Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetisk forhør av langdistanse synaptisk overføring og plastisitet fra medial prefrontal cortex til lateral entorhinal cortex

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/63077
Automatic Translation
1, 1
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver viral transduksjon av diskrete hjernegrupper med optogenetiske konstruksjoner for å tillate synapsespesifikk elektrofysiologisk karakterisering i akutte gnagerhjerneskiver.

Abstract

Å studere de fysiologiske egenskapene til spesifikke synapser i hjernen, og hvordan de gjennomgår plastiske endringer, er en sentral utfordring i moderne nevrovitenskap. Tradisjonelle in vitro elektrofysiologiske teknikker bruker elektrisk stimulering for å fremkalle synaptisk overføring. En stor ulempe ved denne metoden er dens uspesifikke natur; Alle aksoner i regionen av den stimulerende elektroden vil bli aktivert, noe som gjør det vanskelig å tilskrive en effekt til en bestemt afferente forbindelse. Dette problemet kan løses ved å erstatte elektrisk stimulering med optogenetisk basert stimulering. Vi beskriver en metode for å kombinere optogenetikk med in vitro patch-clamp opptak. Dette er et kraftig verktøy for studier av både basal synaptisk overføring og synaptisk plastisitet av presise anatomisk definerte synaptiske forbindelser og gjelder for nesten hvilken som helst vei i hjernen. Her beskriver vi forberedelse og håndtering av et viralt vektorkodingskanalrhodopsinprotein for kirurgisk injeksjon i et presynaptisk interesseområde (medial prefrontal cortex) i gnagerhjernen og fremstilling av akutte skiver av nedstrøms målregioner (lateral entorhinal cortex). En detaljert prosedyre for å kombinere patch-clamp-opptak med synaptisk aktivering ved lysstimulering for å studere kort- og langsiktig synaptisk plastisitet presenteres også. Vi diskuterer eksempler på eksperimenter som oppnår vei- og cellespesifisitet ved å kombinere optogenetikk og Cre-avhengig cellemerking. Endelig beskrives histologisk bekreftelse av den presynaptiske interesseområdet sammen med biocytinmerking av den postsynaptiske cellen, for å muliggjøre ytterligere identifisering av den nøyaktige plasseringen og celletypen.

Introduction

Å forstå synapsenes fysiologi og hvordan de gjennomgår plastiske endringer er grunnleggende for å forstå hvordan hjernenettverk fungerer i den sunne hjernen1, og hvordan de svikter i hjernesykdommer. Bruken av akutte ex vivo hjerneskiver muliggjør registrering av den elektriske aktiviteten til synapser fra enkeltneuroner med høyt signal-til-støy-forhold ved bruk av helcelle-patch-klemmeopptak. Kontroll av membranpotensial og enkel farmakologisk manipulasjon tillater isolering av reseptorsubtyper. Disse opptakene kan gjøres med utsøkt spesifisitet for å identifisere det postsynaptiske nevronet, inkludert laminær og subregional posisjon2, cellulær morfologi3, tilstedeværelse av molekylære markører4, dens afferente fremspring5, eller selv om den nylig var aktiv6.

Å oppnå spesifisitet av presynaptiske innganger er imidlertid noe mer utfordrende. Den konvensjonelle metoden har brukt stimuleringselektroder for å opphisse aksonene som kjører i en bestemt lamina. Et eksempel på dette er i hippocampus hvor lokal stimulering i stratum radiatum aktiverer synapser som projiserer fra CA3 til CA1-underfeltet7. I dette tilfellet oppnås presynaptisk spesifisitet da CA3-inngang representerer den eneste eksitatoriske inngangen som ligger innenfor stratum radiatum som projiserer til CA1-pyramideceller8. Denne høye graden av inngangsspesifisitet som kan oppnås med konvensjonell elektrisk presynaptisk aktivering av CA3-CA1-aksoner, er imidlertid et unntak som gjenspeiles i den intense studien som denne synapsen har vært utsatt for. I andre hjernegrupper eksisterer aksoner fra flere afferente veier i samme lamina, for eksempel i lag 1 av neocortex9, noe som gjør inngangsspesifikk presynaptisk stimulering umulig med konvensjonelle stimulerende elektroder. Dette er problematisk da forskjellige synaptiske innganger kan ha divergerende fysiologiske egenskaper; Derfor kan deres samstimulering føre til feilkarakterisering av synaptisk fysiologi.

Fremkomsten av optogenetikk, den genetiske kodingen av lysfølsomme membranproteiner (opsiner) som channelrhodopsin-2 (ChR2), har gitt en stor utvidelse av mulighetene for å studere isolerte synaptiske fremskrivninger mellom hjernegrupper10,11. Her beskriver vi en generaliserbar og rimelig løsning for å studere langtrekkende synaptisk fysiologi og plastisitet. De optogenetiske konstruksjonene leveres på en svært spesifikk måte ved bruk av virale vektorer som muliggjør ekstremt presis kontroll av det presynaptiske interesseområdet. Efferente fremspring vil uttrykke den lysaktiverte kanalen som muliggjør aktivering av disse fibrene i et målområde. Dermed kan langtrekkende, anatomisk diffuse veier som ikke kan aktiveres uavhengig av tradisjonell, ikke-spesifikk, elektrisk stimulering studeres.

Vi beskriver, som eksempelvei, transduksjon av medial prefrontal cortex (mPFC) med adenoassosierte virus (AAV) som koder for eksitatoriske kationkanalopsiner. Deretter beskriver vi fremstilling av akutte skiver fra lateral entorhinal cortex (LEC), patch-clamp-opptak fra lag 5 LEC pyramidale nevroner, og lysfremkalt aktivering av glutamaterge mPFC-LEC-projeksjoner (figur 1). Vi beskriver også den histologiske vurderingen av injeksjonsstedet for å bekrefte lokalisering av det presynaptiske interesseområdet og identifisering av postsynaptisk cellemorfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med United Kingdom Animals Scientific Procedures Act (1986) og tilhørende retningslinjer samt lokale institusjonelle retningslinjer.

1. Stereotaksisk viral injeksjon

MERK: Den nåværende protokollen krever anatomisk, men ikke postsynaptisk celletype, spesifisitet.

  1. Velg riktig dyr. Hannrotter av villtype Lister-hette ble brukt i denne protokollen (300-350 g, ca. 3 måneder gamle).
  2. Velg riktig viral konstruksjon. Det er flere faktorer å vurdere (se diskusjon). Den nåværende protokollen bruker et virus for å uttrykke den optogenetiske kanalen ChETATC 12, for å transdusere eksitatoriske nevroner (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (E123T / T159C) - mCherry; titer: 3,3 x 10 13 virale genomer / ml).
  3. Etabler koordinater og injeksjonsvolum ved hjelp av et hjerneatlas som tidligere beskrevet35.
  4. Stereotaksisk injeksjon av viruspreparatet
    MERK: Alle relevante nasjonale og institusjonelle retningslinjer for bruk og stell av dyr skal følges. Virusvektorene injiseres stereotaks som tidligere beskrevet13 med følgende modifikasjoner.
    1. Hold viruspreparatet på is under bedøvelse og forberedelse av dyret.
    2. Induser anestesi i et bedøvelsesmiddel induksjonskammer med 4% isofluran. Overvåk anestesinivået indikert ved langsommere regelmessig pustefrekvens (1 Hz) og fravær av pedal- og hornhinnereflekser (test ved å klemme tærne og lett berøre øyets hjørne, henholdsvis, ingen respons skal oppdages).
    3. Administrer preoperativt analgetisk middel som meloksikam minst 30 minutter før den invasive prosedyren.
    4. Når dyret er fullt bedøvet, bruk clippers for å fjerne pels fra hodebunnen. Bytt isofluranstrømmen til nesekjeglen på den stereotaksiske rammen og monter rotta i rammen. Påfør smørende øyegel på øynene for å forhindre tørrhet under prosedyren.
    5. Operasjonen skal utføres under aseptiske forhold. Bruk sterile hansker og instrumenter gjennom hele prosedyren. Påfør lidokainsalve (5% w / w) før du desinfiserer hodebunnen med 4% w / v klorhexidinoppløsning, og dekk deretter kroppen med en steril drapering. Bruk en skalpell til å lage et langsgående snitt på ca. 15 mm i hodebunnen for å eksponere bregma.
    6. Legg en Hamilton-sprøyte inn i en mikroinjeksjonssprøytepumpe festet til en bevegelig arm montert på stereotaksrammen.
    7. Plasser en 5 μL aliquot av viruset i et 0,2 ml rør og spinn i noen sekunder til alt volumet er i bunnen av røret. Pipette 2 μL av viruspreparatet inn i lokket på røret.
    8. Fyll sprøyten med viruspreparatet ved først å se på nålespissen med et kirurgisk mikroskop, og plasser deretter virusets bolus manuelt på spissen av nålen og trekk ut sprøytestemplet ved hjelp av pumpekontrollene.
    9. Sett pumpeinjeksjonsvolumet til 300 nL og strømningshastigheten til 100 nL / min. Kjør pumpen og bekreft riktig strømning ved å observere dråpen av viruset på nålespissen. Absorber viruset på en bomullspinne og rengjør forsiktig nålen med 70% etanol.
    10. Ved hjelp av justeringsskruene på den stereotaksiske rammen, naviger nålspissen til bregma (punktet på skallen der koronale og sagittale suturer møtes) og legg merke til de stereotaksiske målingene som er observert på de tre vernierskalaene på rammen. Koordinatene i forhold til bregma av rotte mPFC er fremre-bakre + 3,1 mm, mediolaterale ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; Legg til / trekk fra (som angitt) disse avstandene fra Bregma-koordinatene, og naviger deretter nålen til de fremre-bakre og mediolaterale koordinatene og senk nålen forsiktig ned på skalleoverflaten.
      MERK: MPFC-koordinatene gitt ovenfor er passende for hannrotter på 300-350 g; endringer i rottestamme, kan størrelse kreve endringer i disse koordinatene (se Diskusjon).
    11. Løft nålen av skalleoverflaten og merk dette punktet med en permanent tusjpenn. Lag et burrhull på dette punktet ved hjelp av en mikrobor montert på den stereotaksiske armen.
    12. Stikk nålen inn i hjernen ved den forhåndsbestemte dorsoventralkoordinaten og tilfør et forhåndsbestemt volum (for mPFC: 300 nL). La nålen stå på stedet i 10 minutter for å muliggjøre diffusjon av bolusen. Når nålen er fjernet, må du kjøre pumpen for å sikre at nålen ikke er blokkert.
      MERK: Stikk inn og fjern nålen sakte (~3 mm/min) for å minimere skaden på hjernevevet og tilbakestrømningen av viruset inn i nålekanalen.
    13. Administrer 2,5 ml oppvarmet natriumklorid (0,9 % w/v) og glukoseoppløsning (5 % w/v) subkutant for å opprettholde hydrering.
    14. Gjenta trinn 1.4.12. for den andre halvkule.
    15. Sutur snittet i hodebunnen og når prosedyren er fullført, administrer 2,5 ml natriumklorid og glukoseoppløsning og et passende, institusjonelt anbefalt, smertestillende middel for smertebehandling, f.eks. buprenorfin eller meloksikam. Ikke la dyret være uten tilsyn mens det er bevisstløs. Plasser rotten i en oppvarmet oppvåkningsboks til den gjenvinner bevisstheten helt. Bare gå tilbake til hjemmeburet med andre dyr når de er fullstendig gjenopprettet.
    16. Følg de institusjonelle retningslinjene for postoperativ omsorg og boligprosedyrer for virustransfekterte gnagere. Vent i minst 2 uker for opsintransgenet å uttrykke tilstrekkelig før du starter eksperimentet.
      MERK: Tiden som kreves for transduksjon er avhengig av avstanden og styrken til forbindelsen mellom pre- og postsynaptiske regioner. For mPFC til LEC er 4-6 uker nødvendig.

2. Forberedelse av akutte hjerneskiver

MERK: Her beskriver vi en enkel metode for fremstilling av hjerneskiver som i våre hender er tilstrekkelig til å oppnå høykvalitets kortikale, hippocampale og thalamiske skiver fra voksne mus og rotter.

  1. Forbered løsningene for disseksjon.
    1. Fyll et 250 ml beger med ~200 ml iskald sukroseskjæringsløsning (189 mM sukrose, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukose, 5 mM MgSO 4,3 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO4 og 0,2 mM CaCl 2 laget i ultrarent vann (UPW) med resistivitet på 18,2 MΩ cm ved 25 °C) eller et tilstrekkelig volum til å fylle vibratomevevskammeret. Boble med karbogen (95% O 2, 5% CO2) og hold deg på is.
    2. Fyll et skiveoppsamlingskammer med kunstig cerebrospinalvæske (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukose,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2PO 4 og 1 mM MgSO4 laget i UPW) ved romtemperatur, boblet med karbogen. Skiveoppsamlingskammeret14 er skreddersydd av et mikrosentrifugerørstativ limt på et ark med nylonnett og plassert i et beger der det er nedsenket i aCSF (figur 2A).
    3. Fyll et 50 ml rør med 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffer (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 Oog 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
      FORSIKTIG: PFA er giftig. Bruk i avtrekkshette.
  2. Disseksjon av hjernen.
    1. Bedøv rotta i et induksjonskammer ved bruk av 5 % isofluran til pusten er langsom og regelmessig (~1 Hz). For å sikre et tilstrekkelig nivå av anestesi test for fravær av pedal og hornhinnen reflekser.
    2. Halshugg dyret ved hjelp av en giljotin.
    3. Disseker raskt ut hele hjernen som tidligere beskrevet15 og overføres til sukroseskjæringsløsning. Fullfør trinnet innen 90 s halshugging for god skivekvalitet og vellykket helcelleopptak.
    4. Bruk en teskje av metall, plukk opp hjernen, kast overflødig skjæreløsning og legg den på et stykke filterpapir på benken.
    5. Bruk en skalpell eller barberblad, fjern raskt lillehjernen og kutt storhjernen i koronalplanet omtrent halvveis langs lengden; den bakre halvdelen er LEC-vevblokken. Sørg for å inkludere litt overflødig vev i tillegg til regionen som skal skives for de neste trinnene. Returner både denne vevsblokken og resten av hjernen til sukroseskjæringsløsningen.
    6. Legg en dråpe cyanoakrylatlim på et vibratomvevsstadium. Spred det i et tynt lag med et område som er litt større enn vevblokken som ble opprettet i forrige trinn.
    7. Plukk opp LEC-vevsblokken med en teskje, kast overflødig løsning og overfør på limplasteret slik at det fremre koronale kuttet har festet seg.
    8. Monter scenen i vibratomevevkammeret og hell raskt en tilstrekkelig mengde sukroseskjæringsløsning for å senke vevet; boble denne løsningen med karbogen. Orienter LEC-vevsblokken med den ventrale overflaten mot bladet. Mens omgivende rombelysning ikke er tilstrekkelig til å aktivere opsinet, unngå å bruke ekstra lyskilder som kan være tilstede på vibratomet.
    9. Skjær skiver på 350 μm tykkelse fra ventral til dorsal ved hjelp av en høy bladoscillasjonshastighet (100 Hz) og en langsom bladfremdriftshastighet (0,06 mm/s). Vanligvis kan syv LEC-skiver oppnås per halvkule.
    10. Overfør skivene til stykkeoppsamlingskammeret. Når oppsamlingen av skiver er fullført, overfør oppsamlingskammeret til et vannbad på 34 °C i 1 time før det går tilbake til romtemperatur. Boble med karbogen kontinuerlig. Skiver vil være tilstrekkelig sunne for opptak i minst 6 timer.
    11. Plasser resten av hjernen i PFA i 48 timer for posthoc undersøkelse av injeksjonsstedet (se avsnitt 4).

3. Elektrofysiologi og optogenetisk stimulering

  1. Identifisering av målcelle.
    1. Plasser skiven i et nedsenket opptakskammer ved 34 °C perfundert med aCSF med en hastighet på 2 ml/min av en peristaltisk pumpe. Immobiliser stykket ved hjelp av et stykkeanker.
    2. Under målet med lav forstørrelse (4x) i et vidvinkelmikroskop ved hjelp av skrå infrarød belysning, naviger til LEC-lag 5. Mål avstanden fra pialoverflaten til ønsket lag.
      MERK: Skrå infrarød belysning ble oppnådd ved å plassere en nær infrarød LED omtrent 3 mm under opptakskammerdekselet i en vinkel på ~ 55 ° til dekselets plan (figur 2B). Differensiell interferenskontrast er en alternativ og ofte brukt avbildningsteknikk for skiveelektrofysiologi.
    3. Bytt til et høyt forstørrelse vann nedsenking mål (40x) og identifisere pyramidale nevroner. Merk cellens posisjon på dataskjermen med tape.
      MERK: De pyramidale nevronene har en omtrent trekantet morfologi med fremtredende apikale dendritter som projiserer mot skivens pialoverflate (figur 3A). Cellehelse kan vurderes ved fravær av kondensert, synlig kjerne og inspeksjon av plasmamembranen som skal virke glatt. Det er usannsynlig at klar fluorescerende merking av aksoner av opsin-fluoroforfusjonsproteinet vil være synlig ved bruk av et bredfeltfluorescensmikroskop. For å visualisere aksonale projeksjoner, utfør immunhistokjemi post-hoc ved bruk av et primært antistoff mot opsinets fluorofor og forsterk med et sekundært antistoff konjugert til en fluorofor med samme eller lignende bølgelengde.
  2. Dannelse av helcelle patch-klemme.
    1. Fremstill en borosilikatglassmikropipette ved hjelp av en pipettetrekker og fyll med filtrert intracellulær opptaksløsning (120 mM k-glukonat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA og 0,25% biocytin laget i UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Plasser den fylte mikropipetten i elektrodeholderen på patch-klemmeforsterkerens hodetrinn, slik at elektrodetråden er i kontakt med den intracellulære løsningen.
    2. Påfør positivt trykk gjennom munnen ved å blåse hardt inn i et munnstykke (for eksempel en 1 ml sprøyte med stempelet fjernet) koblet med slanger til elektrodeholderens sideport og opprettholde trykket ved å lukke en inline treveisventil. Løft mikroskopmålet slik at en menisk dannes og sett elektroden inn i menisken til den kan ses på mikroskopet.
    3. Åpne tetningstestvinduet i WinLTP16 (eller annen anskaffelsesprogramvare/oscilloskop) og med forsterkeren i spenningsklemmemodus, bruk en 5 mV kvadratpuls for å avgjøre om pipettemotstanden er 3-6 MΩ.
    4. Tilnærm deg og berør den identifiserte cellen med pipettespissen; Dette skal resultere i et innrykk i cellemembranen (figur 3A; høyre panel) og en liten økning i pipetteresistens (0,1 MΩ).
    5. Slipp positivt trykk og påfør negativt trykk ved å bruke moderat sug på munnstykket; dette bør resultere i en enorm økning i pipettemotstanden (>1000 MΩ). Presset kan nå stå nøytralt. Påfør negativt trykk i en gradvis økende rampe til cellemembranbrudd resulterer i helcellekapasitanstransienter.
  3. Registrer optogenetisk fremkalte synaptiske hendelser.
    1. Angi gjeldende klemmekonfigurasjon.
      MERK: I de fleste tilfeller er langdistanse synaptisk overføring glutamatergisk, derfor vil registrering ved membranpotensialer nær kloridreverseringspotensialet best isolere AMPAR-reseptor (AMPAR)-mediert overføring og minimere måling av eventuell feed-forward inhibering (FFI) fremkalt. Kloridreversering er avhengig av sammensetningen av intracellulær opptaksløsning og aCSF og kan beregnes ved hjelp av Goldman-Hodgkin-Katz-ligningen; for ovennevnte løsninger var dette -61,3 mV. Lag 5 LEC pyramidale nevroner hadde et gjennomsnittlig hvilemembranpotensial på -62 mV og ble om nødvendig opprettholdt ved dette potensialet ved injeksjon av konstant strøm. Alternativt kan celler spenningsklemmes til ønsket potensial. For å registrere langtrekkende hemmende projeksjoner16 eller for å registrere FFI, spenningsklemme ved kationreverseringspotensial for å isolere GABAergisk kloridkonduktans. Når spenningsklemmende nevroner ved membranpotensialer over handlingspotensialsgrensen, brukes en cesiumbasert intracellulær løsning som inneholder spenningsstyrte natriumkanalblokkere for å forbedre spenningsklemmen og forhindre initiering av handlingspotensialer (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 klorid,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocytin laget i UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
    2. Ved hjelp av datainnsamlingsprogramvare sender du TTL-signaler (transistor-transistor-transistor) til en LED-driver for å aktivere en montert 470 nm LED. Den monterte LED-lampen ledes inn i mikroskopets lysbane ved hjelp av filterkuber og passende optikk (figur 2B) for å påføre lyspulser på skiven via 40x-målet for å fremkalle optogenetiske eksitatoriske postsynaptiske potensialer (oEPSP).
      MERK: Lyspulser kan påføres perisomatisk / over dendrittene, noe som vil resultere i aktivering av opsiner i aksonene og presynaptisk bouton, eller etterforskeren kan flytte målet til aksoner bort fra den innspilte cellen for å unngå over-bouton stimulering (se Diskusjon). Maksimal oEPSP-amplitude avhenger av styrken av den synaptiske projeksjonen, effekten av virale injeksjoner og opsin som brukes. oEPSP-er kan titreres til ønsket amplitude med varierende lysintensitet og/eller varighet18; variere varigheten av lyspulser (typisk varighet mellom 0,2-5 ms ved maksimal LED-effekt, noe som resulterer i 4,4 mW / mm lystetthet19) gir mer konsistente oEPSP-amplituder enn å endre LED-effekten.
    3. Undersøke presynaptiske frigjøringsegenskaper (spenningsendring) ved å levere tog med flere lyspulser med forskjellige interstimulusintervaller (figur 3E); forsiktighet bør utvises ved tolking av optogenetisk fremkalt overføring (se diskusjon).
    4. Undersøk langsiktig plastisitet enten ved å gjentatte ganger fremkalle oEPSPs19 eller påføring av ligander. Overvåk oEPSP-amplitude i 5-10 minutter for å sikre stabilitet før induksjon av plastisitet, og overvåk deretter til en stabil amplitude er nådd (vanligvis 30-40 min).
      MERK: De fleste nåværende opsiner er ikke i stand til pålitelig å fremkalle flere handlingspotensialer ved høye frekvenser, for eksempel 100 stimuli levert ved 100 Hz, som vanligvis brukes til å indusere LTP.
    5. For å bekrefte at oEPSP er monosynaptiske, utfør over-bouton aktivering av den transducerte banen ved å plassere målet over dendritisk arbor og stimulere i nærvær av 0,5 μM tetrodotoksin og 100 μM aminopyridin. Påføring av tetrodotoksin vil avskaffe overføring dersom responsene er virkningspotensialavhengige, og påfølgende inklusjon av aminopyridin vil delvis gjenopprette transmisjonen dersom oEPSP-ene genereres monosynaptisk19,20.
    6. For å tillate biocytin å fylle nevronet, vent i minst 15 minutter etter at du har kommet inn i helcellekonfigurasjonen. I spenningsklemme, overvåk membrankapasitans og inngangsmotstand.
    7. Trekk pipetten sakte langs innflygingsvinkelen bort fra cellens soma, og observer den langsomme forsvinningen av kapasitanstransienter og membranstrøm som indikerer re-forsegling av cellemembranen og dannelse av en utvendig ved pipettespissen. Legg merke til retningen på stykket og plasseringen av cellen(e) i stykket. Legg skiven i PFA i en 24-brønns plate og inkuber over natten ved 4 °C, og overfør deretter til 0,1 M PB.
      MERK: Skiver kan lagres i opptil en uke. Hvis lengre lagring er nødvendig, bytt PB regelmessig eller bruk PB som inneholder natriumazid (0,02% -0,2% natriumazid).

4. Histologi

  1. Injeksjonssted for skiver
    1. Etter fiksering kryobeskytter vevet i 30 % sukrose (w/v) i PB til det synker (det vil i utgangspunktet flyte i sukroseoppløsningen), vanligvis over natten ved romtemperatur eller 24-48 timer ved 4 °C.
    2. Bruk et optimalt skjæretemperaturmedium (OCT) til å feste en blokk med vev til kryostatprøvedisken. Frys ned vevsblokken ved å følge trinnene 4.1.3 til 4.1.4.
    3. Plasser isopentan i en passende beholder. Senk bare prøvedisken, slik at vevet er over isopentannivået. Senk beholderen med isopentan til flytende nitrogen (eller tørris) og la vevet fryse.
    4. Når den er helt frossen (hele vevsblokken blir blek og hard), la vevsblokken ligge i kryostatkammeret ved -20 °C i 30 minutter for å la temperaturen på blokken likestilles.
    5. Skjær 40 μm tykke seksjoner i kryostat ved -20 °C. Bruk en fin pensel til å lede seksjonene av bladet. Hold frosne seksjoner til en romtemperatur, poly-L-lysinbelagt, glassmikroskop lysbilde ved å berøre lysbildet til seksjonene.
    6. Legg til rundt 150 μL monteringsmedium til hvert lysbilde og deksel med en deksel; Fjern eventuelle luftbobler ved å trykke forsiktig på dekselet. Dekk lysbildene for å beskytte mot fotobleking og lufttørk ved romtemperatur i minst 12 timer (eller over natten). Ved hjelp av et fluorescensmikroskop, undersøk plasseringen av det virale injeksjonsstedet.
  2. Biocytin farging protokoll
    MERK: Denne protokollen kan brukes på tykke seksjoner; skiver trenger ikke å seksjoneres på nytt.
    1. Vask hjerneskivene med fosfatbufret saltvann (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 og 1,8 mMKH2PO4) seks ganger i 10 minutter per vask. Bruk en overføringspipette til å tømme brønnene etter hvert trinn.
    2. Inkuber skivene i 3% H 2 O2(w / v) i PBS i 30 minutter for å blokkere endogen peroksidaseaktivitet. Dette genererer oksygenbobler.
    3. Vask hjerneskivene med PBS seks ganger i 10 minutter per vask eller til ingen ytterligere oksygenbobler er synlige. Inkuber hjerneskivene i 1% (v / v) avidin-biotinylert HRP-kompleks (ABC) oppløsning i PBS inneholdende 0,1% (v / v) Triton X-100 ved romtemperatur i 3 timer.
    4. Vask hjerneskivene med PBS seks ganger i 10 minutter per vask.
    5. Inkuber hver skive i 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) løsning i flere minutter til biocytinfargingen av nevronstrukturer blir synlig (tar rundt 5-10 minutter).
      FORSIKTIG: DAB er giftig. Bruk i avtrekkshette.
      MERK: DAB inkubasjonstider kan være uforutsigbare, overvåke vevet nøye etter hvert som fargen utvikler seg.
    6. Stopp reaksjonen ved å overføre skivene til kaldt (4 °C) PBS. Vask hjerneskivene med PBS seks ganger i 10 minutter per vask. Bruk en børste til å montere hjernen skiver på poly-L-lysin belagt glass mikroskop lysbilder.
    7. Fjern alt overflødig PBS med rent vev. Dekk hver skive med ca. 200 μL monteringsmedium; dekk med deksler og trykk forsiktig på dekselet for å skyve ut luftbobler. Lufttørk ved romtemperatur i minst 12 timer (eller over natten). Ved hjelp av et lysmikroskop, undersøk plasseringen og morfologiske detaljer av cellen (e).
      MERK: Biocytin kan alternativt visualiseres ved hjelp av fluorofor-konjugert streptavidin; Avbildning kan imidlertid kreve reseksjonering eller bruk av et konfokalt mikroskop21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokollen beskriver vi hvordan man studerer langtrekkende synaptisk fysiologi og plastisitet ved hjelp av viral levering av optogenetiske konstruksjoner. Protokollen kan veldig enkelt tilpasses for å studere nesten hvilken som helst langdistanseforbindelse i hjernen. Som et eksempel beskriver vi injeksjon av AAV-er som koder for en opsin til rotte mPFC, fremstilling av akutte skiver fra LEC, patch-clamp-opptak fra lag 5 LEC-pyramidale nevroner og lysfremkalt aktivering av mPFC-terminaler i LEC (figur 1).

En frisk pyramidecelle ble lokalisert og lappet (f.eks. figur 3A). I det nåværende eksemplet fra MPFC til LEC ble de postsynaptiske cellene ikke merket; Hvis postsynaptisk celleidentifikasjon er nødvendig, bør en celle som uttrykker fluorescerende markør lokaliseres ved hjelp av bredfeltoptikk (f.eks. figur 3B). Helsen til cellen bør vurderes ved infrarød optikk før eksperimentering. For å aktivere mPFC-aksoner i LEC ble en LED plassert direkte over lag 5-celle soma og proksimale dendritter via mikroskopmålet (figur 1), enkeltlyspulser på 2 ms resulterte i enkle bølgeformede oEPSP-er (figur 3C); toppamplituden til oEPSP kan måles. For å undersøke kortsiktig plastisitet i synapsen ble 5, 10 og 20 Hz tog av lysstimulering påført (figur 3E). For å undersøke langsiktig plastisitet, etter overvåking av baseline oEPSP-amplitude i 10 minutter, ble den kolinerge agonisten carbachol tilsatt sirkulerende aCSF i 10 minutter. Dette førte til langvarig depresjon som fortsatt var tydelig 40 minutter etter fjerning av liganden (figur 3D).

Etter elektrofysiologiske registreringsforsøk ble hjernevevet som inneholdt det virale injeksjonsstedet snittet og lengden på injeksjonsstedet undersøkt (figur 4A). Den fluorescerende reporteren, mCherry, er lokalisert til de dypere lagene av prelimbic og infralimbic cortex (bestanddeler av gnagere mPFC). Disse lagene ble målrettet da projeksjonen til LEC har vist seg å stamme hovedsakelig fra de dypere kortikale lagene22. mCherry positive fibre kan også sees å bli med i den hvite substanskanalen. I et piloteksperiment for å optimalisere viral injeksjonsplassering ble 40 μm seksjoner av LEC tatt og undersøkt; mCherry-positive fibre kan ses i lag 5 av LEC (figur 4B). Til slutt ble den biocytinfylte cellen farget, slik at dens plassering og morfologi kunne bekreftes (figur 4C, D).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell oversikt. (A) Skjematisk av viral vektorinjeksjon i medial prefrontal cortex (mPFC), transduksjon av mPFC-celler med optogenetisk konstruksjon og transport av konstruksjon til terminaler i lateral entorhinal cortex (LEC). (B) Skjematisk fremstilling av helcelleopptak fra lag 5 pyramidale nevroner i en akutt LEC-skive og lysaktivering av MPFC-terminaler via mikroskopmål. Forkortelser: CA = cornu ammonis; PERI = perirhinal cortex; TR = overgangsregion. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skiveoppsamlingskammer og optisk konfigurasjon for visualiserte helcelleopptak, optogenetisk eksitasjon og identifisering av tdTomato-positive nevroner. (A) Skiveoppsamlingskammeret14 er skreddersydd fra et mikrosentrifugerørstativ limt på et ark med nylonnett og plassert i et beger der det er nedsenket i aCSF (B ) Lysdioder for eksitering av ChR2 (470 nm) og tdTomato (565 nm) er rettet gjennom en asfærisk kondensatorlinse for å kollimere lys, 565 nm lys stråles gjennom et båndpassfilter for å oppnå spektral separasjon av tdTomato eksitasjons- og utslippsspektra. Disse er kombinert med et langpassert dikroisk speil og rettet mot skiven med et andre langpassert dikroisk speil med lengre bølgelengde. Lyset fokuseres deretter på skiven via objektivlinsen. I eksperimenter der tdTomato-merkede nevroner er til stede, passerer utsendt fluorescerende lys gjennom dikroisk speil og utslippsfilter og fokuseres på kamerasensoren med en akromatisk linse. Ikke-fluorescerende egenskaper av skiven visualiseres ved skrått brytes nær infrarødt (NIR) lys påført fra under skivekammeret; dette lyset sender optikken til kameraet og negerer dermed behovet for å bytte filterkuber mellom fluorescerende og NIR-avbildning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Visualisering av nevroner under NIR/fluorescerende avbildning og representative eksempler på oEPSP. (A) Venstre: Eksempel på nevron med pyramidemorfologi visualisert med NIR-lys. Høyre: Samme nevron med dannelse av konkav dimple forårsaket av positivt trykk fra patchpipetten. (B) Cre-recombinase avhengig uttrykk av tdTomato i en enkelt neuron. (C) Representativ oEPSP fra LEC lag 5 i pyramidecellen. (D) Eksempel på langsiktig plastisitetseksperimentovervåking oEPSP over tid etter tilsetning av 10 μm karbachol (CCh). Den stiplede linjen indikerer gjennomsnittlig oEPSP-amplitude i baselineperioden før legemiddeltilsetning. (E) Representative spor av stimuleringstog ved 5, 10 og 20 Hz. Blå piler angir lysaktivering. Skala barer = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Histologisk verifisering av injeksjonssted og restitusjon av biocytinfylt celle . (A) Koronal fotomikrografi som viser viralt injeksjonssted i MPFC, +3,00 mm fra bregma. (B) Tynn koronalseksjon av LEC som illustrerer mCherry+-fibre. (C) Lavt effektbilde på 350 μm tykt skarpt stykke, -6,2 mm fra bregma, med biocytinfylt pyramidecelle i LEC. Den stiplede boksen er vist ved høyere forstørrelse i D. (D) LEC pyramidecelle; Den apikale dendritten kan sees til høyre i bildet på vei mot lag 1. Stiplede linjer angir regionale grenser. Forkortelser: IL = infralimbisk cortex; PL = prelimbisk cortex; wm = hvit substans. Skala barer = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å utforske svært spesifikke langtrekkende synaptiske projeksjoner ved hjelp av en kombinasjon av stereotaksisk kirurgi for å levere AAV-er som koder for optogenetiske konstruksjoner, og elektrofysiologi i akutte hjerneskiver (figur 1). Sammen tilbyr disse teknikkene verktøy for å karakterisere fysiologien og plastisiteten til hjernekretser med høy presisjon i langdistanse og anatomisk diffuse veier som tidligere var utilgjengelige ved hjelp av tradisjonell, ikke-spesifikk, elektrisk stimulering. Kombinasjon med cellespesifikke molekylære markører tillater karakterisering av fremskrivninger fra en hjernegruppe til forskjellige definerte cellepopulasjoner i en annen region23.

For å dra full nytte av den svært presise naturen til denne teknikken, er det viktig å verifisere veispesifisitet. Dette gjøres i flere trinn; Under opptak må du sørge for at synapsen som undersøkes er monosynaptisk (trinn 3.3.5). Etter dette undersøker du histologisk injeksjonsstedet for å sikre at viruset er begrenset til det tiltenkte presynaptiske interesseområdet og vurderer plasseringen og morfologien til den biocytinfargede postsynaptiske cellen for å sikre at den er som forventet.

Virusvalg og oppnåelse av cellulær spesifisitet
Teknikken er svært tilpasningsdyktig og egnet for bruk hos både mus og rotter. Eksperimenter som krever anatomisk spesifisitet kan utføres med wild-type gnagere. Eksperimenter som krever postsynaptisk celletypespesifisitet kan kreve en genetisk modifisert gnagerstamme hvis celler ikke er identifiserbare basert på morfologi eller plassering. For eksempel, for å målrette parvalbumin (PV) som uttrykker interneuroner, kan en PV-Cre knock-in transgen muselinje der Cre-recombinase uttrykkes i PV-uttrykkende nevroner brukes. For å visualisere disse cellene kan PV-Cre-linjen krysses med en reportermuselinje for å uttrykke et fluorescerende protein etter Cre-mediert rekombinasjon. Alternativt kan et Cre-avhengig fluorescerende reportergen introduseres viralt. ChR2-fluoroforfusjonsproteiner er begrenset til cellemembranen og kan vises som et omriss av nevronet når det ses med bredfeltsmikroskopi i akutte skiver, noe som gjør identifisering av celler for helcelleopptak mer utfordrende enn å bruke cytosoliske fluoroforer. Hvis ChR2 brukes til å identifisere celler, kan separasjon av ChR2 og fluorofor oppnås ved bruk av bicistroniske vektorer24. Hvis du bruker en fluorescerende reporter for å identifisere målneuroner for helcelleopptak, bør eksitasjonsbølgelengden ideelt sett ikke overlappe med aktiveringsbølgelengden til opsinet; Dette vil unngå langvarig aktivering av transducerte afferenter mens du søker etter nevroner å registrere fra. På samme måte bør pre- og postsynaptiske reportere være spektralt atskilt. Vanlige reportere er mCherry, grønt fluorescerende protein (GFP) og forbedret gult fluorescerende protein (eYFP).

Den virale konstruksjonen som brukes har flere forskjellige komponenter, hver kan påvirke eksperimentets suksess, og det må derfor tas hensyn til hvert element. Primær betydning bør gis til valg av opsin. For presynaptisk aktivering har den ideelle opsinen store fotostrømmer (for pålitelig å bringe aksoner til handlingspotensialterskel), rask på- og av-kinetikk og en langsom desensibiliseringshastighet for å tillate høyfrekvent gjentatt stimulering. Som regel kommer rask kinetikk ofte på bekostning av mindre fotostrømmer25; Imidlertid har molekylær screening og engineering gitt opsiner med store fotostrømmer. Den nåværende protokollen bruker ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12, men Chronos 26, CheRiff 27, oChIEFAC28 og ChRmine 29 er også egnet. I tillegg finnes eksitatoriske opsiner med enten rødforskjøvet (ChrimsonR)26 eller fiolettforskjøvet (CheRiff) aktiveringsbølgelengder, noe som kan være nødvendig for å unngå overlapping med eksitasjonsspektra av fluoroforer brukt til celleidentifikasjon (se ovenfor).

Serotypen av AAV kan påvirke vektorens evne til å transdusere forskjellige hjernegrupper og celletyper, samt omfanget av aksonal transport i både anterograd og retrograd retning30. Serotyper som vanligvis brukes til nevrontransduksjon er 1, 2, 5, 8 og 9. Et litteratursøk kan gi en indikasjon på hvilken serotype som har blitt brukt med hell i en gitt region. For eksempel har AAV9 blitt anbefalt for transduksjon av kortikale nevroner31.

Promotoren tillater spesifikasjon av celletypen der opsinet vil bli uttrykt. Promotorer faller inn i flere klasser. Generelle promotorer, for eksempel CAG eller EF1a, resulterer i uttrykk i de fleste celletyper. Neuron-spesifikke promotorer, for eksempel synapsin, genererer uttrykk i alle nevrontyper. CaMKIIa brukes ofte til å begrense uttrykk til eksitatoriske nevroner, selv om det har vist seg å være lekkende - noe uttrykk har blitt observert i interneuroner32. mDlx enhancer-elementet begrenser uttrykket til GABAergic interneurons33. Pre-synaptisk celletypespesifisitet kan oppnås ved hjelp av en Cre-mus-linje (som beskrevet ovenfor for den postsynaptiske cellen). I dette tilfellet vil det være nødvendig med en Cre-avhengig genetisk konstruksjon for å begrense opsinuttrykk til Cre-uttrykkende celler.

Titre er antall virale partikler i viruspreparatet. Igjen kan et litteratursøk gi en indikasjon på et titer som har generert tilstrekkelig transduksjon i en bestemt region. Ved bruk av et Cre-avhengig system kan titeren være spesielt viktig da høye virale titre kan transdusere uttrykk i ikke-Cre-uttrykkende celler34.

Optimalisering av viruslevering
Presis viral levering til interesseområdet er av avgjørende betydning for denne tilnærmingen. Injeksjonskoordinater for den presynaptiske regionen kan estimeres ved å konsultere litteraturen og / eller et hjerneatlas for den aktuelle arten35,36. Eksperimentøren bør da ta seg tid til å optimalisere og avgrense de nøyaktige injeksjonskoordinatene og volumet som brukes for å sikre at virusinjeksjonen er begrenset til deres presynaptiske interesseområde. Dette er spesielt viktig når naboregioner også projiserer til opptaksstedet. Vi anbefaler å bruke små mengder av viruset som en effektiv metode for å gjøre dette. Hvis et spesielt lite injeksjonssted er nødvendig, kan bruk av glassmikropipetter i stedet for sprøyte og kanyle være fordelaktig13. Å la kanylen ligge på stedet i en tilstrekkelig periode og langsom seponering av kanylen er avgjørende for å forhindre at viruset slipper ut i kanylekanalen. For å bekrefte nøyaktigheten av injeksjoner, er det beste praksis å histologisk verifisere injeksjonsstedet til hvert dyr som brukes gjennom elektrofysiologi der det er mulig, og utelukke data der viral transduksjon er utenfor målet. I våre hender har protokollen beskrevet ovenfor vist seg å være generaliserbar til mange forskjellige langdistanseforbindelser, inkludert fremspring fra ventrale midtlinje thalamiske kjerner, hippocampus, mediodorsal thalamus og LEC til PFC; fremskrivninger fra PFC til LEC og mediodorsal thalamus; projeksjoner fra LEC og ventrale midtlinje thalamiske kjerner til hippocampus (Zafar Bashir lab, University of Bristol, upubliserte observasjoner19). Optogenetisk merking av disse forskjellige banene har bare krevd forbedring av injeksjonskoordinater og volumer.

Protokoll begrensninger
Rask disseksjon av hjernen og forsiktig kutting er kritisk viktig for suksessen til disse eksperimentene. Skiveprotokollen beskrevet her gir friske akutte skiver uten tilpasning for ulike hjernegrupper; Imidlertid er det rapportert variasjon i skivemedium og inkubasjonstemperatur etter kutting beskrevet andre steder28 for å forbedre skivehelsen ytterligere. Videre har vi også vært i stand til å ta akutte skiver fra to hjernegrupper etter viral transduksjon av et enkelt område, og dermed redusere antall dyr som brukes. Vi har funnet ut at i anatomisk tette baner er perioder så korte som 7 dager mellom viral transduksjon og opptak tilstrekkelig til å fremkalle robuste oEPSP-er av passende størrelse for helcellepatch-klemmeopptak. I mer langsiktige eller mer sparsomme anslag er lengre forsinkelser fordelaktig.

Forsiktighet bør utvises ved tolkning av resultatene av optogenetisk fremkalt aktivitet, spesielt med hensyn til kortsiktig plastisitet. Tidligere resultater har vist at optogenetisk fremkalt overføring kan gjennomgå mer uttalt synaptisk depresjon ved gjentatt stimulering enn elektrisk stimulering, som kan oppstå på grunn av en rekke faktorer. For det første kan opsin desensibilisering25 føre til redusert antall presynaptiske aksoner, noe som fører til redusert postsynaptisk respons. Den forbedrede kanalkinetikken til nylig oppdagede opsiner og de som har gjennomgått molekylærteknikk (se ovenfor) har gått en betydelig vei for å redusere effekten av desensibilisering; Imidlertid forblir 100 Hz-stimulering utenfor rekkevidden til mange opsiner, noe som kan hindre bruken av visse langsiktige plastisitetsinduksjonsprotokoller (men se37). For det andre kan den langsomme kinetikken til opsiner utvide virkningspotensialene18 som fører til langvarig transmitterfrigjøring og vesikulær uttømming; Dette kan også skyldes kalsiumpermeabiliteten til eksitatoriske opsiner11; Disse problemene kan reduseres ved å unngå over-bouton fotoaktivering38. For det tredje kan transduksjon av nevroner ved hjelp av AAV-vektorer også føre til endrede presynaptiske frigjøringsegenskaper i visse synapser; Dette kan imidlertid reduseres ved å bruke AAV9 serotype38. Til tross for disse begrensningene, med forsiktig bruk, kan optogenetisk aktivering etterligne elektrisk stimulering 19,38 og er derfor et uvurderlig verktøy for å undersøke fysiologien til uutforskede synaptiske veier. Vi bemerker også at dataene vist i figur 3E vurderer kortsiktig plastisitet i strømklemme og er derfor gjenstand for interaksjon av synaptiske potensialer og inneboende membranegenskaper, dette kan unngås ved å utføre ekvivalente eksperimenter i spenningsklemme.

Fremtidige retninger
Den stadig voksende optogenetiske verktøykassen har økt muligheten for å anvende denne teknologien i to synaptiske veier i samme preparat, ved å bruke et par opsiner med divergerende eksitasjonsspektra. Dette er muliggjort ved bruk av en opsin ChrimsonR26, som, i motsetning til ChR2, fotoaktiveres av rødt bølgelengdelys. ChrimsonR beholder lav følsomhet for blått lys, og for å unngå aktivering av tverrveier kan den brukes i kombinasjon med rødsensitive opsiner, som er fiolettforskjøvet (CheRiff 27) og/eller har størrelsesordener høyere følsomhet for blått lys (Chronos26). Dette muliggjør bruk av blå / fiolett lysstimuli som er for svake til å aktivere ChrimsonR betydelig og tillater derfor aktivering av to veier39,40, noe som kan øke eksperimentell gjennomstrømning, tillate undersøkelse av konvergente veiinteraksjoner og tillate frigjøring av nevromodulatorer fra endogene kilder 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av Wellcome grant 206401/Z/17/Z. Vi vil gjerne takke Zafar Bashir for hans ekspertmentorskap og Dr. Clair Booth for teknisk assistanse og kommentarer til manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL tube Fisher Scientific Ltd 12134102
10 µL pipette Gilson FD10001
24 well plate SARSTEDT 83.3922
3 way luer valve Cole-Parmer WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate Vector Laboratories SK-4105
40x objective Olympus LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine Hello Bio HB1073
4x objective Olympus PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry Addgene 35512 Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lens Edmund Optics 49363 Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge Benchmark Scientific C1005*
Biocytin Sigma-Aldrich B4261
Borosillicate glass capillary Warner Instruments G150F-6
Burr Fine science tools 19008-07
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Camera - Qimaging Retiga Electro Photometrics 01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol Tocris 2810
Chlorhexidine surgical scrub Vetasept XHG008
Clippers Andis 22445 AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens ThorLabs ACL2520-A
Coverslips Fisher Scientific Ltd 10011913
Cryostat Leica CM3050 S
CsMeSO4 Sigma-Aldrich C1426
Cyanoacrylate glue Rapid Electronics Ltd 84-4557
Data acquisition device National Instruments USB-6341 BNC
D-glucose Sigma-Aldrich G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass Edmund Optics 69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass Edmund Optics 69901
Dichroic mirror cube ThorLabs CM1-DCH/M
EGTA Millpore 324626
Electrode holder with side port HEKA 895150
Emission filter Chroma 59022m
Excitation filter Chroma ET570/20x
Eye gel Dechra Lubrithal
Fine paint brush Scientific Laboratory Supplies BRU2052
Guillotine World Precision Instruments DCAP
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich H1009 30% (w/w)
Isoflurane Henry Schein 988-3245
Isopentane Sigma-Aldrich M32631
KCl Sigma-Aldrich P3911
k-gluconate Sigma-Aldrich G4500
Kinematic fluorescence filter cube ThorLabs DFM1T1
LED driver ThorLabs LEDD1B
Lidocaine ointment Teva 80007150
MgATP Sigma-Aldrich A9187
MgCl Sigma-Aldrich M2670
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Micro drill Harvard Apparatus 75-1887
Microelectrode puller Sutter instruments P-87
Microinjection syringe Hamilton 7634-01/00
Microinjection syringe needle Hamilton 7803-05 Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pump World Precision Instruments UMP3T-1
Mounted blue LED ThorLabs M470L5
Mounted green LED ThorLabs M565L3
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich S9390
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
NaH2PO4.H2O Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
NIR LED OSRAM SFH4550 Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium VWR International RAYLLAMB/OCT Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch clamp amplifier Molecular Devices 700A
Peristaltic pump World Precision Instruments Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides Fisher Scientific Ltd 23-769-310
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Scalpel blade Swann Morton #24
Slice anchor Warner Instruments SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame Kopf Model 902
Stereotaxic holder for micro drill Harvard Apparatus 75-1874
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Surgical Microscope Carl Zeiss OPMI 1 FR pro
Suture Ethicon W577H
Syringe filter for intracellular recording solution Thermo Scientific Nalgene 171-0020
Tetrodotoxin citrate Hello Bio HB1035
Transfer pipettes Fisher Scientific Ltd 10458842
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Upright fluorescence microscope Leica DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit Vector Laboratories PK-4000
Vibratome Campden Instruments 7000smz-2
WinLTP https://www.winltp.com/ Version 2.32 Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
  3. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
  4. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  5. Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
  6. Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
  7. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  8. van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
  9. Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  12. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  13. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  14. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
  15. Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  16. Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
  17. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  18. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  19. Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
  20. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  21. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
  22. Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
  23. Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
  24. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  25. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
  26. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  27. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  29. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  30. Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
  32. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  33. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  34. Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
  35. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
  36. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
  37. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  38. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  39. Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
  40. Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
  41. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).

Tags

Nevrovitenskap utgave 180 elektrofysiologi optogenetikk synaptisk overføring synaptisk plastisitet rotter mus nevroner
<em>Ex Vivo</em> Optogenetisk forhør av langdistanse synaptisk overføring og plastisitet fra medial prefrontal cortex til lateral entorhinal cortex
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex… More

Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex. J. Vis. Exp. (180), e63077, doi:10.3791/63077 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter