Summary
Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Beyindeki belirli sinapsların fizyolojik özelliklerini ve plastik değişikliklere nasıl maruz kaldıklarını incelemek, modern sinirbilimde önemli bir zorluktur. Geleneksel in vitro elektrofizyolojik teknikler, sinaptik iletimi uyandırmak için elektriksel stimülasyon kullanır. Bu yöntemin en büyük dezavantajı, spesifik olmayan doğasıdır; uyarıcı elektrot bölgesindeki tüm aksonlar aktive edilecek ve bu da belirli bir afferent bağlantıya bir etki atfetmeyi zorlaştıracaktır. Bu sorun, elektriksel stimülasyonun optogenetik temelli stimülasyonla değiştirilmesiyle aşılabilir. Optogenetiği in vitro yama-kelepçe kayıtlarıyla birleştirmek için bir yöntem tanımladık. Bu, anatomik olarak tanımlanmış hassas sinaptik bağlantıların hem bazal sinaptik iletiminin hem de sinaptik plastisitesinin incelenmesi için güçlü bir araçtır ve beyindeki hemen hemen her yola uygulanabilir. Burada, kemirgen beynindeki pre-sinaptik bir bölgeye (medial prefrontal korteks) cerrahi enjeksiyon için kanalrodopsin proteinini kodlayan bir viral vektörün hazırlanmasını ve işlenmesini ve aşağı akış hedef bölgelerinin (lateral entorinal korteks) akut dilimlerinin oluşturulmasını açıklıyoruz. Kısa ve uzun süreli sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyonla birleştirmek için ayrıntılı bir prosedür de sunulmaktadır. Optogenetik ve Cre-bağımlı hücre etiketlemesini birleştirerek yol ve hücre özgüllüğünü sağlayan deney örneklerini tartışıyoruz. Son olarak, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin histolojik doğrulaması, kesin konumun ve hücre tipinin daha fazla tanımlanmasına izin vermek için post-sinaptik hücrenin biyositin etiketlemesi ile birlikte açıklanmaktadır.
Introduction
Sinapsların fizyolojisini ve plastik değişikliklere nasıl uğradıklarını anlamak, beyin ağlarının sağlıklı beyinde nasıl çalıştığını anlamak için esastır1 ve beyin bozukluklarında nasıl arızalandıklarını anlamak için temeldir. Akut ex vivo beyin dilimlerinin kullanılması, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları kullanılarak tek nöronlardan sinapsların elektriksel aktivitesinin yüksek sinyal-gürültü oranıyla kaydedilmesini sağlar. Membran potansiyelinin kontrolü ve basit farmakolojik manipülasyon, reseptör alt tiplerinin izolasyonuna izin verir. Bu kayıtlar, laminer ve alt bölgesel pozisyon2, hücresel morfoloji3, moleküler belirteçlerin varlığı4, afferent projeksiyonları5 veya yakın zamanda aktif olsa bile6 dahil olmak üzere post-sinaptik nöronu tanımlamak için mükemmel bir özgüllükle yapılabilir.
Bununla birlikte, sinaptik öncesi girdilerin özgüllüğünü elde etmek biraz daha zordur. Geleneksel yöntem, belirli bir laminada çalışan aksonları uyarmak için stimülasyon elektrotları kullanmıştır. Bunun bir örneği, stratum radiatumdaki lokal stimülasyonun, CA3'ten CA1 alt alanı7'ye yansıyan sinapsları aktive ettiği hipokampustadır. Bu örnekte, CA3 girişi, CA1 piramidal hücrelere8 yansıyan stratum radyatumunda bulunan tek uyarıcı girişi temsil ettiği için presinaptik özgüllük elde edilir. Bununla birlikte, CA3-CA1 eksenlerinin geleneksel elektriksel presinaptik aktivasyonu ile elde edilebilen bu yüksek giriş özgüllüğü derecesi, bu sinapsın maruz kaldığı yoğun çalışmaya yansıyan bir istisnadır. Diğer beyin bölgelerinde, çoklu afferent yollardan gelen aksonlar aynı laminada, örneğin neokorteks9'un 1. tabakasında bir arada bulunur, böylece geleneksel uyarıcı elektrotlarla girişe özgü presinaptik stimülasyonu imkansız hale getirir. Farklı sinaptik girdiler farklı fizyolojik özelliklere sahip olabileceğinden bu sorunludur; bu nedenle, birlikte stimülasyonları sinaptik fizyolojinin yanlış karakterize edilmesine yol açabilir.
Optogenetiğin ortaya çıkışı, channelrhodopsin-2 (ChR2) gibi ışığa duyarlı membran proteinlerinin (opsinler) genetik kodlaması, beyin bölgeleri10,11 arasındaki izole sinaptik projeksiyonları incelemek için olasılıkların geniş bir genişlemesine izin vermiştir. Burada, uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisiteyi incelemek için genelleştirilebilir ve düşük maliyetli bir çözümü açıklıyoruz. Optogenetik yapılar, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin son derece hassas kontrolüne izin veren viral vektörler kullanılarak oldukça spesifik bir şekilde teslim edilir. Efferent projeksiyonları, bu liflerin bir hedef bölgede aktivasyonuna izin veren ışıkla aktive edilen kanalı ifade edecektir. Böylece, geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon ile bağımsız olarak aktive edilemeyen uzun menzilli, anatomik olarak dağınık yollar incelenebilir.
Örnek bir yol olarak, medial prefrontal korteksin (mPFC) uyarıcı katyon kanallı opsinleri kodlayan adeno ilişkili virüslerle (AAV'ler) transdüksiyonunu tanımladık. Daha sonra lateral entorinal korteksten (LEC) akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve glutamaterjik mPFC-LEC projeksiyonlarının ışıkla uyarılmış aktivasyonunu tanımladık (Şekil 1). Ayrıca, pre-sinaptik bölgenin yerini doğrulamak ve post-sinaptik hücre morfolojisinin tanımlanmasını doğrulamak için enjeksiyon bölgesinin histolojik değerlendirmesini de açıklayacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Birleşik Krallık Hayvanlar Bilimsel Prosedürler Yasası (1986) ve ilgili kılavuzların yanı sıra yerel kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Stereotaksik viral enjeksiyon
NOT: Mevcut protokol anatomik gerektirir, ancak sinaptik hücre sonrası hücre tipi değil, özgüllük gerektirir.
- Uygun hayvanı seçin. Bu protokolde erkek vahşi tip Lister kapüşonlu sıçanlar kullanıldı (300-350 g, yaklaşık 3 aylık).
- Uygun viral yapıyı seçin. Göz önünde bulundurulması gereken birkaç faktör vardır (bkz. Mevcut protokol, uyarıcı nöronları (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (E123T / T159C) - mCherry; titre: 3.3 x 10 13 viral genom / mL) dönüştürmek için optogenetik kanal ChETATC 12'yi eksprese etmek için bir virüs kullanır.
- Daha önce tarif edildiği gibi bir beyin atlası kullanarak enjeksiyonun koordinatlarını ve hacmini belirleyin35.
- Viral preparatın stereotaksik enjeksiyonu
NOT: Hayvanların kullanımı ve bakımı ile ilgili tüm ulusal ve kurumsal kılavuzlara uyulmalıdır. Viral vektörler daha önce tarif edildiği gibi stereotaksik olarak enjekte edilir13 aşağıdaki değişikliklerle.- Anestezi ve hayvanın hazırlanması sırasında viral preparatı buz üzerinde tutun.
- % 4 izofluran içeren bir anestezik indüksiyon odasında anesteziyi indükleyin. Daha yavaş düzenli solunum hızı (1 Hz) ve pedal ve kornea reflekslerinin yokluğu ile belirtilen anestezi seviyesini izleyin (sırasıyla ayak parmaklarını sıkıştırarak ve gözün köşesine hafifçe dokunarak test edin; yanıt tespit edilmemelidir).
- İnvaziv prosedürden en az 30 dakika önce meloksikam gibi ameliyat öncesi analjezik uygulayın.
- Hayvan tamamen anestezi altına alındığında, kürkü kafa derisinden çıkarmak için makas kullanın. İzofluran akışını stereotaksik çerçevenin burun konisine geçirin ve sıçanı çerçeveye monte edin. İşlem sırasında kuruluğu önlemek için gözlere yağlayıcı göz jeli uygulayın.
- Ameliyat aseptik koşullarda yapılmalıdır. İşlem boyunca steril eldivenler ve aletler kullanın. Kafa derisini% 4 w / v klorheksidin çözeltisi ile dezenfekte etmeden önce lidokain merhem (% 5 w / w) uygulayın ve ardından vücudu steril bir örtü ile örtün. Bir neşter kullanarak, bregmayı ortaya çıkarmak için kafa derisi üzerinde yaklaşık 15 mm uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapın.
- Bir Hamilton şırıngasını, stereotaksik çerçeveye monte edilmiş hareketli bir kola bağlı bir mikroenjeksiyon şırınga pompasına yükleyin.
- Virüsün 5 μL'lik bir alikotunu 0.2 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve tüm hacim tüpün dibinde olana kadar birkaç saniye döndürün. Pipet, tüpün kapağına viral preparatın 2 μL'sini verir.
- Önce iğne ucunu cerrahi mikroskopla görüntüleyerek şırıngayı viral preparatla doldurun ve ardından virüsün bolusunu manuel olarak iğnenin ucuna yerleştirin ve pompa kontrollerini kullanarak şırınga pistonunu geri çekin.
- Pompa enjeksiyon hacmini 300 nL'ye ve akış hızını 100 nL/dk'ya ayarlayın. Pompayı çalıştırın ve iğne ucundaki virüs damlacığını gözlemleyerek doğru akışı onaylayın. Virüsü bir pamuk tomurcuğu üzerinde emin ve iğneyi% 70 etanol ile nazikçe temizleyin.
- Stereotaksik çerçeve üzerindeki ayarlayıcı vidaları kullanarak iğne ucunu bregmaya (kafatası üzerinde koronal ve sagital sütürlerin buluştuğu nokta) yönlendirin ve çerçeve üzerindeki üç vernier ölçeğinde gözlenen stereotaksik ölçümleri not alın. Sıçan mPFC'nin bregmasına göre koordinatlar anterior-posterior + 3.1 mm, mediolateral ± 0.7 mm, dorsoventral - 4.5 mm'dir; Bu mesafeleri bregma koordinatlarından ekleyin / çıkarın (belirtildiği gibi) ve daha sonra iğneyi ön-arka ve mediolateral koordinatlara yönlendirin ve iğneyi yavaşça kafatası yüzeyine indirin.
NOT: Yukarıda verilen mPFC koordinatları, 300-350 g'lık erkek lister kapüşonlu sıçanlar için uygundur; sıçan suşundaki değişiklikler, boyut bu koordinatlarda değişiklikler gerektirebilir (bkz. - İğneyi kafatası yüzeyinden kaldırın ve bu noktayı ince uçlu kalıcı bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Bu noktada stereotaksik kola monte edilmiş bir mikro matkap kullanarak bir çapak deliği açın.
- İğneyi önceden belirlenmiş dorsoventral koordinatta beyne yerleştirin ve önceden belirlenmiş bir hacim aşılayın (mPFC için: 300 nL). Bolusun difüzyonuna izin vermek için iğneyi yerinde 10 dakika bekletin. İğnenin çıkarılmasından sonra, iğnenin tıkanmadığından emin olmak için pompayı çalıştırın.
NOT: Beyin dokusuna verilen hasarı ve virüsün iğne sistemine geri akışını en aza indirmek için iğneyi yavaşça (~ 3 mm / dak) takın ve çıkarın. - Hidrasyonu korumak için 2.5 mL ısıtılmış sodyum klorür (% 0.9 w / v) ve glikoz (% 5 w / v) çözeltisini deri altından uygulayın.
- 1.4.12 adımını yineleyin. ikinci yarımküre için.
- Kafa derisi insizyonunu dikin ve prosedürün tamamlanmasından sonra, 2.5 mL sodyum klorür ve glikoz çözeltisi ve ağrı yönetimi için uygun, kurumsal olarak önerilen, analjezik (örneğin, buprenorfin veya meloksikam) uygulayın. Bilinçsizken hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Sıçanı, bilincini tamamen geri kazanana kadar ısıtılmış bir kurtarma kutusuna yerleştirin. Sadece tamamen iyileştikten sonra diğer hayvanlarla ev kafesine dönün.
- Viral transfekte kemirgenler için ameliyat sonrası bakım ve barınma prosedürleri için kurumsal yönergeleri izleyin. Deneye başlamadan önce opsin transgeninin yeterince ifade etmesi için en az 2 hafta bekleyin.
NOT: Transdüksiyon için gereken süre, sinaptik öncesi ve sonrası bölgeler arasındaki bağlantının mesafesine ve gücüne bağlıdır. mPFC'den LEC'ye 4-6 hafta gereklidir.
2. Akut beyin dilimlerinin hazırlanması
NOT: Burada, elimizde yetişkin farelerden ve sıçanlardan yüksek kaliteli kortikal, hipokampal ve talamik dilimler elde etmek için yeterli olan beyin dilimlerinin hazırlanması için basit bir yöntem açıklıyoruz.
- Diseksiyon için çözeltileri hazırlayın.
- 250 mL'lik bir beheri, 25 mL sıcaklıkta 18,2 MΩ cm dirençliliğe sahip ultra saf suda (UPW) üretilen ~200 mL buz gibi soğuk sakkaroz kesme çözeltisi (189 mM sakaroz, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukoz, 5 mM MgSO4,3 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO4 ve 0,2 mM CaCl2ile doldurun ve25 °C'de 18,2 MΩ cm direnç gösterin veya yeterli hacim elde edin. Karbojenli kabarcık (% 95 O 2,% 5 CO2) ve buz üzerinde tutun.
- Bir dilim toplama odasını, karbojenle kabarcıklanmış oda sıcaklığında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukoz, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25mM NaH2 PO4 ve 1 mM MgSO4) ile doldurun. Dilim toplama odası14, bir naylon ağ tabakasına yapıştırılmış ve aCSF'ye batırıldığı bir beher içine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüp rafından özel olarak yapılmıştır (Şekil 2A).
- 50 mL'lik bir tüpü fosfat tamponunda %4 paraformaldehit (PFA) ile doldurun (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O ve 24,6 mM NaH2PO4). H2O).
DİKKAT: PFA toksiktir. Duman davlumbazında kullanın.
- Beynin diseksiyonu.
- Solunum yavaş ve düzenli olana kadar (~ 1 Hz) sıçanı% 5 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında anestezi yapın. Pedal ve kornea reflekslerinin yokluğu için yeterli düzeyde anestezi testi sağlamak.
- Bir giyotin kullanarak hayvanın kafasını kesin.
- Daha önce tarif edildiği gibi tüm beyni hızla diseke edin15 ve sakkaroz kesme çözeltisine aktarın. İyi dilim kalitesi ve başarılı tüm hücre kaydı için 90 saniyelik kafa kesme adımını tamamlayın.
- Metal bir çay kaşığı kullanarak beyni alın, fazla kesme solüsyonunu atın ve tezgahın üstündeki bir filtre kağıdına yerleştirin.
- Bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, beyinciği hızla çıkarın ve koronal düzlemdeki beyinciği uzunluğu boyunca yaklaşık olarak yarıya kadar kesin; arka yarısı LEC doku bloğudur. Sonraki adımlar için dilimlenecek bölgeye ek olarak bazı fazla dokuları da eklediğinizden emin olun. Hem bu doku bloğunu hem de beynin geri kalanını sakkaroz kesme çözeltisine geri döndürün.
- Bir vibratom doku aşamasına bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin. Önceki adımda oluşturulan doku bloğundan biraz daha büyük bir alana sahip ince bir tabakaya yayın.
- Bir çay kaşığı kullanarak LEC doku bloğunu alın, fazla çözeltiyi atın ve ön koronal kesim yapışacak şekilde tutkal yamasına aktarın.
- Aşamayı vibratom doku odasına takın ve dokuyu batırmak için hızlı bir şekilde yeterli miktarda sakkaroz kesme çözeltisi dökün; Bu çözeltiyi karbojenle kabarcıklayın. LEC doku bloğunu ventral yüzeyle bıçağa doğru yönlendirin. Ortam odası aydınlatması opsini'yi aktive etmek için yetersiz olsa da, vibratomda bulunabilecek ek ışık kaynaklarını kullanmaktan kaçının.
- Yüksek bıçak salınım hızı (100 Hz) ve yavaş bıçak ilerleme hızı (0,06 mm/s) kullanarak ventralden sırta 350 μm kalınlığındaki dilimleri kesin. Tipik olarak, yarımküre başına yedi LEC dilimi elde edilebilir.
- Dilimleri dilim toplama odasına aktarın. Dilim toplama işleminin tamamlanmasının ardından, oda sıcaklığına dönmeden önce toplama odasını 1 saat boyunca 34 °C'lik bir su banyosuna aktarın. Sürekli karbojenli kabarcık. Dilimler en az 6 saat boyunca kayıt için yeterince sağlıklı olacaktır.
- Enjeksiyon bölgesinin post-hoc muayenesi için beynin geri kalanını 48 saat PFA'ya yerleştirin (bkz. bölüm 4).
3. Elektrofizyoloji ve optogenetik stimülasyon
- Hedef hücrenin tanımlanması.
- Dilimi, peristaltik bir pompa tarafından 2 mL/dak hızında aCSF ile perfüze edilmiş 34 °C'de batık bir kayıt odasına yerleştirin. Bir dilim ankrajı kullanarak dilimi hareketsiz hale getirin.
- Eğik kızılötesi aydınlatma kullanan geniş alan mikroskobunun düşük büyütme (4x) hedefi altında, LEC katman 5'e gidin. Pial yüzeyden gerekli katmana olan mesafeyi ölçün.
NOT: Eğik kızılötesi aydınlatma, kayıt odası kapak kaymasının yaklaşık 3 mm altında, kapak kaymasının düzlemine ~55°'lik bir açıyla yakın kızılötesi bir LED konumlandırılarak elde edilmiştir (Şekil 2B). Diferansiyel girişim kontrastı, dilim elektrofizyolojisi için alternatif ve yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. - Yüksek büyütmeli suya daldırma hedefine (40x) geçin ve piramidal nöronları tanımlayın. Bilgisayar monitöründeki hücrenin konumunu bantla işaretleyin.
NOT: Piramidal nöronlar, dilimin pial yüzeyine doğru çıkıntı yapan belirgin apikal dendritlerle kabaca üçgen bir morfolojiye sahiptir (Şekil 3A). Hücre sağlığı, yoğunlaşmış, görünür bir çekirdeğin yokluğu ve pürüzsüz görünmesi gereken plazma zarının incelenmesi ile değerlendirilebilir. Aksonların opsin-florofor füzyon proteini tarafından net floresan etiketlemesinin, geniş alan floresan mikroskobu kullanıldığında görünür olması muhtemel değildir. Aksonal projeksiyonları görselleştirmek için, opsin floroforuna karşı birincil bir antikor kullanarak post-hoc immünohistokimya yapın ve aynı veya benzer dalga boyundaki bir florofora konjuge edilmiş ikincil bir antikor ile yükseltin.
- Tüm hücre yama kelepçesinin oluşumu.
- Bir pipet çektirici kullanarak bir borosilikat cam mikropipet imal edin ve filtrelenmiş hücre içi kayıt çözeltisi (120 mM k-glukonat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA ve UPW'de yapılan %0,25 biyositin, pH 7,25, 285-300 mOsm) ile doldurun. Doldurulmuş mikropipeti, elektrot telinin hücre içi çözelti ile temas halinde olmasını sağlamak için yama kelepçeli amplifikatör baş tarafındaki elektrot tutucusuna yerleştirin.
- Elektrot tutucu yan portuna boru ile bağlanmış bir ağızlığa (piston çıkarılmış 1 mL'lik bir şırınga gibi) sert bir şekilde üfleyerek ağız yoluyla pozitif basınç uygulayın ve sıralı üç bir valfi kapatarak basıncı koruyun. Mikroskop hedefini bir menisküs oluşturacak şekilde yükseltin ve elektrodu mikroskopta görülene kadar menisküsün içine yerleştirin.
- WinLTP16'da (veya başka bir edinme yazılımı/osiloskopta) Sızdırmazlık Testi penceresini açın ve amplifikatör voltaj kelepçesi modundayken, pipet direncinin 3-6 MΩ olup olmadığını belirlemek için 5 mV'luk bir kare darbe uygulayın.
- Pipet ucu ile tanımlanan hücreye yaklaşın ve dokunun; bu, hücre zarında bir girinti (Şekil 3A; sağ panel) ve pipet direncinde küçük bir artışa (0.1 MΩ) neden olmalıdır.
- Pozitif basıncı serbest bırakın ve ağızlığa orta derecede emme uygulayarak negatif basınç uygulayın; bu, pipet direncinde büyük bir artışa neden olmalıdır (>1000 MΩ). Basınç artık nötr bırakılabilir. Hücre zarı yırtılana kadar kademeli olarak artan bir rampada, tüm hücre kapasitans geçicileri ile sonuçlanan negatif basınç uygulayın.
- Optogenetik olarak uyarılmış sinaptik olayları kaydedin.
- Akım kelepçesi yapılandırmasını girin.
NOT: Çoğu durumda uzun menzilli sinaptik iletim glutamaterjiktir, bu nedenle klorür ters çevirme potansiyeline yakın membran potansiyellerinde kayıt yapmak, AMPA reseptörü (AMPAR) aracılı iletimi en iyi şekilde izole edecek ve uyarılan herhangi bir ileri besleme inhibisyonunun (FFI) ölçümünü en aza indirecektir. Klorür tersine çevrilmesi, hücre içi kayıt çözeltisinin ve aCSF'nin bileşimine bağlıdır ve Goldman-Hodgkin-Katz denklemi kullanılarak hesaplanabilir; Yukarıdaki çözümler için bu -61.3 mV idi. Katman 5 LEC piramidal nöronları ortalama dinlenme zarı potansiyeli -62 mV'a sahipti ve gerektiğinde sabit akım enjeksiyonu ile bu potansiyelde tutuldu. Alternatif olarak, hücreler istenen potansiyele voltajla kenetlenebilir. Uzun menzilli inhibitör projeksiyonları kaydetmek için16 veya FFI'yı kaydetmek için, GABAerjik klorür iletkenliğini izole etmek için katyon ters çevirme potansiyelinde voltaj kelepçesi. Membran potansiyellerinde aksiyon potansiyeli eşiğinin üzerindeki voltaj sıkıştırıcı nöronlar kullanıldığında, voltaj kelepçesini iyileştirmek ve aksiyon potansiyellerinin başlatılmasını önlemek için voltaj kapılı sodyum kanal blokerleri içeren sezyum bazlı bir hücre içi çözelti kullanılır (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 klorür,4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, UPW'de yapılan% 0.25 biyositin, pH 7.25, 285-300 mOsm). - Veri toplama yazılımını kullanarak, monte edilmiş 470 nm LED'i etkinleştirmek için transistör-transistör mantığı (TTL) sinyallerini bir LED sürücüsüne gönderin. Monte edilmiş LED, optogenetik uyarıcı post-sinaptik potansiyelleri (oEPSP'ler) uyandırmak için 40x hedefi aracılığıyla dilime ışık darbeleri uygulamak için filtre küpleri ve uygun optikler (Şekil 2B) kullanılarak mikroskop ışık yoluna yönlendirilir.
NOT: Işık darbeleri perizomatik / dendritlerin üzerine uygulanabilir, bu da aksonlar ve presinaptik boutondaki opsinlerin aktivasyonu ile sonuçlanır veya araştırmacı, aşırı bukton stimülasyonunu önlemek için hedefi kaydedilen hücreden aksonlara hareket ettirebilir (bkz. Maksimum oEPSP genliği, sinaptik projeksiyonun gücüne, viral enjeksiyonların etkinliğine ve kullanılan opsin'e bağlıdır. oEPSP'ler, değişen ışık yoğunluğu ve / veya süresi18 ile istenen genliğe titre edilebilir; Işık darbelerinin süresini değiştirmek (maksimum LED güç çıkışında 0,2-5 ms arasında tipik süre, 4,4 mW / mm ışık yoğunluğu19 ile sonuçlanır), LED'in güç çıkışını değiştirmekten daha tutarlı oEPSP genlikleri sağlar. - Farklı uyaranlar arası aralıklara sahip çoklu ışık darbelerinin trenlerini ileterek presinaptik salınım özelliklerini (voltajdaki değişim) araştırın (Şekil 3E); Optogenetik olarak uyarılmış iletimi yorumlarken dikkatli olunmalıdır (bkz.
- Uzun süreli plastisiteyi oEPSPs19'u tekrar tekrar uyandırarak veya ligandların uygulanmasıyla araştırın. Plastisite indüksiyonundan önce stabiliteyi sağlamak için oEPSP genliğini 5-10 dakika boyunca izleyin ve ardından kararlı bir genliğe ulaşılana kadar (tipik olarak 30-40 dakika) izleyin.
NOT: Mevcut opsinlerin çoğu, LTP'yi indüklemek için tipik olarak kullanıldığı gibi, yüksek frekanslarda çoklu aksiyon potansiyellerini, örneğin 100 Hz'de verilen 100 uyaranı güvenilir bir şekilde uyandıramaz. - OEPSP'lerin monosinaptik olduğunu doğrulamak için, hedefi dendritik çardak üzerine konumlandırarak ve 0.5 μM tetrodotoksin ve 100 μM aminopiridin varlığında uyararak dönüştürülmüş yolun aşırı bukon aktivasyonunu gerçekleştirin. Tetrodotoksin uygulaması, yanıtlar aksiyon potansiyeline bağımlıysa iletimi ortadan kaldıracak ve daha sonra aminopiridin dahil edilmesi, oEPSP'ler monosinaptik olarak19,20 üretilirse iletimi kısmen geri yükleyecektir.
- Biyositinin nöronu doldurmasına izin vermek için, tüm hücre konfigürasyonuna girdikten sonra en az 15 dakika bekleyin. Voltaj kelepçesinde, membran kapasitansını ve giriş direncini izleyin.
- Pipetin yaklaşma açısı boyunca yavaşça hücrenin soma'sından uzağa çekilmesi, kapasitans geçicilerinin ve membran akımının yavaş yavaş kaybolduğunu gözlemleyerek hücre zarının yeniden sızdırmazlığını ve pipet ucunda bir dış-dış yama oluşumunu gözlemleyin. Dilimin yönünü ve dilim içindeki hücrelerin konumunu not edin. Dilimi 24 delikli bir plakada PFA'ya koyun ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve ardından 0,1 M PB'ye aktarın.
NOT: Dilimler bir haftaya kadar saklanabilir. Daha uzun süre depolama gerekiyorsa, PB'yi düzenli olarak değiştirin veya sodyum azid içeren PB kullanın (sodyum azidin% 0.02 -% 0.2'si).
- Akım kelepçesi yapılandırmasını girin.
4. Histoloji
- Dilimleme enjeksiyon bölgesi
- Fiksasyonu takiben, dokuyu batana kadar PB'de% 30 sakkarozda (w / v) kriyoprotezde korur (başlangıçta sakkaroz çözeltisinde yüzer), genellikle oda sıcaklığında gece boyunca veya 4 ° C'de 24-48 saat.
- Optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamını kullanarak, kriyostat numune diskine bir doku bloğu takın. 4.1.3 ila 4.1.4 arasındaki adımları izleyerek doku bloğunu dondurun.
- İzopentanı uygun bir kaba koyun. Sadece numune diskini batırın ve dokunun isopentan seviyesinin üzerinde olmasını sağlayın. İzopentan kabını sıvı azota (veya kuru buza) indirin ve dokunun donmasına izin verin.
- Tamamen dondurulduktan sonra (tüm doku bloğu soluk ve sertleşir), bloğun sıcaklığının dengelenmesine izin vermek için doku bloğunu kriyostat odasında -20 ° C'de 30 dakika bekletin.
- Kriyostattaki 40 μm kalınlığındaki kesitleri -20 °C'de kesin. Bölümleri bıçaktan çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Dondurulmuş kesitleri oda sıcaklığında, poli-L-lizin kaplı, cam mikroskopla kaydırılan bölümlere kaydırarak yapıştırın.
- Her slayta yaklaşık 150 μL montaj ortamı ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün; Kapak kapağına hafifçe bastırarak hava kabarcıklarını çıkarın. Fotobeyazlatmaya karşı korumak için kızakları örtün ve oda sıcaklığında en az 12 saat (veya gece boyunca) hava ile kurutun. Bir floresan mikroskobu kullanarak, viral enjeksiyon bölgesinin yerini inceleyin.
- Biyositin boyama protokolü
NOT: Bu protokol kalın bölümlere uygulanabilir; dilimlerin yeniden bölümlenmesine gerek yoktur.- Beyin dilimlerini fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ve 1.8 mM KH2PO4) ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Her adımdan sonra kuyucukları boşaltmak için bir transfer pipeti kullanın.
- Herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için dilimleri PBS'de%3 H 2O2 (w / v) içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu oksijen kabarcıkları oluşturur.
- Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca veya daha fazla oksijen kabarcığı görünmeyene kadar altı kez yıkayın. Beyin dilimlerini, 3 saat boyunca oda sıcaklığında% 0.1 (v / v) Triton X-100 içeren% 1 (v / v) avidin-biyotinile HRP kompleksi (ABC) çözeltisinde inkübe edin.
- Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın.
- Her dilimi 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) çözeltisinde, nöronal yapıların biyositin boyaması görünür hale gelene kadar birkaç dakika boyunca inkübe edin (yaklaşık 5-10 dakika sürer).
DİKKAT: DAB toksiktir. Duman davlumbazında kullanın.
NOT: DAB inkübasyon süreleri tahmin edilemez olabilir, renk geliştikçe dokuyu yakından izleyin. - Dilimleri soğuk (4 °C) PBS'ye aktararak reaksiyonu durdurun. Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Beyin dilimlerini poli-L-lizin kaplı cam mikroskop slaytlarına monte etmek için bir fırça kullanın.
- Tüm fazla PBS'yi temiz bir doku ile çıkarın. Her dilimi yaklaşık 200 μL montaj ortamı ile örtün; kapak kapaklarıyla örtün ve hava kabarcıklarını dışarı itmek için kapak kapağına hafifçe bastırın. Oda sıcaklığında en az 12 saat (veya gece boyunca) hava ile kurulayın. Bir ışık mikroskobu kullanarak, hücrelerin yerini ve morfolojik ayrıntılarını inceleyin.
NOT: Biyositin alternatif olarak florofor konjuge streptavidin kullanılarak görselleştirilebilir; Bununla birlikte, görüntüleme rezeksiyon veya konfokal mikroskop kullanımı gerektirebilir21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, optogenetik yapıların viral iletimini kullanarak uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisitenin nasıl çalışılacağını açıklıyoruz. Protokol, beyindeki hemen hemen her türlü uzun menzilli bağlantıyı incelemek için çok kolay bir şekilde uyarlanabilir. Örnek olarak, bir opsini sıçan mPFC'sine kodlayan AAV'lerin enjeksiyonunu, LEC'den akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve LEC'deki mPFC terminallerinin ışıkla uyarılmış aktivasyonunu açıklıyoruz (Şekil 1).
Sağlıklı bir piramidal hücre yerleştirildi ve yamalandı (örneğin, Şekil 3A). Mevcut mPFC'den LEC'ye örnekte, sinaptik sonrası hücreler etiketlenmemiştir; post-sinaptik hücre tanımlaması gerekiyorsa, floresan işaretleyiciyi eksprese eden bir hücre geniş alan optikleri kullanılarak lokalize edilmelidir (örneğin, Şekil 3B). Hücrenin sağlığı, deneyden önce kızılötesi optiklerle değerlendirilmelidir. LEC'de mPFC aksonlarını aktive etmek için, mikroskop hedefi aracılığıyla doğrudan katman 5 hücre soma ve proksimal dendritlerin üzerine bir LED yerleştirildi (Şekil 1), 2 ms'lik tek ışık darbeleri basit dalga formu oEPSP'leri ile sonuçlandı (Şekil 3C); oEPSP'nin tepe genliği ölçülebilir. Sinapsın kısa süreli plastisitesini incelemek için 5, 10 ve 20 Hz ışık stimülasyon trenleri uygulanmıştır (Şekil 3E). Uzun süreli plastisiteyi araştırmak için, 10 dakika boyunca bazal oEPSP genliği izlendikten sonra, 10 dakika boyunca dolaşımdaki aCSF'ye kolinerjik agonist karbaçol eklendi. Bu, ligandın çıkarılmasından 40 dakika sonra hala belirgin olan uzun süreli depresyona neden oldu (Şekil 3D).
Elektrofizyolojik kayıt deneylerini takiben, viral enjeksiyon bölgesini içeren beyin dokusu kesitlendi ve enjeksiyon bölgesinin uzunluğu incelendi (Şekil 4A). Floresan muhabir mCherry, prelimbik ve infralimbik korteksin (kemirgen mPFC'nin kurucu bölgeleri) daha derin katmanlarına lokalizedir. Bu katmanlar, LEC'ye projeksiyonun ağırlıklı olarak daha derin kortikal katmanlardan kaynaklandığı gösterildiğinden hedeflenmiştir22. mCherry pozitif liflerin beyaz madde kanalına katıldığı da görülebilir. Viral enjeksiyon yerleşimini optimize etmek için yapılan bir pilot deneyde, LEC'nin 40 μm kesitleri alındı ve incelendi; mCherry pozitif lifler LEC'nin 5. tabakasında görülebilir (Şekil 4B). Son olarak, biyositin dolu hücre boyandı ve yerinin ve morfolojisinin doğrulanmasına izin verildi (Şekil 4C, D).
Şekil 1: Deneysel genel bakış. (A) Medial prefrontal kortekse (mPFC) viral vektör enjeksiyonunun şeması, optogenetik yapıya sahip mPFC hücrelerinin transdüksiyonu ve yapının lateral entorinal korteksteki (LEC) terminallere taşınması. (B) Akut bir LEC diliminde katman 5 piramidal nöronlardan tüm hücre kaydının şematik gösterimi ve mikroskop hedefi ile mPFC terminallerinin ışık aktivasyonu. Kısaltmalar: CA = cornu ammonis; PERI = perirhinal korteks; TR = geçiş bölgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görselleştirilmiş tüm hücre kayıtları, optogenetik uyarılma ve tdDomates pozitif nöronların tanımlanması için dilim toplama odası ve optik konfigürasyon. (A) Dilim toplama odası14 , bir naylon ağ tabakasına yapıştırılmış ve aCSF'ye batırıldığı bir beher içine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüp rafından özel olarak yapılmıştır (B ) ChR2 (470 nm) ve tdDomates (565 nm) uyarımı için LED'ler, ışığı harmanlamak için asferik bir kondenser merceğinden geçirilir, tdDomates uyarımı ve emisyon spektrumlarının spektral olarak ayrılmasını sağlamak için 565 nm ışık bir bant geçirgen filtreden geçirilir. Bunlar uzun geçişli dikroik bir ayna ile birleştirilir ve daha uzun dalga boyunda ikinci bir uzun geçişli dikroik ayna ile dilime doğru yönlendirilir. Işık daha sonra objektif lens aracılığıyla dilime odaklanır. TdDomates etiketli nöronların bulunduğu deneylerde, yayılan floresan ışık dikroik aynadan ve emisyon filtresinden geçer ve akromatik bir lens ile kamera sensörüne odaklanır. Dilimin floresan olmayan özellikleri, dilim odasının altından uygulanan kızılötesi (NIR) ışığın yakınında kırılan eğik ile görselleştirilir; Bu ışık optikleri kameraya iletir, böylece floresan ve NIR görüntüleme arasında filtre küplerini değiştirme ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NIR / floresan görüntüleme altında nöronların görselleştirilmesi ve oEPSP'lerin temsili örnekleri. (A) Sol: NIR ışığı ile görselleştirilmiş piramidal morfolojiye sahip nöron örneği. Sağ: Yama pipetinden gelen pozitif basıncın neden olduğu içbükey gamze oluşumu ile aynı nöron. (B) Tek bir nöronda tdDomates'in Cre-rekombinaz'a bağımlı ekspresyonu. (C) Piramidal hücredeki LEC katman 5'ten temsili oEPSP. (D) 10 μm karbaçol (CCh) ilavesini takiben zaman içinde oEPSP'yi izleyen uzun süreli plastisite deneyi örneği. Noktalı çizgi, ilaç ilavesinden önceki başlangıç döneminde ortalama oEPSP genliğini gösterir. (E) 5, 10 ve 20 Hz'de stimülasyon trenlerinin temsili izleri. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Enjeksiyon yerinin histolojik olarak doğrulanması ve biyositin dolgulu hücrenin geri kazanımı . (A) mPFC'de viral enjeksiyon bölgesini gösteren koronal fotomikrograf, bregmadan +3.00 mm. (B) LEC'nin mCherry + liflerini gösteren ince koronal bölümü. (C) LEC'de biyositin dolgulu piramidal hücre ile 350 μm kalınlığında akut dilimin, bregmadan -6.2 mm'nin düşük güçlü görüntüsü. Kesikli kutu, D. (D) LEC piramidal hücresinde daha yüksek büyütmede gösterilir; apikal dendrit, görüntünün sağında katman 1'e doğru ilerlerken görülebilir. Kesikli çizgiler bölgesel sınırları gösterir. Kısaltmalar: IL = infralimbik korteks; PL = prelimbik korteks; wm = beyaz madde. Ölçek çubukları = 250 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol, optogenetik yapıları kodlayan AAV'leri ve akut beyin dilimlerinde elektrofizyolojiyi sunmak için stereotaksik cerrahinin bir kombinasyonunu kullanarak oldukça spesifik uzun menzilli sinaptik projeksiyonları keşfetmek için bir yöntemi açıklamaktadır (Şekil 1). Bu teknikler birlikte, daha önce geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon kullanılarak erişilemeyen uzun menzilli ve anatomik olarak dağınık yollarda beyin devresinin fizyolojisini ve plastisitesini yüksek hassasiyetle karakterize etmek için araçlar sunar. Hücreye özgü moleküler belirteçlerle kombinasyon, projeksiyonların bir beyin bölgesinden başka bir bölgedeki farklı tanımlanmış hücre popülasyonlarına karakterizasyonuna izin verir23.
Bu tekniğin son derece hassas doğasından tam olarak yararlanmak için, yol özgüllüğünü doğrulamak önemlidir. Bu birkaç adımda yapılır; Kayıt sırasında, incelenen sinapsın mono-sinaptik olduğundan emin olun (adım 3.3.5). Bunu takiben, virüsün amaçlanan sinaptik öncesi bölgeyle sınırlı olduğundan emin olmak için enjeksiyon bölgesini histolojik olarak inceleyin ve beklendiği gibi olduğundan emin olmak için biyositin boyalı post-sinaptik hücrenin yerini ve morfolojisini değerlendirin.
Virüs seçimi ve hücresel özgüllüğün sağlanması
Bu teknik son derece uyarlanabilir ve hem farelerde hem de sıçanlarda kullanım için uygundur. Anatomik özgüllük gerektiren deneyler vahşi tip kemirgenlerle yapılabilir. Post-sinaptik hücre tipi özgüllüğü gerektiren deneyler, hücreler morfolojiye veya konuma göre tanımlanamıyorsa, genetiği değiştirilmiş bir kemirgen suşu gerektirebilir. Örneğin, internöronları eksprese eden parvalbümini (PV) hedeflemek için, Cre-rekombinazın PV eksprese eden nöronlarda eksprese edildiği bir PV-Cre knock-in transgenik fare hattı kullanılabilir. Bu hücreleri görselleştirmek için, PV-Cre çizgisi, Cre-aracılı rekombinasyonu takiben bir floresan proteini ifade etmek için bir muhabir fare çizgisi ile çaprazlanabilir. Alternatif olarak, Cre'e bağımlı bir floresan muhabir geni viral olarak tanıtılabilir. ChR2-florofor füzyon proteinleri hücre zarı ile sınırlıdır ve akut dilimlerde geniş alan mikroskobu ile bakıldığında nöronun bir taslağı olarak görünebilir, bu da tüm hücre kaydı için hücrelerin tanımlanmasını, sitozolik floroforların kullanılmasından daha zor hale getirir. Hücreleri tanımlamak için ChR2 kullanılıyorsa, bisistronik vektörler24 kullanılarak ChR2 ve floroforun ayrılması sağlanabilir. Tüm hücre kaydı için hedef nöronları tanımlamak için bir floresan muhabir kullanılıyorsa, uyarma dalga boyu ideal olarak opsinin aktivasyon dalga boyu ile örtüşmemelidir; bu, kayıt için nöronları ararken dönüştürülmüş afferentlerin uzun süreli aktivasyonunu önleyecektir. Aynı şekilde, sinaptik öncesi ve sonrası muhabirler spektral olarak ayrı olmalıdır. Yaygın muhabirler mCherry, yeşil floresan proteini (GFP) ve gelişmiş sarı floresan proteinidir (eYFP).
Kullanılan viral yapının birkaç farklı bileşeni vardır, her biri deneyin başarısını etkileyebilir ve bu nedenle her bir öğeye dikkat edilmelidir. Opsin seçimine birincil önem verilmelidir. Presinaptik aktivasyon için, ideal opsin büyük fotoakımlara (aksonları aksiyon potansiyeli eşiğine güvenilir bir şekilde getirmek için), hızlı açma ve kapama kinetik ve yüksek frekanslı tekrarlanan stimülasyona izin vermek için yavaş bir duyarsızlaştırma hızına sahiptir. Kural olarak, hızlı kinetik genellikle daha küçük fotoakımların maliyetine gelir25; Bununla birlikte, moleküler tarama ve mühendislik, opsinlere büyük fotoakımlar sağlamıştır. Mevcut protokol ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12'yi kullanıyor, ancak Chronos 26, CheRiff 27, oChIEFAC28 ve ChRmine29 da uygundur. Ek olarak, kırmızıya kaymış (ChrimsonR)26 veya menekşe kaymış (CheRiff) aktivasyon dalga boylarına sahip uyarıcı opsinler mevcuttur, bu da hücre tanımlaması için kullanılan floroforların uyarma spektrumları ile örtüşmesini önlemek için gerekli olabilir (yukarıya bakınız).
AAV'lerin serotipi, vektörün farklı beyin bölgelerini ve hücre tiplerini dönüştürme yeteneğini ve hem anterograd hem de retrograd yönlerde aksonal taşımanın derecesini etkileyebilir30. Nöronal transdüksiyon için yaygın olarak kullanılan serotipler 1, 2, 5, 8 ve 9'dur. Bir literatür taraması, herhangi bir bölgede hangi serotipin başarıyla kullanıldığına dair bir gösterge verebilir. Örneğin, AAV9, kortikal nöronların transdüksiyonu için önerilmiştir31.
Promotor, opsinin ifade edileceği hücre tipinin spesifikasyonuna izin verir. Promotorlar birkaç sınıfa ayrılır. Genel promotorlar, örneğin CAG veya EF1a, çoğu hücre tipinde ekspresyonla sonuçlanır. Nörona özgü promotorlar, örneğin sinapsin, tüm nöron tiplerinde ekspresyon üretir. CaMKIIa, sızdırıcı olduğu gösterilmesine rağmen, uyarıcı nöronlarla ekspresyonu kısıtlamak için yaygın olarak kullanılır – internöronlarda bazı ifadeler gözlenmiştir32. mDlx arttırıcı eleman, ekspresyonu GABAerjik internöronlarla sınırlar33. Pre-sinaptik hücre tipi özgüllüğü, bir Cre-mouse çizgisi kullanılarak elde edilebilir (yukarıda post-sinaptik hücre için açıklandığı gibi). Bu durumda, opsin ekspresyonunu Cre-eksprese eden hücrelerle sınırlamak için Cre'e bağımlı bir genetik yapı gerekecektir.
Titre, viral preparattaki viral parçacıkların sayısıdır. Yine, bir literatür taraması, belirli bir bölgede yeterli transdüksiyon üreten bir titrenin bir göstergesi olabilir. Cre'ye bağımlı bir sistem kullanıldığında, titre özellikle önemli olabilir, çünkü yüksek viral titreler Cre-eksprese etmeyen hücrelerde ekspresyonu dönüştürebilir34.
Virüs dağıtımının optimizasyonu
İlgilenilen bölgeye kesin viral teslimat, bu yaklaşım için kritik öneme sahiptir. Presinaptik bölgenin enjeksiyon koordinatları, literatüre ve/veya uygun türler için beyin atlasına danışılarak tahmin edilebilir35,36. Deneyci daha sonra viral enjeksiyonun ilgilendikleri presinaptik bölgeyle sınırlı olmasını sağlamak için kullanılan hassas enjeksiyon koordinatlarını ve hacmini optimize etmek ve hassaslaştırmak için zaman ayırmalıdır. Bu, özellikle komşu bölgeler de kayıt alanına yansıtıldığında kritik öneme sahiptir. Bunu yapmak için etkili bir yöntem olarak virüsün küçük hacimlerini kullanmanızı öneririz. Özellikle küçük bir enjeksiyon bölgesi gerekiyorsa, şırınga ve iğne yerine cam mikropipetlerin kullanılması avantajlı olabilir13. Enjeksiyon iğnesinin yeterli bir süre yerinde bırakılması ve enjeksiyon iğnesinin yavaş çekilmesi, virüsün iğne sistemine kaçmasını önlemek için kritik öneme sahiptir. Enjeksiyonların doğruluğunu doğrulamak için, mümkün olduğunca elektrofizyoloji yoluyla kullanılan her hayvanın enjeksiyon bölgesini histolojik olarak doğrulamak ve viral iletimin hedef dışı olduğu verileri hariç tutmak en iyi uygulamadır. Ellerimizde, yukarıda açıklanan protokolün, ventral orta hat talamik çekirdekleri, hipokampus, mediodorsal talamus ve LEC'den PFC'ye projeksiyonlar da dahil olmak üzere birçok farklı uzun menzilli bağlantıya genellenebilir olduğu kanıtlanmıştır; PFC'den LEC'ye ve mediodorsal talamusa projeksiyonlar; LEC ve ventral orta hat talamik çekirdeklerinden hipokampusa projeksiyonlar (Zafar Bashir laboratuvarı, Bristol Üniversitesi, yayınlanmamış gözlemler19). Bu farklı yolakların optogenetik etiketlenmesi sadece enjeksiyon koordinatlarının ve hacimlerinin iyileştirilmesini gerektirmiştir.
Protokol sınırlamaları
Beynin hızlı diseksiyonu ve dikkatli dilimleme, bu deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan dilimleme protokolü, farklı beyin bölgeleri için adaptasyon olmadan sağlıklı akut dilimler verir; Bununla birlikte, dilimleme ortamındaki ve dilimleme sonrası inkübasyon sıcaklığındaki varyasyonun28'in başka bir yerinde tarif edildiği gibi, dilim sağlığını daha da iyileştirdiği bildirilmiştir. Ayrıca, tek bir bölgenin viral transdüksiyonunu takiben iki beyin bölgesinden akut dilimler alabildik, böylece kullanılan hayvan sayısını azalttık. Anatomik olarak yoğun yollarda, viral transdüksiyon ve kayıt arasındaki 7 gün kadar kısa sürelerin, tüm hücre yama kelepçeli kayıtlar için uygun büyüklükte sağlam oEPSP'leri uyandırmak için yeterli olduğunu bulduk. Daha uzun menzilli veya daha seyrek projeksiyonlarda, daha uzun gecikmeler avantajlıdır.
Optogenetik olarak uyarılmış aktivitenin sonuçlarını, özellikle kısa süreli plastisite açısından yorumlarken dikkatli olunmalıdır. Önceki sonuçlar, optogenetik olarak uyarılmış iletimin, tekrarlanan stimülasyon üzerine, bir dizi faktöre bağlı olarak ortaya çıkabilecek elektriksel stimülasyondan daha belirgin sinaptik depresyona maruz kalabileceğini göstermiştir. İlk olarak, opsin duyarsızlaştırma25, presinaptik aksonların sayısının azalmasına ve postsinaptik yanıtların azalmasına neden olabilir. Son zamanlarda keşfedilen opsinlerin ve moleküler mühendislik geçirmiş olanların (yukarıya bakınız) geliştirilmiş kanal kinetiği, duyarsızlaştırmanın etkilerini hafifletmek için önemli bir yol kat etmiştir; Bununla birlikte, 100 Hz stimülasyon, bazı uzun vadeli plastisite indüksiyon protokollerinin kullanımını engelleyebilecek birçok opsinin erişiminin ötesinde kalmaktadır (ancak bkz.37). İkincisi, opsinlerin yavaş kinetiği, aksiyon potansiyellerini genişletebilir18 uzun süreli verici salınımına ve veziküler tükenmeye yol açar; bu aynı zamanda uyarıcı opsinler11'in kalsiyum geçirgenliğinden de kaynaklanabilir; Bu sorunlar, aşırı bukton fotoaktivasyonundan kaçınılarak hafifletilebilir38. Üçüncüsü, AAV vektörleri kullanılarak nöronların transdüksiyonu, bazı sinapslarda değişmiş presinaptik salınım özelliklerine de yol açabilir; ancak AAV9 serotip38 kullanılarak bu durum hafifletilebilir. Bu sınırlamalara rağmen, dikkatli kullanımla, optogenetik aktivasyon elektriksel stimülasyonu taklit edebilir19,38 ve bu nedenle, çalışılmamış sinaptik yolların fizyolojisini araştırmada paha biçilmez bir araçtır. Ayrıca, Şekil 3E'de gösterilen verilerin akım kelepçesindeki kısa süreli plastisiteyi değerlendirdiğini ve bu nedenle sinaptik potansiyellerin ve içsel membran özelliklerinin etkileşimine maruz kaldığını, voltaj kelepçesinde eşdeğer deneyler yapılarak bunun önlenebileceğini not ediyoruz.
Gelecekteki yol tarifleri
Sürekli genişleyen optogenetik araç kutusu, bu teknolojiyi farklı uyarma spektrumlarına sahip bir çift opsin kullanarak, aynı preparattaki iki sinaptik yolda uygulama olasılığını artırmıştır. Bu, ChR2'den farklı olarak kırmızı dalga boyu ışığı tarafından fotoaktif hale getirilen bir opsin ChrimsonR26 kullanılarak mümkün kılınmıştır. ChrimsonR, mavi ışığa karşı düşük hassasiyetini korur, bu nedenle çapraz yol aktivasyonunu önlemek için, mor kaymış (CheRiff 27) ve/veya mavi ışığa karşı daha yüksek hassasiyete sahip (Chronos26) kırmızıya duyarlı olmayan opsinlerle birlikte kullanılabilir. Bu, ChrimsonR'yi önemli ölçüde aktive etmek için çok zayıf olan mavi / mor ışık uyaranlarının kullanılmasına izin verir ve bu nedenle deneysel verimi artırabilecek, yakınsak yol etkileşimlerinin incelenmesine izin verebilecek ve nöromodülatörlerin endojen kaynaklardan salınmasına izin verebilecek iki yol 39,40'ın aktivasyonuna izin verir 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Wellcome hibe 206401/Z/17/Z tarafından desteklenmektedir. Zafar Beşir'e uzman mentorluğu için ve Dr. Clair Booth'a teknik yardım ve makale hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
