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Biology

लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशन डायनेमिक्स को मापना

Published: November 1, 2021 doi: 10.3791/63157
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Neuroscience, Yale University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कोशिकाओं को फैलाने के किनारे पर प्रोट्रूशन के गतिशील मापदंडों (प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन, रफल्स) को मापना है।

Abstract

बहुकोशिकीय जीवों का विकास और होमोस्टैसिस कोशिका प्रवास के समन्वित विनियमन पर निर्भर करता है। कोशिका प्रवास ऊतकों के निर्माण और उत्थान में एक आवश्यक घटना है, और भ्रूण विकास, प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं और घाव भरने में महत्वपूर्ण है। कोशिका गतिशीलता की विकृति रोग संबंधी विकारों में योगदान देती है, जैसे कि पुरानी सूजन और कैंसर मेटास्टेसिस। सेल माइग्रेशन, ऊतक आक्रमण, अक्षतंतु, और डेंड्राइट आउटग्रोथ सभी एक्टिन पोलीमराइजेशन-मध्यस्थता सेल-एज प्रोट्रूशन के साथ शुरू करते हैं। यहां, हम प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता के इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सरल, कुशल, समय-बचत विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि सेल-एज झिल्ली गतिशीलता की असतत विशेषताओं को मापती है, जैसे कि प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन और रफल्स, और रफल्स, और इसका उपयोग यह आकलन करने के लिए किया जा सकता है कि प्रमुख एक्टिन नियामकों के जोड़तोड़ विभिन्न संदर्भों में सेल-एज प्रोट्रूशन को कैसे प्रभावित करते हैं।

Introduction

सेल माइग्रेशन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो सभी जीवित जीवों के विकास और कार्य को नियंत्रित करती है। सेल माइग्रेशन दोनों शारीरिक स्थितियों में होता है, जैसे कि भ्रूणजनन, घाव भरने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और रोग संबंधी स्थितियों में, जैसे कि कैंसर मेटास्टेसिस और ऑटोइम्यून रोग। विभिन्न प्रवासी घटनाओं में भाग लेने वाले सेल प्रकारों में अंतर के बावजूद, सभी सेल गतिशीलता घटनाएं समान आणविक तंत्र साझा करती हैं, जिन्हें प्रोटोजोआ से स्तनधारियों तक विकास में संरक्षित किया गया है, और इसमें आम साइटोस्केलेटल नियंत्रण तंत्र शामिल हैं जो पर्यावरण को समझ सकते हैं, संकेतों का जवाब दे सकते हैं, और प्रतिक्रिया में सेल व्यवहार को संशोधित कर सकते हैं1।

सेल माइग्रेशन में एक प्रारंभिक चरण सेल के अग्रणी किनारे पर अत्यधिक गतिशील प्रोट्रूशन का गठन हो सकता है। लैमेलिपोडियम के पीछे एक लामेला पा सकता है, जो मायोसिन द्वितीय-मध्यस्थता संकुचन के लिए एक्टिन जोड़ता है और अंतर्निहित सब्सट्रेट के लिए आसंजन की मध्यस्थता करता है। लैमेलिपोडिया विकास कारकों, साइटोकिन्स और सेल आसंजन रिसेप्टर्स जैसे बाहरी उत्तेजनाओं से प्रेरित होते हैं और एक्टिन पोलीमराइजेशन द्वारा संचालित होते हैं, जो भौतिक बल प्रदान करता है जो प्लाज्मा झिल्ली को आगे बढ़ाता है2,3। कई सिग्नलिंग और संरचनात्मक प्रोटीन इसमें शामिल किए गए हैं; उनमें से Rho GTPases हैं, जो अन्य संकेतों के साथ समन्वय से कार्य करते हैं ताकि एक्टिन-विनियमित प्रोटीन को सक्रिय किया जा सके जैसे कि Arp 2/3 कॉम्प्लेक्स, WASP परिवार के प्रोटीन, और लैमेलिपोडिया 2,4,5 में फॉर्मिन और स्पीयर परिवारों के सदस्य।

एक्टिन पोलीमराइजेशन के अलावा, मायोसिन II गतिविधि लैमेलिपोडियम और पूर्वकाल लामेला में संकुचनशील बलों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। ये संकुचन, जिसे सेल-एज रिट्रेक्शन के रूप में भी परिभाषित किया गया है, सेल परिधि पर डेंड्राइटिक एक्टिन के डीपोलीमराइजेशन के परिणामस्वरूप भी हो सकता है और लैमेलिपोडियल अग्रणी किनारे को विकसित करने और प्रोट्रूशन को बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स और अन्य कोशिकाओं के लचीलेपन को समझने और माइग्रेशन की दिशा निर्धारित करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। . सेल एज प्रोट्रूशन जो सब्सट्रेट से संलग्न नहीं हो सकते हैं, परिधीय झिल्ली रफल्स, शीट जैसी संरचनाएं बनाएंगे जो लैमेलिपोडिया और लामेला की वेंट्रल सतह पर दिखाई देते हैं और माइग्रेशन की दिशा के सापेक्ष पीछे की ओर बढ़ते हैं। जैसा कि लैमेलिपोडियम सब्सट्रेट से जुड़ने में विफल रहता है, एक पीछे का लैमेलिपोडियम इसके नीचे बनता है और यांत्रिक रूप से पहले लैमेलिपोडियम को ऊपरी वेंट्रल सतह की ओर धकेलता है। रफल में एक्टिन फिलामेंट्स जो पहले सब्सट्रेट के समानांतर थे, अब इसके लंबवत हो जाते हैं, और रफल अब आगे बढ़ने वाले लैमेलिपोडियम के ऊपर स्थित है। रफ़ल जो पीछे की ओर चलता है, साइटोसोल में वापस आ जाता है और लैमेलिपोडियल एक्टिन 9,10 रीसाइक्लिंग के लिए एक सेलुलर तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है।

यहां, हम सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता के माप के लिए एक परख का वर्णन करते हैं। फलाव परख सेल के प्रसार चरण के दौरान 10 मिनट के लिए एकल सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता को मापने के लिए समय-चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है। इन फिल्मों से kymographs उत्पन्न करके फलाव गतिशीलता का विश्लेषण किया जाता है। सिद्धांत रूप में, एक kymograph सेल किनारे गतिशीलता की एक गुणात्मक समझ उपज करने के लिए एक spatiotemporal साजिश में चलती कणों का विस्तृत मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है। चलती कण की तीव्रता को एक समय बनाम अंतरिक्ष प्लॉट में सभी छवि स्टैक के लिए प्लॉट किया जाता है, जहां एक्स-अक्ष और वाई-अक्ष क्रमशः समय और दूरी का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह विधि विस्तृत मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए ImageJ के साथ एक मैनुअल काइमोग्राफ विश्लेषण का उपयोग करती है, जिससे कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और / या उच्च सुविधा घनत्व के मामले में फिल्मों और छवियों से जानकारी प्राप्त करने में सक्षम होता है, और चरण-विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोपी या खराब छवि गुणवत्ता में प्राप्त छवियों का विश्लेषण होता है।

सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता परख यहाँ वर्णित एक तेज, सरल, और लागत प्रभावी विधि है। जैसे, और क्योंकि इसे सीधे सेल माइग्रेशन 11,12 के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है, इसका उपयोग अधिक संसाधन-मांग वाले तरीकों को करने का निर्णय लेने से पहले सेल गतिशीलता में शामिल साइटोस्केलेटल गतिशीलता के परीक्षण के लिए एक प्रारंभिक विधि के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, यह साइटोस्केलेटल प्रोटीन के आनुवंशिक जोड़तोड़ (नॉकआउट, नॉकडाउन, या बचाव निर्माण) के मात्रात्मक माप को भी सक्षम बनाता है, जो एक सरल मंच का उपयोग करके साइटोस्केलेटल गतिशीलता को प्रभावित करता है। परख सेल माइग्रेशन के संदर्भ में साइटोस्केलेटल गतिशीलता की खोज के लिए एक शिक्षाप्रद मॉडल है और इसका उपयोग कोशिका गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र और अणुओं के स्पष्टीकरण के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों को बार-इलन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

नोट:: इस खंड में वर्णित कार्यविधि का चरण-दर-चरण ग्राफ़िकल चित्रण चित्र 1 में प्रकट होता है.

1. सेल संस्कृति

नोट: प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) हैं जो जंगली प्रकार के C57BL /6 चूहों के E11.5-13.5 भ्रूण से उत्पन्न हुई थीं। प्राथमिक एमईएफ जैक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल 13 के अनुसार उत्पन्न किए गए थे। पांच अलग-अलग भ्रूणों से कोशिकाओं को एक साथ पूल किया गया था और एक रेट्रोवायरल वेक्टर के साथ संक्रमण से अमर कर दिया गया था, जो SV40 बड़े टी एंटीजन को व्यक्त करता है, जिसके बाद 3 सप्ताह के लिए 4 mM हिस्टिडिनोल के साथ चयन किया जाता है।

  1. ड्यूलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) युक्त ऊतक संस्कृति प्लेटों में संस्कृति कोशिकाएं जिसमें 1 ग्राम / एल ग्लूकोज, 1% ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में।
  2. कोशिकाओं को 90% -95% तक संस्कृति दें और हर 2-3 दिनों में 1: 5 के अनुपात में विभाजित करें।

2. ग्लास नीचे पकवान कोटिंग

नोट: ग्लास-बॉटम डिश कोटिंग को बाँझ स्थितियों में ऊतक संस्कृति हुड में किया जाना चाहिए।

  1. एक ग्लास-बॉटम डिश (सामग्री की तालिका) के केंद्र में 1N HCl समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट:: यह चरण कांच से अवशेषों को हटाने के लिए है जो बाद में इमेजिंग को बाधित कर सकता है।
  2. ग्लास-बॉटम डिश को 1x पीबीएस (सामग्री की तालिका) के 2 एमएल के साथ तीन बार धोएं।
  3. फाइब्रोनेक्टिन को पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें) 1x PBS में 10 μg / mL करने के लिए। डिश के कांच के केंद्र में पतला फाइब्रोनेक्टिन समाधान का 200 μL जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर) पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ग्लास-बॉटम डिश को एक सपाट सतह पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट किया जा सकता है।
  4. फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग इनक्यूबेशन समय के दौरान, 1x PBS में 1% BSA (सामग्री की तालिका) समाधान तैयार करें, 0.2 μm के माध्यम से फ़िल्टर करें, और एक पूर्व-गर्म पानी-स्नान में 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा denature।
  5. लेपित ग्लास-बॉटम डिश को 1x पीबीएस प्रत्येक के 2 एमएल के साथ तीन बार धोएं।
  6. कांच के केंद्र में विकृत बीएसए समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस (ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर) पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ग्लास-बॉटम डिश को एक सपाट सतह पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट किया जा सकता है।
  7. ग्लास-बॉटम डिश को 1x पीबीएस प्रत्येक के 2 एमएल के साथ 3 बार धोएं।
    नोट: फाइब्रोनेक्टिन के साथ ग्लास-बॉटम व्यंजनों का इनक्यूबेशन सतह को ठीक से कोट करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए किया जाना चाहिए। कम इनक्यूबेशन समय उचित कोटिंग का उत्पादन नहीं कर सकता है, और परिणामस्वरूप, सेल फेनोटाइप इंटीग्रिन सक्रियण से संबंधित नहीं हो सकता है। बीएसए परत निष्क्रिय है और फलाव गतिशीलता को प्रभावित नहीं करेगी और इंटीग्रिन-स्वतंत्र सेल आसंजन के लिए मुक्त संभावित साइटों को अवरुद्ध करने के लिए है। बीएसए को कोटिंग से पहले विकृत किया जाना चाहिए ताकि इसे सेल एपोप्टोसिस को प्रेरित करने से रोका जा सके, जो सेल-एज गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है।

3. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. प्रयोग से सोलह से अठारह घंटे पहले, अगले दिन 70% -80% संगम तक पहुंचने के लिए कोशिकाओं को प्लेट करें। एमईएफ के लिए, प्रयोग करने से एक दिन पहले प्लेट 0.7 x 106 कोशिकाएं प्रति 10 सेमी व्यास ऊतक संस्कृति प्लेट।
    नोट: एक सफल फलाव प्रयोग के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को उनके लॉगरिदमिक विकास चरण के दौरान उपयोग किया जाएगा। इसे प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को प्रयोग के दिन 70% -80% संगम तक पहुंचना चाहिए। कोशिकाओं के उच्च घनत्व के परिणामस्वरूप प्रयोग के दौरान अनुलग्नक में लंबे समय तक फैलने का समय और / या बाधा होगी।
  2. प्रयोग के दिन, प्रति 10 सेमी व्यास ऊतक संस्कृति प्लेट में ट्रिप्सिन समाधान (सामग्री की तालिका) के 2 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं के अलग होने तक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पूर्ण माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें।
  3. ऊपर के रूप में लेपित ग्लास-बॉटम डिश पर पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर में हेमोसाइटोमीटर और प्लेट 20,000 कोशिकाओं का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें (खंड 2)।
    नोट:: चढ़ाना के लिए कक्षों की संख्या आकार और कक्षों के प्रकार पर निर्भर करता है। बड़े या अधिक प्रसार कोशिकाओं के लिए, इमेजिंग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए केवल 10,000 कोशिकाओं को प्लेट करें। एकल कोशिकाओं को चुनना महत्वपूर्ण है जो सेल-टू-सेल संपर्क के रूप में स्पर्श नहीं करते हैं, सेल-आंतरिक प्रसार व्यवहार को बदल सकते हैं।
  4. 15 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में मढ़वाया कोशिकाओं के साथ ग्लास-बॉटम व्यंजनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस चरण के दौरान, कोशिकाएं फाइब्रोनेक्टिन सब्सट्रेट का पालन करती हैं और उस पर फैल जाती हैं। सेल के प्रसार के दौरान प्रोट्रूशन को मापते समय, कोशिकाओं को चढ़ाना के बाद और इमेजिंग से पहले 15 मिनट तक फैलने की अनुमति दी जानी चाहिए। इमेजिंग को चढ़ाना के बाद 15 मिनट से ~ 1 घंटे के बीच एक समय विंडो के भीतर किया जा सकता है, और किसी भी मामले में, कोशिकाओं को माइग्रेट करना शुरू करने से पहले।

4. माइक्रोस्कोप सेटअप और इमेजिंग

नोट: विभिन्न लाइव सेल माइक्रोस्कोपी सिस्टम उपलब्ध हैं। यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली एक Leica AF6000 उल्टे माइक्रोस्कोप है जो CO2 और हीटिंग इकाइयों से सुसज्जित है और एक ORCA-Flash 4.0 V2 डिजिटल CMOS कैमरे से जुड़ी हुई है।

  1. इमेजिंग से कम से कम 1 घंटे पहले हीटिंग यूनिट को चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. इमेजिंग से कम से कम 10 मिनट पहले CO2 इकाई को चालू करें और इसे 5% CO2 पर सेट करें।
  3. माइक्रोस्कोप, कैमरा और कंप्यूटर पर स्विच करें.
  4. माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। कैप्चर की गई छवियों को सहेजने के लिए फ़ोल्डर चुनें और फ़ाइल नाम लिखें. प्रत्येक चलचित्र को एक नई फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  5. एक 40x शुष्क लेंस, चरण-विपरीत पर आवर्धन सेट करें। 5 s पर समय अंतराल सेट करें, कुल फिल्म अवधि 10 मिनट।
  6. मढ़वाया कोशिकाओं के इनक्यूबेशन 15 मिनट के बाद, एडेप्टर में चिपके हुए कोशिकाओं के साथ ग्लास-बॉटम डिश को रखें और इसे ठीक करें। डिश के साथ एडाप्टर को माइक्रोस्कोप चरण में इसके स्लॉट में डालें।
  7. डिश कवर को बंद कर दें और इसके बजाय सीओ 2 ढक्कन रखें। CO2 वाल्व खोलें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि CO2 कवर ग्लास-बॉटम डिश के शीर्ष पर रखने से पहले साफ है। एक गंदे कवर से फिल्मों की गुणवत्ता कम हो जाएगी। धूल और गंदगी को हटाने के लिए 70% इथेनॉल के साथ भिगोए गए लिंट-फ्री वाइप के साथ सीओ 2 ढक्कन के नीचे की ओर पोंछें। एक सूखी लिंट-मुक्त पोंछे के साथ दूसरी बार पोंछें।
  8. कक्षों को देखें और इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त कक्ष ढूँढें. सुनिश्चित करें कि सेल फोकस में है और मूवी अधिग्रहण शुरू करें।

5. छवि विश्लेषण

नोट:: छवि विश्लेषण निम्न के रूप में ImageJ (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर किया जाता है:

  1. ImageJ में अधिग्रहित चलचित्र खोलें।
  2. मुख्य उपकरण पट्टी में सीधे उपकरण का उपयोग करते हुए, 20 मनमाने ढंग से इकाइयों की आठ लाइनें बनाएं, जिनमें से प्रत्येक फलाव के लिए लंबवत है, जिसमें लामेला और सेल किनारे भी शामिल हैं, हर 45 डिग्री में रेडियल व्यवस्था में, जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाया गया है।
  3. मुख्य उपकरण पट्टी में, छवि > स्टैक > Reslice पर जाएँ. यह एक काइमोग्राफ चित्र उत्पन्न करेगा, जो कोशिका झिल्ली के भीतर एकल बिंदुओं के आंदोलन का वर्णन करता है (चित्रा 2 बी)। यह क्रिया आठ लाइनों में से प्रत्येक पंक्ति के लिए अलग-अलग की जानी चाहिए।
  4. निकालें और मैन्युअल रूप से संबंधित kymograph छवियों से गिनती सेल में आठ क्षेत्रों में से प्रत्येक में protrusions, retractions, और ruffles की संख्या, ग्रिड लाइनों द्वारा चिह्नित. ये संख्याएं प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन और रफल्स प्रति 10 मिनट (चित्रा 2 सी, डी) की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करती हैं।
    नोट: रफल्स को चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी में उनकी अंधेरे उपस्थिति और उनके सेंट्रिपेटल आंदोलन के आधार पर अन्य संरचनाओं से अलग किया जा सकता है, जो सेल किनारे से शुरू होता है और सेल बॉडी की सीमा पर समाप्त होता है, जिसे अधिग्रहित फिल्मों में देखा जा सकता है। ध्यान दें, जब फलाव, पीछे हटने, और रफल आवृत्ति को परिमाणित करते हैं, तो फिल्मों को परिमाणीकरण के लिए एक नियंत्रण के रूप में और विशेष रूप से रफल्स को परिभाषित करने के लिए मनाया जाना चाहिए।
  5. kymography विश्लेषण द्वारा फलाव दृढ़ता, दूरी, और वेग निर्धारित करें। उत्पन्न kymographs में से प्रत्येक के लिए, X-अक्ष दूरी का प्रतिनिधित्व करता है, और Y-अक्ष समय का प्रतिनिधित्व करता है।
  6. फलाव दूरी को मापने के लिए, चरण 5.6.1-5.6.2 का पालन करें।
    1. फलाव के आधार से फलाव के उच्चतम शिखर तक एक लंबवत रेखा खींचें। पिक्सेल में रेखा की लंबाई को मापने के लिए ImageJ में M दबाएँ.
    2. पिक्सेल से μm तक लंबाई को परिवर्तित करने के लिए, सुनिश्चित करें कि पिक्सेल से μm अनुपात ज्ञात है।
      नोट: पिक्सेल अनुपात के लिए μm सीसीडी कैमरा / कुल आवर्धन पर एक पिक्सेल की भौतिक लंबाई है। पिक्सेल का आकार प्रत्येक प्रकार के कैमरे की विशेषता है। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कैमरे के लिए, पिक्सेल का आकार 6.5 μm x 6.5 μm है, भौतिक लंबाई 6.5 μm है और हमारे द्वारा उपयोग किया जाने वाला आवर्धन 40x है। इसलिए, हमारे कैमरे का पिक्सेल अनुपात μm 0.1625 μm / पिक्सेल है। विश्लेषण में, 30 पिक्सेल की लंबाई में एक रेखा के लिए, फलाव दूरी 30 पिक्सेल x 0.1625 μm / पिक्सेल = 4.875 μm (चित्रा 3) होगी।
  7. फलाव समय को मापने के लिए (दृढ़ता; एक फलाव वापस लेने से पहले एक फलाव खर्च करने वाले समय की मात्रा), चरणों का पालन करें 5.7.1-5.7.2।
    1. उच्चतम शिखर के क्षेत्र के लिए फलाव (बाएं से दाएं) की शुरुआत से एक क्षैतिज रेखा खींचें। पिक्सेल में रेखा की लंबाई को मापने के लिए ImageJ में M दबाएँ.
    2. लंबाई को पिक्सेल से मिनट में कनवर्ट करने के लिए, पिक्सेल को न्यूनतम अनुपात में परिकलित करें. यह मान छवियों के बीच अंतराल पर निर्भर करता है।
      नोट:: इस उदाहरण में, छवियों के बीच का अंतराल 5 s है, न्यूनतम/पिक्सेल अनुपात 0.0833 है, और क्षैतिज रेखा लंबाई 8 पिक्सेल है। इसलिए, फलाव समय 8 पिक्सेल x 0.0833 मिनट / पिक्सेल = 0.6664 मिनट है।
  8. मापने और इसी तरह एक रेखा के लिए प्रोट्रूशन समय की गणना करें जो फलाव के आधार पर क्षैतिज रूप से खींची गई रेखा के लिए है जहां से फलाव का शिखर दाईं ओर इसके आधार पर है ( चित्र 3 में रेखा X2)।
  9. फलाव समय द्वारा फलाव दूरी को विभाजित करके फलाव वेग की गणना करें। रिट्रूशन समय द्वारा फलाव दूरी को विभाजित करके पीछे हटने के वेग की गणना करें। इस उदाहरण में, फलाव वेग की गणना 4.875 μm/0.6664 min = 7.315 μm/min. के रूप में की जाती है, और पीछे हटने का वेग समान है क्योंकि समय का प्रतिनिधित्व करने वाली रेखा समान लंबाई पर है।
    नोट: विभिन्न सेल प्रकारों की तुलना में, यानी, एक ही प्रोटीन के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती निर्माणों को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं, एक अंधा विश्लेषण करना अनिवार्य है, इसलिए कोई पूर्वाग्रह पेश नहीं किया जाता है।

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Representative Results

चित्रा 2 में वर्णित प्रयोग में, अमर एमईएफ को कांच-नीचे के व्यंजनों पर चढ़ाया गया था, जो फाइब्रोनेक्टिन के साथ पूर्व-लेपित थे, ताकि इंटीग्रिन-मध्यस्थता सिग्नलिंग को सक्रिय किया जा सके, जो विकृत बीएसए द्वारा अवरुद्ध किया गया था, सेल आसंजन के लिए मुक्त संभावित साइटों को अवरुद्ध करने के लिए जो इंटीग्रिन सक्रियण पर निर्भर नहीं है। प्रयोग के दिन कोशिकाओं के 70% -80% संगम पर लॉगरिदमिक विकास चरण तक पहुंचने के लिए, 0.7 x 106 एमईएफ को प्रयोग से पहले 10 सेमी व्यास के ऊतक संस्कृति प्लेट में 16 घंटे में मढ़वाया गया था। प्रयोग के दिन, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ और गिनती की गई थी, और 20,000 कोशिकाओं को फाइब्रोनेक्टिन / बीएसए-लेपित ग्लास-बॉटम डिश पर चढ़ाया गया था। डिश को इमेजिंग से पहले कोशिकाओं के अनुलग्नक और प्रसार की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। इनक्यूबेशन बाद, प्लेट को एक माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर कक्ष (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में रखा गया था, और एकल कोशिकाओं को चरण प्रकाश में 40x सूखे लेंस का उपयोग करके चित्रित किया गया था। कोशिकाओं के माइग्रेट होने से पहले चढ़ाना के बाद इमेजिंग 15 मिनट से 1 घंटे के बीच की गई थी। छवियों को 10 मिनट के लिए हर 5 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था, जिसने प्रति सेल 121 छवियों (पूरक मूवी 1) को प्राप्त किया था।

छवि विश्लेषण ImageJ का उपयोग कर किया गया था। मुख्य टूलबार में सीधे उपकरण का उपयोग करते हुए, सभी कोशिकाओं में हर 45 डिग्री पर एक ही स्थान पर रेडियल ग्रिड पर 20 मनमाने ढंग से इकाई-लंबी सीधी रेखाएं बनाई गई थीं (चित्रा 2 ए)। एक kymograph उत्पन्न करने के लिए, हम स्टैक > Reslice आदेश है, जो एक kymograph सेल झिल्ली (चित्रा 2B-D) के भीतर एकल अंक के आंदोलन का वर्णन चित्र उपज > स्टैक का उपयोग किया. कोशिकाओं में आठ क्षेत्रों में से प्रत्येक में फिल्म के 10 मिनट के दौरान गठित प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन और रफल्स की संख्या, जो ग्रिड लाइनों द्वारा चिह्नित हैं, को निकाला गया था, मैन्युअल रूप से संबंधित काइमोग्राफ छवियों से गिना गया था, और प्रति 10 मिनट में प्रोट्रूशन / रिट्रेक्शन / रफल्स आवृत्तियों के रूप में एक ग्राफ में प्लॉट किया गया था। प्राप्त औसत आवृत्तियों protrusions और retractions के लिए 5.1/10 मिनट और ruffles के लिए 2.1/10 मिनट थे (चित्रा 2E).

फलाव दूरी, फलाव समय, पीछे हटने का समय, फलाव और पीछे हटने वेग उत्पन्न kymographs से गणना की गई थी। चित्र 3 में प्रतिनिधि काइमोग्राफ में, फलाव की दूरी 30 पिक्सेल x 0.1625 μm/पिक्सेल = 4.875 μm थी, फलाव का समय 8 पिक्सेल x 0.0833 मिनट/पिक्सेल = 0.6664 मिनट था, पीछे हटने का समय 8 पिक्सेल x 0.0833 मिनट/ पिक्सेल = 0.6664 मिनट था। फलाव और पीछे हटने के वेग की गणना 4.875 μm/0.6664 min = 7.315 μm/min के रूप में की गई थी।

सेल-एज प्रोट्रूशन को मापते समय, उन कोशिकाओं को चुनना महत्वपूर्ण है जो उनके प्रसार चरण में हैं। विश्लेषण के लिए एक उचित सेल का एक उदाहरण चित्र 2A और अनुपूरक मूवी 1 में दिखाई देता है। kymography विश्लेषण के बाद, इस प्रयोग में protrusions, retractions, और ruffles को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। एक जंगली-प्रकार के फाइब्रोब्लास्ट का एक उदाहरण जो विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है , चित्र 4 में दिखाया गया है। Kymography विश्लेषण के बाद, लाइनों (स्लाइस) 1, 3, 5, 7 में, उदाहरण के लिए, स्पष्ट protrusions प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। इस मामले में, सेल फैलना समाप्त हो गया लेकिन अभी तक आगे बढ़ना शुरू नहीं हुआ, और इसलिए कई झिल्ली आंदोलनों को नहीं देखा जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: फलाव परख के प्रयोगात्मक चरणों. (A) कांच के नीचे की डिश में 20 मिनट के लिए एक 1N HCl घोल जोड़ा जाता है। (B) PBS में धोने के बाद, डिश के कांच के हिस्से में 10 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन घोल जोड़ा जाता है और 37 °C पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। (C) डिश ग्लास बॉटम को 1% विकृत BSA में 37 °C पर 1 h के लिए इनक्यूबेशन द्वारा अवरुद्ध किया जाता है। (D) 70% की एक ऊतक संस्कृति प्लेट (D) 70% -80% confluent fibroblasts की एक ऊतक संस्कृति प्लेट है। 20,000 कोशिकाओं को ग्लास-बॉटम डिश में चढ़ाया जाता है और (एफ) कोशिकाओं को फैलने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। (जी) प्लेट को 5% CO2 में 37 °C के साथ एक माइक्रोस्कोप आर्द्र कक्ष में रखा जाता है, और लाइव इमेजिंग को फेज-कंट्रास्ट लाइट माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है। (एच) सेल फिल्मों और छवियों को छवि जे द्वारा kymography विश्लेषण के अधीन किया जाता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फलाव परख छवि विश्लेषण. (ए) 10 मिनट के दौरान परिमाणीकरण के लिए आठ झिल्ली क्रॉस-सेक्शन के साथ इमेजजे में एमईएफ की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार, 20 μm. (B) छवि J. (C) में एक kymograph की पीढ़ी क्रॉस-सेक्शन से प्रतिनिधि kymograph जिस पर protrusions, retractions, और ruffles को प्रतिष्ठित किया जा सकता है। (डी) परिणामस्वरूप 10 मिनट के दौरान छवि विश्लेषण के बाद छवि जे में Reslice आदेश का उपयोग कर kymographs. (ई) विश्लेषण की गई फिल्म और कामोग्राफ से प्रति 10 मिनट में प्रोट्रूशियंस, रिट्रेक्शन और रफल्स आवृत्तियों का परिमाणीकरण। प्रति 10 मिनट औसत फलाव आवृत्ति = 5.1, प्रति 10 मिनट औसत वापसी आवृत्ति = 5.125, प्रति 10 मिनट औसत रफल्स आवृत्ति = 2.1। एक फिल्म से आठ kymographs का विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विश्लेषण और फलाव दृढ़ता, दूरी, और वेग का परिमाणीकरण। प्रतिनिधि kymograph में, X-अक्ष मिनट (बाएं से दाएं) में समय का प्रतिनिधित्व करता है, और Y-अक्ष μm में दूरी दिखाता है। X1 फलाव समय (दृढ़ता) का प्रतिनिधित्व करता है, X2 पीछे हटने के समय का प्रतिनिधित्व करता है, और Y फलाव दूरी का प्रतिनिधित्व करता है। फलाव वेग की गणना फलाव दूरी (Y) को फलाव समय (X1) द्वारा विभाजित करके की जाती है। रिट्रेक्शन वेग की गणना प्रोट्रूशन दूरी (वाई) को रिट्रेक्शन समय (एक्स 2) द्वारा विभाजित करके की जाती है। इस उदाहरण में, फलाव दूरी 30 पिक्सेल x 0.1625 μm/pixel = 4.875 μm थी, फलाव समय 8 पिक्सेल x 0.0833 मिनट/पिक्सेल = 0.6664 मिनट था, पीछे हटने का समय 8 पिक्सेल x 0.0833 मिनट / पिक्सेल = 0.6664 मिनट था। प्रोट्रूशन/रिट्रेक्शन वेग की गणना 4.875 μm/0.6664 min. = 7.315 μm/min के रूप में की गई थी। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एक कक्ष का उदाहरण जिसे विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. (ए) एक सेल का एक उदाहरण जो विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है। स्केल बार, 20 μm. (B) इस सेल के kymography विश्लेषण से पता चलता है, विशेष रूप से फिर से स्लाइस 1,3,5,7 में, कोई स्पष्ट प्रोट्रूशन नहीं। इस मामले में, सेल फैलना समाप्त हो गया लेकिन अभी तक आगे बढ़ना शुरू नहीं हुआ, और इसलिए कई झिल्ली प्रोट्रूशन नहीं देखे जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फिल्म 1. एमईएफ को एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित ग्लास-बॉटम डिश पर चढ़ाया गया था और 40x / 1.4 एनए सूखे उद्देश्य का उपयोग करके 10 मिनट के लिए टाइम-लैप्स फेज-कंट्रास्ट वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया गया था। समय सेकंड में इंगित किया जाता है। स्केल बार, 10 μm. इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता, जिसमें प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन और रफल्स शामिल हैं, सेल गतिशीलता में एक शर्त और संभावित दर-सीमित घटना दोनों है। यहां हम प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशियंस की गतिशीलता को मापने के लिए एक तेज और सरल विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि अल्पकालिक इमेजिंग को सक्षम बनाती है, डेटा की एक महत्वपूर्ण मात्रा उत्पन्न करती है, कोशिकाओं या महंगे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी उपकरणों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है, और अधिक संसाधन-मांग वाले तरीकों को करने का निर्णय लेने से पहले सेल गतिशीलता में शामिल साइटोस्केलेटल गतिशीलता के परीक्षण के लिए प्रारंभिक विधि के रूप में उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, एक नॉकआउट या नॉकडाउन कोशिकाओं और / या प्रोटीन उत्परिवर्ती का उपयोग इस परख में एक तेज और सरल उपकरण के रूप में कर सकते हैं ताकि साइटोस्केलेटल गतिशीलता में शामिल महत्वपूर्ण प्रोटीन और संभावित सिग्नलिंग तंत्र की पहचान की जा सके।

ध्यान दें, फलाव विश्लेषण के लिए सही कोशिकाओं का चयन करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को फैलने की अनुमति देने के लिए फिल्मों का अधिग्रहण करने से पहले 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। यदि कोई प्रसार के दौरान फलाव को मापने का फैसला करता है (जैसा कि प्रवास के दौरान प्रोट्रूशियंस को मापने के विपरीत), तो केवल उन कोशिकाओं को चित्रित किया जाना चाहिए जो फिल्म अधिग्रहण के दौरान अपने प्रसार चरण में हैं। जिन कोशिकाओं ने फैलना शुरू नहीं किया था, वे कीमोग्राफी विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं थे। जिन कोशिकाओं ने अपने प्रसार चरण को पूरा किया लेकिन आगे बढ़ना शुरू नहीं किया (चित्रा 4) विश्लेषण के लिए भी उपयुक्त नहीं होगा। उनके नाभिक का आंदोलन इन कोशिकाओं को अलग कर सकता है: प्रसार के दौरान, नाभिक स्थिर होता है, जबकि सेल माइग्रेशन के दौरान, नाभिक गतिशील होता है और सेल के पीछे की ओर स्थानीयकरण करता है ताकि माइग्रेशन की दिशा की ओर एक अग्रणी एज-सेंट्रोसोम-न्यूक्लियस अक्ष का निर्माण किया जा सके। इमेजिंग के बाद के चरणों में एक और आम मुद्दा एक ऐसी स्थिति है जिसमें कोशिकाएं एक-दूसरे को छूती हैं। इस तरह की फिल्मों को विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए, क्योंकि पड़ोसी कोशिकाओं से इंटरैक्शन और सिग्नल सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

इस पांडुलिपि में, हम चरण-विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता के विश्लेषण का वर्णन करते हैं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इंट्रासेल्युलर घटकों की गतिशीलता को मापने के लिए इस विधि का विस्तार किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट कीमोग्राफी के इस तरह के सामान्य उपयोग को अक्सर कोशिकाओं के भीतर साइटोस्केलेटल संरचनाओं की गतिशीलता को मापने के लिए वर्णित किया जाता है। उदाहरण के लिए, Dogget और Breslin ने Actin तनाव फाइबर गतिशीलता और टर्नओवर 14 का विश्लेषण करने के लिए GFP-actin transfected HUVEC कोशिकाओं की kymography का उपयोग किया है।

इस प्रोटोकॉल और कई अन्य पिछले कागजात फाइब्रोब्लास्ट ्स सेल-एज प्रोट्रूशन परख के लिए फाइब्रोनेक्टिन पर मढ़वाया के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो आयामी सेल गतिशीलता assays के लिए इस्तेमाल किया. Fibroblasts आमतौर पर गतिशीलता assays और इस तरह के सेल किनारे फलाव गतिशीलता परख के रूप में अन्य संबंधित assays के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि वे mesenchymal और motile हैं और इस तरह के lamellipodia, filopodia, और फोकल आसंजन के रूप में स्पष्ट साइटोस्केलेटल संरचनाओं है. यद्यपि हम अन्य सेल प्रकार और substrates के लिए परख का वर्णन नहीं करते हैं, इस विधि को आसानी से संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लामेला गतिशीलता परख के पहले प्रलेखन में, जो हम और दूसरों को सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता परख11 बनने के लिए संशोधित किया गया था, लेखकों ने एक खरोंच परख में ईजीएफ द्वारा माइग्रेट करने के लिए प्रेरित केराटिनोसाइट्स का उपयोग किया, यह प्रदर्शित करते हुए कि अन्य सेल प्रकार और अन्य उत्तेजनाओं को इस परख पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, हालांकि हम सेल प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता के माप का वर्णन करते हैं, एक ही विधि का उपयोग कोशिकाओं के प्रवास के दौरान प्रोट्रूशन की गतिशीलता को मापकर किया जा सकता है, जैसा कि दिखाया गया है, उदाहरण के लिए, भालू एट अल.12 और हिंज एट अल.11 में।

दरअसल, कई प्रयोगशालाओं ने अतीत में साइटोस्केलेटल गतिशीलता और सिग्नलिंग तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एमईएफ पर इस परख का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, मिलर एट अल ने पहले फलाव परख का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया था कि Abl2 / Arg सेल-एज 15 पर एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच संपर्क की मध्यस्थता करता है। Bryce एट अल परख है कि cortactin नॉकडाउन कोशिकाओं का उपयोग कर प्रदर्शित किया है बिगड़ा हुआ सेल गतिशीलता जो सह-lamellipodial protrusions की दृढ़ता में हानि के साथ insides है. यह दोष protrusions16 में नए आसंजन की विधानसभा में हानि के परिणामस्वरूप होता है। Lapetina et al. Abl2 / Arg नॉकआउट और cortactin नॉकडाउन कोशिकाओं में सेल-एज प्रोट्रूशन परख का उपयोग दो प्रोटीनों के उत्परिवर्ती के साथ बचाया गया ताकि Abl2 / Arg-मध्यस्थता विनियमन तंत्र सेल-एज protrusions17 को स्पष्ट किया जा सके। एक ही परख का उपयोग करते हुए, मिलर एट अल ने यह भी प्रदर्शित किया है कि Arg एन-WASP-मध्यस्थता एक्टिन पोलीमराइजेशन और परिणामस्वरूप सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता 18 को नियंत्रित करता है। हमने हाल ही में सेल एज प्रोट्रूशन परख का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया है कि गैर-रिसेप्टर टायरोसिन किनेज Pyk2 एडेप्टर प्रोटीन CrkII के साथ प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष इंटरैक्शन के माध्यम से प्रोट्रूशन और बाद के सेल माइग्रेशन की गतिशीलता को नियंत्रित करता है। इस पेपर में, हमने Pyk2-WT और Pyk2-/- और Crk-WT और नॉकडाउन MEF, बचाव उत्परिवर्ती, और एपिस्टेसिस प्रयोगों का उपयोग सेल-एज प्रोट्रूशन के दौरान दो प्रोटीनों के बीच आणविक इंटरैक्शन और सिग्नलिंग पदानुक्रम को स्पष्ट करने के लिए किया है। यह उपन्यास जटिल विनियमन तंत्र सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता और परिणामस्वरूप सेल माइग्रेशन के ठीक-ट्यूनिंग को एक तरफ सेल गतिशीलता पर तंग विनियमन के साथ-साथ दूसरी ओर सेल गतिशीलता पर तंग विनियमन के साथ सक्षम बनाता है। सेल-एज प्रोट्रूशन परख का उपयोग करते हुए, उपरोक्त कागजात और अन्य लोग जो इसके बाद आए थे, उन्होंने विशेष रूप से सेल-एज प्रोट्रूशन के विनियमन तंत्र के हमारे ज्ञान में काफी वृद्धि की है और सामान्य रूप से सेल माइग्रेशन।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को अनुदान NIH MH115939, NS112121, NS105640, और R56MH122449-01A1 (एंथोनी जे कोलेस्के के लिए) और इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 1462/17 और 2142/21) (Hava Gil-Henn के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm cell culture plates Greiner P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Biological Industries, Israel 01-055-1A Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) Biological Industries, Israel 02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries, Israel 04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture Sigma-Aldrich F0895
Glass bottom dishes Cellvis D35-20-1.5-N 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software NIH Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2 Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000 Leica Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution Biological Industries, Israel 03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution Biological Industries, Israel 03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries, Israel 03-052-1A

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References

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जीव विज्ञान अंक 177 सेल माइग्रेशन lamellipodia protrusions retractions ruffles लाइव इमेजिंग kymography
लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशन डायनेमिक्स को मापना
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Lukic, N., Saha, T., Lapetina, S.,… More

Lukic, N., Saha, T., Lapetina, S., Gendler, M., Lehmann, G., Koleske, A. J., Gil-Henn, H. Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy. J. Vis. Exp. (177), e63157, doi:10.3791/63157 (2021).

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