Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.
Abstract
חקר התכונות הפיזיולוגיות של סינפסות מסוימות במוח, וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים, הוא אתגר מרכזי במדעי המוח המודרניים. טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות במבחנה משתמשות בגירוי חשמלי כדי לעורר תמסורת סינפטית. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא האופי הלא ספציפי שלה; כל האקסונים באזור האלקטרודה המגרה יופעלו, מה שמקשה על ייחוס אפקט לחיבור אפרנטי מסוים. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי החלפת גירוי חשמלי בגירוי מבוסס אופטוגנטיקה. אנו מתארים שיטה לשילוב אופטוגנטיקה עם הקלטות מהדקי טלאים במבחנה . זהו כלי רב עוצמה לחקר ההעברה הסינפטית הבסיסית והפלסטיות הסינפטית של קשרים סינפטיים מדויקים המוגדרים אנטומית, והוא ישים כמעט לכל מסלול במוח. כאן אנו מתארים את ההכנה והטיפול בווקטור נגיפי המקודד חלבון channelrhodopsin להזרקה כירורגית לאזור טרום-סינפטי בעל עניין (קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית) במוח המכרסם ויצירת פרוסות חריפות של אזורי מטרה במורד הזרם (קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית). כמו כן מוצג הליך מפורט לשילוב הקלטות מהדקי טלאים עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית לטווח קצר וארוך. אנו דנים בדוגמאות לניסויים שמשיגים ספציפיות של מסלולים ותאים על ידי שילוב של אופטוגנטיקה ותיוג תאים תלויי Cre. לבסוף, אישור היסטולוגי של האזור הקדם-סינפטי של העניין מתואר יחד עם תיוג ביוציטין של התא הפוסט-סינפטי, כדי לאפשר זיהוי נוסף של המיקום המדויק וסוג התא.
Introduction
הבנת הפיזיולוגיה של הסינפסות וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים היא בסיסית להבנת האופן שבו רשתות מוחיות מתפקדות במוח בריא1, וכיצד הן מתפקדות בהפרעות מוחיות. השימוש בפרוסות מוח חריפות של ex vivo מאפשר הקלטה של הפעילות החשמלית של סינפסות מנוירונים בודדים עם יחס אות לרעש גבוה באמצעות הקלטות של מהדק טלאי שלם. שליטה בפוטנציאל הממברנה ומניפולציה פרמקולוגית פשוטה מאפשרת בידוד של תת-סוגים של קולטנים. ניתן לבצע הקלטות אלה בספציפיות מעודנת כדי לזהות את הנוירון הפוסט-סינפטי, כולל מיקום למינרי ותת-אזורי2, מורפולוגיה תאית3, נוכחות של סמנים מולקולריים4, התחזיות האפקטיביות שלו5, או אפילו אם הוא היה פעיל לאחרונה6.
עם זאת, השגת ספציפיות של תשומות קדם-סינפטיות היא, עם זאת, קצת יותר מאתגרת. השיטה הקונבנציונלית השתמשה באלקטרודות גירוי כדי לעורר את האקסונים הפועלים בלמינה מסוימת. דוגמה לכך היא בהיפוקמפוס, שם גירוי מקומי בשכבה רדיאטום מפעיל סינפסות שמקרינות מ-CA3 לתת-השדה CA17. במקרה זה, הספציפיות הקדם-סינפטית מושגת כאשר קלט CA3 מייצג את הקלט המעורר היחיד הממוקם בתוך רדיאטום שכבה אשר מקרין לתאים פירמידליים CA18. רמה גבוהה זו של ספציפיות קלט הניתנת להשגה עם הפעלה קדם-סינפטית חשמלית קונבנציונלית של אקסונים CA3-CA1 היא, עם זאת, יוצא מן הכלל אשר בא לידי ביטוי במחקר אינטנסיבי כי סינפסה זו היה נתון. באזורים אחרים במוח, אקסונים ממסלולים רבים מתקיימים יחד באותה למינה, לדוגמה, בשכבה 1 של ניאוקורטקס9, ובכך הופכים גירוי קדם-סינפטי ספציפי לקלט לבלתי אפשרי עם אלקטרודות מגרה קונבנציונליות. זה בעייתי מכיוון שלקלטים סינפטיים שונים עשויות להיות תכונות פיזיולוגיות שונות; לכן, הגירוי המשותף שלהם עלול להוביל לאפיון שגוי של הפיזיולוגיה הסינפטית.
הופעתה של האופטוגנטיקה, הקידוד הגנטי של חלבוני ממברנה רגישים לאור (אופסינים) כגון channelrhodopsin-2 (ChR2), אפשרה הרחבה עצומה של אפשרויות לחקר תחזיות סינפטיות מבודדות בין אזורי מוח10,11. כאן אנו מתארים פתרון הניתן להכללה ובעלות נמוכה לחקר פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות. המבנים האופטוגנטיים מועברים באופן ספציפי מאוד באמצעות וקטורים נגיפיים המאפשרים שליטה מדויקת ביותר באזור העניין הקדם-סינפטי. הקרנות אפרנט יבטאו את הערוץ המופעל על ידי האור ויאפשרו הפעלה של סיבים אלה באזור מטרה. לפיכך, ניתן לחקור מסלולים ארוכי טווח, מפוזרים אנטומית, שלא ניתן להפעילם באופן עצמאי על ידי גירוי חשמלי מסורתי, לא ספציפי.
אנו מתארים, כמסלול לדוגמה, התמרה של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) עם וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) המקודדים אופסינים של תעלת קטיון מעוררת. לאחר מכן אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חריפות מקליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (LEC), הקלטות של מהדקי טלאי מנוירונים פירמידליים של LEC בשכבה 5, והפעלה מעוררת אור של תחזיות mPFC-LEC גלוטמטרגיות (איור 1). אנו מתארים גם את ההערכה ההיסטולוגית של אתר ההזרקה כדי לאשר את המיקום של האזור הקדם-סינפטי של עניין וזיהוי של מורפולוגיה של תאים פוסט-סינפטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים לבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הנהלים המדעיים של בעלי חיים בבריטניה (1986) וההנחיות הקשורות אליו, כמו גם הנחיות מוסדיות מקומיות.
1. הזרקה ויראלית סטריאוטקסית
הערה: הפרוטוקול הנוכחי דורש ספציפיות אנטומית, אך לא פוסט-סינפטית.
- בחר את החיה המתאימה. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בחולדות זכרים מסוג ליסטר עם ברדס (300-350 גרם, כ-3 חודשים).
- בחר את המבנה הוויראלי המתאים. ישנם מספר גורמים שיש לקחת בחשבון (ראו דיון). הפרוטוקול הנוכחי משתמש בנגיף כדי לבטא את הערוץ האופטוגנטי ChETATC 12, כדי להתמר נוירונים מעוררים (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; טיטר: 3.3 x 10 13 גנומים ויראליים / mL).
- קבע את הקואורדינטות ואת נפח ההזרקה באמצעות אטלס מוח כפי שתואר קודםלכן 35.
- הזרקה סטריאוטקסית של התכשיר הנגיפי
הערה: יש לעקוב אחר כל ההנחיות הלאומיות והמוסדיות הרלוונטיות לשימוש בבעלי חיים ולטיפול בהם. הווקטורים הנגיפיים מוזרקים באופן סטריאוטקסי כפי שתואר קודם לכן13 עם השינויים הבאים.- שמור את התכשיר הנגיפי על הקרח במהלך הרדמה והכנה של החיה.
- השרה הרדמה בתא אינדוקציה הרדמה עם 4% איזופלורן. עקוב אחר רמת ההרדמה המצוינת על ידי קצב נשימה סדיר איטי יותר (1 הרץ) והיעדר רפלקסים של דוושות וקרנית (בדיקה על ידי צביטה בהונות ונגיעה קלה בזווית העין, בהתאמה; אין לזהות תגובה).
- מתן משכך כאבים טרום ניתוחי כגון meloxicam לפחות 30 דקות לפני ההליך הפולשני.
- כאשר החיה מורדמת לחלוטין, השתמש בקוצץ כדי להסיר את הפרווה מהקרקפת. החלף את זרימת האיזופלורן לחרוט האף של המסגרת הסטריאוטקסית והרכיב את החולדה במסגרת. יש למרוח ג'ל עיניים משמן על העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההליך.
- הניתוח צריך להתבצע בתנאים אספטיים. השתמש בכפפות ומכשירים סטריליים לאורך כל ההליך. יש למרוח משחת לידוקאין (5% w/w) לפני חיטוי הקרקפת בתמיסת כלורהקסידין 4% w/v, ולאחר מכן לכסות את הגוף בווילון סטרילי. באמצעות אזמל, לבצע חתך אורכי באורך של כ-15 מ"מ על הקרקפת כדי לחשוף ברגמה.
- טען מזרק המילטון לתוך משאבת מזרק מיקרו-הזרקה המחוברת לזרוע ניתנת להזזה המותקנת על המסגרת הסטריאוטקסית.
- מניחים אליקוט 5 μL של הנגיף בצינור של 0.2 מ"ל ומסתובבים במשך כמה שניות עד שכל הנפח נמצא בתחתית הצינור. פיפטה 2 μL של הכנה ויראלית לתוך המכסה של הצינור.
- מלא את המזרק עם הכנה ויראלית על ידי צפייה ראשונה בקצה המחט עם מיקרוסקופ כירורגי, ולאחר מכן באופן ידני למקם את בולוס של הנגיף בקצה המחט ולמשוך את הבוכנה מזרק באמצעות פקדי המשאבה.
- הגדר את נפח הזרקת המשאבה ל-300 nL ואת קצב הזרימה ל-100 nL/min. הפעל את המשאבה ואשר זרימה תקינה על ידי התבוננות בטיפת הנגיף בקצה המחט. סופגים את הנגיף על צמר גפן ומנקים בעדינות את המחט עם 70% אתנול.
- באמצעות ברגי הכוונון על המסגרת הסטריאוטקסית נווט את קצה המחט לברגמה (הנקודה על הגולגולת שבה נפגשים התפרים הכתריים והסגיטליים) ושים לב למדידות הסטריאוטקסיות שנצפו בשלושת סולמות ורנייה במסגרת. הקואורדינטות ביחס לברגמה של חולדה mPFC הן קדמיות-אחוריות + 3.1 מ"מ, בינוניות ± 0.7 מ"מ, גב - 4.5 מ"מ; להוסיף/להחסיר (כפי שצוין) את המרחקים הללו מקואורדינטות ברגמה, ולאחר מכן לנווט את המחט לקואורדינטות הקדמיות-אחוריות והבינוניות ולהוריד בעדינות את המחט על פני הגולגולת.
הערה: קואורדינטות mPFC שניתנו לעיל מתאימות לחולדות זכרים עם ברדס ליסטר של 300-350 גרם; שינויים בזן החולדה, הגודל עשויים לדרוש שינויים בקואורדינטות אלה (ראו דיון). - הרימו את המחט מעל משטח הגולגולת וסמנו נקודה זו בעט טוש קבוע בעל קצה דק. צור חור בור בנקודה זו באמצעות מקדחה מיקרו המותקנת על הזרוע הסטריאוטקסית.
- יש להחדיר את המחט למוח בקואורדינטציה הגבית-בנית שנקבעה מראש ולהחדיר נפח שנקבע מראש (עבור mPFC: 300 nL). השאירו את המחט באתרה למשך 10 דקות כדי לאפשר את פיזור הבולוס. עם הסרת המחט, הפעל את המשאבה כדי לוודא שהמחט אינה חסומה.
הערה: הכנס והסר את המחט באיטיות (~ 3 מ"מ לדקה) כדי למזער את הנזק לרקמת המוח ואת הזרימה האחורית של הנגיף לתוך מערכת המחט. - יש לתת 2.5 מ"ל של נתרן כלורי מחומם (0.9% w/v) וגלוקוז (5% w/v) תמיסה תת עורית כדי לשמור על הידרציה.
- חזור על שלב 1.4.12. לחצי הכדור השני.
- לתפור את החתך בקרקפת ועם השלמת ההליך, לתת 2.5 מ"ל של נתרן כלורי ותמיסת גלוקוז מתאים, מומלץ מוסדית, משכך כאבים לניהול כאב, למשל, buprenorphine או meloxicam. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה כשהוא מחוסר הכרה. הניחו את החולדה בקופסת התאוששות מחוממת עד שהיא תחזור להכרה מלאה. חזרו לכלוב הביתי רק עם בעלי חיים אחרים לאחר שהחלימו לחלוטין.
- עקוב אחר ההנחיות המוסדיות לטיפול לאחר הניתוח ונהלי דיור למכרסמים שעברו טרנספקציה ויראלית. המתן לפחות שבועיים עד שהאופסין טרנסג'ן יתבטא כראוי לפני תחילת הניסוי.
הערה: הזמן הדרוש להתמרה תלוי במרחק ובחוזק של החיבור בין האזורים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים. עבור mPFC ל- LEC, נדרשים 4-6 שבועות.
2. הכנת פרוסות מוח חריפות
הערה: כאן אנו מתארים שיטה פשוטה להכנת פרוסות מוח אשר בידינו מספיקה כדי להשיג פרוסות קליפת המוח, ההיפוקמפוס והתלמית באיכות גבוהה מעכברים וחולדות בוגרים.
- הכן את הפתרונות לנתיחה.
- מלאו של 250 מ"ל עם ~200 מ"ל של תמיסת חיתוך סוכרוז קרה כקרח (189 מ"מ סוכרוז, 26 מ"מ NaHCO 3, 10 מ"מ D-גלוקוז, 5 מ"מ MgSO 4,3 mM KCl, 1.25 mM NaH 2 PO4, ו-0.2 mM CaCl 2 המיוצרים במים אולטרה-טהורים (UPW) עם התנגדות של 18.2 MΩ ס"מ ב-25 מעלות צלזיוס) או נפח מספיק כדי למלא את תא רקמת הוויברטום. מבעבעים עם קרבוגן (95% O 2, 5% CO2) ושומרים על קרח.
- מלאו תא איסוף פרוסות בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-גלוקוז,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1.25 mM NaH2 PO 4,ו-1 mM MgSO4 תוצרת UPW) בטמפרטורת החדר, מבעבע בקרבוגן. תא איסוף הפרוסות14 עשוי בהתאמה אישית ממתלה צינורות מיקרוצנטריפוגה המודבק על יריעה של רשת ניילון ומונח לתוך שבה הוא שקוע ב-aCSF (איור 2A).
- מלא שפופרת של 50 מ"ל ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר פוספט (PB; 75.4 mM Na 2 HPO4.7H 2 O ו-24.6 mM NaH2PO4. ח2או).
אזהרה: PFA הוא רעיל. יש להשתמש במכסה אדים.
- דיסקציה של המוח.
- הרדימו את החולדה בתא אינדוקציה באמצעות 5% איזופלורן עד שהנשימה איטית וסדירה (~1 הרץ). כדי להבטיח רמה מספקת של בדיקת הרדמה להיעדר רפלקסים של דוושה וקרנית.
- ערפו את החיה באמצעות גיליוטינה.
- לנתח במהירות את כל המוח כפי שתואר קודם לכן15 ולהעביר לתמיסת חיתוך סוכרוז. השלם את השלב תוך 90 שניות מרגע עריפת הראש לקבלת איכות פרוסה טובה והקלטה מוצלחת של תאים שלמים.
- בעזרת כפית מתכת, הרימו את המוח, השליכו תמיסת חיתוך עודפת והניחו אותה על פיסת נייר סינון על הספסל.
- באמצעות אזמל או סכין גילוח, להסיר במהירות את המוח הקטן ולחתוך את המוח במישור הכתר בערך באמצע הדרך לאורכו; החצי האחורי הוא גוש הרקמה LEC. הקפד לכלול כמה רקמה עודפת בנוסף לאזור להיות פרוס עבור השלבים הבאים. החזירו גם את גוש הרקמה הזה וגם את שארית המוח לתמיסת חיתוך הסוכרוז.
- מניחים טיפה של דבק ציאנואקרילט על שלב רקמת ויברטום. מורחים אותו לשכבה דקה עם שטח מעט גדול יותר מגוש הרקמה שנוצר בשלב הקודם.
- מרימים את גוש הרקמה LEC באמצעות כפית, משליכים תמיסת עודפים ומעבירים למדבקת הדבק כך שהחתך הקורונלי הקדמי נדבק.
- התקן את הבמה לתוך תא רקמת ויברטום במהירות לשפוך כמות מספקת של תמיסת חיתוך סוכרוז כדי להטביע את הרקמה; לבעבע את הפתרון הזה עם carbogen. כוון את בלוק רקמת LEC עם משטח הגחון לכיוון הלהב. בעוד שתאורת הסביבה בחדר אינה מספיקה להפעלת האופסין, הימנעו משימוש במקורות אור נוספים שעשויים להימצא בוויברטום.
- חותכים פרוסות בעובי 350 מיקרומטר מגחון לגב באמצעות מהירות תנודת להב גבוהה (100 הרץ) ומהירות התקדמות להב איטית (0.06 מ"מ לשנייה). בדרך כלל, ניתן להשיג שבע פרוסות LEC לכל חצי כדור.
- מעבירים את הפרוסות לתא איסוף הפרוסות. עם השלמת איסוף הפרוסות, העבירו את תא האיסוף לאמבט מים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני שתחזרו לטמפרטורת החדר. בועה עם קרבוגן ברציפות. פרוסות יהיו בריאות מספיק להקלטה במשך 6 שעות לפחות.
- מניחים את שארית המוח ב-PFA למשך 48 שעות לבדיקה לאחר הוק של אתר ההזרקה (ראו סעיף 4).
3. אלקטרופיזיולוגיה וגירוי אופטוגנטי
- זיהוי תא יעד.
- הכניסו את הפרוסה לתא הקלטה שקוע בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס עם aCSF בקצב של 2 מ"ל/דקה על ידי משאבה פריסטלטית. שיתוק הפרוסה באמצעות עוגן פרוסה.
- תחת מטרת ההגדלה הנמוכה (4x) של מיקרוסקופ שדה רחב באמצעות תאורת אינפרא אדום אלכסונית, נווט לשכבת LEC 5. מדוד את המרחק ממשטח הפיס לשכבה הנדרשת.
הערה: תאורת אינפרה-אדום אלכסונית הושגה על-ידי מיקום נורית LED אינפרה-אדומה קרובה כ-3 מ"מ מתחת לכיסוי תא ההקלטה בזווית של ~55° למישור הכיסוי (איור 2B). ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית היא טכניקת הדמיה חלופית ונפוצה לאלקטרופיזיולוגיה של פרוסות. - שנה ליעד טבילה במים בהגדלה גבוהה (פי 40) וזהה נוירונים פירמידליים. סמן את המיקום של התא על צג המחשב עם קלטת.
הערה: לנוירונים הפירמידליים יש מורפולוגיה משולשת בערך עם דנדריטים אפיקליים בולטים המקרינים לעבר פני השטח הפיניאליים של הפרוסה (איור 3A). ניתן להעריך את בריאות התא על ידי היעדר גרעין מעובה ונראה לעין ובדיקה של קרום הפלזמה שאמור להיראות חלק. אין זה סביר כי תיוג פלואורסצנטי ברור של אקסונים על ידי חלבון היתוך אופסין-פלואורופור יהיה גלוי בעת שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. כדי להמחיש תחזיות אקסונאליות, בצע אימונוהיסטוכימיה לאחר הוק באמצעות נוגדן ראשוני כנגד הפלואורופור של האופסין והגבר עם נוגדן משני המצומד לפלואורופור באורך גל זהה או דומה.
- היווצרות של מהדק טלאי שלם.
- ייצרו מיקרופיפט זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך פיפטה ומלאו בתמיסת הקלטה תוך-תאית מסוננת (120 mM k-gluconate, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0.3 mM NaGTP, 0.2 mM EGTA ו-0.25% ביוציטין המיוצר ב-UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm). הנח את המיקרופיפטה המלאה במחזיק האלקטרודה על מגבר המדבקה-מהדק על במת הראש של מגבר המדבקה כדי להבטיח שחוט האלקטרודה נמצא במגע עם התמיסה התוך-תאית.
- הפעילו לחץ חיובי דרך הפה על ידי ניפוח חזק לתוך פיה (כגון מזרק 1 מ"ל כאשר הבוכנה הוסרה) המחוברת על ידי צינורות ליציאה הצדדית של מחזיק האלקטרודה ושמרו על הלחץ על ידי סגירת שסתום תלת-כיווני בשורה. הרימו את מטרת המיקרוסקופ כך שייווצר מניסקוס והכניסו את האלקטרודה לתוך המניסקוס עד שניתן יהיה לראותה במיקרוסקופ.
- פתח את חלון בדיקת החותם ב- WinLTP16 (או תוכנת רכישה/אוסצילוסקופ אחרת) ועם המגבר במצב מהדק מתח, החל פולס מרובע של 5 mV כדי לקבוע אם התנגדות הפיפטה היא 3-6 MΩ.
- להתקרב ולגעת בתא המזוהה עם קצה הפיפטה; זה אמור לגרום לכניסה לקרום התא (איור 3A; פאנל ימני) ולעלייה קטנה בהתנגדות הפיפטה (0.1 MΩ).
- לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל לחץ שלילי על ידי הפעלת יניקה מתונה על השופר; זה אמור לגרום לעלייה עצומה בעמידות הפיפטה (>1000 MΩ). כעת ניתן להשאיר את הלחץ נייטרלי. הפעל לחץ שלילי ברמפה ההולכת וגדלה בהדרגה עד לקרום התא נקרע וכתוצאה מכך לקיבול של תאים שלמים חולפים.
- תיעוד אירועים סינפטיים המעוררים באופן אופטיגנטי.
- הזן את תצורת המהדק הנוכחי.
הערה: ברוב המקרים העברה סינפטית ארוכת טווח היא גלוטמטרגית, ולכן רישום בפוטנציאלים של ממברנה קרוב לפוטנציאל ההיפוך של כלוריד יבודד בצורה הטובה ביותר את ההולכה בתיווך קולטן AMPA (AMPAR) וימזער את המדידה של כל עיכוב הזנה קדימה (FFI) המעורר. היפוך כלוריד תלוי בהרכב תמיסת ההקלטה התוך-תאית וב-aCSF וניתן לחשב אותו באמצעות משוואת גולדמן-הודג'קין-כץ; עבור הפתרונות לעיל, זה היה -61.3 mV. לנוירונים הפירמידליים של LEC בשכבה 5 היה פוטנציאל ממברנה מנוחה ממוצע של -62 mV, ובמידת הצורך נשמרו בפוטנציאל זה על ידי הזרקת זרם קבוע. לחלופין, התאים יכולים להיות מהודקים במתח לפוטנציאל הרצוי. כדי לרשום תחזיות מעכבות ארוכות טווח16 או כדי להקליט FFI, מהדק מתח בפוטנציאל היפוך קטיונים כדי לבודד את מוליכות הכלוריד GABAergic. כאשר נוירונים מהדקי מתח בפוטנציאל הממברנה מעל סף פוטנציאל הפעולה, תמיסה תוך-תאית מבוססת צזיום המכילה חוסמי תעלות נתרן מגודרות מתח משמשת לשיפור מהדק המתח ולמניעת התחלת פוטנציאל פעולה (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 כלוריד,4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, 0.25% ביוציטין תוצרת UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm). - באמצעות תוכנה לאיסוף נתונים, שלח אותות לוגיקת טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) למנהל התקן LED כדי להפעיל נורית LED מותקנת בגודל 470 ננומטר. נורית ה-LED המותקנת מופנית לנתיב האור של המיקרוסקופ באמצעות קוביות סינון ואופטיקה מתאימה (איור 2B) כדי להחיל פולסים של אור על הפרוסה דרך המטרה פי 40 כדי לעורר פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים אופטוגנטיים (oEPSPs).
הערה: פולסים קלים יכולים להיות מיושמים באופן פריסומטי / מעל הדנדריטים, מה שיגרום להפעלת אופסינים באקסונים ובבוטון הקדם-סינפטי, או שהחוקר יכול להזיז את המטרה לאקסונים הרחק מהתא המוקלט כדי למנוע גירוי יתר של בוטון (ראה דיון). משרעת oEPSP מקסימלית תלויה בחוזק ההקרנה הסינפטית, ביעילות הזריקות הנגיפיות ובאופסין המשמש. oEPSPs ניתן לקשר למשרעת הרצויה על ידי עוצמת אור משתנה ו / או משך18; שינוי משך פעימות האור (משך אופייני בין 0.2-5 אלפיות השנייה בתפוקת הספק LED מקסימלית, מה שמביא לצפיפות אור של 4.4 mW/mm19) מעניק אמפליטודות oEPSP עקביות יותר מאשר שינוי תפוקת ההספק של הנורית. - חקרו את תכונות השחרור הקדם-סינפטי (שינוי במתח) על-ידי העברת רכבות של פולסים מרובים של אור עם מרווחים בין-גירויים שונים (איור 3E); יש לנקוט משנה זהירות בעת פירוש העברה מעוררת אופוגנטית (ראו דיון).
- לחקור את הפלסטיות לטווח ארוך על ידי התעוררות חוזרת ונשנית של oEPSPs19 או יישום של ליגנדות. נטר את משרעת oEPSP למשך 5-10 דקות כדי להבטיח יציבות לפני אינדוקציה של פלסטיות, ולאחר מכן נטר עד להגעה לאמפליטודה יציבה (בדרך כלל 30-40 דקות).
הערה: רוב האופסינים הנוכחיים אינם מסוגלים לעורר באופן אמין פוטנציאל פעולה מרובה בתדרים גבוהים, למשל, 100 גירויים המועברים ב-100 הרץ, כפי שמשמש בדרך כלל להשראת LTP. - כדי לאשר oEPSPs הם monosynaptic, לבצע הפעלה over-bouton של המסלול מתמר על ידי מיקום המטרה מעל סוך דנדריטי מגרה בנוכחות 0.5 μM טטרודוטוקסין ו 100 μM aminopyridine. יישום של טטרודוטוקסין יבטל את ההעברה אם התגובות תלויות פוטנציאל פעולה והכללה לאחר מכן של אמינופירידין תשחזר חלקית את ההעברה אם ה- oEPSPs נוצרים באופן מונוסינפטי19,20.
- כדי לאפשר לביוציטין למלא את הנוירון, יש להמתין לפחות 15 דקות לאחר הכניסה לתצורת התא כולו. במהדק מתח, עקוב אחר קיבוליות הממברנה והתנגדות הכניסה.
- משכו באיטיות את הפיפטה לאורך זווית הגישה הרחק מהסומה של התא, תוך התבוננות בהיעלמותם האיטית של טרנזיינטים קיבוליים וזרם ממברנה המעידים על איטום מחדש של קרום התא והיווצרות טלאי חיצוני בקצה הפיפטה. שימו לב לכיוון הפרוסה ולמיקום התאים בתוך הפרוסה. מכניסים את הפרוסה ל-PFA בצלחת של 24 בארות ודוגרים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, ואז מעבירים ל-0.1 M PB.
הערה: ניתן לאחסן פרוסות למשך עד שבוע. אם נדרש אחסון ארוך יותר, שנה את ה- PB באופן קבוע או השתמש ב- PB המכיל נתרן אזיד (0.02%-0.2% של נתרן אזיד).
- הזן את תצורת המהדק הנוכחי.
4. היסטולוגיה
- חיתוך אתר הזרקה
- לאחר הקיבוע, יש להגן על הרקמה ב-30% סוכרוז (w/v) ב-PB עד שהיא שוקעת (בתחילה היא תצוף בתמיסת סוכרוז), בדרך כלל לילה בטמפרטורת החדר או 24-48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
- באמצעות טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיום, לצרף בלוק של רקמה לדיסק הדגימה cryostat. הקפיאו את בלוק הרקמה בעקבות שלבים 4.1.3 עד 4.1.4.
- מניחים איזופנטאן במיכל מתאים. לטבול רק את דיסק הדגימה, להבטיח את הרקמה היא מעל רמת isopentane. מורידים את מיכל האיזופנטאן לחנקן נוזלי (או קרח יבש) ומאפשרים לרקמה לקפוא.
- לאחר שקפא לחלוטין (כל גוש הרקמה הופך חיוור וקשה), השאירו את בלוק הרקמה בתא הקריוסטאט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לטמפרטורת הבלוק להתאזן.
- חותכים חלקים בעובי 40 מיקרומטר בקריסטאט ב-20 מעלות צלזיוס. השתמש במכחול עדין כדי להנחות את החלקים מהלהב. הדבק חלקים קפואים לטמפרטורת החדר, מצופה פולי-L-ליזין, שקופית מיקרוסקופ זכוכית על ידי נגיעה במגלשה לחלקים.
- הוסף כ-150 μL של מדיום הרכבה לכל שקופית ומכסה עם מכסה מחליק; הסירו את בועות האוויר על ידי לחיצה עדינה על הכיסוי. כסו את השקופיות כדי להגן מפני הלבנת תמונות וייבוש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות (או למשך הלילה). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש לבחון את מיקום אתר ההזרקה הנגיפי.
- פרוטוקול צביעת ביוציטין
הערה: ניתן להחיל פרוטוקול זה על חלקים עבים; אין צורך לחתוך מחדש פרוסות.- שטפו את פרוסות המוח בתמיסת מלח אפופית פוספט (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ו-1.8 mM KH2PO4) שש פעמים למשך 10דקות לכל שטיפה. השתמש פיפטה העברה כדי לרוקן את הבארות לאחר כל שלב.
- דגירה של הפרוסות ב-3% H2 O2 (w/v) ב-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום כל פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. זה יוצר בועות חמצן.
- שטפו את פרוסות המוח עם PBS שש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה או עד שלא נראות בועות חמצן נוספות. דגירה של פרוסות המוח בתמיסת קומפלקס HRP (ABC) של 1% (v/v) אבידין-ביוטינילציה ב-PBS המכילה 0.1% (v/v) Triton X-100 בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
- שטפו את פרוסות המוח עם PBS שש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה.
- דגירה של כל פרוסה בתמיסת 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) למשך מספר דקות עד שהכתם הביוציטין של מבנים עצביים הופך גלוי לעין (לוקח בערך 5-10 דקות).
אזהרה: DAB הוא רעיל. יש להשתמש במכסה אדים.
הערה: זמני הדגירה של DAB יכולים להיות בלתי צפויים, עקוב אחר הרקמה מקרוב ככל שהצבע מתפתח. - עצרו את התגובה על ידי העברת הפרוסות ל-PBS קר (4 מעלות צלזיוס). שטפו את פרוסות המוח עם PBS שש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה. השתמש במברשת כדי להרכיב את פרוסות המוח על שקופיות זכוכית מצופות פולי-L-ליזין.
- הסר את כל עודף PBS עם רקמה נקייה. מכסים כל פרוסה בכ-200 μL של מדיום הרכבה; מכסים בכיסויים ולוחצים בעדינות על הכיסוי כדי לדחוף החוצה בועות אוויר. יש לייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות (או למשך הלילה). באמצעות מיקרוסקופ אור, יש לבחון את המיקום והפרטים המורפולוגיים של התאים.
הערה: ניתן להמחיש את הביוציטין לחלופין באמצעות סטרפטווידין מצומד פלואורופור; עם זאת, הדמיה עשויה לדרוש כריתה או שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לחקור פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות באמצעות העברה נגיפית של מבנים אופטוגנטיים. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות רבה לחקר כמעט כל קשר ארוך טווח במוח. לדוגמה, אנו מתארים את ההזרקה של AAVs המקודדים אופסין לתוך mPFC של חולדה, הכנת פרוסות חריפות מ-LEC, הקלטות של מהדקי טלאים מנוירונים פירמידליים של LEC בשכבה 5, והפעלה מעוררת אור של מסופי mPFC ב-LEC (איור 1).
תא פירמידלי בריא אותר ותוקנה (לדוגמה, איור 3A). בדוגמה הנוכחית של mPFC ל-LEC, התאים הפוסט-סינפטיים לא סומנו; אם נדרש זיהוי של תאים פוסט-סינפטיים, תא המבטא את הסמן הפלואורסצנטי צריך להיות מקומי באמצעות אופטיקה של שדה רחב (לדוגמה, איור 3B). יש להעריך את בריאות התא על ידי אופטיקה אינפרא אדומה לפני הניסוי. כדי להפעיל אקסונים של mPFC ב-LEC, נורית LED הונחה ישירות מעל סומה של תא בשכבה 5 ודנדריטים פרוקסימליים דרך מטרת המיקרוסקופ (איור 1), פולסים של אור יחיד של 2 אלפיות השנייה גרמו ל-oEPSPs פשוטים בצורת גל (איור 3C); ניתן למדוד את משרעת השיא של oEPSP. כדי לבחון את הפלסטיות לטווח קצר של הסינפסה, הופעלו רכבות 5, 10 ו-20 הרץ של גירוי קל (איור 3E). כדי לחקור פלסטיות לטווח ארוך, לאחר ניטור משרעת oEPSP בסיסית במשך 10 דקות האגוניסט הכולינרגי, קרבצ'ול, נוסף ל- aCSF במחזור במשך 10 דקות. זה גרם לדיכאון ארוך טווח שעדיין ניכר 40 דקות לאחר הסרת הליגנד (איור 3D).
לאחר ניסויי הקלטה אלקטרופיזיולוגיים, נחתכה רקמת המוח המכילה את אתר ההזרקה הנגיפי ונבדקה אורך אתר ההזרקה (איור 4A). הכתב הפלואורסצנטי, mCherry, ממוקם בשכבות העמוקות יותר של קליפת המוח הפרה-לימבית והתת-לימבית (אזורים המרכיבים את mPFC של מכרסמים). שכבות אלה היו ממוקדות מכיוון שהוכח כי ההקרנה ל-LEC מקורה בעיקר בשכבות קליפת המוח העמוקותיותר 22. ניתן לראות גם סיבים חיוביים mCherry המצטרפים למערכת החומר הלבן. בניסוי פיילוט לאופטימיזציה של מיקום הזרקת הנגיף, נלקחו ונבדקו 40 מקטעים של LEC של מיקרומטר; ניתן לראות סיבים חיוביים של mCherry בשכבה 5 של LEC (איור 4B). לבסוף, התא המלא בביוציטין הוכתם, מה שאפשר לאשר את מיקומו ואת המורפולוגיה שלו (איור 4C,D).
איור 1: סקירה כללית של הניסוי. (A) סכמטי של הזרקת וקטור נגיפי לקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC), התמרה של תאי mPFC עם מבנה אופטוגנטי, והובלת מבנה לטרמינלים בקליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (LEC). (B) ייצוג סכמטי של רישום תאים שלמים מנוירונים פירמידליים בשכבה 5 בפרוסת LEC חריפה והפעלת אור של מסופי mPFC באמצעות מטרת מיקרוסקופ. קיצורים: CA = קורנו אמוניס; PERI = קליפת המוח הפרירינלית; TR = אזור מעבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תא איסוף פרוסות ותצורה אופטית להקלטות חזותיות של תאים שלמים, עירור אופטוגנטי וזיהוי של נוירונים חיוביים ל-tdTomato. (A) תא איסוף הפרוסה14 מיוצר בהתאמה אישית ממתלה צינורות מיקרוצנטריפוגה המודבק על יריעה של רשת ניילון ומונח לתוך שבה הוא שקוע ב-aCSF (B נוריות LED לעירור של ChR2 (470 ננומטר) ו- tdTomato (565 ננומטר) מכוונות דרך עדשת מעבה אספרית כדי להתנגש באור, אור של 565 ננומטר מוקרן דרך מסנן מעבר פס כדי להשיג הפרדה ספקטרלית של עירור tdTomato וספקטרום פליטה. אלה משולבים עם מראה דיכרואית בעלת מעבר ארוך ומכוונים לכיוון הפרוסה עם מראה דיכרואית שנייה בעלת מעבר ארוך באורך גל ארוך יותר. לאחר מכן האור מתמקד בפרוסה דרך העדשה האובייקטיבית. בניסויים שבהם נמצאים תאי עצב המסומנים ב-tdTomato, אור פלואורסצנטי הנפלט עובר דרך המראה הדיכרואית ומסנן הפליטה וממוקד בחיישן המצלמה על ידי עדשה אכרומטית. תכונות לא פלואורסצנטיות של הפרוסה מוצגות על ידי שבירה אלכסונית ליד אור אינפרא-אדום (NIR) המופעל מתחת לתא הפרוסה; אור זה מעביר את האופטיקה למצלמה ובכך שולל את הצורך להחליף קוביות מסנן בין הדמיה פלואורסצנטית להדמיית NIR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הדמיה של תאי עצב תחת הדמיה NIR/פלואורסצנטית ודוגמאות מייצגות של oEPSPs. (A) משמאל: דוגמה של נוירון עם מורפולוגיה פירמידלית שהומחשה עם אור NIR. מימין: אותו נוירון עם היווצרות גומה קעורה הנגרמת על ידי לחץ חיובי מהפיפטה של המדבקה. (B) ביטוי תלוי Cre-recombinase של tdTomato בתא עצב יחיד. (C) oEPSP מייצג משכבת LEC 5 בתא הפירמידלי. (D) דוגמה לניסוי פלסטיות ארוך טווח המנטר oEPSP לאורך זמן לאחר תוספת של 10 מיקרומטר קרבקול (CCh). הקו המקווקו מציין משרעת oEPSP ממוצעת במהלך תקופת הבסיס לפני הוספת סמים. (E) עקבות מייצגים של רכבות גירוי ב-5, 10 ו-20 הרץ. חיצים כחולים מציינים הפעלת אור. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: אימות היסטולוגי של אתר ההזרקה והתאוששות של תאים מלאים בביוציטין . (A) פוטומיקרוגרף קורונלי המציג אתר הזרקה נגיפי ב-mPFC, +3.00 מ"מ מברגמה. (B) קטע קורונלי דק של LEC הממחיש סיבי mCherry+. (C) תמונה בהספק נמוך של פרוסה חריפה בעובי 350 מיקרומטר, -6.2 מ"מ מברגמה, עם תא פירמידלי מלא בביוציטין ב-LEC. התיבה המקווקו מוצגת בהגדלה גבוהה יותר בתא פירמידלי D. (D) LEC; ניתן לראות את הדנדריט האפיקלי בצד ימין של התמונה לכיוון שכבה 1. קווים מקווקווים מציינים גבולות אזוריים. קיצורים: IL = קליפת המוח האינפרא-לימבית; PL = קליפת המוח הקדם-לימבית; wm = חומר לבן. סרגלי קנה מידה = 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקור הקרנות סינפטיות ארוכות טווח ספציפיות ביותר באמצעות שילוב של ניתוחים סטריאוטקסיים כדי לספק AAVs המקודדים מבנים אופטוגנטיים, ואלקטרופיזיולוגיה בפרוסות מוח חריפות (איור 1). יחד טכניקות אלה מציעות כלים לאפיון הפיזיולוגיה והפלסטיות של מעגלים מוחיים בדיוק גבוה במסלולים ארוכי טווח ומפוזרים אנטומית שלא היו נגישים בעבר באמצעות גירוי חשמלי מסורתי, לא ספציפי. שילוב עם סמנים מולקולריים ספציפיים לתא מאפשר אפיון של הקרנות מאזור מוח אחד לאוכלוסיות תאים מוגדרות שונות באזור אחר23.
כדי לנצל את מלוא האופי המדויק ביותר של טכניקה זו, חיוני לאמת את ספציפיות המסלול. זה נעשה בכמה שלבים; במהלך ההקלטה, ודא שהסינפסה הנחקרת היא חד-סינפטית (שלב 3.3.5). לאחר מכן, יש לבחון באופן היסטולוגי את אתר ההזרקה כדי לוודא שהנגיף מוגבל לאזור העניין הקדם-סינפטי המיועד ולהעריך את המיקום והמורפולוגיה של התא הפוסט-סינפטי המוכתם בביוציטין כדי לוודא שהוא כצפוי.
בחירת וירוסים והשגת ספציפיות תאית
הטכניקה ניתנת להתאמה גבוהה ומתאימה לשימוש הן בעכברים והן בחולדות. ניסויים הדורשים ספציפיות אנטומית יכולים להתבצע עם מכרסמים מסוג בר. ניסויים הדורשים ספציפיות של סוג תא פוסט-סינפטי עשויים לדרוש זן מכרסם מהונדס גנטית אם התאים אינם ניתנים לזיהוי על סמך מורפולוגיה או מיקום. לדוגמה, כדי להתמקד בפרוולבומין (PV) המבטא אינטרנורונים, ניתן להשתמש בקו עכברים מהונדסים PV-Cre שבו Cre-recombinase מתבטא בתאי עצב המבטאים PV. כדי להמחיש את התאים האלה, ניתן לחצות את קו PV-Cre עם קו עכבר מדווח כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי בעקבות רקומבינציה בתיווך Cre. לחלופין, ניתן להכניס גן מדווח פלואורסצנטי תלוי Cre באופן ויראלי. חלבוני היתוך ChR2-fluorophore מוגבלים לקרום התא ועשויים להופיע כקווי מתאר של הנוירון כאשר מסתכלים עליהם במיקרוסקופיה של שדה רחב בפרוסות חריפות, מה שהופך את זיהוי התאים לרישום תאים שלמים למאתגר יותר מאשר שימוש בפלואורופורים ציטוזוליקים. אם ChR2 משמש לזיהוי תאים, ניתן להשיג הפרדה של ChR2 ופלואורופור באמצעות וקטורים ביקסטרוניים24. אם משתמשים במדווח פלואורסצנטי כדי לזהות נוירוני מטרה לרישום תאים שלמים, אורך גל העירור שלו לא צריך באופן אידיאלי לחפוף עם אורך גל ההפעלה של האופסין; זה ימנע הפעלה ממושכת של afferents מתמרים תוך חיפוש נוירונים להקליט מהם. כמו כן, כתבים לפני ואחרי סינפטיים צריכים להיות נפרדים מבחינה ספקטרלית. כתבים נפוצים הם mCherry, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), וחלבון פלואורסצנטי צהוב משופר (eYFP).
המבנה הוויראלי שבו נעשה שימוש כולל מספר מרכיבים שונים, כל אחד מהם יכול להשפיע על הצלחת הניסוי ולכן יש לתת את הדעת לכל אלמנט. יש לתת חשיבות עליונה לבחירת האופסין. עבור הפעלה קדם-סינפטית, לאופסין האידיאלי יש זרמי צילום גדולים (כדי להביא באופן אמין אקסונים לסף פוטנציאל פעולה), קינטיקה מהירה לסירוגין, וקצב איטי של דה-סנסיטיזציה כדי לאפשר גירוי חוזר בתדר גבוה. ככלל, קינטיקה מהירה באה לעתים קרובות במחיר של זרמי צילום קטניםיותר 25; עם זאת, סינון מולקולרי והנדסה סיפקו לאופסינים זרמי צילום גדולים. הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-ChR2(E123T/T159C) ChETATC12, אולם כרונוס26, CheRiff 27, oChIEFAC28 ו-ChRmine29 מתאימים גם הם. בנוסף, קיימים אופסינים מעוררים עם אורכי גל הפעלה בהסטה אדומה (ChrimsonR)26 או בהזזת סגול (CheRiff), אשר עשויים להידרש כדי למנוע חפיפה עם ספקטרום עירור של פלואורופורים המשמשים לזיהוי תאים (ראה לעיל).
הסרוטיפ של AAVs יכול להשפיע על יכולתו של הווקטור להתמר אזורי מוח וסוגי תאים שונים, כמו גם על מידת ההובלה האקסונאלית הן בכיוון האנטרוגרד והן בכיוון המדרדר30. סרוטיפים המשמשים בדרך כלל להתמרה עצבית הם 1, 2, 5, 8 ו-9. חיפוש ספרותי עשוי לתת אינדיקציה לאיזה סרוטיפ נעשה שימוש מוצלח בכל אזור נתון. לדוגמה, AAV9 הומלץ על התמרה של נוירונים קליפת המוח31.
המקדם מאפשר אפיון של סוג התא שבו יתבטא האופסין. מקדמים נופלים למספר כיתות. מקדמים כלליים, כגון CAG או EF1a, מביאים לביטוי ברוב סוגי התאים. מקדמים ספציפיים לנוירונים, למשל סינפסין, יוצרים ביטוי בכל סוגי הנוירונים. CaMKIIa משמש בדרך כלל להגבלת ביטוי לנוירונים מעוררים למרות שהוכח שהוא דולף – ביטוי מסוים נצפה באינטרנורונים32. אלמנט משפר mDlx מגביל את הביטוי ל- GABAergic interneurons33. ניתן להשיג ספציפיות של סוג תא קדם-סינפטי באמצעות קו Cre-mouse (כפי שתואר לעיל עבור התא הפוסט-סינפטי). במקרה זה, מבנה גנטי תלוי Cre יידרש להגביל את ביטוי האופסין לתאים המבטאים Cre.
טיטר הוא מספר החלקיקים הנגיפיים בתכשיר הנגיפי. שוב, חיפוש ספרותי עשוי לתת אינדיקציה לטיטר שיצר התמרה מספקת באזור מסוים. בעת שימוש במערכת תלוית Cre, הטיטר עשוי להיות חשוב במיוחד מכיוון שטיטרים נגיפיים גבוהים יכולים להתמר ביטוי בתאים שאינם מבטאים Cre34.
אופטימיזציה של משלוח וירוסים
משלוח ויראלי מדויק לאזור העניין הוא בעל חשיבות קריטית לגישה זו. ניתן להעריך את קואורדינטות ההזרקה של האזור הקדם-סינפטי על ידי עיון בספרות ו/או באטלס המוח עבור המינים המתאימים35,36. לאחר מכן על הנסיין לקחת זמן כדי לייעל ולחדד את קואורדינטות ההזרקה המדויקות ואת הנפח המשמשים כדי להבטיח שהזריקה הנגיפית מוגבלת לאזור העניין הקדם-סינפטי שלהם. זה קריטי במיוחד כאשר אזורים שכנים מקרינים גם לאתר ההקלטה. אנו ממליצים להשתמש בכמויות קטנות של הנגיף כשיטה יעילה לעשות זאת. אם נדרש אתר הזרקה קטן במיוחד, השימוש במיקרופיפטים מזכוכית במקום מזרק ומחט עשוי להיות יתרון13. השארת מחט ההזרקה באתרה לתקופה מספקת ונסיגה איטית של מחט ההזרקה היא קריטית כדי למנוע מהנגיף לברוח לתוך מערכת המחט. כדי לאשר את דיוק הזריקות, מומלץ לוודא באופן היסטולוגי את אתר ההזרקה של כל חיה המשמשת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה במידת האפשר ולא לכלול נתונים שבהם התמרה ויראלית היא מחוץ למטרה. בידינו, הפרוטוקול שתואר לעיל הוכיח את עצמו כניתן להכללה לקשרים ארוכי טווח רבים ושונים, כולל תחזיות מגרעינים תלמיים של קו האמצע הגחוני, היפוקמפוס, תלמוס מדיודורסלי ו-LEC ל-PFC; תחזיות מ- PFC ל- LEC ותלמוס מדיודורסלי; תחזיות מ-LEC וגרעינים תלמיים של קו האמצע הגחוני להיפוקמפוס (מעבדת זפאר באשיר, אוניברסיטת בריסטול, תצפיות שלא פורסמו19). תיוג אופטוגנטי של מסלולים שונים אלה דרש רק עידון של קואורדינטות הזרקה ונפחים.
מגבלות פרוטוקול
דיסקציה מהירה של המוח וחיתוך זהיר הם בעלי חשיבות קריטית להצלחת הניסויים הללו. פרוטוקול החיתוך המתואר כאן מניב פרוסות חריפות בריאות ללא התאמה לאזורי מוח שונים; עם זאת, דווח על שונות בטמפרטורת הדגירה הבינונית והפוסט-חיתוך שתוארה במקומות אחרים28 כמשפרת עוד יותר את בריאות הפרוסות. יתר על כן, הצלחנו גם לקחת פרוסות חריפות משני אזורים במוח בעקבות התמרה נגיפית של אזור אחד, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים שבהם נעשה שימוש. מצאנו שבמסלולים צפופים מבחינה אנטומית, פרקי זמן קצרים עד 7 ימים בין התמרה ויראלית להקלטה מספיקים כדי לעורר oEPSPs חזקים בסדר גודל מתאים להקלטות של מהדקי טלאים של תאים שלמים. בתחזיות ארוכות טווח או דלילות יותר, עיכובים ארוכים יותר הם יתרון.
יש לנקוט משנה זהירות כאשר מפרשים את התוצאות של פעילות מעוררת אופטיגנטית, במיוחד ביחס לפלסטיות קצרת טווח. תוצאות קודמות הראו כי העברה מעוררת אופוגנטית עשויה לעבור דיכאון סינפטי בולט יותר עם גירוי חוזר מאשר גירוי חשמלי, אשר עשוי להתעורר עקב מספר גורמים. ראשית, דה-סנסיטיזציה של אופסין25 עלולה להוביל למספר מופחת של אקסונים קדם-סינפטיים, מה שיוביל לתגובות פוסט-סינפטיות מופחתות. קינטיקת התעלות המשופרת של אופסינים שהתגלו לאחרונה ושל אלה שעברו הנדסה מולקולרית (ראה לעיל) עשתה דרך ניכרת למתן את ההשפעות של דה-סנסיטיזציה; עם זאת, גירוי של 100 הרץ נותר מעבר להישג ידם של אופסינים רבים, מה שעלול לעכב את השימוש בפרוטוקולי אינדוקציה פלסטיים ארוכי טווח מסוימים (אם כי ראה37). שנית, הקינטיקה האיטית של אופסינים עשויה להרחיב את פוטנציאל הפעולה18 ולהוביל לשחרור ממושך של המשדר ולהידלדלות שלפוחית שלפוחית; זה עשוי גם לנבוע מחדירות סידן של אופסינים מעוררים11; ניתן למתן בעיות אלה על ידי הימנעות מפוטואקטיבציה מוגזמת של בוטון38. שלישית, התמרה של נוירונים באמצעות וקטורים AAV עשויה גם להוביל לשינויים בתכונות שחרור קדם-סינפטיות בסינפסות מסוימות; עם זאת, ניתן למתן זאת באמצעות סרוטיפAAV9 38. למרות מגבלות אלה, בשימוש זהיר, הפעלה אופטוגנטית יכולה לחקות גירוי חשמלי19,38 ולכן היא כלי רב ערך בחקר הפיזיולוגיה של מסלולים סינפטיים לא נחקרים. כמו כן, נציין כי הנתונים המוצגים באיור 3E מעריכים פלסטיות לטווח קצר במהדק הנוכחי, ולכן הם כפופים לאינטראקציה של פוטנציאלים סינפטיים ותכונות ממברנה פנימית, ניתן להימנע מכך על ידי ביצוע ניסויים מקבילים במהדק מתח.
כיוונים עתידיים
ארגז הכלים האופטוגנטי ההולך ומתרחב העלה את האפשרות ליישם טכנולוגיה זו בשני מסלולים סינפטיים באותו הכנה, על ידי שימוש בזוג אופסינים עם ספקטרום עירור מסתעף. זה מתאפשר על ידי שימוש באופסין ChrimsonR26, אשר, בניגוד ChR2, הוא photoactivated על ידי אור אורך גל אדום. ChrimsonR שומר על רגישות נמוכה לאור כחול, ולכן כדי להימנע מהפעלת מסלולים צולבים ניתן להשתמש בו בשילוב עם אופסינים חסרי רגישות לאדום, שהם סגולים מוסטים (CheRiff 27) ו/או בעלי רגישות גבוהה יותר לאור כחול (כרונוס26). זה מאפשר שימוש בגירויי אור כחול/סגול שהם חלשים מכדי להפעיל באופן משמעותי את ChrimsonR ולכן מאפשרים הפעלה של שני מסלולים39,40, מה שעשוי להגדיל את תפוקת הניסוי, לאפשר בחינה של אינטראקציות מסלול מתכנס, ולאפשר שחרור של נוירומודולטורים ממקורות אנדוגניים 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק Wellcome 206401/Z/17/Z. ברצוננו להודות לזפאר בשיר על חונכותו המקצועית ולד"ר קלייר בות' על הסיוע הטכני וההערות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
