Summary
Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.
Abstract
Lo sviluppo e l'omeostasi degli organismi multicellulari si basano sulla regolazione coordinata della migrazione cellulare. La migrazione cellulare è un evento essenziale nella costruzione e nella rigenerazione dei tessuti ed è fondamentale per lo sviluppo embrionale, le risposte immunologiche e la guarigione delle ferite. La disregolazione della motilità cellulare contribuisce a disturbi patologici, come l'infiammazione cronica e le metastasi del cancro. La migrazione cellulare, l'invasione tissutale, l'assone e la crescita del dendrite iniziano tutti con sporgenze del bordo cellulare mediate dalla polimerizzazione dell'actina. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e che consente di risparmiare tempo per l'imaging e l'analisi quantitativa delle dinamiche di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo misura le caratteristiche discrete della dinamica della membrana del bordo cellulare, come sporgenze, retrazioni e volant, e può essere utilizzato per valutare come le manipolazioni dei regolatori di actina chiave influenzano le sporgenze del bordo cellulare in diversi contesti.
Introduction
La migrazione cellulare è un processo critico che controlla lo sviluppo e la funzione di tutti gli organismi viventi. La migrazione cellulare avviene sia in condizioni fisiologiche, come l'embriogenesi, la guarigione delle ferite e la risposta immunitaria, sia in condizioni patologiche, come metastasi tumorali e malattie autoimmuni. Nonostante le differenze nei tipi di cellule che prendono parte a diversi eventi migratori, tutti gli eventi di motilità cellulare condividono meccanismi molecolari simili, che sono stati conservati nell'evoluzione dai protozoi ai mammiferi e coinvolgono meccanismi di controllo citoscheletrico comuni in grado di rilevare l'ambiente, rispondere ai segnali e modulare il comportamento cellulare in risposta1.
Una fase iniziale della migrazione cellulare può essere la formazione di sporgenze altamente dinamiche sul bordo anteriore della cella. Dietro il lamellipodio si trova la lamella, che accoppia l'actina alla contrattilità mediata dalla miosina II e media l'adesione al substrato sottostante. Le lamellipodia sono indotte da stimoli extracellulari come fattori di crescita, citochine e recettori di adesione cellulare e sono guidate dalla polimerizzazione dell'actina, che fornisce la forza fisica che spinge la membrana plasmatica in avanti2,3. Molte proteine di segnalazione e strutturali sono state implicate in questo; tra questi ci sono rho GTPasi, che agiscono in coordinate con altri segnali per attivare proteine che regolano l'actina come il complesso Arp 2/3, le proteine della famiglia WASP e membri delle famiglie Formin e Spire in lamellipodia2,4,5.
Oltre alla polimerizzazione dell'actina, l'attività della miosina II è necessaria per generare forze contrattili al lamellipodio e alla lamella anteriore. Queste contrazioni, definite anche come retrazioni del bordo cellulare, possono anche derivare dalla depolimerizzazione dell'actina dendritica alla periferia cellulare e sono fondamentali per lo sviluppo del bordo d'attacco lamellipodiale e consentire alla protrusione di rilevare la flessibilità della matrice extracellulare e di altre cellule e determinare la direzione della migrazione6,7,8 . Le sporgenze del bordo cellulare che non possono attaccarsi al substrato formeranno volant periferici della membrana, strutture simili a fogli che appaiono sulla superficie ventrale di lamellipodi e lamelle e si muovono all'indietro rispetto alla direzione della migrazione. Poiché il lamellipodio non riesce ad attaccarsi al substrato, un lamellipodio posteriore si forma sotto di esso e spinge meccanicamente il primo lamellipodio verso la superficie ventrale superiore. I filamenti di actina nel volant che erano precedentemente paralleli al substrato ora diventano perpendicolari ad esso, e il volant è ora posizionato sopra il lamellipodio che avanza. Il volant che si muove all'indietro ricade nel citosol e rappresenta un meccanismo cellulare per il riciclo dell'actina lamellipodiale9,10.
Qui, descriviamo un test per la misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare. Il test di protrusione utilizza la microscopia video time-lapse per misurare la dinamica di protrusione del bordo della singola cellula per 10 minuti durante la fase di diffusione della cellula. Le dinamiche di protrusione vengono analizzate generando cimografi da questi filmati. In linea di principio, un chimografo impartisce dati quantitativi dettagliati di particelle in movimento in un grafico spaziotemporale per ottenere una comprensione qualitativa della dinamica dei bordi cellulari. L'intensità della particella in movimento viene tracciata per tutte le pile di immagini in un grafico tempo rispetto allo spazio, dove l'asse X e l'asse Y rappresentano rispettivamente il tempo e la distanza11. Questo metodo utilizza un'analisi manuale del kymograph con ImageJ per ottenere dati quantitativi dettagliati, consentendo il recupero di informazioni da filmati e immagini in caso di basso rapporto segnale-rumore e / o alta densità di funzionalità, e l'analisi di immagini acquisite in microscopia a luce a contrasto di fase o scarsa qualità dell'immagine.
Il test della dinamica di protrusione del bordo cellulare descritto qui è un metodo veloce, semplice ed economico. Come tale, e poiché è stato dimostrato che è direttamente correlato con la migrazione cellulare11,12, può essere utilizzato come metodo preliminare per testare le dinamiche citoscheletriche coinvolte nella motilità cellulare prima di decidere di eseguire metodi più esigenti in termini di risorse. Inoltre, consente anche la misurazione quantitativa di come le manipolazioni genetiche (knockout, knockdown o costrutti di salvataggio) delle proteine citoscheletriche influiscono sulla dinamica citoscheletrica utilizzando una piattaforma semplice. Il test è un modello istruttivo per esplorare la dinamica citoscheletrica nel contesto della migrazione cellulare e potrebbe essere utilizzato per chiarire i meccanismi e le molecole alla base della motilità cellulare.
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Protocol
Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Bar-Ilan.
Nota : nella Figura 1 viene visualizzata una rappresentazione grafica dettagliata della procedura descritta in questa sezione.
1. Coltura cellulare
NOTA: Le cellule utilizzate nel protocollo sono fibroblasti embrionali di topo (MEF) che sono stati generati da embrioni E11.5-13.5 di topi C57BL/6 wild-type. I MEF primari sono stati generati secondo il protocollo di laboratorio Jacks13. Le cellule di cinque diversi embrioni sono state raggruppate insieme e immortalate dall'infezione con un vettore retrovirale che esprime l'antigene T grande SV40 seguito dalla selezione con 4 mM di istidinolo per 3 settimane.
- Cellule di coltura in piastre di coltura tissutale contenenti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenenti 1 g/L di glucosio, 1% di glutammina, 1% di penicillina-streptomicina e 10% di siero bovino fetale (FBS) (vedi Tabella dei materiali), in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 a 37 °C.
- Coltivare le cellule fino al 90% -95% di confluenza e dividersi in un rapporto di 1:5 ogni 2-3 giorni.
2. Rivestimento del piatto con fondo di vetro
NOTA: il rivestimento del piatto con fondo di vetro deve essere eseguito nella cappa di coltura del tessuto in condizioni sterili.
- Aggiungere 2 ml di soluzione 1N HCl al centro di un piatto con fondo di vetro (Table of Materials) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
NOTA: questa fase ha lo scopo di rimuovere i residui dal vetro che potrebbero interrompere l'imaging in un secondo momento. - Lavare il piatto con fondo di vetro tre volte con 2 ml di 1x PBS (Table of Materials) ciascuno.
- Diluire la fibronectina (vedere Tabella dei materiali) a 10 μg/mL in 1x PBS. Aggiungere 200 μL della soluzione di fibronectina diluita al centro di vetro del piatto. Incubare a 37 °C (incubatore di colture tissutali) per 1 ora.
NOTA: In alternativa, il piatto con fondo di vetro può essere incubato durante la notte a 4 °C su una superficie piana. - Durante il tempo di incubazione del rivestimento in fibronectina, preparare la soluzione di BSA (Table of Materials) all'1% in 1x PBS, filtrare attraverso 0,2 μm e denaturare incubando a 70 °C per 30 minuti in un bagno d'acqua preriscaldato.
- Lavare il piatto rivestito con fondo di vetro tre volte con 2 ml di 1x PBS ciascuno.
- Aggiungere 2 mL di soluzione BSA denaturata al centro del vetro e incubare per 1 ora a 37 °C (incubatore di colture tissutali).
NOTA: In alternativa, il piatto con fondo di vetro può essere incubato durante la notte a 4 °C su una superficie piana. - Lavare il piatto con fondo di vetro 3 volte con 2 ml di 1x PBS ciascuno.
NOTA: L'incubazione di piatti con fondo di vetro con fibronectina deve essere eseguita per almeno 1 ora a 37 °C per rivestire correttamente la superficie. Un tempo di incubazione più breve potrebbe non produrre un rivestimento adeguato e, di conseguenza, il fenotipo cellulare potrebbe non essere correlato all'attivazione dell'integrina. Lo strato BSA è inerte e non influenzerà la dinamica della protrusione e ha lo scopo di bloccare i siti potenziali liberi per l'adesione cellulare indipendente dall'integrina. La BSA deve essere denaturata prima del rivestimento per evitare che induca l'apoptosi cellulare, che può influenzare la dinamica del bordo cellulare.
3. Preparazione delle cellule per l'imaging
- Da sedici a diciotto ore prima dell'esperimento, piazzare le cellule per raggiungere il 70% -80% di confluenza il giorno seguente. Per i MEF, piastra 0,7 x 106 cellule per piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro un giorno prima di eseguire l'esperimento.
NOTA: Per un esperimento di protrusione di successo, è importante che le cellule vengano utilizzate durante la loro fase di crescita logaritmica. Per raggiungere questo obiettivo, le cellule dovrebbero raggiungere il 70% -80% di confluenza il giorno dell'esperimento. Una maggiore densità di cellule si tradurrà in un tempo di diffusione più lungo e / o impedimento nell'attaccamento durante l'esperimento. - Il giorno dell'esperimento, aggiungere 2 ml di soluzione di tripsina (Tabella dei materiali) per piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro e incubare per 2-3 minuti in un incubatore di colture tissutali fino a quando le cellule non si staccano. Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml del mezzo completo.
- Contare le cellule usando un emocitometro e lastra 20.000 cellule in 2 ml del mezzo completo su un piatto con fondo di vetro rivestito come sopra (sezione 2).
NOTA: il numero di celle per la placcatura dipende dalle dimensioni e dal tipo di celle. Per le cellule più grandi o più diffuse, placcare solo 10.000 cellule per avere abbastanza cellule per l'imaging. È importante scegliere singole cellule che non si toccano poiché il contatto cellula-cellula può alterare i comportamenti di diffusione intrinseci delle cellule. - Incubare i piatti con fondo di vetro con cellule placcate nell'incubatore di colture tissutali per 15 minuti.
NOTA: Durante questa fase, le cellule aderiscono al substrato della fibronectina e si diffondono su di esso. Quando si misurano le sporgenze durante la diffusione cellulare, le cellule devono essere lasciate diffondersi per 15 minuti dopo la placcatura e prima dell'imaging. L'imaging può essere eseguito entro una finestra temporale compresa tra 15 minuti e ~ 1 ora dopo la placcatura e, in ogni caso, prima che le cellule inizino a migrare.
4. Configurazione e imaging del microscopio
NOTA: Sono disponibili vari sistemi di microscopia a cellule vive. Il sistema utilizzato qui è un microscopio invertito Leica AF6000 dotato di CO2 e unità di riscaldamento ed è collegato a una fotocamera CMOS digitale ORCA-Flash 4.0 V2.
- Accendere l'unità di riscaldamento almeno 1 ora prima dell'imaging e impostarla a 37 °C.
- Accendere l'unità CO2 almeno 10 minuti prima dell'imaging e impostarla al 5% di CO2.
- Accendere il microscopio, la fotocamera e il computer.
- Aprire il software di acquisizione del microscopio (vedere Tabella dei materiali). Scegliere la cartella in cui salvare le immagini acquisite e digitare un nome di file. Salva ogni filmato come nuovo file.
- Imposta l'ingrandimento su una lente asciutta 40x, contrasto di fase. Imposta l'intervallo di tempo su 5 s, durata totale del film 10 min.
- Dopo 15 minuti di incubazione delle celle placcate, posizionare il piatto con fondo di vetro con celle aderenti nell'adattatore e fissarlo. Inserire l'adattatore con la parabola nella sua fessura nella fase del microscopio.
- Togliere il coperchio del piatto e posizionare invece il coperchio di CO2 . Aprire la valvola CO2 .
NOTA: Assicurarsi che il coperchio in CO2 sia pulito prima di posizionarlo sopra il piatto con fondo di vetro. Una copertina sporca ridurrà la qualità dei film. Pulire la parte inferiore del coperchio a CO2 con una salvietta priva di lanugine imbevuta di etanolo al 70% per rimuovere polvere e sporco. Pulire una seconda volta con una salvietta asciutta senza lanugine. - Visualizzare le celle e trovare una cella appropriata per l'imaging. Assicurati che la cella sia a fuoco e avvia l'acquisizione del filmato.
5. Analisi delle immagini
NOTA: l'analisi delle immagini viene eseguita utilizzando ImageJ (Table of Materials) come segue:
- Apri il filmato acquisito in ImageJ.
- Utilizzando lo strumento Diritto (Straight ) nella barra degli strumenti principale, create otto linee di 20 unità arbitrarie ciascuna perpendicolari alle sporgenze, comprese la lamella e il bordo della cella, in una disposizione radiale ogni 45°, come mostrato nella Figura 2A.
- Nella barra degli strumenti principale, vai a Image > Stacks > Reslice. Ciò produrrà un'immagine del kymografo, che descrive il movimento di singoli punti all'interno della membrana cellulare (Figura 2B). Questa azione deve essere eseguita separatamente per ogni riga delle otto righe.
- Estrarre e contare manualmente dalle rispettive immagini del kymograph il numero di sporgenze, retrazioni e volant in ciascuna delle otto regioni della cella, contrassegnate dalle linee della griglia. Questi numeri rappresentano la frequenza di sporgenze, retrazioni e volant per 10 minuti (Figura 2C, D).
NOTA: I volant possono essere distinti da altre strutture in base al loro aspetto scuro nella microscopia a contrasto di fase e al loro movimento centripeto, che inizia dal bordo della cellula e termina al bordo del corpo cellulare, che può essere osservato nei filmati acquisiti. Da notare, quando si quantifica la protrusione, la retrazione e la frequenza dell'arruffamento, i filmati dovrebbero essere osservati come controllo per la quantificazione e soprattutto per la definizione dei volant. - Determinare la persistenza, la distanza e la velocità della protrusione mediante l'analisi della chimografia. Per ciascuno dei kymografi generati, l'asse X rappresenta la distanza e l'asse Y rappresenta il tempo.
- Per misurare la distanza di protrusione, seguite i passaggi 5.6.1-5.6.2.
- Disegnate una linea perpendicolare dalla base della protrusione al picco più alto della protrusione. Premere M in ImageJ per misurare la lunghezza della linea in pixel.
- Per convertire la lunghezza da pixel a μm, assicurarsi che il rapporto pixel/μm sia noto.
NOTA: il rapporto μm/pixel è la lunghezza fisica di un pixel sulla fotocamera CCD / ingrandimento totale. La dimensione dei pixel è caratteristica di ogni tipo di fotocamera. Ad esempio, per la fotocamera utilizzata in questo studio, la dimensione dei pixel è 6,5 μm x 6,5 μm, la lunghezza fisica è 6,5 μm e l'ingrandimento che abbiamo usato è 40x. Pertanto, il rapporto μm/pixel della nostra fotocamera è di 0,1625 μm/pixel. Nell'analisi, per una linea della lunghezza di 30 pixel, la distanza di protrusione sarebbe di 30 pixel x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm (Figura 3).
- Per misurare il tempo di protrusione (persistenza; la quantità di tempo che una protrusione trascorre sporgendo prima di ritrarsi), seguite i passaggi 5.7.1-5.7.2.
- Disegnate una linea orizzontale dall'inizio della protrusione (da sinistra a destra) alla regione della vetta più alta. Premere M in ImageJ per misurare la lunghezza della linea in pixel.
- Per convertire la lunghezza da pixel a minuti, calcolate il rapporto pixel/min. Questo valore dipende dall'intervallo tra le immagini.
NOTA: in questo esempio, l'intervallo tra le immagini è 5 s, il rapporto min/pixel è 0,0833 e la lunghezza della linea orizzontale è di 8 pixel. Pertanto, il tempo di protrusione è 8 pixel x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
- Misurate e calcolate il tempo di retrazione in modo simile al tempo di protrusione per una linea disegnata orizzontalmente alla base della protrusione da dove si trova il picco della protrusione alla sua base a destra (linea X2 nella Figura 3).
- Calcolate la velocità di protrusione dividendo la distanza di protrusione per il tempo di protrusione. Calcolate la velocità di retrazione dividendo la distanza di protrusione per il tempo di retrazione. In questo esempio, la velocità di protrusione viene calcolata come 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min. e la velocità di retrazione è identica perché la linea che rappresenta il tempo è alla stessa lunghezza.
NOTA: Nel confrontare diversi tipi di cellule, cioè cellule che esprimono costrutti wild type e mutanti della stessa proteina, è imperativo eseguire un'analisi in cieco, quindi non viene introdotto alcun pregiudizio.
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Representative Results
Nell'esperimento descritto nella Figura 2, i MEF immortalizzati sono stati placcati su piatti con fondo di vetro pre-rivestiti con fibronectina per attivare la segnalazione mediata dall'integrina, bloccata dalla BSA denaturata, per bloccare i siti potenziali liberi per l'adesione cellulare che non dipende dall'attivazione dell'integrina. Per raggiungere la fase di crescita logaritmica al 70%-80% di confluenza delle cellule il giorno dell'esperimento, 0,7 x 106 MEF sono stati placcati in una piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro 16 ore prima dell'esperimento. Il giorno dell'esperimento, le cellule sono state tripsinate e contate, e 20.000 cellule sono state placcate su un piatto di fondo di vetro rivestito di fibronectina / BSA. Il piatto è stato incubato per 15 minuti a 37 °C per consentire l'attaccamento e la diffusione delle cellule prima dell'imaging. Dopo l'incubazione, la piastra è stata collocata in una camera di incubatore del microscopio (37 ° C, 5% di CO2) e le singole cellule sono state fotografate utilizzando una lente asciutta 40x in luce di fase. L'imaging è stato eseguito tra 15 minuti e 1 ora dopo la placcatura prima che le cellule iniziassero a migrare. Le immagini sono state acquisite ogni 5 s per 10 minuti, che hanno prodotto 121 immagini per cella (Filmato supplementare 1).
L'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando ImageJ. Utilizzando lo strumento Dritto nella barra degli strumenti principale, sono state create 20 linee rette arbitrarie lunghe unità su una griglia radiale negli stessi punti ogni 45 gradi in tutte le celle (Figura 2A). Per generare un kymograph, abbiamo usato i comandi Image > Stack > Reslice, che ha prodotto un'immagine del kymograph che descrive il movimento di singoli punti all'interno della membrana cellulare (Figura 2B-D). Il numero di sporgenze, retrazioni e volant formati durante 10 minuti del filmato in ciascuna delle otto regioni delle celle, che sono contrassegnate dalle linee della griglia, è stato estratto, contato manualmente dalle rispettive immagini del kymograph e tracciato in un grafico come sporgenze / retrazioni / volant frequenze per 10 min. Le frequenze medie ottenute sono state di 5,1/10 min per sporgenze e retrazioni e 2,1/10 min per volant (Figura 2E).
La distanza di protrusione, il tempo di protrusione, il tempo di retrazione, le velocità di protrusione e retrazione sono stati calcolati dai kymograph generati. Nel kymografo rappresentativo nella Figura 3, la distanza di protrusione era di 30 pixel x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, il tempo di protrusione era di 8 pixel x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min, il tempo di retrazione era di 8 pixel x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. Le velocità di protrusione e retrazione sono state calcolate come 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min.
Quando si misura la protrusione del bordo della cella, è importante scegliere le cellule che si trovano nella loro fase di diffusione. Un esempio di cella appropriata per l'analisi viene visualizzato nella Figura 2A e nel Filmato supplementare 1. Dopo l'analisi della kymografia, le sporgenze, le retrazioni e le volant possono essere facilmente distinte in questo esperimento. Un esempio di fibroblasto wild-type che non è appropriato per l'analisi è mostrato nella Figura 4. Dopo l'analisi della kymografia, nelle linee (fette) 1, 3, 5, 7, ad esempio, non è possibile distinguere le sporgenze chiare. In questo caso, la cellula ha finito di diffondersi ma non ha ancora iniziato a muoversi, e quindi non si possono osservare molti movimenti di membrana.
Figura 1: Fasi sperimentali del saggio di protrusione. (A) Una soluzione di HCl da 1 N viene aggiunta alla parabola con fondo di vetro per 20 minuti. (B) Dopo lavaggi in PBS, 10 μg/mL di soluzione di fibronectina viene aggiunta alla parte di vetro del piatto e incubata per 1 ora a 37 °C. (C) Il fondo di vetro del piatto viene bloccato mediante incubazione in BSA denaturato all'1% per 1 ora a 37 °C. (D) Una lastra di coltura tissutale di fibroblasti confluenti al 70%-80% viene tripsinizzata e contata (E) 20.000 cellule sono placcate in un piatto con fondo di vetro e (F) incubate per 15 minuti a 37 ° C per consentire alle cellule di diffondersi. (G) La piastra viene collocata in una camera umida al microscopio con 37 °C in 5% di CO2 e l'imaging dal vivo viene eseguito mediante microscopia ottica a contrasto di fase. (H) I filmati e le immagini cellulari sono sottoposti all'analisi della kymografia da parte dell'immagine J. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi delle immagini del saggio di protrusione. (A) Immagine rappresentativa del MEF in ImageJ con otto sezioni trasversali di membrana indicate per la quantificazione durante 10 min. Barra della scala, 20 μm. (B) Generazione di un kymograph nell'immagine J. (C) Kymograph rappresentativo da sezione trasversale su cui si possono distinguere sporgenze, retrazioni e volant. (D) Kymografi risultanti dopo l'analisi dell'immagine durante 10 minuti nell'immagine J utilizzando il comando Reslice . (E) Quantificazione di sporgenze, retrazioni e frequenze di volant per 10 minuti dal filmato e dal kymograph analizzati. Frequenza media di protrusione per 10 min = 5,1, frequenza media di retrazione per 10 min = 5.125, frequenza media dei volant per 10 min = 2.1. Otto kymographs sono stati analizzati da un film. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi e quantificazione della persistenza, della distanza e della velocità della protrusione. Nel kymograph rappresentativo, l'asse X rappresenta il tempo in min (da sinistra a destra) e l'asse Y mostra la distanza in μm. X1 rappresenta il tempo di protrusione (persistenza), X2 rappresenta il tempo di retrazione e Y rappresenta la distanza di protrusione. La velocità di protrusione viene calcolata dividendo la distanza di protrusione (Y) per il tempo di protrusione (X1). La velocità di retrazione viene calcolata dividendo la distanza di protrusione (Y) per il tempo di retrazione (X2). In questo esempio, la distanza di protrusione era di 30 pixel x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, il tempo di protrusione era di 8 pixel x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min., il tempo di retrazione era di 8 pixel x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. La velocità di protrusione/retrazione è stata calcolata come 4,875 μm/0,6664 min. = 7,315 μm/min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio di cella che deve essere esclusa dall'analisi. (A) Un esempio di cella che non è appropriata per l'analisi. Barra di scala, 20 μm. (B) L'analisi kymografica di questa cella mostra, specialmente in ri-slice 1,3,5,7, nessuna chiara sporgenza. In questo caso, la cellula ha finito di diffondersi ma non ha ancora iniziato a muoversi, e quindi non si possono osservare molte sporgenze di membrana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato supplementare 1. MEF è stato placcato su una parabola con fondo di vetro rivestito di fibronectina e ripreso utilizzando la microscopia video a contrasto di fase time-lapse per 10 minuti utilizzando un obiettivo a secco 40x / 1,4 NA. Il tempo è indicato in secondi. Barra della scala, 10 μm. Clicca qui per scaricare questo film.
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Discussion
La dinamica di protrusione del bordo cellulare, composta da protrusioni, retrazioni e volant, è sia un prerequisito che un potenziale evento limitante la velocità nella motilità cellulare. Qui descriviamo un metodo rapido e semplice per misurare la dinamica delle sporgenze del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo consente l'imaging a breve termine, genera una quantità significativa di dati, non richiede l'etichettatura fluorescente delle cellule o costose apparecchiature di microscopia fluorescente e potrebbe essere utilizzato come metodo preliminare per testare le dinamiche citoscheletriche coinvolte nella motilità cellulare prima di decidere di eseguire metodi più esigenti in termini di risorse. Inoltre, si possono utilizzare cellule knockout o knockdown e / o mutanti proteici in questo test come strumento rapido e semplice per identificare proteine critiche e potenziali meccanismi di segnalazione coinvolti nella dinamica citoscheletrica.
Da notare, è importante scegliere le celle corrette per l'analisi della protrusione. Le cellule vengono incubate per 15 minuti prima che i film vengano acquisiti per consentire la diffusione. Se si decide di misurare la protrusione durante la diffusione (invece di misurare le sporgenze durante la migrazione), allora solo le cellule che si trovano nella loro fase di diffusione durante l'acquisizione del filmato dovrebbero essere visualizzate. Le cellule che non hanno iniziato a diffondersi non sono appropriate per l'analisi della chimografia. Anche le cellule che hanno completato la loro fase di diffusione ma non hanno iniziato a muoversi (Figura 4) non saranno appropriate per l'analisi. Il movimento del loro nucleo può distinguere queste cellule: durante la diffusione, il nucleo è stazionario, mentre durante la migrazione cellulare, il nucleo è dinamico e si localizza sul lato posteriore della cellula per costruire un asse bordo-centrosoma-nucleo verso la direzione della migrazione. Un altro problema comune nelle fasi successive dell'imaging è una situazione in cui le cellule si toccano. Tali filmati dovrebbero essere esclusi dall'analisi, poiché le interazioni e i segnali provenienti dalle cellule vicine possono interferire con le dinamiche di protrusione del bordo cellulare.
In questo manoscritto, descriviamo l'analisi della dinamica di protrusione del bordo cellulare utilizzando la microscopia a luce a contrasto di fase. Questo metodo può essere ampliato per misurare la dinamica dei componenti intracellulari anche con la microscopia a fluorescenza. Tale uso comune della chimografia fluorescente è spesso descritto per misurare la dinamica delle strutture citoscheletriche all'interno delle cellule. Ad esempio, Dogget e Breslin hanno utilizzato la kymografia delle cellule HUVEC trasfettate con GFP-actina per analizzare la dinamica e il turnover delle fibre di stress dell'actina14.
Questo protocollo e molti altri articoli precedenti utilizzavano fibroblasti placcati su fibronectina per il test di protrusione del bordo cellulare e per i saggi di motilità cellulare bidimensionali. I fibroblasti sono comunemente usati per i saggi di motilità e altri saggi correlati come il test dinamico della protrusione del bordo cellulare perché sono mesenchimali e mobili e hanno strutture citoscheletriche chiare come lamellipodia, filopodia e aderenze focali. Sebbene non descriviamo il test per altri tipi di cellule e substrati, questo metodo potrebbe essere facilmente modificato. Ad esempio, nella prima documentazione del test della dinamica delle lamelle, che noi e altri abbiamo modificato per diventare il test della dinamica della protrusione del bordo cellulare11, gli autori hanno utilizzato cheratinociti stimolati a migrare dall'EGF in un test di graffio, dimostrando che altri tipi di cellule e altre stimolazioni potrebbero essere applicati a questo test. Inoltre, sebbene descriviamo la misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione cellulare, lo stesso metodo potrebbe essere utilizzato misurando la dinamica delle protrusioni durante la migrazione delle cellule, come dimostrato, ad esempio, in Bear et al.12 e Hinz et al.11.
In effetti, diversi laboratori hanno utilizzato questo test sui MEF per chiarire le dinamiche citoscheletriche e i meccanismi di segnalazione in passato. Ad esempio, Miller et al. avevano precedentemente utilizzato il test di protrusione per dimostrare che Abl2 / Arg media il contatto tra actina e microtubuli sul bordo cellulare15. Bryce et al. hanno dimostrato utilizzando il test che le cellule knockdown della cortactina hanno una motilità cellulare compromessa che co-dentro con la compromissione della persistenza delle protrusioni lamellipodiali. Questo difetto deriva da una compromissione nell'assemblaggio di nuove aderenze nelle protrusioni16. Lapetina et al. hanno utilizzato il test di protrusione del bordo cellulare in cellule knockout abl2 / Arg knockout e cortactin knockdown salvate con mutanti delle due proteine per chiarire un meccanismo di regolazione mediato da Abl2 / Arg protrusioni del bordo cellulare17. Utilizzando lo stesso test, Miller et al. hanno anche dimostrato che Arg regola la polimerizzazione dell'actina mediata da N-WASP e la conseguente dinamica di protrusione del bordo cellulare18. Recentemente abbiamo utilizzato il test di protrusione del bordo cellulare per dimostrare che la tirosin-chinasi pyk2 non recettore regola la dinamica delle protrusioni e la successiva migrazione cellulare attraverso interazioni dirette e indirette con la proteina adattatrice CrkII. In questo articolo, abbiamo usato Pyk2-WT e Pyk2-/- e Crk-WT e knockdown MEF, mutanti di salvataggio ed esperimenti di epistasi per chiarire le interazioni molecolari e la gerarchia di segnalazione tra le due proteine durante la protrusione del bordo cellulare. Questo nuovo meccanismo di regolazione complesso consente di mettere a punto la dinamica di protrusione del bordo cellulare e la conseguente migrazione cellulare da un lato insieme a una stretta regolazione sulla motilità cellulare dall'altro19. Utilizzando il test di protrusione del bordo cellulare, i documenti di cui sopra e altri che sono seguiti hanno aumentato significativamente la nostra conoscenza dei meccanismi di regolazione delle protrusioni del bordo cellulare in particolare e della migrazione cellulare in generale.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (ad Anthony J. Koleske) e dalla Israel Science Foundation (sovvenzioni numero 1462/17 e 2142/21) (a Hava Gil-Henn).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
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