Summary
Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Çok hücreli organizmaların gelişimi ve homeostazı, hücre göçünün koordineli bir şekilde düzenlenmesine dayanır. Hücre göçü, dokuların yapımında ve yenilenmesinde önemli bir olaydır ve embriyonik gelişimde, immünolojik yanıtlarda ve yara iyileşmesinde kritik öneme sahiptir. Hücre hareketliliğinin düzensizliği, kronik inflamasyon ve kanser metastazı gibi patolojik bozukluklara katkıda bulunur. Hücre göçü, doku invazyonu, akson ve dendrit büyümesi, aktin polimerizasyonu aracılı hücre kenarı çıkıntıları ile başlar. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin görüntülenmesi ve kantitatif analizi için basit, verimli, zaman kazandıran bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar gibi hücre kenarı membran dinamiklerinin ayrık özelliklerini ölçer ve anahtar aktin düzenleyicilerinin manipülasyonlarının çeşitli bağlamlarda hücre kenarı çıkıntılarını nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Hücre göçü, tüm canlı organizmaların gelişimini ve işlevini kontrol eden kritik bir süreçtir. Hücre göçü hem embriyogenez, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi gibi fizyolojik durumlarda hem de kanser metastazı ve otoimmün hastalık gibi patolojik durumlarda ortaya çıkar. Farklı göç olaylarında yer alan hücre tiplerindeki farklılıklara rağmen, tüm hücre hareketlilik olayları, protozoalardan memelilere evrimde korunmuş olan benzer moleküler mekanizmaları paylaşır ve çevreyi algılayabilen, sinyallere yanıt verebilen ve yanıt olarak hücre davranışını modüle edebilen ortak hücre iskeleti kontrol mekanizmalarını içerir1.
Hücre göçünde ilk aşama, hücrenin ön kenarında oldukça dinamik çıkıntıların oluşumu olabilir. Lamellipodyumun arkasında, aktin'i miyozin II aracılı kontraktiliteye bağlayan ve altta yatan substrata yapışmaya aracılık eden lamel bulunabilir. Lamellipodia, büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre adezyon reseptörleri gibi hücre dışı uyaranlar tarafından indüklenir ve plazma zarını ileriye doğru iten fiziksel kuvveti sağlayan aktin polimerizasyonu tarafından tahrik edilir2,3. Birçok sinyal ve yapısal protein buna dahil edilmiştir; Bunlar arasında, Arp 2/3 kompleksi, WASP ailesi proteinleri ve lamellipodia2,4,5'teki Formin ve Spire ailelerinin üyeleri gibi aktin düzenleyici proteinleri aktive etmek için diğer sinyallerle koordineli olarak hareket eden Rho GTPazlar bulunmaktadır.
Aktin polimerizasyonuna ek olarak, lamellipodyum ve anterior lamelde kontraktil kuvvetler üretmek için miyozin II aktivitesi gereklidir. Hücre kenarı retraksiyonları olarak da tanımlanan bu kasılmalar, hücre periferinde dendritik aktinin depolimerizasyonundan da kaynaklanabilir ve lamellipodial ön kenarı geliştirmek ve çıkıntının hücre dışı matrisin ve diğer hücrelerin esnekliğini algılamasına ve göç yönünü belirlemesine izin vermek için kritik öneme sahiptir6,7,8 . Substrata yapışamayan hücre kenarı çıkıntıları, periferik membran fırfırları, lamellipodia ve lamelin ventral yüzeyinde görünen tabaka benzeri yapılar oluşturacak ve göç yönüne göre geriye doğru hareket edecektir. Lamellipodyum substrata yapışamadığından, altında bir posterior lamellipodyum oluşur ve ilk lamellipodyumu mekanik olarak üst ventral yüzeye doğru iter. Daha önce substrata paralel olan fırfırdaki aktin filamentleri şimdi ona dik hale gelir ve fırfır şimdi ilerleyen lamellipodyumun üzerine yerleştirilir. Geriye doğru hareket eden fırfır, sitosol içine geri düşer ve lamellipodial aktinin geri dönüşümü için hücresel bir mekanizmayı temsil eder9,10.
Burada, hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin ölçümü için bir tahlil açıklıyoruz. Çıkıntı testi, hücrenin yayılma aşamasında 10 dakika boyunca tek hücre kenarı çıkıntı dinamiklerini ölçmek için hızlandırılmış video mikroskopisi kullanır. Çıkıntı dinamikleri, bu filmlerden kimografiler üretilerek analiz edilir. Prensip olarak, bir kimograf, hücre kenarı dinamiklerinin nitel bir anlayışını sağlamak için uzaysal zamansal bir grafikte hareketli parçacıkların ayrıntılı nicel verilerini verir. Hareketli parçacığın yoğunluğu, X ekseni ve Y ekseninin sırasıyla zaman ve mesafeyi temsil ettiği bir zamana karşı uzay grafiğindeki tüm görüntü yığınları için çizilir11. Bu yöntem, ayrıntılı nicel veriler elde etmek için ImageJ ile manuel bir kimograf analizi kullanır, düşük sinyal-gürültü oranı ve / veya yüksek özellik yoğunluğu durumunda filmlerden ve görüntülerden bilgi alınmasını ve faz kontrastlı ışık mikroskobu veya düşük görüntü kalitesinde elde edilen görüntülerin analizini sağlar.
Burada açıklanan hücre kenarı çıkıntı dinamiği testi hızlı, basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu nedenle ve hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterildiğinden11,12, daha fazla kaynak gerektiren yöntemler gerçekleştirmeye karar vermeden önce hücre hareketliliğinde yer alan sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Ayrıca, sitoiskelet proteinlerinin genetik manipülasyonlarının (nakavt, nakavt veya kurtarma yapıları) basit bir platform kullanarak sitoiskelet dinamiklerini nasıl etkilediğinin nicel ölçümünü de sağlar. Tahlil, hücre göçü bağlamında sitoiskelet dinamiklerini araştırmak için öğretici bir modeldir ve hücre hareketliliğinin altında yatan mekanizmaların ve moleküllerin aydınlatılması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm yöntemler, Bar-Ilan Üniversitesi kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Bu bölümde açıklanan yordamın adım adım grafiksel gösterimi Şekil 1'de görülmektedir.
1. Hücre kültürü
NOT: Protokolde kullanılan hücreler, vahşi tip C57BL / 6 farelerin E11.5-13.5 embriyolarından üretilen fare embriyonik fibroblastlarıdır (MEF'ler). Birincil MEF'ler Jacks laboratuvar protokolüne göre oluşturulmuştur13. Beş farklı embriyodan elde edilen hücreler bir araya getirildi ve SV40 büyük T antijenini eksprese eden retroviral bir vektör ile enfeksiyon ile ölümsüzleştirildi ve ardından 3 hafta boyunca 4 mM Histidinol ile seçildi.
- 1 g / L glikoz,% 1 glutamin,% 1 penisilin-streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren doku kültürü plakalarındaki kültür hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu), 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde.
- Hücreleri% 90-95 akıcılığa kadar kültürleyin ve her 2-3 günde bir 1: 5 oranında bölün.
2. Cam tabanlı çanak kaplama
NOT: Cam tabanlı çanak kaplama, doku kültürü davlumbazında steril koşullarda yapılmalıdır.
- Cam tabanlı bir kabın ortasına 2 mL 1N HCl çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Bu aşama, daha sonra görüntülemeyi kesintiye uğratabilecek kalıntıları camdan uzaklaştırmak içindir. - Cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS (Malzeme Tablosu) ile üç kez yıkayın.
- Fibronektini (bakınız Malzeme Tablosu) 1x PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltin. Seyreltilmiş fibronektin çözeltisinin 200 μL'sini kabın cam merkezine ekleyin. 1 saat boyunca 37 °C'de (doku kültürü inkübatörü) inkübe edin.
NOT: Alternatif olarak, cam tabanlı çanak düz bir yüzeyde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilebilir. - Fibronektin kaplama inkübasyon süresi boyunca, 1x PBS'de% 1 BSA (Malzeme Tablosu) çözeltisi hazırlayın, 0,2 μm'den süzün ve önceden ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe ederek denatüre edin.
- Kaplamalı cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Cam merkeze 2 mL denatüre BSA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin (doku kültürü inkübatörü).
NOT: Alternatif olarak, cam tabanlı çanak düz bir yüzeyde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilebilir. - Cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
NOT: Cam tabanlı tabakların fibronektin ile inkübasyonu, yüzeyi düzgün bir şekilde kaplamak için 37 ° C'de en az 1 saat boyunca yapılmalıdır. Daha kısa inkübasyon süresi uygun kaplama üretmeyebilir ve sonuç olarak, hücre fenotipi integrin aktivasyonu ile ilişkili olmayabilir. BSA tabakası inerttir ve çıkıntı dinamiklerini etkilemez ve integrinden bağımsız hücre yapışması için serbest potansiyel bölgeleri bloke etmek içindir. BSA, hücre kenarı dinamiklerini etkileyebilecek hücre apoptozunu indüklemesini önlemek için kaplamadan önce denatüre edilmelidir.
3. Görüntüleme için hücrelerin hazırlanması
- Deneyden on altı ila on sekiz saat önce, ertesi gün% 70 -% 80 birleşime ulaşmak için hücreleri plakalayın. MEF'ler için, deneyi gerçekleştirmeden bir gün önce 10 cm çapında doku kültürü plakası başına 0.7 x 106 hücre plakası.
NOT: Başarılı bir çıkıntı deneyi için, hücrelerin logaritmik büyüme fazları sırasında kullanılması önemlidir. Bunu başarmak için, hücreler deney gününde% 70 -% 80 birleşme noktasına ulaşmalıdır. Daha yüksek bir hücre yoğunluğu, deney sırasında daha uzun bir yayılma süresine ve / veya bağlanmada engele neden olacaktır. - Deney gününde, 10 cm çapında doku kültürü plakası başına 2 mL tripsin çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve hücreler ayrılana kadar bir doku kültürü inkübatöründe 2-3 dakika inkübe edin. Tam ortamın 5 mL'sini ekleyerek tripsini devre dışı bırakın.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve yukarıdaki gibi kaplanmış cam tabanlı bir tabakta tam ortamın 2 mL'sinde 20.000 hücre tabak yapın (bölüm 2).
NOT: Kaplama için hücre sayısı, hücrelerin boyutuna ve türüne bağlıdır. Daha büyük veya daha fazla yayılmış hücre için, görüntüleme için yeterli hücreye sahip olmak için sadece 10.000 hücreyi plakalayın. Hücreden hücreye temas, hücreye özgü yayılma davranışlarını değiştirebileceğinden, dokunmayan tek hücreleri seçmek önemlidir. - Cam tabanlı tabakları doku kültürü inkübatöründe kaplanmış hücrelerle 15 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Bu aşamada, hücreler fibronektin substratına yapışır ve üzerine yayılır. Hücre yayılımı sırasında çıkıntıları ölçerken, hücrelerin kaplamadan sonra ve görüntülemeden önce 15 dakika boyunca yayılmasına izin verilmelidir. Görüntüleme, kaplamadan sonra 15 dakika ila ~ 1 saat arasında bir zaman aralığında ve her durumda, hücreler göç etmeye başlamadan önce gerçekleştirilebilir.
4. Mikroskop kurulumu ve görüntüleme
NOT: Çeşitli canlı hücre mikroskopi sistemleri mevcuttur. Burada kullanılan sistem, CO2 ve ısıtma üniteleri ile donatılmış bir Leica AF6000 ters mikroskoptur ve bir ORCA-Flash 4.0 V2 dijital CMOS kameraya takılıdır.
- Isıtma ünitesini görüntülemeden en az 1 saat önce açın ve 37 °C'ye ayarlayın.
- CO2 ünitesini görüntülemeden en az 10 dakika önce açın ve %5 CO2'ye ayarlayın.
- Mikroskop, kamera ve bilgisayarı açın.
- Mikroskop edinme yazılımını açın (bkz. Yakalanan görüntülerin kaydedileceği klasörü seçin ve bir dosya adı yazın. Her filmi yeni bir dosya olarak kaydedin.
- Büyütmeyi 40x kuru lens, faz kontrastlı olarak ayarlayın. Zaman aralığını 5 sn, toplam film süresi 10 dakika olarak ayarlayın.
- Kaplanmış hücrelerin 15 dakikalık inkübasyonundan sonra, yapıştırılmış hücrelere sahip cam tabanlı kabı adaptöre yerleştirin ve sabitleyin. Adaptörü çanak ile mikroskop aşamasındaki yuvasına yerleştirin.
- Çanak kapağını çıkarın ve yerine CO2 kapağını yerleştirin. CO2 vanasını açın.
NOT: CO2 kapağını cam tabanlı kabın üstüne yerleştirmeden önce temiz olduğundan emin olun. Kirli bir kapak filmlerin kalitesini düşürecektir. CO2 kapağının alt tarafını, toz ve kiri temizlemek için %70 etanol ile ıslatılmış tüy bırakmayan bir mendille silin. Tüy bırakmayan kuru bir mendille ikinci kez silin. - Hücreleri görüntüleyin ve görüntüleme için uygun bir hücre bulun. Hücrenin odakta olduğundan emin olun ve film alımını başlatın.
5. Görüntü analizi
NOT: Görüntü analizi, aşağıdaki gibi ImageJ (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir:
- Alınan filmi ImageJ'de açın.
- Ana araç çubuğundaki Düz aracı kullanarak, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, her 45°'de bir radyal düzenlemede, lamel ve hücre kenarı da dahil olmak üzere çıkıntılara dik 20 rasgele birimden oluşan sekiz satır oluşturun.
- Ana araç çubuğunda, Görüntü > Yığınları > Reslice'a gidin. Bu, hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini tanımlayan bir kimograf resmi verecektir (Şekil 2B). Bu eylem, sekiz satırdan her satır için ayrı ayrı gerçekleştirilmelidir.
- İlgili kimograf görüntülerinden ızgara çizgileriyle işaretlenmiş hücredeki sekiz bölgenin her birindeki çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sayısını ayıklayın ve manuel olarak sayın. Bu sayılar 10 dakikada çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sıklığını temsil eder (Şekil 2C, D).
NOT: Fırfırlar, faz kontrastlı mikroskopideki karanlık görünümlerine ve hücre kenarında başlayıp hücre gövdesinin sınırında sona eren ve elde edilen filmlerde gözlemlenebilen merkezcil hareketlerine dayanarak diğer yapılardan ayırt edilebilir. Dikkat edilmesi gereken, çıkıntı, geri çekilme ve karıştırma sıklığını ölçerken, filmler nicelleştirme ve özellikle fırfırları tanımlamak için bir kontrol olarak gözlemlenmelidir. - Kimografi analizi ile çıkıntı kalıcılığını, mesafesini ve hızını belirleyin. Oluşturulan kimografların her biri için, X ekseni mesafeyi ve Y ekseni zamanı temsil eder.
- Çıkıntı mesafesini ölçmek için 5.6.1-5.6.2 adımlarını izleyin.
- Çıkıntının tabanından çıkıntının en yüksek zirvesine dik bir çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek için ImageJ'de M düğmesine basın.
- Uzunluğu piksellerden μm'ye dönüştürmek için piksel-μm oranının bilindiğinden emin olun.
NOT: μm-piksel oranı, CCD kameradaki bir pikselin fiziksel uzunluğu / toplam büyütmedir. Piksel boyutu her kamera türünün karakteristiğidir. Örneğin, bu çalışmada kullanılan kamera için piksel boyutu 6,5 μm x 6,5 μm, fiziksel uzunluk 6,5 μm ve kullandığımız büyütme 40x'tir. Bu nedenle, kameramızın μm / piksel oranı 0.1625 μm / pikseldir. Analizde, 30 piksel uzunluğundaki bir çizgi için çıkıntı mesafesi 30 piksel x 0.1625 μm / piksel = 4.875 μm olacaktır (Şekil 3).
- Çıkıntı süresini ölçmek için (kalıcılık; bir çıkıntının geri çekilmeden önce çıkıntı yapmak için harcadığı süre), 5.7.1-5.7.2 adımlarını izleyin.
- Çıkıntının başlangıcından (soldan sağa) en yüksek tepe bölgesine yatay bir çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek için ImageJ'de M düğmesine basın.
- Uzunluğu piksellerden dakikalara dönüştürmek için piksel-minimum oranını hesaplayın. Bu değer, görüntüler arasındaki aralığa bağlıdır.
NOT: Bu örnekte, görüntüler arasındaki aralık 5 sn, min/piksel oranı 0,0833 ve yatay çizgi uzunluğu 8 pikseldir. Bu nedenle, çıkıntı süresi 8 piksel x 0.0833 dakika / piksel = 0.6664 dakikadır.
- Geri çekilme süresini, çıkıntının tepesinin sağdaki tabanına olduğu yerden çıkıntının tabanına yatay olarak çizilen bir çizgi için çıkıntı süresine benzer şekilde ölçün ve hesaplayın ( Şekil 3'teki X2 çizgisi).
- Çıkıntı mesafesini çıkıntı süresine bölerek çıkıntı hızını hesaplayın. Çıkıntı mesafesini geri çekme süresine bölerek geri çekme hızını hesaplayın. Bu örnekte, çıkıntı hızı 4.875 μm / 0.6664 dakika = 7.315 μm / dak. olarak hesaplanır ve zamanı temsil eden çizgi aynı uzunlukta olduğu için geri çekme hızı aynıdır.
NOT: Farklı hücre tiplerini, yani aynı proteinin vahşi tipini ve mutant yapılarını ifade eden hücreleri karşılaştırırken, kör bir analiz yapmak zorunludur, bu nedenle önyargı ortaya çıkmaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2'de açıklanan deneyde, ölümsüzleştirilmiş MEF'ler, integrin aktivasyonuna bağlı olmayan hücre yapışması için serbest potansiyel bölgeleri bloke etmek için denatüre BSA tarafından bloke edilen integrin aracılı sinyallemeyi aktive etmek için fibronektin ile önceden kaplanmış cam tabanlı tabaklar üzerine kaplanmıştır. Deney günü hücrelerin %70-%80 birleşmesinde logaritmik büyüme evresine ulaşmak için, deneyden 16 saat önce 10 cm çapında bir doku kültürü plakasında 0.7 x 106 MEF kaplandı. Deney gününde, hücreler tripsinize edildi ve sayıldı ve 20.000 hücre fibronektin / BSA kaplı cam tabanlı bir kabın üzerine kaplandı. Çanak, görüntülemeden önce hücrelerin bağlanmasına ve yayılmasına izin vermek için 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edildi. İnkübasyonu takiben, plaka bir mikroskop inkübatör odasına (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirildi ve faz ışığında 40x kuru lens kullanılarak tek hücreler görüntülendi. Görüntüleme, hücreler göç etmeye başlamadan önce kaplamayı takiben 15 dakika ila 1 saat arasında yapıldı. Görüntüler 10 dakika boyunca her 5 saniyede bir elde edildi ve bu da hücre başına 121 görüntü verdi (Ek Film 1).
Görüntü analizi ImageJ kullanılarak yapıldı. Ana araç çubuğundaki Düz aracı kullanılarak, radyal ızgara üzerinde, tüm hücrelerde her 45 derecede aynı yerlerde 20 rasgele birim uzunluğunda düz çizgi oluşturulmuştur (Şekil 2A). Bir kimograf oluşturmak için, hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini açıklayan bir kimograf resmi veren Image > Stack > Reslice komutlarını kullandık (Şekil 2B-D). Izgara çizgileri ile işaretlenmiş hücrelerdeki sekiz bölgenin her birinde filmin 10 dakikası boyunca oluşan çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar sayısı çıkarıldı, ilgili kimograf görüntülerinden manuel olarak sayıldı ve bir grafikte 10 dakikada çıkıntılar / geri çekmeler / fırfırlar frekansları olarak çizildi. Elde edilen ortalama frekanslar çıkıntılar ve geri çekilmeler için 5.1/10 dk, fırfırlar için 2.1/10 dk idi (Şekil 2E).
Üretilen kimograflardan çıkıntı mesafesi, çıkıntı süresi, geri çekilme süresi, çıkıntı ve geri çekilme hızları hesaplanmıştır. Şekil 3'teki temsili kimografta, çıkıntı mesafesi 30 piksel x 0.1625 μm / piksel = 4.875 μm, çıkıntı süresi 8 piksel x 0.0833 dakika / piksel = 0.6664 dakika, geri çekme süresi 8 piksel x 0.0833 dakika / piksel = 0.6664 dakika idi. Çıkıntı ve geri çekilme hızları 4.875 μm/0.6664 min = 7.315 μm/dak olarak hesaplandı.
Hücre kenarı çıkıntısını ölçerken, yayılma aşamasında olan hücreleri seçmek önemlidir. Analiz için uygun bir hücre örneği Şekil 2A ve Ek Film 1'de görülmektedir. Kimografi analizini takiben, çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar bu deneyde kolayca ayırt edilebilir. Analiz için uygun olmayan vahşi tip bir fibroblast örneği Şekil 4'te gösterilmiştir. Kimografi analizini takiben, örneğin 1, 3, 5, 7 satırlarında (dilimlerde) açık çıkıntılar ayırt edilemez. Bu durumda, hücre yayılmayı bitirdi ancak henüz hareket etmeye başlamadı ve bu nedenle çok fazla zar hareketi gözlenemedi.
Resim 1: Çıkıntı testinin deneysel aşamaları. (A) Cam tabanlı kaba 20 dakika boyunca 1N HCl çözeltisi eklenir. (B) PBS'deki yıkamaları takiben, kabın cam kısmına 10 μg / mL fibronektin çözeltisi eklenir ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir. (C) Çanak cam tabanı, 37 ° C'de 1 saat boyunca% 1 denatüre BSA'da inkübasyon ile bloke edilir. (D) % 70-80 akıcı% fibrülatörlerden oluşan bir doku kültürü plakası tripsinize edilir ve sayılır (E) 20.000 hücre cam tabanlı bir tabakta kaplanır ve (F) hücrelerin yayılmasına izin vermek için 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edilir. (G) Plaka, %5 CO2'de 37 °C ile mikroskop nemli bir odaya yerleştirilir ve faz-kontrast ışık mikroskobu ile canlı görüntüleme gerçekleştirilir. (H) Hücre filmleri ve görüntüleri, Image J. tarafından kimografi analizine tabi tutulur.
Şekil 2: Çıkıntı tahlili görüntü analizi. (A) 10 dakika boyunca nicelleştirme için belirtilen sekiz membran kesiti ile ImageJ'deki MEF'in temsili görüntüsü. Ölçek çubuğu, 20 μm. ( B) Resim J. (C)' de bir kimografın oluşturulması Çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar ayırt edilebilen kesitten temsili kimograf. (D) Reslice komutunu kullanarak Resim J'de 10 dakika boyunca görüntü analizinden sonra elde edilen kimograflar. (E) Analiz edilen film ve kimograftan 10 dakika başına çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar frekanslarının ölçülmesi. 10 dakika başına ortalama çıkıntı frekansı = 5.1, 10 dakika başına ortalama geri çekilme frekansı = 5.125, 10 dakika başına ortalama fırfır frekansı = 2.1. Bir filmden sekiz kimograf analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çıkıntı kalıcılığının, uzaklığının ve hızının analizi ve miktarı. Temsili kimografta, X ekseni zamanı min cinsinden (soldan sağa) temsil eder ve Y ekseni mesafeyi μm cinsinden gösterir. X1 çıkıntı süresini (kalıcılığı), X2 geri çekilme süresini ve Y çıkıntı mesafesini temsil eder. Çıkıntı hızı, çıkıntı mesafesinin (Y) çıkıntı süresine (X1) bölünmesiyle hesaplanır. Geri çekme hızı, çıkıntı mesafesinin (Y) geri çekme süresine (X2) bölünmesiyle hesaplanır. Bu örnekte, çıkıntı mesafesi 30 piksel x 0,1625 μm/piksel = 4,875 μm, çıkıntı süresi 8 piksel x 0,0833 dakika/piksel = 0,6664 dakika, geri çekme süresi 8 piksel x 0,0833 dakika/piksel = 0,6664 dakika idi. Çıkıntı/geri çekilme hızı 4.875 μm/0.6664 dk. = 7.315 μm/dk olarak hesaplanmıştır.
Şekil 4: Analizden dışlanması gereken bir hücre örneği. (A) Analiz için uygun olmayan bir hücre örneği. Ölçek çubuğu, 20 μm. (B) Bu hücrenin kimografi analizi, özellikle 1,3,5,7 yeniden diliminde, belirgin bir çıkıntı olmadığını göstermektedir. Bu durumda, hücre yayılmayı bitirdi, ancak henüz hareket etmeye başlamadı ve bu nedenle çok fazla zar çıkıntısı gözlenemez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Film 1. MEF, fibronektin kaplı cam tabanlı bir çanak üzerine kaplandı ve 40x/1.4 NA kuru hedef kullanılarak 10 dakika boyunca hızlandırılmış faz-kontrastlı video mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Süre saniye cinsinden gösterilir. Ölçek çubuğu, 10 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çıkıntılar, retraksiyonlar ve fırfırlardan oluşan hücre kenarı çıkıntı dinamikleri, hücre hareketliliğinde hem bir ön koşul hem de potansiyel bir hız sınırlayıcı olaydır. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntılarının dinamiklerini ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem kısa süreli görüntülemeyi mümkün kılar, önemli miktarda veri üretir, hücrelerin floresan etiketlemesini veya pahalı floresan mikroskopi ekipmanı gerektirmez ve daha fazla kaynak gerektiren yöntemler gerçekleştirmeye karar vermeden önce hücre hareketliliğinde yer alan sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Dahası, bu tahlilde nakavt veya nakavt hücreleri ve / veya protein mutantları, sitoiskelet dinamiklerinde yer alan kritik proteinleri ve potansiyel sinyal mekanizmalarını tanımlamak için hızlı ve basit bir araç olarak kullanılabilir.
Dikkat edilirse, çıkıntı analizi için doğru hücreleri seçmek önemlidir. Hücreler, yayılmaya izin vermek için filmler edinilmeden önce 15 dakika boyunca inkübe edilir. Yayılma sırasında çıkıntıyı ölçmeye karar verilirse (göç sırasındaki çıkıntıları ölçmenin aksine), o zaman yalnızca film edinimi sırasında yayılma aşamasında olan hücreler görüntülenmelidir. Yayılmaya başlamayan hücreler kimografi analizi için uygun değildir. Yayılma evresini tamamlamış ancak hareket etmeye başlamamış hücreler (Şekil 4) de analiz için uygun olmayacaktır. Çekirdeklerinin hareketi bu hücreleri ayırt edebilir: yayılma sırasında, çekirdek sabittir, hücre göçü sırasında çekirdek dinamiktir ve göç yönüne doğru önde gelen bir kenar-sentrozom-çekirdek ekseni oluşturmak için hücrenin arka tarafında lokalize olur. Görüntülemenin sonraki aşamalarında bir diğer yaygın sorun, hücrelerin birbirine temas ettiği bir durumdur. Bu tür filmler analizden dışlanmalıdır, çünkü komşu hücrelerden gelen etkileşimler ve sinyaller hücre kenarı çıkıntı dinamiklerine müdahale edebilir.
Bu yazıda, faz-kontrast ışık mikroskobu kullanılarak hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin analizi anlatılmaktadır. Bu yöntem, floresan mikroskobu ile hücre içi bileşenlerin dinamiklerini ölçmek için de genişletilebilir. Floresan kimografinin bu tür yaygın kullanımı, hücreler içindeki sitoiskelet yapılarının dinamiklerini ölçmek için sıklıkla tanımlanmaktadır. Örneğin, Dogget ve Breslin, aktin stres lifi dinamiklerini ve cirosunu analiz etmek için GFP-aktin transfekte HUVEC hücrelerinin kimografisini kullanmışlardır14.
Bu protokol ve önceki birkaç makale, hücre kenarı çıkıntı testi ve iki boyutlu hücre hareketlilik testleri için fibronektin üzerine kaplanmış fibroblastları kullandı. Fibroblastlar motilitesi tahlilleri ve hücre kenarı çıkıntı dinamiği testi gibi diğer ilgili tahliller için yaygın olarak kullanılır, çünkü mezenkimal ve motildir ve lamellipodia, filopodia ve fokal adezyonlar gibi net sitoiskelet yapılarına sahiptirler. Diğer hücre tipleri ve substratları için tahlili tanımlamasak da, bu yöntem kolayca değiştirilebilir. Örneğin, biz ve diğerlerinin hücre kenarı çıkıntı dinamiği testi haline gelmek üzere değiştirdiğimiz lamel dinamiği testinin ilk dokümantasyonunda11, yazarlar EGF tarafından göç etmek üzere uyarılan keratinositleri bir çizik testinde kullandılar ve bu da diğer hücre tiplerinin ve diğer stimülasyonların bu teste uygulanabileceğini gösterdi. Dahası, hücre yayılımı sırasında hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin ölçümünü tanımlamamıza rağmen, aynı yöntem, örneğin Bear ve ark.12 ve Hinz ve ark.11'de gösterildiği gibi, hücrelerin göçü sırasında çıkıntıların dinamiklerini ölçerek kullanılabilir.
Gerçekten de, birkaç laboratuvar geçmişte sitoiskelet dinamiklerini ve sinyal mekanizmalarını aydınlatmak için MEF'ler üzerindeki bu testi kullanmıştır. Örneğin, Miller ve ark. daha önce Abl2 / Arg'nin hücre kenarındaki aktin ve mikrotübüller arasındaki temasa aracılık ettiğini göstermek için çıkıntı testini kullanmışlardı15. Bryce ve ark., testi kullanarak, kortaktin nakavt hücrelerinin, lamellipodial çıkıntıların kalıcılığında bozulma ile birlikte iç içe geçen bozulmuş hücre hareketliliğine sahip olduğunu göstermiştir. Bu kusur, çıkıntılardaki yeni yapışıklıkların montajındaki bozulmadan kaynaklanmaktadır16. Lapetina ve ark., Abl2/Arg aracılı regülasyon mekanizması hücre kenarı çıkıntılarını aydınlatmak için iki proteinin mutantlarıyla kurtarılan Abl2/Arg nakavt ve kortaktin nakavt hücrelerinde hücre kenarı çıkıntı testini kullanmışlardır17. Aynı tahlili kullanarak, Miller ve ark. ayrıca Arg'nin N-WASP aracılı aktin polimerizasyonunu ve bunun sonucunda hücre kenarı çıkıntı dinamiklerini düzenlediğini göstermiştir18. Son zamanlarda, reseptör olmayan tirozin kinaz Pyk2'nin, adaptör proteini CrkII ile doğrudan ve dolaylı etkileşimler yoluyla çıkıntıların dinamiklerini ve müteakip hücre göçünü düzenlediğini göstermek için hücre kenarı çıkıntı testini kullandık. Bu yazıda, hücre kenarı çıkıntısı sırasında iki protein arasındaki moleküler etkileşimleri ve sinyal hiyerarşisini aydınlatmak için Pyk2-WT ve Pyk2-/- ve Crk-WT ve knockdown MEF, kurtarma mutantları ve epistaz deneylerini kullandık. Bu yeni karmaşık regülasyon mekanizması, bir yandan hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin ince ayarlanmasını ve bunun sonucunda hücre göçünü, diğer yandan hücre hareketliliği üzerinde sıkı bir düzenlemeyi mümkün kılar19. Hücre kenarı çıkıntı testini kullanarak, yukarıdaki makaleler ve takip eden diğerleri, özellikle hücre kenarı çıkıntılarının ve genel olarak hücre göçünün düzenleme mekanizmaları hakkındaki bilgimizi önemli ölçüde artırmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH MH115939, NS112121, NS105640 ve R56MH122449-01A1 (Anthony J. Koleske'ye) ve İsrail Bilim Vakfı'ndan (1462/17 ve 2142/21 numaralı hibeler) (Hava Gil-Henn'e) hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A.
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Jacks laboratory protocol. , Available from: http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs (2021).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
