Summary
Denne protokollen tar sikte på å måle de dynamiske parametrene (fremspring, tilbaketrekninger, ruffles) av fremspring på kanten av spredningsceller.
Abstract
Utviklingen og homeostase av multicellulære organismer er avhengig av koordinert regulering av cellemigrasjon. Cellemigrasjon er en viktig begivenhet i bygging og regenerering av vev, og er kritisk i embryonal utvikling, immunologiske responser og sårheling. Dysregulering av cellemotilitet bidrar til patologiske lidelser, som kronisk betennelse og kreftmetastase. Cellemigrasjon, vevsinvasjon, axon og dendritutvekst starter alle med aktinpolymeriseringsmediert cellekantutstikk. Her beskriver vi en enkel, effektiv, tidsbesparende metode for avbildning og kvantitativ analyse av cellekant fremspringdynamikk under spredning. Denne metoden måler diskrete egenskaper ved cellekantmembrandynamikk, for eksempel fremspring, tilbaketrekninger og ruffles, og kan brukes til å vurdere hvordan manipulasjoner av viktige aktinregulatorer påvirker cellekantutstikk i forskjellige sammenhenger.
Introduction
Cellemigrasjon er en kritisk prosess som styrer utviklingen og funksjonen til alle levende organismer. Cellemigrasjon skjer i både fysiologiske forhold, som embryogenese, sårheling og immunrespons, og i patologiske forhold, som kreftmetastase og autoimmun sykdom. Til tross for forskjeller i celletyper som deltar i forskjellige trekkhendelser, deler alle cellemotilitetshendelser lignende molekylære mekanismer, som har blitt bevart i evolusjon fra protozoer til pattedyr, og involverer vanlige cytoskeletale kontrollmekanismer som kan føle miljøet, reagere på signaler og modulere celleadferd som svar1.
Et innledende stadium i cellemigrasjon kan være dannelsen av svært dynamiske fremspring i forkant av cellen. Bak lamellipodiumet kan man finne lamellen, som par handler med myosin II-mediert kontraktilitet og formidler vedheft til det underliggende substratet. Lamellipodia er indusert av ekstracellulære stimuli som vekstfaktorer, cytokiner og celleadhesjonsreseptorer og drives av aktinpolymerisering, noe som gir den fysiske kraften som skyver plasmamembranen fremover2,3. Mange signalering og strukturelle proteiner har blitt involvert i dette; blant dem er Rho GTPases, som virker koordinert med andre signaler for å aktivere aktinregulerende proteiner som Arp 2/3-komplekset, WASP-familieproteiner og medlemmer av Formin- og Spire-familiene i lamellipodia2,4,5.
I tillegg til aktinpolymerisering er myosin II-aktivitet nødvendig for å generere kontraktilkrefter ved lamellipodium og den fremre lamellen. Disse sammentrekningene, også definert som tilbaketrekninger av cellekanten, kan også skyldes depolymerisering av dendritisk aktin ved celleperiærien og er avgjørende for å utvikle lamellipodial forkant og la fremspringet føle fleksibiliteten til den ekstracellulære matrisen og andre celler og bestemme retningen for migrasjon6,7,8 . Cellekantutstikk som ikke kan festes til substratet, vil danne perifere membran ruffles, arklignende strukturer som vises på ventral overflate av lamellipodia og lamell og beveger seg bakover i forhold til migrasjonsretningen. Ettersom lamellipodiumet ikke klarer å feste seg til substratet, dannes et bakre lamellipodium under det og skyver mekanisk det første lamellipodiumet mot den øvre ventrale overflaten. Aktinfilamentene i ruffle som tidligere var parallelle med substratet, blir nå vinkelrett på det, og ruffle er nå plassert over det fremadstormende lamellipodiumet. Ruffle som beveger seg bakover faller tilbake i cytosol og representerer en cellulær mekanisme for resirkulering lamellipodial actin9,10.
Her beskriver vi en analyse for måling av cellekant fremspringdynamikk. Fremspringsanalysen bruker videomikroskopi for tidsforløp til å måle enkeltcellekantutstikksdynamikk i 10 minutter under spredningsfasen av cellen. Fremspringsdynamikk analyseres ved å generere kymografer fra disse filmene. I prinsippet gir en kymografi detaljerte kvantitative data om bevegelige partikler i et romlig plott for å gi en kvalitativ forståelse av cellekantdynamikk. Intensiteten til den bevegelige partikkelen tegnes inn for alle bildestakker i en tid kontra et mellomrom, der X-aksen og Y-aksen representerer henholdsvis tid og avstand11. Denne metoden bruker en manuell kymografanalyse med ImageJ for å få detaljerte kvantitative data, slik at du kan hente informasjon fra filmer og bilder i tilfelle lavt signal-til-støy-forhold og / eller høy funksjonstetthet, og analysen av bilder som er anskaffet i fasekontrastlysmikroskopi eller dårlig bildekvalitet.
Cellekantprotrusjonsdynamikkanalysen som er beskrevet her, er en rask, enkel og kostnadseffektiv metode. Som sådan, og fordi det har vist seg å direkte korrelere med cellemigrasjon11,12, kan den brukes som en foreløpig metode for å teste cytoskeletal dynamikk involvert i cellemotilitet før du bestemmer deg for å utføre mer ressurskrevende metoder. Videre muliggjør den også kvantitativ måling av hvordan genetiske manipulasjoner (knockout, knockdown eller redningskonstruksjoner) av cytoskeletale proteiner påvirker cytoskeletal dynamikk ved hjelp av en enkel plattform. Analysen er en lærerik modell for å utforske cytoskeletal dynamikk i sammenheng med cellemigrasjon og kan brukes til belysning av mekanismene og molekylene som ligger til grunn for cellemotiliteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet i denne protokollen er godkjent av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC) ved Bar-Ilan University.
MERK: En trinnvis grafisk fremstilling av prosedyren som er beskrevet i dette avsnittet, vises i figur 1.
1. Cellekultur
MERK: Cellene som brukes i protokollen er mus embryonale fibroblaster (MEFer) som ble generert fra E11.5-13.5 embryoer av villtype C57BL / 6 mus. Primære MEFer ble generert i henhold til Jacks laboratorieprotokoll13. Celler fra fem forskjellige embryoer ble samlet sammen og udødeliggjort av infeksjon med en retroviral vektor som uttrykker SV40 stort T-antigen etterfulgt av utvelgelse med 4 mM Histidinol i 3 uker.
- Kulturceller i vevskulturplater som inneholder Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder 1 g/L glukose, 1 % glutamin, 1 % penicillin-streptomycin og 10 % foster bovint serum (FBS) (se Materialfortegnelse), i en fuktet inkubator med 5 % CO2 ved 37 °C.
- Kultur cellene til 90%-95% samløp og delt med et forhold på 1:5 hver 2-3 dager.
2. Glassbunnsbelegg
MERK: Glassbunnbelegg skal utføres i vevskulturhetten under sterile forhold.
- Tilsett 2 ml 1N HCl-oppløsning i midten av en glassbunnsfat (Materialbord) og inkuber i 20 min ved romtemperatur (RT).
MERK: Dette stadiet er ment å fjerne rester fra glasset som kan avbryte bildet senere. - Vask glassbunnsfatet tre ganger med 2 ml 1x PBS (materialbord) hver.
- Fortynn fibronektin (se Materialtabellen) til 10 μg/ml i 1x PBS. Tilsett 200 μL av den fortynnede fibronektinoppløsningen til glasssenteret på parabolen. Inkuber ved 37 °C (vevskulturinkubator) i 1 time.
MERK: Alternativt kan glassbunnsfatet inkuberes over natten ved 4 °C på et flatt underlag. - Under fibronectin belegg inkubasjonstid, forberede 1% BSA (Table of Materials) løsning i 1x PBS, filtrere gjennom 0,2 μm, og denature ved inkubering ved 70 °C i 30 minutter i et forvarmet vannbad.
- Vask den belagte glassbunnsfatet tre ganger med 2 ml 1x PBS hver.
- Tilsett 2 ml denaturert BSA-oppløsning til glasssenteret og inkuber i 1 time ved 37 °C (vevskulturinkubator).
MERK: Alternativt kan glassbunnsfatet inkuberes over natten ved 4 °C på et flatt underlag. - Vask glassbunnsfatet 3 ganger med 2 ml 1x PBS hver.
MERK: Inkubasjon av glassbunnsretter med fibronektin bør utføres i minst 1 time ved 37 °C for å belegge overflaten ordentlig. Kortere inkubasjonstid gir kanskje ikke riktig belegg, og som et resultat kan cellefenotype ikke være relatert til integrin aktivering. BSA-laget er inert og vil ikke påvirke fremspringdynamikken og er ment å blokkere frie potensielle steder for integrin-uavhengig celleadhesjon. BSA må denatureres før belegg for å forhindre at den induserer celleapoptose, noe som kan påvirke cellekantdynamikken.
3. Forberedelse av celler for avbildning
- Seksten til atten timer før eksperimentet, plate cellene til å nå 70%-80% samløp påfølgende dag. For MEF-er, plate 0,7 x 106 celler per 10 cm diameter vev kulturplate om dagen før du utfører eksperimentet.
MERK: For et vellykket fremspringsforsøk er det viktig at cellene brukes i den logaritmiske vekstfasen. For å oppnå dette bør cellene nå 70% -80% samløp på eksperimentets dag. En høyere tetthet av celler vil resultere i lengre spredningstid og / eller hindring i vedlegg under eksperimentet. - På eksperimentdagen legger du til 2 ml trypsinoppløsning (Materialbord) per 10 cm diameter vevskulturplate og inkuberer i 2-3 min i en vevskulturinkubator til cellene løsner. Deaktiver trypsin ved å legge til 5 ml av hele mediet.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og plate 20 000 celler i 2 ml av hele mediet på en glassbunnsfat belagt som ovenfor (avsnitt 2).
MERK: Antall celler for plating avhenger av størrelsen og typen celler. For større eller flere oppslagsceller er det bare 10 000 celler som har nok celler til avbildning. Det er viktig å velge enkeltceller som ikke berører som celle-til-celle-kontakt, kan endre virkemåten for celleintrinsisk spredning. - Inkuber glassbunnsrettene med belagte celler i vevskulturinkubatoren i 15 min.
MERK: I løpet av dette stadiet holder cellene seg til fibronectin-substratet og sprer seg over det. Ved måling av fremspring under cellespredning, bør celler få lov til å spre seg i 15 minutter etter plating og før avbildning. Bildebehandling kan utføres innen et tidsvindu mellom 15 min og ~ 1 t etter plating, og i alle fall før cellene begynner å migrere.
4. Mikroskopoppsett og avbildning
MERK: Ulike levende cellemikroskopisystemer er tilgjengelige. Systemet som brukes her er et Leica AF6000 invertert mikroskop utstyrt med CO2 - og varmeenheter og er festet til et ORCA-Flash 4.0 V2 digitalt CMOS-kamera.
- Slå på varmeenheten minst 1 time før bildebehandling og sett den på 37 °C.
- Slå på CO2-enheten minst 10 minutter før avbildning og sett den på 5% CO2.
- Slå på mikroskopet, kameraet og datamaskinen.
- Åpne programvaren for mikroskopanskaffelse (se Materialliste). Velg mappen for å lagre innspilte bilder og skrive inn et filnavn. Lagre alle filmer som en ny fil.
- Sett forstørrelsen på et 40x tørt objektiv, fasekontrast. Angi tidsintervallet på 5 s, total filmvarighet 10 min.
- Etter 15 min inkubasjon av de belagte cellene, plasser glassbunnsfatet med festede celler i adapteren og fest den. Sett adapteren med parabolen inn i sporet i mikroskopstadiet.
- Ta av paraboldekselet og legg i stedet på CO2-lokket . Åpne CO2-ventilen .
MERK: Pass på at CO2-dekselet er rent før du legger det oppå glassbunnsfatet. Et skittent deksel vil redusere kvaliteten på filmene. Tørk av undersiden av CO2-lokket med en lofri klut gjennomvåt med 70% etanol for å fjerne støv og smuss. Tørk av en gang til med en tørr lofri klut. - Vis cellene, og finn en passende celle for avbildning. Kontroller at cellen er i fokus, og start filmanskaffelsen.
5. Bildeanalyse
MERK: Bildeanalyse utføres ved hjelp av ImageJ (Tabell over materialer) som følger:
- Åpne den oppkjøpte filmen i ImageJ.
- Bruk det rette verktøyet på hovedverktøylinjen til å lage åtte linjer med 20 vilkårlige enheter som hver vinkelrett på fremspringene, inkludert lamell- og cellekanten, i et radialt arrangement hver 45°, som vist i figur 2A.
- Gå til Bilde > stakker > Reslice på hovedverktøylinjen. Dette vil gi et kymografbilde, som beskriver bevegelsen av enkeltpunkter i cellemembranen (figur 2B). Denne handlingen bør utføres for hver linje ut av de åtte linjene separat.
- Trekk ut og tell manuelt fra de respektive kymoografibildene antall fremspring, tilbaketrekninger og ruffles i hver av de åtte regionene i cellen, merket med rutenettlinjene. Disse tallene representerer hyppigheten av fremspring, tilbaketrekninger og ruffles per 10 min (figur 2C, D).
MERK: Ruffles kan skille seg fra andre strukturer basert på deres mørke utseende i fasekontrastmikroskopi og deres sentripetal bevegelse, som starter ved cellekanten og slutter ved grensen til cellekroppen, som kan observeres i de oppkjøpte filmene. Vær oppmerksom på at når du kvantifiserer fremspring, tilbaketrekning og ruffle-frekvens, bør filmer observeres som en kontroll for kvantifisering og spesielt for å definere ruffles. - Bestem fremspringets utholdenhet, avstand og hastighet ved kymografianalyse. For hver av de genererte kymografiene representerer X-aksen avstand, og Y-aksen representerer tid.
- Følg trinn 5.6.1-5.6.2 for å måle fremspringavstanden.
- Tegn en vinkelrett linje fra bunnen av fremspringet til den høyeste toppen av fremspringet. Trykk M i ImageJ for å måle lengden på linjen i piksler.
- Hvis du vil konvertere lengden fra bildepunkter til μm, må du kontrollere at forholdet mellom bildepunkt og μm er kjent.
MERK: Forholdet mellom μm og piksel er den fysiske lengden på en piksel på CCD-kameraet / total forstørrelse. Pikselstørrelsen er karakteristisk for hver kameratype. For kameraet som brukes i denne studien, er pikselstørrelsen for eksempel 6,5 μm x 6,5 μm, den fysiske lengden er 6,5 μm og forstørrelsen vi brukte er 40x. Derfor er μm til pikselforholdet til kameraet vårt 0,1625 μm / piksel. I analysen, for en linje i lengden på 30 piksler, vil fremspringavstanden være 30 piksler x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm (figur 3).
- Følg trinn 5.7.1-5.7.2 for å måle fremspringstid (utholdenhet, hvor lenge et fremspring bruker på å trekke seg tilbake).
- Tegn en vannrett linje fra begynnelsen av fremspringet (venstre mot høyre) til området med høyest topp. Trykk M i ImageJ for å måle lengden på linjen i piksler.
- Hvis du vil konvertere lengden fra piksler til minutter, beregner du forholdet mellom bildepunkt og min. Denne verdien avhenger av intervallet mellom bilder.
MERK: I dette eksemplet er intervallet mellom bildene 5 s, minimums-/pikselforholdet er 0,0833, og den vannrette linjelengden er 8 piksler. Derfor er fremspringstiden 8 piksler x 0,0833 min/piksel = 0,6664 min.
- Mål og beregn tilbaketrekningstiden på samme måte som fremspringstid for en linje som trekkes horisontalt ved foten av fremspringet, hvorfra toppen av fremspringet er til basen til høyre (linje X2 i figur 3).
- Beregn fremspringhastigheten ved å dele fremspringavstanden ved fremspringstid. Beregn tilbaketrekkingshastigheten ved å dele fremspringavstanden ved tilbaketrekkingstid. I dette eksemplet beregnes fremspringhastigheten som 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., og tilbaketrekkingshastigheten er identisk fordi linjen som representerer tid, har samme lengde.
MERK: Ved sammenligning av forskjellige celletyper, det vil si celler som uttrykker vill type og mutantkonstruksjoner av samme protein, er det viktig å utføre en blindet analyse, så ingen skjevhet blir introdusert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I eksperimentet beskrevet i figur 2 ble udødeliggjorte MEFer belagt på glassbunnsretter forhåndsbelagt med fibronectin for å aktivere integrinsk mediert signalering, blokkert av denaturert BSA, for å blokkere frie potensielle steder for celleadhesjon som ikke er avhengig av integrinsk aktivering. For å nå den logaritmiske vekstfasen ved 70% -80% sammenløp av celler på eksperimentets dag, ble 0,7 x 106 MEF-er belagt i en vevskulturplate med 10 cm diameter 16 timer før eksperimentet. På eksperimentdagen ble cellene trypsinisert og talt, og 20.000 celler ble belagt på en fibronektin / BSA-belagt glassbunnsfat. Retten ble inkubert i 15 min ved 37 °C for å tillate festing og spredning av cellene før avbildning. Etter inkubasjon ble platen plassert i et mikroskopinkubatorkammer (37 °C, 5 % CO2), og enkeltceller ble avbildet med en 40x tørr linse i faselys. Imaging ble utført mellom 15 min og 1 time etter plating før cellene begynte å migrere. Bilder ble anskaffet hver 5 s i 10 min, noe som ga 121 bilder per celle (Supplementary Movie 1).
Bildeanalyse ble utført ved hjelp av ImageJ. Ved hjelp av rett verktøy på hovedverktøylinjen ble det laget 20 vilkårlige, enhetslange rette linjer på et radialt rutenett på de samme stedene hver 45. For å generere en kymografi brukte vi Image > Stack > Reslice-kommandoer, som ga et kymografibilde som beskriver bevegelsen av enkeltpunkter i cellemembranen (figur 2B-D). Antall fremspring, tilbaketrekninger og ruffles dannet i løpet av 10 minutter av filmen i hver av de åtte regionene i cellene, som er merket med rutenettlinjene, ble hentet ut, manuelt talt fra de respektive kymografibildene, og plottet inn i en graf som fremspring / tilbaketrekninger / ruffles frekvenser per 10 min. Gjennomsnittlig antall oppnådde frekvenser var 5,1/10 min for fremspring og tilbaketrekninger og 2,1/10 min for ruffles (figur 2E).
Fremspringsavstanden, fremspringstiden, tilbaketrekningstiden, fremspringet og tilbaketrekkingshastighetene ble beregnet fra de genererte kymografene. I den representative kymografen i figur 3, fremspringavstanden var 30 piksler x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, fremspringstiden var 8 piksler x 0,0833 min/piksel = 0,6664 min, tilbaketrekningstiden var 8 x 0,0833 min/piksel = 0,6664 min. Fremspring og tilbaketrekkingshastigheter ble beregnet som 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min.
Ved måling av cellekantprotrudering er det viktig å velge celler som er i spredningsfasen. Et eksempel på en riktig celle for analyse vises i figur 2A og tilleggsfilm 1. Etter kymografianalyse kan fremspringene, tilbaketrekningene og ruffles lett skille seg ut i dette eksperimentet. Et eksempel på en vill-type fibroblast som ikke passer for analyse, er vist i figur 4. Etter kymografianalyse, i linjer (skiver) 1, 3, 5, 7, for eksempel, kan det ikke skilles klare fremspring. I dette tilfellet var cellen ferdig med å spre seg, men begynte ikke å bevege seg ennå, og derfor kan ikke mange membranbevegelser observeres.
Figur 1: Eksperimentelle stadier av fremspringsanalysen. (A) En 1N HCl-oppløsning tilsettes glassbunnsfatet i 20 min. (B) Etter vask i PBS tilsettes 10 μg/ml fibronektinoppløsning til glassdelen av fatet og inkuberes i 1 time ved 37 °C. (C) Parabolens glassbunn blokkeres ved inkubasjon i 1% denaturert BSA i 1 time ved 37 °C. (D) En vevskulturplate på 70%-80% konfluente fibroblaster prøves og telles (E) 20 000 celler er belagt i en glassbunnsfat og (F) inkuberes i 15 min ved 37 °C for å la cellene spre seg. (G) Platen er plassert i et mikroskop fuktig kammer med 37 °C i 5 % CO2, og levende avbildning utføres ved fasekontrastlysmikroskopi. (H) Cellefilmer og bilder blir utsatt for kymografianalyse av Bilde J. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av fremspringanalyse. (A) Representativt bilde av MEF i ImageJ med indikert åtte membrantrsnitt for kvantifisering i løpet av 10 min. Skalalinje, 20 μm. (B) Generering av en kymografi i Bilde J. (C) Representativ kymograf fra tverrsnitt som fremspring, tilbaketrekninger og ruffles kan skille seg ut. (D) Resulterende kymografier etter bildeanalyse i løpet av 10 min i bilde J ved hjelp av Reslice-kommandoen . (E) Kvantifisering av fremspring, tilbaketrekninger og ruffles frekvenser per 10 min fra analysert film og kymograf. Gjennomsnittlig fremspringfrekvens per 10 min = 5,1, gjennomsnittlig tilbaketrekkingsfrekvens per 10 min = 5,125, gjennomsnittlig rufflesfrekvens per 10 min = 2,1. Åtte kymografier ble analysert fra en film. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse og kvantifisering av fremspring vedvarighet, avstand og hastighet. I den representative kymografen representerer X-aksen tid i min (venstre mot høyre), og Y-aksen viser avstanden i μm. X1 representerer fremspringstid (utholdenhet), X2 representerer tilbaketrekkingstid, og Y representerer fremspringavstanden. Fremspringhastigheten beregnes ved å dele fremspringavstanden (Y) med fremspringstid (X1). Tilbaketrekkingshastigheten beregnes ved å dele fremspringavstanden (Y) ved tilbaketrekkingstid (X2). I dette eksemplet var fremspringavstanden 30 piksler x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, fremspringstiden var 8 x 0,0833 min/piksel = 0,6664 min., tilbaketrekningstiden var 8 piksler x 0,0833 min/piksel = 0,6664 min. Fremspring/tilbaketrekkingshastighet ble beregnet som 4.875 μm/0.6664 min. = 7.315 μm/min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på en celle som bør utelates fra analysen. (A) Et eksempel på en celle som ikke passer for analyse. Skalalinje, 20 μm. (B) Kymografianalysen av denne cellen viser, spesielt i re-slice 1,3,5,7, ingen klare fremspring. I dette tilfellet var cellen ferdig med å spre seg, men begynte ikke å bevege seg ennå, og derfor kan ikke mange membranutstikk observeres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende film 1. MEF ble belagt på en fibronectin-belagt glassbunnsfat og avbildet ved hjelp av tidsforløpfase-kontrastvideomikroskopi i 10 minutter ved hjelp av 40x / 1,4 NA tørt mål. Tiden er angitt i sekunder. Skalastang, 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-edge fremspringdynamikk, bestående av fremspring, tilbaketrekninger og ruffles, er både en forutsetning og en potensiell hastighetsbegrensende hendelse i cellemotilitet. Her beskriver vi en rask og enkel metode for å måle dynamikken i cellekantprotrusjoner under spredning. Denne metoden muliggjør korttidsavbildning, genererer en betydelig mengde data, krever ikke fluorescerende merking av celler eller dyrt fluorescerende mikroskopiutstyr, og kan brukes som en foreløpig metode for å teste cytoskeletal dynamikk involvert i cellemotilitet før du bestemmer deg for å utføre mer ressurskrevende metoder. Videre kan man bruke knockout- eller knockdown-celler og/ eller proteinmutanter i denne analysen som et raskt og enkelt verktøy for å identifisere kritiske proteiner og potensielle signalmekanismer involvert i cytoskeletal dynamikk.
Vær oppmerksom på at det er viktig å velge de riktige cellene for fremspringanalyse. Celler inkuberes i 15 minutter før filmer er anskaffet for å tillate spredning. Hvis man bestemmer seg for å måle fremspring under spredning (i motsetning til å måle fremspring under migrasjon), bør bare celler som er i spredningsfasen under filmanskaffelse, avbildes. Celler som ikke begynte å spre seg, passer ikke for kymografianalyse. Celler som fullførte spredningsfasen, men som ikke begynte å bevege seg (figur 4), vil heller ikke være egnet for analyse. Bevegelsen av kjernen kan skille disse cellene: under spredning er kjernen stasjonær, mens under cellemigrasjon er kjernen dynamisk og lokaliserer på baksiden av cellen for å konstruere en ledende kant-sentrosomkjerneakse mot migrasjonsretningen. Et annet vanlig problem i de senere stadiene av avbildning er en situasjon der celler berører hverandre. Slike filmer bør utelukkes fra analyse, da interaksjoner og signaler fra nærliggende celler kan forstyrre cellekantutstikkdynamikken.
I dette manuskriptet beskriver vi analysen av utstikkende cellekantdynamikk ved hjelp av fasekontrastlymikroskopi. Denne metoden kan utvides for å måle dynamikken i intracellulære komponenter med fluorescensmikroskopi også. Slike vanlige bruk av fluorescerende kymografi er ofte beskrevet for å måle dynamikken i cytoskeletale strukturer i celler. For eksempel har Dogget og Breslin brukt kymografi av GFP-aktin transfected HUVEC celler for å analysere aktin stress fiber dynamikk og omsetning14.
Denne protokollen og flere andre tidligere papirer brukte fibroblaster belagt på fibronectin for cellekant fremspring analyse samt for todimensjonale cellemotilitetsanalyser. Fibroblaster brukes ofte til motilitetsanalyser og andre relaterte analyser som fremspringsdynamikkanalysen for cellekanten fordi de er mesenchymale og motile og har klare cytoskeletale strukturer som lamellipodia, filopodia og fokale adhesjoner. Selv om vi ikke beskriver analysen for andre celletyper og substrater, kan denne metoden lett endres. For eksempel, i den første dokumentasjonen av lamelldynamikkanalysen, som vi og andre modifiserte til å bli cellekantprotrusjonsdynamikken assay11, brukte forfatterne keratinocytter stimulert til å migrere av EGF i en ripeanalyse, noe som viste at andre celletyper og andre stimuleringer kunne brukes på denne analysen. Videre, selv om vi beskriver målingen av cellekant fremspringdynamikk under cellespredning, kan den samme metoden brukes ved å måle dynamikken i fremspring under migrering av celler, som demonstrert, for eksempel i Bear et al.12 og Hinz et al.11.
Faktisk har flere laboratorier brukt denne analysen på MEFer for å belyse cytoskeletal dynamikk og signalmekanismer tidligere. For eksempel hadde Miller et al. tidligere brukt fremspringsanalysen for å demonstrere at Abl2/Arg formidler kontakten mellom aktin og mikrotubuler ved cellekanten15. Bryce et al. demonstrerte ved hjelp av analysen at cortactin knockdown celler har svekket cellemotilitet som co-insides med svekkelse i utholdenheten av lamellipodiale fremspring. Denne feilen skyldes svekkelse i montering av nye vedheft i fremspring16. Lapetina et al. brukte cellekantutstikksanalysen i Abl2/Arg knockout og cortactin knockdown celler reddet med mutanter av de to proteinene for å belyse en Abl2 / Arg-mediert reguleringsmekanisme cellekant fremspring17. Ved hjelp av samme analyse har Miller et al. også vist at Arg regulerer N-WASP-mediert aktinpolymerisering og følgelig cellekantutstikkdynamikk18. Vi har nylig brukt cellekanten fremspring analyse for å demonstrere at ikke-reseptor tyrosin kinase Pyk2 regulerer dynamikken i fremspring og påfølgende cellemigrasjon via direkte og indirekte interaksjoner med adapterproteinet CrkII. I dette dokumentet har vi brukt Pyk2-WT og Pyk2-/- og Crk-WT og knockdown MEF, redningsmutanter og epistaseeksperimenter for å belyse molekylære interaksjoner og signalhierarki mellom de to proteinene under cellekantutstikk. Denne nye komplekse reguleringsmekanismen muliggjør finjustering av cellekant fremspringdynamikk og følgelig cellemigrering på den ene siden sammen med tett regulering av cellemotilitet derimot19. Ved hjelp av cellekantutstikksanalysen har ovennevnte papirer og andre som fulgte økt vår kunnskap om reguleringsmekanismene for cellekantutstikk spesielt og cellemigrasjon generelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd NIH MH115939, NS112121, NS105640 og R56MH122449-01A1 (til Anthony J. Koleske) og fra Israel Science Foundation (tilskudd nummer 1462/17 og 2142/21) (til Hava Gil-Henn).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A.
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Jacks laboratory protocol. , Available from: http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs (2021).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
