क्रे नॉक-इन ट्रांसजेनिक माउस लाइन जिसमें पीवी-व्यक्त न्यूरॉन्स में क्रे-रिकोम्बिनेस व्यक्त किया जाता है, का उपयोग किया जा सकता है। इन कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, सीआरई-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए पीवी-क्रे लाइन को एक रिपोर्टर माउस लाइन के साथ पार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक क्रे-निर्भर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन को वायरल रूप से पेश किया जा सकता है। सीएचआर 2-फ्लोरोफोरे संलयन प्रोटीन कोशिका झिल्ली तक ही सीमित हैं और तीव्र स्लाइस में वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ देखे जाने पर न्यूरॉन की रूपरेखा के रूप में दिखाई दे सकते हैं, जिससे साइटोसोलिक फ्लोरोफोरेस का उपयोग करने की तुलना में पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए कोशिकाओं की पहचान अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाती है। यदि सीएचआर 2 का उपयोग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जा रहा है, तो सीएचआर 2 और फ्लोरोफोरे का पृथक्करण बिसिस्ट्रोनिक वैक्टर24 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यदि पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए लक्ष्य न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग कर रहे हैं, तो इसकी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य आदर्श रूप से ऑप्सिन के सक्रियण तरंग दैर्ध्य के साथ ओवरलैप नहीं होनी चाहिए; यह रिकॉर्ड करने के लिए न्यूरॉन्स की खोज करते समय ट्रांसड्यूस्ड अभिवाही के लंबे समय तक सक्रियण से बच जाएगा। इसी तरह, पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक रिपोर्टर वर्णक्रमीय रूप से अलग होने चाहिए। आम संवाददाता एमचेरी, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), और एन्हांस्ड येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईवाईएफपी) हैं।

उपयोग किए गए वायरल निर्माण में कई अलग-अलग घटक होते हैं, प्रत्येक प्रयोग की सफलता को प्रभावित कर सकता है और इसलिए प्रत्येक तत्व पर विचार किया जाना चाहिए। प्राथमिक महत्व ऑप्सिन के विकल्प को दिया जाना चाहिए। प्रीसिनैप्टिक सक्रियण के लिए, आदर्श ऑप्सिन में बड़े फोटोकरंट (भरोसेमंद रूप से अक्षतंतु को संभावित सीमा तक लाने के लिए), तेजी से ऑन-और ऑफ-कैनेटीक्स, और उच्च आवृत्ति बार-बार उत्तेजना की अनुमति देने के लिए डिसेन्सिटाइजेशन की धीमी दर होती है। एक नियम के रूप में, रैपिड कैनेटीक्स अक्सर छोटे फोटोकरंट25 की कीमत पर आते हैं; हालांकि, आणविक स्क्रीनिंग और इंजीनियरिंग ने बड़े फोटोकरंट के साथ ऑप्सिन प्रदान किए हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल CHR2 (E123T / T159C) ChETATC12 का उपयोग करता है, हालांकि क्रोनोस26, CheRiff27, oChIEFAC28, और ChRmine29 भी उपयुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, लाल-स्थानांतरित (क्रिमसनआर)26 या वायलेट-शिफ्टेड (चेरिफ) सक्रियण तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजक ऑप्सिन मौजूद हैं, जिन्हें सेल पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर के उत्तेजना स्पेक्ट्रा के साथ ओवरलैप से बचने की आवश्यकता हो सकती है (ऊपर देखें)।

एएवी का सीरोटाइप विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों और सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने की वेक्टर की क्षमता के साथ-साथ एंटेरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं दोनों में अक्षीय परिवहन की सीमा को प्रभावित कर सकताहै। न्यूरोनल ट्रांसडक्शन के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले सीरोटाइप 1, 2, 5, 8 और 9 हैं। एक साहित्य खोज एक संकेत दे सकती है कि किसी भी क्षेत्र में किस सीरोटाइप का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, कॉर्टिकल न्यूरॉन्स31 के पारगमन के लिए एएवी 9 की सिफारिश की गई है।

प्रोमोटर सेल प्रकार के विनिर्देश के लिए अनुमति देता है जिसमें ऑप्सिन व्यक्त किया जाएगा। प्रोमोटर्स कई वर्गों में आते हैं। सामान्य प्रोमोटर्स, उदाहरण के लिए, सीएजी या ईएफ 1 ए, अधिकांश सेल प्रकारों में अभिव्यक्ति का परिणाम है। न्यूरॉन-विशिष्ट प्रोमोटर्स, उदाहरण के लिए, सिनैप्सिन, सभी न्यूरॉन प्रकारों में अभिव्यक्ति उत्पन्न करते हैं। CaMKIIA का उपयोग आमतौर पर उत्तेजक न्यूरॉन्स के लिए अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने के लिए किया जाता है, हालांकि इसे लीक दिखाया गया है - कुछ अभिव्यक्ति इंटरन्यूरॉन32 में देखी गई है। एमडीएलएक्स एन्हांसर तत्व जीएबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन33 के लिए अभिव्यक्ति को सीमित करता है। प्री-सिनैप्टिक सेल प्रकार विशिष्टता को क्रे-माउस लाइन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है (जैसा कि पोस्ट-सिनैप्टिक सेल के लिए ऊपर वर्णित है)। इस मामले में, क्रे-व्यक्त कोशिकाओं के लिए ऑप्सिन अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए एक क्रे-निर्भर आनुवंशिक निर्माण की आवश्यकता होगी।

टिट्रे वायरल तैयारी में वायरल कणों की संख्या है। फिर, एक साहित्य खोज एक ऐसे टाइटर का संकेत दे सकती है जिसने किसी विशेष क्षेत्र में पर्याप्त पारगमन उत्पन्न किया है। क्रे-निर्भर प्रणाली का उपयोग करते समय, टिट्रे विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है क्योंकि उच्च वायरल टाइटर्स गैर-क्रे-व्यक्त कोशिकाओं में अभिव्यक्ति को ट्रांसड्यूस करसकते हैं।

वायरस वितरण का अनुकूलन
रुचि के क्षेत्र में सटीक वायरल वितरण इस दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। प्री-सिनैप्टिक क्षेत्र के इंजेक्शन निर्देशांक का अनुमान साहित्य और / या उपयुक्त प्रजातियों35,36 के लिए मस्तिष्क एटलस से परामर्श करके लगाया जा सकता है। प्रयोगकर्ता को तब सटीक इंजेक्शन निर्देशांक और मात्रा को अनुकूलित और परिष्कृत करने के लिए समय लेना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वायरल इंजेक्शन उनके प्रीसिनेप्टिक क्षेत्र तक ही सीमित है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब पड़ोसी क्षेत्र भी रिकॉर्डिंग साइट पर प्रोजेक्ट करते हैं। हम ऐसा करने के एक प्रभावी तरीके के रूप में वायरस की छोटी मात्रा का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यदि एक विशेष रूप से छोटी इंजेक्शन साइट की आवश्यकता होती है, तो सिरिंज और सुई के स्थान पर ग्लास माइक्रोपिपेट्स का उपयोग फायदेमंद हो सकताहै। पर्याप्त अवधि के लिए इंजेक्शन सुई को सीटू में छोड़ना और इंजेक्शन सुई की धीमी वापसी वायरस को सुई पथ में भागने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। इंजेक्शन की सटीकता की पुष्टि करने के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के माध्यम से उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक जानवर की इंजेक्शन साइट को हिस्टोलॉजिकल रूप से सत्यापित करना सबसे अच्छा अभ्यास है जहां संभव हो और डेटा को बाहर करें जहां वायरल ट्रांसडक्शन ऑफ-टारगेट है। हमारे हाथों में, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल कई अलग-अलग लंबी दूरी के कनेक्शनों के लिए सामान्य साबित हुआ है, जिसमें वेंट्रल मिडलाइन थैलेमिक नाभिक, हिप्पोकैम्पस, मेडियोडोरसल थैलेमस और एलईसी से पीएफसी तक के अनुमान शामिल हैं; पीएफसी से एलईसी और मेडियोडोरसल थैलेमस तक के अनुमान; एलईसी और वेंट्रल मिडलाइन थैलेमिक नाभिक से हिप्पोकैम्पस तक अनुमान (जफर बशीर लैब, ब्रिस्टल विश्वविद्यालय, अप्रकाशित अवलोकन19)। इन विभिन्न मार्गों के ऑप्टोजेनेटिक लेबलिंग को केवल इंजेक्शन निर्देशांक और वॉल्यूम के शोधन की आवश्यकता होती है।

प्रोटोकॉल सीमाएँ
मस्तिष्क का तेजी से विच्छेदन और सावधानीपूर्वक टुकड़े इन प्रयोगों की सफलता के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। यहां वर्णित स्लाइसिंग प्रोटोकॉल विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुकूलन के बिना स्वस्थ तीव्र स्लाइस उत्पन्न करता है; हालांकि, स्लाइसिंग मध्यम और पोस्ट-स्लाइसिंग इनक्यूबेशन तापमान में भिन्नता कहीं और वर्णित28 स्लाइस स्वास्थ्य में सुधार के लिए रिपोर्ट की गई है। इसके अलावा, हम एक ही क्षेत्र के वायरल ट्रांसडक्शन के बाद दो मस्तिष्क क्षेत्रों से तीव्र स्लाइस लेने में भी सक्षम हैं, इस प्रकार उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या कम हो गई है। हमने पाया है कि शारीरिक रूप से घने मार्गों में, वायरल ट्रांसडक्शन और रिकॉर्डिंग के बीच 7 दिनों की अवधि पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त परिमाण के मजबूत ओईपीएसपी को पैदा करने के लिए पर्याप्त है। लंबी दूरी या अधिक विरल अनुमानों में, लंबी देरी फायदेमंद होती है।

ऑप्टोजेनेटिक रूप से उत्पन्न गतिविधि के परिणामों की व्याख्या करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, विशेष रूप से अल्पकालिक प्लास्टिसिटी के संबंध में। पिछले परिणामों से पता चला है कि ऑप्टोजेनेटिक रूप से उत्पन्न संचरण विद्युत उत्तेजना की तुलना में बार-बार उत्तेजना पर अधिक स्पष्ट सिनैप्टिक अवसाद से गुजर सकता है, जो कई कारकों के कारण उत्पन्न हो सकता है। सबसे पहले, ऑप्सिन डिसेंसिटाइजेशन25 से प्रीसिनेप्टिक अक्षतंतु स्पाइकिंग की संख्या कम हो सकती है, जिससे पोस्टसिनेप्टिक प्रतिक्रियाएं कम हो सकती हैं। हाल ही में खोजे गए ऑप्सिन और आणविक इंजीनियरिंग (ऊपर देखें) से गुजरने वाले लोगों के बेहतर चैनल कैनेटीक्स ने डिसेन्सिटाइजेशन के प्रभावों को कम करने के लिए काफी हद तक काम किया है; हालांकि, 100 हर्ट्ज उत्तेजना कई ऑप्सिन की पहुंच से परे रहती है, जो कुछ दीर्घकालिक प्लास्टिसिटी प्रेरण प्रोटोकॉल के उपयोग में बाधा डाल सकती है (हालांकिदेखें 37)। दूसरा, ऑप्सिन की धीमी कैनेटीक्स कार्रवाई क्षमता को व्यापक बना सकती हैजिससे लंबे समय तक ट्रांसमीटर रिलीज और वेसिकुलर कमी हो सकती है; यह उत्तेजक ऑप्सिन11 की कैल्शियम पारगम्यता के परिणामस्वरूप भी हो सकता है; इन मुद्दों को ओवर-बाउटन फोटोएक्टिवेशन38 से बचकर कम किया जा सकता है। तीसरा, एएवी वैक्टर का उपयोग करके न्यूरॉन्स के पारगमन से कुछ सिनैप्स में प्रीसिनेप्टिक रिलीज गुणों में भी बदलाव हो सकता है; हालांकि, इसे एएवी 9 सीरोटाइप38 का उपयोग करके कम किया जा सकता है। इन सीमाओं के बावजूद, सावधानीपूर्वक उपयोग के साथ, ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण विद्युत उत्तेजना19,38 की नकल कर सकता है और इसलिए, अध्ययन नहीं किए गए सिनैप्टिक मार्गों के शरीर विज्ञान की जांच में एक अमूल्य उपकरण है। हम यह भी ध्यान देते हैं कि चित्रा 3 ई में दिखाए गए डेटा वर्तमान-क्लैंप में अल्पकालिक प्लास्टिसिटी का आकलन करते हैं और इसलिए, सिनैप्टिक क्षमता और आंतरिक झिल्ली गुणों की बातचीत के अधीन है, वोल्टेज-क्लैंप में समकक्ष प्रयोग करके इससे बचा जा सकता है।

भविष्य की दिशाएँ
लगातार विस्तारित ऑप्टोजेनेटिक टूलबॉक्स ने डाइवर्जेंट उत्तेजना स्पेक्ट्रा के साथ ऑप्सिन की एक जोड़ी का उपयोग करके, एक ही तैयारी में दो सिनैप्टिक मार्गों में इस तकनीक को लागू करने की संभावना बढ़ा दी है। यह एक ऑप्सिन क्रिमसन आर26 के उपयोग से संभव हो जाता है, जो सीएचआर 2 के विपरीत, लाल तरंग दैर्ध्य प्रकाश द्वारा फोटोएक्टिव होता है। क्रिम्सनआर नीली रोशनी के प्रति कम संवेदनशीलता को बरकरार रखता है, इस प्रकार क्रॉस पाथवे सक्रियण से बचने के लिए इसका उपयोग लाल-असंवेदनशील ऑप्सिन के साथ संयोजन में किया जा सकता है, जो बैंगनी स्थानांतरित होते हैं (चेरिफ 27) और / या नीली रोशनी के लिए उच्च संवेदनशीलता के आदेश होते हैं (क्रोनोस26)। यह नीले / बैंगनी प्रकाश उत्तेजनाओं के उपयोग की अनुमति देता है जो क्रिम्सन आर को महत्वपूर्ण रूप से सक्रिय करने के लिए बहुत कमजोर हैं और इसलिए दोमार्गों 39,40 के सक्रियण की अनुमति देते हैं, जो प्रयोगात्मक थ्रूपुट को बढ़ा सकते हैं, अभिसरण मार्ग इंटरैक्शन की परीक्षा की अनुमति देते हैं, औरअंतर्जात स्रोतों से न्यूरोमोडुलेटर की रिहाई की अनुमति देते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम वेलकम अनुदान 206401 / जेड / 17 / जेड द्वारा समर्थित है। हम जफर बशीर को उनके विशेषज्ञ मेंटरशिप के लिए और डॉ क्लेयर बूथ को पांडुलिपि पर तकनीकी सहायता और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL tube Fisher Scientific Ltd 12134102
10 µL pipette Gilson FD10001
24 well plate SARSTEDT 83.3922
3 way luer valve Cole-Parmer WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate Vector Laboratories SK-4105
40x objective Olympus LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine Hello Bio HB1073
4x objective Olympus PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry Addgene 35512 Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lens Edmund Optics 49363 Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge Benchmark Scientific C1005*
Biocytin Sigma-Aldrich B4261
Borosillicate glass capillary Warner Instruments G150F-6
Burr Fine science tools 19008-07
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Camera - Qimaging Retiga Electro Photometrics 01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol Tocris 2810
Chlorhexidine surgical scrub Vetasept XHG008
Clippers Andis 22445 AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens ThorLabs ACL2520-A
Coverslips Fisher Scientific Ltd 10011913
Cryostat Leica CM3050 S
CsMeSO4 Sigma-Aldrich C1426
Cyanoacrylate glue Rapid Electronics Ltd 84-4557
Data acquisition device National Instruments USB-6341 BNC
D-glucose Sigma-Aldrich G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass Edmund Optics 69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass Edmund Optics 69901
Dichroic mirror cube ThorLabs CM1-DCH/M
EGTA Millpore 324626
Electrode holder with side port HEKA 895150
Emission filter Chroma 59022m
Excitation filter Chroma ET570/20x
Eye gel Dechra Lubrithal
Fine paint brush Scientific Laboratory Supplies BRU2052
Guillotine World Precision Instruments DCAP
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich H1009 30% (w/w)
Isoflurane Henry Schein 988-3245
Isopentane Sigma-Aldrich M32631
KCl Sigma-Aldrich P3911
k-gluconate Sigma-Aldrich G4500
Kinematic fluorescence filter cube ThorLabs DFM1T1
LED driver ThorLabs LEDD1B
Lidocaine ointment Teva 80007150
MgATP Sigma-Aldrich A9187
MgCl Sigma-Aldrich M2670
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Micro drill Harvard Apparatus 75-1887
Microelectrode puller Sutter instruments P-87
Microinjection syringe Hamilton 7634-01/00
Microinjection syringe needle Hamilton 7803-05 Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pump World Precision Instruments UMP3T-1
Mounted blue LED ThorLabs M470L5
Mounted green LED ThorLabs M565L3
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich S9390
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
NaH2PO4.H2O Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
NIR LED OSRAM SFH4550 Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium VWR International RAYLLAMB/OCT Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch clamp amplifier Molecular Devices 700A
Peristaltic pump World Precision Instruments Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides Fisher Scientific Ltd 23-769-310
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Scalpel blade Swann Morton #24
Slice anchor Warner Instruments SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame Kopf Model 902
Stereotaxic holder for micro drill Harvard Apparatus 75-1874
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Surgical Microscope Carl Zeiss OPMI 1 FR pro
Suture Ethicon W577H
Syringe filter for intracellular recording solution Thermo Scientific Nalgene 171-0020
Tetrodotoxin citrate Hello Bio HB1035
Transfer pipettes Fisher Scientific Ltd 10458842
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Upright fluorescence microscope Leica DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit Vector Laboratories PK-4000
Vibratome Campden Instruments 7000smz-2
WinLTP https://www.winltp.com/ Version 2.32 Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
  3. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
  4. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  5. Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
  6. Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
  7. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  8. van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
  9. Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  12. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  13. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  14. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
  15. Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  16. Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
  17. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  18. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  19. Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
  20. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  21. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
  22. Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
  23. Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
  24. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  25. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
  26. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  27. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  29. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  30. Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
  32. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  33. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  34. Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
  35. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
  36. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
  37. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  38. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  39. Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
  40. Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
  41. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 180 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी ऑप्टोजेनेटिक्स सिनैप्टिक ट्रांसमिशन सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी चूहे चूहे न्यूरॉन्स
<em>एक्स वीवो</em> मिडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से लेटरल एंटोरिनल कॉर्टेक्स तक लंबी दूरी के सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और प्लास्टिसिटी की ऑप्टोजेनेटिक पूछताछ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex… More

Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex. J. Vis. Exp. (180), e63077, doi:10.3791/63077 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter