Summary
Denne protokol har til formål at måle de dynamiske parametre (fremspring, tilbagetrækninger, flæser) af fremspring ved kanten af spredende celler.
Abstract
Udviklingen og homeostasen af flercellede organismer er afhængige af koordineret regulering af cellemigration. Cellemigration er en væsentlig begivenhed i konstruktionen og regenereringen af væv og er kritisk i embryonal udvikling, immunologiske reaktioner og sårheling. Dysregulering af cellemotilitet bidrager til patologiske lidelser, såsom kronisk inflammation og kræftmetastase. Cellemigration, vævsinvasion, axon og dendritudvækst initierer alle med actinpolymerisationsmedierede cellekantfremspring. Her beskriver vi en enkel, effektiv, tidsbesparende metode til billeddannelse og kvantitativ analyse af cellekantfremspringsdynamik under spredning. Denne metode måler diskrete træk ved cellekantmembrandynamik, såsom fremspring, tilbagetrækninger og flæser, og kan bruges til at vurdere, hvordan manipulationer af centrale actinregulatorer påvirker cellekantfremspring i forskellige sammenhænge.
Introduction
Cellemigration er en kritisk proces, der styrer udviklingen og funktionen af alle levende organismer. Cellemigration forekommer under både fysiologiske tilstande, såsom embryogenese, sårheling og immunrespons og under patologiske tilstande, såsom kræftmetastase og autoimmun sygdom. På trods af forskelle i celletyper, der deltager i forskellige migrationshændelser, deler alle cellemotilitetshændelser lignende molekylære mekanismer, som er blevet bevaret i evolutionen fra protozoer til pattedyr og involverer fælles cytoskeletale kontrolmekanismer, der kan fornemme miljøet, reagere på signaler og modulere celleadfærd som reaktion1.
En indledende fase i cellemigration kan være dannelsen af meget dynamiske fremspring i forkanten af cellen. Bag lamellipodiet kan man finde lamellen, som kobler actin til myosin II-medieret kontraktilitet og medierer vedhæftning til det underliggende substrat. Lamellipodi induceres af ekstracellulære stimuli såsom vækstfaktorer, cytokiner og celleadhæsionsreceptorer og drives af actinpolymerisation, som tilvejebringer den fysiske kraft, der skubber plasmamembranen fremad2,3. Mange signal- og strukturelle proteiner har været impliceret i dette; blandt dem er Rho GTPaser, som virker koordineret med andre signaler for at aktivere actinregulerende proteiner såsom Arp 2/3-komplekset, WASP-familieproteiner og medlemmer af Formin- og Spire-familierne i lamellipodia2,4,5.
Ud over actinpolymerisation kræves myosin II-aktivitet til generering af kontraktile kræfter ved lamellipodium og den forreste lamel. Disse sammentrækninger, også defineret som cellekant retractioner, kan også skyldes depolymerisering af dendritisk actin i celle periferien og er afgørende for at udvikle den lamellipodiale forkant og tillade fremspringet at fornemme fleksibiliteten i den ekstracellulære matrix og andre celler og bestemme migrationsretningen6,7,8 . Cellekantfremspring, der ikke kan fastgøres til substratet, vil danne perifere membranflæser, arklignende strukturer, der vises på den ventrale overflade af lamellipodia og lameller og bevæger sig baglæns i forhold til migrationsretningen. Da lamellipodium ikke fastgøres til substratet, dannes et bageste lamellipodium under det og skubber mekanisk det første lamellipodium mod den øvre ventrale overflade. Actinfilamenterne i flæsen, der tidligere var parallelle med substratet, bliver nu vinkelret på det, og flæsen er nu placeret over det fremrykkende lamellipodium. Flæsen, der bevæger sig baglæns, falder tilbage i cytosolen og repræsenterer en cellulær mekanisme til genanvendelse af lamellipodial actin9,10.
Her beskriver vi et assay til måling af cellekantfremspringsdynamik. Fremspringsassayet bruger time-lapse-videomikroskopi til at måle fremspringsdynamikken på en enkelt cellekant i 10 minutter under cellens spredningsfase. Fremspringsdynamik analyseres ved at generere kymografer fra disse film. I princippet giver en kymograf detaljerede kvantitative data om bevægelige partikler i et spatiotemporalt plot for at give en kvalitativ forståelse af cellekantdynamikken. Intensiteten af den bevægelige partikel afbildes for alle billedstakke i et tids- versus rumplot, hvor X-aksen og Y-aksen repræsenterer henholdsvis tid og afstand11. Denne metode bruger en manuel kymografanalyse med ImageJ til at få detaljerede kvantitative data, der gør det muligt at hente information fra film og billeder i tilfælde af lavt signal-støj-forhold og / eller høj funktionstæthed og analyse af billeder erhvervet i fasekontrastlysmikroskopi eller dårlig billedkvalitet.
Cellekantens fremspringsdynamikassay beskrevet heri er en hurtig, enkel og omkostningseffektiv metode. Som sådan, og fordi det har vist sig at korrelere direkte med cellemigration11,12, kan det bruges som en foreløbig metode til test af cytoskeletal dynamik involveret i cellemotilitet, før det besluttes at udføre mere ressourcekrævende metoder. Desuden muliggør det også kvantitativ måling af, hvordan genetiske manipulationer (knockout, knockdown eller redningskonstruktioner) af cytoskeletale proteiner påvirker cytoskeletal dynamik ved hjælp af en ligetil platform. Assayet er en lærerig model til at udforske cytoskeletal dynamik i forbindelse med cellemigration og kan bruges til belysning af de mekanismer og molekyler, der ligger til grund for cellemotilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet i denne protokol er blevet godkendt af den institutionelle Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Bar-Ilan University.
BEMÆRK: En trinvis grafisk skildring af den procedure, der er beskrevet i dette afsnit, findes i figur 1.
1. Cellekultur
BEMÆRK: De celler, der anvendes i protokollen, er museembryonale fibroblaster (MEF'er), der blev genereret fra E11,5-13,5 embryoner af vildtype C57BL/6-mus. Primære MEF'er blev genereret i henhold til Jacks-laboratorieprotokollen13. Celler fra fem forskellige embryoner blev samlet sammen og udødeliggjort ved infektion med en retroviral vektor, der udtrykte SV40 stort T-antigen efterfulgt af selektion med 4 mM Histidinol i 3 uger.
- Dyrkningsceller i vævskulturplader indeholdende Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 1 g/l glucose, 1 % glutamin, 1 % penicillinstreptomycin og 10 % føtalt kvægserum (FBS) (se materialetabel) i en befugtet inkubator med 5 % CO2 ved 37 °C.
- Kultur cellerne indtil 90% -95% sammenflydning og opdeles i et forhold på 1:5 hver 2-3 dage.
2. Glasbundet parabolbelægning
BEMÆRK: Glasbundsfadsbelægning skal udføres i vævskulturhætten under sterile forhold.
- Tilsæt 2 ml 1N HCl-opløsning i midten af en glasbundsskål (Materialetabel) og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Dette trin er beregnet til at fjerne rester fra glasset, der kan afbryde billeddannelsen senere. - Vask glasskålen tre gange med 2 ml 1x PBS (Table of Materials) hver.
- Fortynd fibronectin (se materialetabel) til 10 μg/ml i 1x PBS. Tilsæt 200 μL af den fortyndede fibronectinopløsning til skålens glascenter. Inkuber ved 37 °C (vævskulturinkubator) i 1 time.
BEMÆRK: Alternativt kan glasskålen inkuberes natten over ved 4 °C på en plan overflade. - Under fibronectinbelægning inkubationstid, forberede 1% BSA (Table of Materials) opløsning i 1x PBS, filtrere gennem 0,2 μm og denaturere ved at inkubere ved 70 ° C i 30 minutter i et forvarmet vandbad.
- Vask det belagte glasbundsfad tre gange med 2 ml 1x PBS hver.
- Der tilsættes 2 ml denatureret BSA-opløsning til glascentret og inkuberes i 1 time ved 37 °C (vævskulturinkubator).
BEMÆRK: Alternativt kan glasskålen inkuberes natten over ved 4 °C på en plan overflade. - Vask glassbundsfadet 3 gange med 2 ml 1x PBS hver.
BEMÆRK: Inkubation af glasbundsfade med fibronectin skal udføres i mindst 1 time ved 37 °C for at belægge overfladen korrekt. Kortere inkubationstid giver muligvis ikke korrekt belægning, og som følge heraf er cellefænotype muligvis ikke relateret til integrinaktivering. BSA-laget er inert og vil ikke påvirke fremspringsdynamikken og er beregnet til at blokere frie potentielle steder for integrinuafhængig celleadhæsion. BSA skal denatureres før belægning for at forhindre det i at inducere celleapopottose, hvilket kan påvirke cellekantdynamikken.
3. Forberedelse af celler til billeddannelse
- Seksten til atten timer før eksperimentet, plade cellerne for at nå 70% -80% sammenløb den følgende dag. For MEF'er, plade 0,7 x 106 celler pr. 10 cm diameter vævskulturplade en dag før udførelse af eksperimentet.
BEMÆRK: For et vellykket fremspringseksperiment er det vigtigt, at cellerne vil blive brugt i deres logaritmiske vækstfase. For at opnå dette skal cellerne nå 70% -80% sammenløb på forsøgsdagen. En højere tæthed af celler vil resultere i en længere spredningstid og / eller hindring i vedhæftning under eksperimentet. - På forsøgsdagen tilsættes 2 ml trypsinopløsning (Table of Materials) pr. vævskulturplade med en diameter på 10 cm og inkuberes i 2-3 minutter i en vævskulturinkubator, indtil cellerne løsnes. Inaktiver trypsin ved at tilsætte 5 ml af det komplette medium.
- Cellerne tælles ved hjælp af et hæmocytometer og en plade på 20.000 celler i 2 ml af hele mediet på et fad med glasbund belagt som ovenfor (afsnit 2).
BEMÆRK: Antallet af celler til plettering afhænger af størrelsen og typen af celler. For større eller flere spredte celler, plade kun 10.000 celler til at have nok celler til billeddannelse. Det er vigtigt at vælge enkeltceller, der ikke rører ved, da celle-til-celle-kontakt kan ændre celle-iboende spredningsadfærd. - Inkuber glasbundsfadene med belagte celler i vævskulturinkubatoren i 15 minutter.
BEMÆRK: I løbet af dette stadium klæber cellerne til fibronectinsubstratet og spredes over det. Ved måling af fremspring under cellespredning skal celler have lov til at sprede sig i 15 minutter efter plettering og før billeddannelse. Billeddannelse kan udføres inden for et tidsvindue mellem 15 minutter og ~ 1 time efter plettering, og under alle omstændigheder før cellerne begynder at migrere.
4. Mikroskop opsætning og billeddannelse
BEMÆRK: Forskellige levende cellemikroskopisystemer er tilgængelige. Det system, der anvendes her, er et Omvendte Leica AF6000-mikroskop udstyret med CO2 - og varmeenheder og er fastgjort til et ORCA-Flash 4.0 V2 digitalt CMOS-kamera.
- Tænd for varmeenheden mindst 1 time før billeddannelse, og indstil den til 37 °C.
- Tænd for CO2-enheden mindst 10 minutter før billeddannelse, og indstil den til 5% CO2.
- Tænd for mikroskopet, kameraet og computeren.
- Åbn softwaren til anskaffelse af mikroskop (se Tabel over materialer). Vælg den mappe, der skal gemmes, og skriv et filnavn. Gem hver film som en ny fil.
- Indstil forstørrelsen på et 40x tørt objektiv, fasekontrast. Indstil tidsintervallet til 5 s, samlet filmvarighed 10 min.
- Efter 15 minutters inkubation af de belagte celler skal du placere glasbundsskålen med klæbede celler i adapteren og fastgøre den. Indsæt adapteren med skålen i åbningen i mikroskopfasen.
- Tag opvaskedækslet af, og læg CO2-låget i stedet. Åbn CO2-ventilen .
BEMÆRK: Sørg for, at CO2-dækslet er rent, før du placerer det oven på glasskålen. Et snavset cover reducerer kvaliteten af film. Tør undersiden af CO2-låget af med en fnugfri aftørring gennemblødt med 70% ethanol for at fjerne støv og snavs. Tør af en gang til med en tør fnugfri aftørring. - Se cellerne og find en passende celle til billeddannelse. Sørg for, at cellen er i fokus, og start filmanskaffelse.
5. Billedanalyse
BEMÆRK: Billedanalyse udføres ved hjælp af ImageJ (Table of Materials) som følger:
- Åbn den erhvervede film i ImageJ.
- Brug værktøjet Lige i hovedværktøjslinjen til at lave otte linjer med 20 vilkårlige enheder, der hver er vinkelret på fremspringene, herunder lamellen og cellekanten, i et radialt arrangement hver 45°, som vist i figur 2A.
- Gå til Image > Stacks > Reslice på hovedværktøjslinjen. Dette vil give et kymografbillede, som beskriver bevægelsen af enkelte punkter i cellemembranen (figur 2B). Denne handling skal udføres for hver linje ud af de otte linjer separat.
- Uddrag og tæl manuelt fra de respektive kymografbilleder antallet af fremspring, tilbagetrækninger og flæser i hvert af de otte områder i cellen, markeret med gitterlinjerne. Disse tal repræsenterer hyppigheden af fremspring, tilbagetrækninger og flæser pr. 10 min (figur 2C, D).
BEMÆRK: Flæser kan skelnes fra andre strukturer baseret på deres mørke udseende i fasekontrastmikroskopi og deres centripetale bevægelse, som starter ved cellekanten og slutter ved grænsen til cellelegemet, hvilket kan observeres i de erhvervede film. Bemærk, at når man kvantificerer fremspring, tilbagetrækning og flæsefrekvens, skal film observeres som en kontrol til kvantificering og især til definition af flæser. - Bestem fremspringets vedholdenhed, afstand og hastighed ved kymografianalyse. For hver af de genererede kymografer repræsenterer X-aksen afstand, og Y-aksen repræsenterer tid.
- Følg trin 5.6.1-5.6.2 for at måle fremspringsafstand.
- Tegn en vinkelret linje fra bunden af fremspringet til fremspringets højeste top. Tryk på M i ImageJ for at måle længden af linjen i pixels.
- Hvis du vil konvertere længden fra pixels til μm, skal du sikre dig, at forholdet mellem pixel og μm er kendt.
BEMÆRK: Forholdet mellem μm og pixel er den fysiske længde af en pixel på CCD-kameraet / den samlede forstørrelse. Pixelstørrelsen er karakteristisk for hver type kamera. For eksempel for det kamera, der blev brugt i denne undersøgelse, er pixelstørrelsen 6.5 μm x 6.5 μm, den fysiske længde er 6.5 μm og den forstørrelse, vi brugte, er 40x. Derfor er forholdet mellem μm og pixel på vores kamera 0,1625 μm / pixel. I analysen ville fremspringsafstanden for en linje i længden af 30 pixels være 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm (figur 3).
- Følg trin 5.7.1-5.7.2 for at måle fremspringstid (vedholdenhed; den tid, et fremspring bruger, før det trækkes tilbage).
- Tegn en vandret linje fra begyndelsen af fremspringet (venstre mod højre) til området for den højeste top. Tryk på M i ImageJ for at måle længden af linjen i pixels.
- Hvis du vil konvertere længden fra pixels til minutter, skal du beregne forholdet mellem pixel og min. Denne værdi afhænger af intervallet mellem billederne.
BEMÆRK: I dette eksempel er intervallet mellem billeder 5 s, forholdet min/pixel er 0,0833, og den vandrette linjelængde er 8 pixels. Derfor er fremspringstiden 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
- Mål og beregn tilbagetrækningstiden på samme måde som fremspringstiden for en linje, der trækkes vandret ved bunden af fremspringet, hvorfra fremspringets top er til bunden til højre (linje X2 i figur 3).
- Beregn fremspringshastigheden ved at dividere fremspringsafstanden med fremspringstiden. Beregn tilbagetrækningshastigheden ved at dividere fremspringsafstanden med tilbagetrækningstiden. I dette eksempel beregnes fremspringshastigheden som 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., og tilbagetrækningshastigheden er identisk, fordi linjen, der repræsenterer tiden, har samme længde.
BEMÆRK: Ved sammenligning af forskellige celletyper, dvs. celler, der udtrykker vildtype og mutante konstruktioner af det samme protein, er det bydende nødvendigt at udføre en blindet analyse, så der introduceres ingen bias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I eksperimentet beskrevet i figur 2 blev udødeliggjorte MEF'er belagt på glasbundsfade forbelagt med fibronectin for at aktivere integrinmedieret signalering, blokeret af denatureret BSA, for at blokere frie potentielle steder for celleadhæsion, som ikke er afhængig af integrinaktivering. For at nå den logaritmiske vækstfase ved 70%-80% sammenløb af celler på dagen for eksperimentet blev 0,7 x 106 MEF'er belagt i en vævskulturplade med en diameter på 10 cm 16 timer før eksperimentet. På forsøgsdagen blev celler trypsiniseret og talt, og 20.000 celler blev belagt på en fibronectin / BSA-belagt glasbundsskål. Skålen blev inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C for at muliggøre fastgørelse og spredning af cellerne før billeddannelse. Efter inkubation blev pladen anbragt i et mikroskopinkubatorkammer (37 °C, 5 % CO2), og enkeltceller blev afbildet ved hjælp af en 40x tør linse i faselys. Billeddannelse blev udført mellem 15 minutter og 1 time efter plettering, før cellerne begyndte at migrere. Billeder blev erhvervet hver 5. s i 10 minutter, hvilket gav 121 billeder pr. Celle (Supplerende film 1).
Billedanalyse blev udført ved hjælp af ImageJ. Ved hjælp af straight-værktøjet i hovedværktøjslinjen blev der lavet 20 vilkårlige enhedslange lige linjer på et radialt gitter på de samme steder hver 45 grader i alle celler (figur 2A). For at generere en kymograf brugte vi kommandoerne Image > Stack > Reslice, hvilket gav et kymografbillede, der beskriver bevægelsen af enkelte punkter i cellemembranen (figur 2B-D). Antallet af fremspring, tilbagetrækninger og flæser dannet i løbet af 10 minutter af filmen i hver af de otte regioner i cellerne, som er markeret af gitterlinjerne, blev ekstraheret, manuelt talt fra de respektive kymografbilleder og plottet i en graf som fremspring / tilbagetrækninger / flæserfrekvenser pr. 10 minutter. De opnåede gennemsnitlige frekvenser var 5,1/10 min for fremspring og tilbagetrækninger og 2,1/10 min for flæser (figur 2E).
Fremspringsafstanden, fremspringstiden, tilbagetrækningstiden, fremsprings- og tilbagetrækningshastighederne blev beregnet ud fra de genererede kymografer. I den repræsentative kymograf i figur 3 var fremspringsafstanden 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, fremspringstiden var 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min, tilbagetrækningstiden var 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. Fremsprings- og tilbagetrækningshastigheder blev beregnet som 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min.
Ved måling af fremspring af cellekant er det vigtigt at vælge celler, der er i deres spredningsfase. Et eksempel på en korrekt celle til analyse vises i figur 2A og supplerende film 1. Efter kymografianalyse kan fremspringene, tilbagetrækningerne og flæserne let skelnes i dette eksperiment. Et eksempel på en vildtype fibroblast, der ikke er egnet til analyse, er vist i figur 4. Efter kymografianalyse kan der f.eks. ikke skelnes mellem klare fremspring i linjer (skiver) 1, 3, 5, 7. I dette tilfælde sluttede cellen med at sprede sig, men begyndte ikke at bevæge sig endnu, og derfor kan der ikke observeres mange membranbevægelser.
Figur 1: Eksperimentelle stadier af fremspringsassayet. (A) En 1N HCl-opløsning tilsættes til glasskålen i 20 min. (B) Efter vask i PBS tilsættes 10 μg/ml fibronectinopløsning til skålens glasdel og inkuberes i 1 time ved 37 °C. (C) Glasbunden blokeres ved inkubation i 1% denatureret BSA i 1 time ved 37 °C. (D) En vævskulturplade på 70%-80% sammenflydende fibroblaster trypsiniseres og tælles (E) 20.000 celler er belagt i en glasbundsfad og (F) inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C for at give cellerne mulighed for at sprede sig. (G) Pladen anbringes i et mikroskop fugtigt kammer med 37 °C i 5 % CO2, og levende billeddannelse udføres ved hjælp af fasekontrastlysmikroskopi. (H) Cellefilm og -billeder underkastes kymografianalyse af Billede J. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fremspringsanalyse billedanalyse. (A) Repræsentativt billede af MEF i ImageJ med angivet otte membrantværsnit til kvantificering i løbet af 10 min. Skalabjælke, 20 μm. (B) Generering af en kymograf i billede J. (C) Repræsentativ kymograf fra tværsnit, hvorpå fremspring, tilbagetrækninger og flæser kan skelnes. (D) Resulterende kymografer efter billedanalyse i løbet af 10 minutter i billede J ved hjælp af kommandoen Reslice . (E) Kvantificering af fremspring, tilbagetrækninger og flæserfrekvenser pr. 10 minutter fra den analyserede film og kymograf. Gennemsnitlig fremspringsfrekvens pr. 10 min = 5,1, gennemsnitlig tilbagetrækningsfrekvens pr. 10 min = 5,125, gennemsnitlig flæserfrekvens pr. 10 min = 2,1. Otte kymografer blev analyseret fra en film. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Analyse og kvantificering af fremspringets persistens, afstand og hastighed. I den repræsentative kymograf repræsenterer X-aksen tid i min (venstre mod højre), og Y-aksen viser afstanden i μm. X1 repræsenterer fremspringstid (vedholdenhed), X2 repræsenterer tilbagetrækningstid, og Y repræsenterer fremspringsafstanden. Fremspringshastighed beregnes ved at dividere fremspringsafstand (Y) med fremspringstid (X1). Tilbagetrækningshastighed beregnes ved at dividere fremspringsafstanden (Y) med tilbagetrækningstiden (X2). I dette eksempel var fremspringsafstanden 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, fremspringstiden var 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min., tilbagetrækningstiden var 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. Fremsprings-/tilbagetrækningshastigheden blev beregnet til 4,875 μm/0,6664 min. = 7,315 μm/min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempel på en celle, der bør udelukkes fra analysen. (A) Et eksempel på en celle, der ikke er egnet til analyse. Skalabjælke, 20 μm. (B) Kymografianalysen af denne celle viser, især i re-slice 1,3,5,7, ingen klare fremspring. I dette tilfælde var cellen færdig med at sprede sig, men begyndte ikke at bevæge sig endnu, og derfor kan der ikke observeres mange membranfremspring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende film 1. MEF blev belagt på en fibronectinbelagt glasbundsskål og afbildet ved hjælp af time-lapse fasekontrast videomikroskopi i 10 minutter ved hjælp af 40x / 1,4 NA tørt mål. Tiden er angivet i sekunder. Vægtstang, 10 μm. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellekant fremspringsdynamik, der består af fremspring, tilbagetrækninger og flæser, er både en forudsætning og en potentiel hastighedsbegrænsende begivenhed i cellemotilitet. Her beskriver vi en hurtig og enkel metode til måling af dynamikken i cellekantfremspring under spredning. Denne metode muliggør korttidsbilleddannelse, genererer en betydelig mængde data, kræver ikke fluorescerende mærkning af celler eller dyrt fluorescerende mikroskopiudstyr og kan bruges som en foreløbig metode til test af cytoskeletal dynamik involveret i cellemotilitet, før man beslutter at udføre mere ressourcekrævende metoder. Desuden kan man bruge knockout- eller knockdown-celler og / eller proteinmutanter i dette assay som et hurtigt og simpelt værktøj til at identificere kritiske proteiner og potentielle signalmekanismer involveret i cytoskeletal dynamik.
Bemærk, at det er vigtigt at vælge de rigtige celler til fremspringsanalyse. Celler inkuberes i 15 minutter, før film erhverves for at tillade spredning. Hvis man beslutter sig for at måle fremspring under spredning (i modsætning til at måle fremspring under migration), skal kun celler, der er i deres spredningsfase under filmoptagelse, afbildes. Celler, der ikke begyndte at sprede sig, er ikke egnede til kymografianalyse. Celler, der afsluttede deres spredningsfase, men ikke begyndte at bevæge sig (figur 4), vil heller ikke være egnede til analyse. Bevægelsen af deres kerne kan skelne mellem disse celler: Under spredning er kernen stationær, mens kernen under cellemigration er dynamisk og lokaliserer på bagsiden af cellen for at konstruere en forkant-centrosom-kerneakse mod migrationsretningen. Et andet almindeligt problem i de senere stadier af billeddannelse er en situation, hvor celler rører hinanden. Sådanne film bør udelukkes fra analyse, da interaktioner og signaler fra naboceller kan forstyrre cellekantens fremspringsdynamik.
I dette manuskript beskriver vi analysen af cellekantfremspringsdynamik ved hjælp af fasekontrastlysmikroskopi. Denne metode kan udvides til også at måle dynamikken i intracellulære komponenter med fluorescensmikroskopi. En sådan almindelig anvendelse af fluorescerende kymografi beskrives ofte til måling af dynamikken i cytoskeletale strukturer i celler. For eksempel har Dogget og Breslin brugt kymografi af GFP-actin transfekterede HUVEC-celler til at analysere actinstressfiberdynamik og omsætning14.
Denne protokol og flere andre tidligere papirer anvendte fibroblaster belagt på fibronectin til cellekantfremspringsassayet såvel som til todimensionelle cellemotilitetsassays. Fibroblaster anvendes almindeligvis til motilitetsassays og andre relaterede assays såsom cellekantfremspringsdynamikassay, fordi de er mesenkymale og bevægelige og har klare cytoskeletale strukturer såsom lamellipodi, filopodi og fokale adhæsioner. Selvom vi ikke beskriver assayet for andre celletyper og substrater, kan denne metode let ændres. For eksempel brugte forfatterne i den første dokumentation af lameldynamikanalysen, som vi og andre ændrede til at blive cellekantfremspringsdynamikassay11, keratinocytter stimuleret til at migrere af EGF i et ridseassay, hvilket viste, at andre celletyper og andre stimuleringer kunne anvendes på dette assay. Desuden, selvom vi beskriver målingen af cellekantfremspringsdynamik under cellespredning, kunne den samme metode anvendes ved at måle dynamikken i fremspring under migration af celler, som det for eksempel demonstreres i Bear et al.12 og Hinz et al.11.
Faktisk har flere laboratorier tidligere brugt dette assay på MEF'er til at belyse cytoskeletal dynamik og signalmekanismer. For eksempel havde Miller et al. tidligere brugt fremspringsassayet til at demonstrere, at Abl2 / Arg medierer kontakten mellem actin og mikrotubuli ved cellekanten15. Bryce et al. demonstrerede ved hjælp af assayet, at cortactin knockdown-celler har nedsat cellemotilitet, som co-insides med svækkelse i persistensen af lamellipodiale fremspring. Denne defekt skyldes svækkelse i samlingen af nye adhæsioner i fremspring16. Lapetina et al. brugte cellekantfremspringsassayet i Abl2 / Arg knockout og cortactin knockdown celler reddet med mutanter af de to proteiner til at belyse en Abl2 / Arg-medieret reguleringsmekanisme cellekant fremspring17. Ved hjælp af det samme assay har Miller et al. også vist, at Arg regulerer N-WASP-medieret actinpolymerisation og deraf følgende cellekantfremspringsdynamik18. Vi har for nylig brugt cellekantfremspringsassayet til at demonstrere, at den ikke-receptor tyrosinkinase Pyk2 regulerer dynamikken i fremspring og efterfølgende cellemigration via direkte og indirekte interaktioner med adaptorproteinet CrkII. I denne artikel har vi brugt Pyk2-WT og Pyk2-/- og Crk-WT og knockdown MEF, redningsmutanter og epistaseeksperimenter til at belyse de molekylære interaktioner og signalhierarkiet mellem de to proteiner under cellekantfremspring. Denne nye komplekse reguleringsmekanisme muliggør finjustering af fremspringsdynamikken på cellekanten og den deraf følgende cellemigration på den ene side sammen med stram regulering af cellemotiliteten på den anden side19. Ved hjælp af cellekantfremspringsassayet har ovennævnte papirer og andre, der fulgte, signifikant øget vores viden om reguleringsmekanismerne for cellekantfremspring i særdeleshed og cellemigration generelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud NIH MH115939, NS112121, NS105640 og R56MH122449-01A1 (til Anthony J. Koleske) og fra Israel Science Foundation (tilskud nummer 1462/17 og 2142/21) (til Hava Gil-Henn).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A.
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Jacks laboratory protocol. , Available from: http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs (2021).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
