Summary
Ce protocole vise à mesurer les paramètres dynamiques (protubérances, rétractions, volants) des protubérances au bord des cellules étalées.
Abstract
Le développement et l’homéostasie des organismes multicellulaires reposent sur une régulation coordonnée de la migration cellulaire. La migration cellulaire est un événement essentiel dans la construction et la régénération des tissus, et est essentielle au développement embryonnaire, aux réponses immunologiques et à la cicatrisation des plaies. La dérégulation de la motilité cellulaire contribue à des troubles pathologiques, tels que l’inflammation chronique et les métastases cancéreuses. La migration cellulaire, l’invasion tissulaire, l’excroissance de l’axone et de la dendrite commencent toutes par des protubérances de bord cellulaire médiées par la polymérisation de l’actine. Nous décrivons ici une méthode simple, efficace et rapide pour l’imagerie et l’analyse quantitative de la dynamique de la saillie des bords cellulaires pendant l’épandage. Cette méthode mesure les caractéristiques discrètes de la dynamique de la membrane du bord cellulaire, telles que les protubérances, les rétractions et les volants, et peut être utilisée pour évaluer l’impact des manipulations des principaux régulateurs d’actine sur les protubérances du bord cellulaire dans divers contextes.
Introduction
La migration cellulaire est un processus critique qui contrôle le développement et la fonction de tous les organismes vivants. La migration cellulaire se produit à la fois dans des conditions physiologiques, telles que l’embryogenèse, la cicatrisation des plaies et la réponse immunitaire, et dans des conditions pathologiques, telles que les métastases cancéreuses et les maladies auto-immunes. Malgré les différences dans les types de cellules qui participent à différents événements migratoires, tous les événements de motilité cellulaire partagent des mécanismes moléculaires similaires, qui ont été conservés dans l’évolution des protozoaires aux mammifères, et impliquent des mécanismes de contrôle cytosquelettiques communs qui peuvent détecter l’environnement, répondre aux signaux et moduler le comportement cellulaire en réponse1.
Une première étape de la migration cellulaire peut être la formation de protubérances très dynamiques au bord d’attaque de la cellule. Derrière le lamellipodium, on peut trouver la lamelle, qui couple l’actine à la contractilité médiée par la myosine II et médie l’adhésion au substrat sous-jacent. Les lamellipodies sont induites par des stimuli extracellulaires tels que les facteurs de croissance, les cytokines et les récepteurs d’adhésion cellulaire et sont entraînées par la polymérisation de l’actine, qui fournit la force physique qui pousse la membrane plasmique vers l’avant2,3. De nombreuses protéines de signalisation et structurelles ont été impliquées dans cela; parmi eux se trouvent les RHO GTPases, qui agissent en coordination avec d’autres signaux pour activer les protéines régulatrices de l’actine telles que le complexe Arp 2/3, les protéines de la famille WASP et les membres des familles Formin et Spire dans les lamellipodies2,4,5.
En plus de la polymérisation de l’actine, l’activité de la myosine II est nécessaire pour générer des forces contractiles au niveau du lamellipodium et de la lamelle antérieure. Ces contractions, également définies comme des rétractions du bord cellulaire, peuvent également résulter de la dépolymérisation de l’actine dendritique à la périphérie de la cellule et sont essentielles pour développer le bord d’attaque lamellipodial et permettre à la saillie de sentir la flexibilité de la matrice extracellulaire et d’autres cellules et de déterminer la direction de la migration6,7,8 . Les protubérances de bord cellulaire qui ne peuvent pas s’attacher au substrat formeront des volants de membrane périphérique, des structures en forme de feuille qui apparaissent sur la surface ventrale de la lamellipodie et de la lamelle et se déplacent vers l’arrière par rapport à la direction de la migration. Comme le lamellipodium ne parvient pas à se fixer au substrat, un lamellipodium postérieur se forme en dessous et pousse mécaniquement le premier lamellipodium vers la surface ventrale supérieure. Les filaments d’actine dans le volant qui étaient autrefois parallèles au substrat deviennent maintenant perpendiculaires à celui-ci, et le volant est maintenant positionné au-dessus du lamellipodium en progression. Le volant qui recule retombe dans le cytosol et représente un mécanisme cellulaire de recyclage de l’actine lamellipodiale9,10.
Ici, nous décrivons un test pour la mesure de la dynamique de la saillie des bords cellulaires. Le test de saillie utilise la microscopie vidéo time-lapse pour mesurer la dynamique de la protrusion d’une seule cellule pendant 10 minutes pendant la phase d’étalement de la cellule. La dynamique de la saillie est analysée en générant des kymographes à partir de ces films. En principe, un kymographe fournit des données quantitatives détaillées sur les particules en mouvement dans un diagramme spatio-temporel pour donner une compréhension qualitative de la dynamique des bords cellulaires. L’intensité de la particule en mouvement est tracée pour toutes les piles d’images dans un diagramme temporel par rapport à l’espace, où l’axe X et l’axe Y représentent respectivement le temps et la distance11. Cette méthode utilise une analyse kymographique manuelle avec ImageJ pour obtenir des données quantitatives détaillées, permettant de récupérer des informations à partir de films et d’images en cas de faible rapport signal/bruit et/ou de densité de caractéristiques élevée, et l’analyse d’images acquises en microscopie optique à contraste de phase ou en mauvaise qualité d’image.
Le test de dynamique de la saillie du bord cellulaire décrit ici est une méthode rapide, simple et rentable. En tant que tel, et parce qu’il a été démontré qu’il est directement corrélé avec la migration cellulaire11,12, il peut être utilisé comme méthode préliminaire pour tester la dynamique du cytosquelette impliquée dans la motilité cellulaire avant de décider d’effectuer des méthodes plus exigeantes en ressources. En outre, il permet également de mesurer quantitativement l’impact des manipulations génétiques (knockout, knockdown ou rescue) des protéines cytosquelettiques sur la dynamique du cytosquelette à l’aide d’une plate-forme simple. Le test est un modèle instructif pour explorer la dynamique du cytosquelette dans le contexte de la migration cellulaire et pourrait être utilisé pour élucider les mécanismes et les molécules sous-jacents à la motilité cellulaire.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Bar-Ilan.
Remarque : Une représentation graphique étape par étape de la procédure décrite dans cette section apparaît à la figure 1.
1. Culture cellulaire
REMARQUE: Les cellules utilisées dans le protocole sont des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) qui ont été générés à partir d’embryons E11.5-13.5 de souris de type sauvage C57BL / 6. Les MEF primaires ont été générés selon le protocole de laboratoire Jacks13. Les cellules de cinq embryons différents ont été regroupées et immortalisées par infection par un vecteur rétroviral exprimant le grand antigène T SV40, suivie d’une sélection avec 4 mM d’histidinol pendant 3 semaines.
- Cellules de culture dans des plaques de culture tissulaire contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 1 g/L de glucose, 1 % de glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) (voir tableau des matériaux), dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2 à 37 °C.
- Cultivez les cellules jusqu’à 90% à 95% de confluence et divisez-les dans un rapport de 1: 5 tous les 2-3 jours.
2. Revêtement de plat à fond de verre
REMARQUE: Le revêtement de la parabole à fond de verre doit être effectué dans la hotte de culture tissulaire dans des conditions stériles.
- Ajouter 2 mL de solution de HCl 1N au centre d’un plat à fond de verre (Table des matériaux) et incuber pendant 20 min à température ambiante (RT).
REMARQUE: Cette étape est destinée à éliminer les résidus du verre qui peuvent interrompre l’imagerie plus tard. - Lavez le plat à fond de verre trois fois avec 2 mL de 1x PBS (Table des matériaux) chacun.
- Diluer la fibronectine (voir tableau des matériaux) à 10 μg/mL dans 1x PBS. Ajouter 200 μL de la solution de fibronectine diluée au centre en verre du plat. Incuber à 37 °C (incubateur de culture tissulaire) pendant 1 h.
REMARQUE: Alternativement, le plat à fond de verre peut être incubé pendant la nuit à 4 ° C sur une surface plane. - Pendant le temps d’incubation du revêtement de fibronectine, préparer une solution de BSA (Table des matériaux) à 1 % dans 1x PBS, filtrer à 0,2 μm et dénaturer en incubant à 70 °C pendant 30 min dans un bain-marie préchauffé.
- Lavez le plat à fond de verre enduit trois fois avec 2 mL de 1x PBS chacun.
- Ajouter 2 mL de solution de BSA dénaturée au centre du verre et incuber pendant 1 h à 37 °C (incubateur de culture tissulaire).
REMARQUE: Alternativement, le plat à fond de verre peut être incubé pendant la nuit à 4 ° C sur une surface plane. - Lavez le plat à fond de verre 3 fois avec 2 mL de 1x PBS chacun.
REMARQUE: L’incubation des plats à fond de verre avec de la fibronectine doit être effectuée pendant au moins 1 h à 37 ° C pour recouvrir correctement la surface. Un temps d’incubation plus court peut ne pas produire un revêtement approprié et, par conséquent, le phénotype cellulaire peut ne pas être lié à l’activation de l’intégrine. La couche de BSA est inerte et n’affectera pas la dynamique de la saillie et est destinée à bloquer les sites potentiels libres pour l’adhésion cellulaire indépendante de l’intégrine. Le BSA doit être dénaturé avant le revêtement pour l’empêcher d’induire l’apoptose cellulaire, ce qui peut influencer la dynamique du bord cellulaire.
3. Préparation des cellules pour l’imagerie
- Seize à dix-huit heures avant l’expérience, plaquez les cellules pour atteindre 70% à 80% de confluence le lendemain. Pour les MEF, plaque 0,7 x 106 cellules par plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre un jour avant d’effectuer l’expérience.
REMARQUE: Pour une expérience de protrusion réussie, il est important que les cellules soient utilisées pendant leur phase de croissance logarithmique. Pour ce faire, les cellules doivent atteindre une confluence de 70% à 80% le jour de l’expérience. Une densité plus élevée de cellules entraînera un temps d’étalement plus long et / ou un obstacle à la fixation pendant l’expérience. - Le jour de l’expérience, ajouter 2 mL de solution de trypsine (Table des matériaux) par plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre et incuber pendant 2 à 3 minutes dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce que les cellules se détachent. Inactiver la trypsine en ajoutant 5 mL du milieu complet.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquer 20 000 cellules dans 2 mL du milieu complet sur un plat à fond de verre recouvert comme ci-dessus (section 2).
REMARQUE: Le nombre de cellules pour le placage dépend de la taille et du type de cellules. Pour les cellules plus grandes ou plus répandues, ne plaquez que 10 000 cellules pour avoir suffisamment de cellules pour l’imagerie. Il est important de choisir des cellules individuelles qui ne se touchent pas, car le contact de cellule à cellule peut modifier les comportements de propagation intrinsèques à la cellule. - Incuber les plats à fond de verre avec des cellules plaquées dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 15 min.
REMARQUE: Au cours de cette étape, les cellules adhèrent au substrat de fibronectine et s’y propagent. Lors de la mesure des protubérances pendant la propagation cellulaire, les cellules doivent être autorisées à se propager pendant 15 minutes après le placage et avant l’imagerie. L’imagerie peut être effectuée dans une fenêtre de temps comprise entre 15 min et ~1 h après le placage, et dans tous les cas, avant que les cellules ne commencent à migrer.
4. Configuration du microscope et imagerie
REMARQUE: Divers systèmes de microscopie à cellules vivantes sont disponibles. Le système utilisé ici est un microscope inversé Leica AF6000 équipé de CO2 et d’unités de chauffage et est fixé à un appareil photo CMOS numérique ORCA-Flash 4.0 V2.
- Allumez l’unité de chauffage au moins 1 h avant l’imagerie et réglez-la à 37 °C.
- Allumez l’unité de CO2 au moins 10 minutes avant l’imagerie et réglez-la à 5% de CO2.
- Allumez le microscope, l’appareil photo et l’ordinateur.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition de microscope (voir Tableau des matériaux). Choisissez le dossier dans lequel enregistrer les images capturées et tapez un nom de fichier. Enregistrez chaque film en tant que nouveau fichier.
- Réglez le grossissement sur une lentille sèche 40x, contraste de phase. Réglez l’intervalle de temps sur 5 s, la durée totale du film 10 min.
- Après 15 minutes d’incubation des cellules plaquées, placez le plat à fond de verre avec les cellules adhérentes dans l’adaptateur et fixez-le. Insérez l’adaptateur avec la parabole dans sa fente dans l’étage du microscope.
- Retirez le couvercle du plat et placez plutôt le couvercle en CO2 . Ouvrez la vanne de CO2 .
REMARQUE: Assurez-vous que le couvercle de CO2 est propre avant de le placer sur le dessus du plat en verre. Une couverture sale réduira la qualité des films. Essuyez le dessous du couvercle au CO2 avec une lingette non pelucheuse imbibée d’éthanol à 70% pour éliminer la poussière et la saleté. Essuyez une deuxième fois avec une lingette sèche non pelucheuse. - Visualisez les cellules et trouvez une cellule appropriée pour l’imagerie. Assurez-vous que la cellule est au point et commencez l’acquisition du film.
5. Analyse d’images
REMARQUE: L’analyse d’image est effectuée à l’aide d’ImageJ (Table des matériaux) comme suit:
- Ouvrez le film acquis dans ImageJ.
- À l’aide de l’outil Droit de la barre d’outils principale, créez huit lignes de 20 unités arbitraires perpendiculaires chacune aux saillies, y compris la lame et le bord de la cellule, dans un arrangement radial tous les 45°, comme illustré à la figure 2A.
- Dans la barre d’outils principale, accédez à Piles > d’images > Reslice. Cela donnera une image kymographique, qui décrit le mouvement de points uniques à l’intérieur de la membrane cellulaire (Figure 2B). Cette action doit être effectuée séparément pour chaque ligne sur les huit lignes.
- Extrayez et comptez manuellement à partir des images kymographiques respectives le nombre de protubérances, de rétractions et de volants dans chacune des huit régions de la cellule, marquées par les lignes de la grille. Ces chiffres représentent la fréquence des protubérances, des rétractions et des volants par 10 minutes (Figure 2C, D).
REMARQUE: Les volants peuvent être distingués des autres structures en fonction de leur apparence sombre en microscopie à contraste de phase et de leur mouvement centripète, qui commence au bord de la cellule et se termine à la frontière du corps cellulaire, ce qui peut être observé dans les films acquis. Il convient de noter que lors de la quantification de la protrusion, de la rétraction et de la fréquence des volants, les films doivent être observés comme un contrôle pour la quantification et en particulier pour définir les volants. - Déterminez la persistance, la distance et la vitesse de la saillie par analyse par kymographie. Pour chacun des kymographes générés, l’axe X représente la distance et l’axe Y représente le temps.
- Pour mesurer la distance de saillie, suivez les étapes 5.6.1 à 5.6.2.
- Tracez une ligne perpendiculaire de la base de la saillie au plus haut sommet de la saillie. Appuyez sur M dans ImageJ pour mesurer la longueur de la ligne en pixels.
- Pour convertir la longueur des pixels en μm, assurez-vous que le rapport pixel/μm est connu.
REMARQUE: Le rapport μm / pixel est la longueur physique d’un pixel sur la caméra CCD / grossissement total. La taille des pixels est caractéristique de chaque type d’appareil photo. Par exemple, pour la caméra utilisée dans cette étude, la taille des pixels est de 6,5 μm x 6,5 μm, la longueur physique est de 6,5 μm et le grossissement que nous avons utilisé est de 40x. Par conséquent, le rapport μm / pixel de notre appareil photo est de 0,1625 μm / pixel. Dans l’analyse, pour une ligne d’une longueur de 30 pixels, la distance de saillie serait de 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm (Figure 3).
- Pour mesurer le temps de saillie (persistance; le temps qu’une saillie passe à dépasser avant de se rétracter), suivez les étapes 5.7.1 à 5.7.2.
- Tracez une ligne horizontale du début de la saillie (de gauche à droite) jusqu’à la région du plus haut sommet. Appuyez sur M dans ImageJ pour mesurer la longueur de la ligne en pixels.
- Pour convertir la longueur des pixels en minutes, calculez le rapport pixel/min. Cette valeur dépend de l’intervalle entre les images.
Remarque : Dans cet exemple, l’intervalle entre les images est de 5 s, le rapport min/pixel est de 0,0833 et la longueur de ligne horizontale est de 8 pixels. Par conséquent, le temps de saillie est de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
- Mesurez et calculez le temps de rétraction de la même manière que le temps de saillie pour une ligne tracée horizontalement à la base de la saillie à partir de laquelle se trouve le pic de la saillie jusqu’à sa base à droite (ligne X2 de la figure 3).
- Calculez la vitesse de saillie en divisant la distance de saillie par le temps de saillie. Calculez la vitesse de rétraction en divisant la distance de saillie par le temps de rétraction. Dans cet exemple, la vitesse de saillie est calculée comme 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., et la vitesse de rétraction est identique car la ligne représentant le temps est de même longueur.
REMARQUE: En comparant différents types de cellules, c’est-à-dire des cellules exprimant des constructions de type sauvage et mutantes de la même protéine, il est impératif d’effectuer une analyse en aveugle, afin qu’aucun biais ne soit introduit.
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Representative Results
Dans l’expérience décrite à la figure 2, des MEF immortalisés ont été plaqués sur des boîtes à fond de verre pré-enduites de fibronectine pour activer la signalisation médiée par l’intégrine, bloquée par la BSA dénaturée, afin de bloquer les sites potentiels libres pour l’adhésion cellulaire qui ne dépend pas de l’activation de l’intégrine. Pour atteindre la phase de croissance logarithmique à une confluence de cellules de 70% à 80% le jour de l’expérience, 0,7 x 106 MEF ont été plaqués dans une plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre 16 h avant l’expérience. Le jour de l’expérience, les cellules ont été trypsinisées et comptées, et 20 000 cellules ont été plaquées sur un plat à fond de verre recouvert de fibronectine / BSA. La boîte a été incubée pendant 15 min à 37 °C pour permettre la fixation et la propagation des cellules avant l’imagerie. Après l’incubation, la plaque a été placée dans une chambre d’incubateur de microscope (37 °C, 5 % de CO2), et des cellules individuelles ont été imagées à l’aide d’une lentille sèche 40x en lumière de phase. L’imagerie a été réalisée entre 15 min et 1 h après le placage avant que les cellules ne commencent à migrer. Les images ont été acquises toutes les 5 s pendant 10 minutes, ce qui a donné 121 images par cellule (film supplémentaire 1).
L’analyse d’image a été effectuée à l’aide d’ImageJ. À l’aide de l’outil Droit de la barre d’outils principale, 20 lignes droites arbitraires de longueur unitaire ont été créées sur une grille radiale aux mêmes endroits tous les 45 degrés dans toutes les cellules (Figure 2A). Pour générer un kymographe, nous avons utilisé les commandes Image > Stack > Reslice, qui ont donné une image de kymographe décrivant le mouvement de points uniques dans la membrane cellulaire (Figure 2B-D). Le nombre de protubérances, de rétractions et de volants formés pendant 10 minutes du film dans chacune des huit régions des cellules, qui sont marquées par les lignes de la grille, a été extrait, compté manuellement à partir des images kymographiques respectives et tracé dans un graphique sous forme de fréquences de protubérances / rétractions / volants par 10 minutes. Les fréquences moyennes obtenues étaient de 5,1/10 min pour les protubérances et les rétractions et de 2,1/10 min pour les volants (Figure 2E).
La distance de saillie, le temps de saillie, le temps de rétraction, la saillie et les vitesses de rétraction ont été calculés à partir des kymographes générés. Dans le kymographe représentatif de la figure 3, la distance de saillie était de 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, le temps de saillie était de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min, le temps de rétraction était de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. Les vitesses de saillie et de rétraction ont été calculées comme étant de 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min.
Lors de la mesure de la saillie du bord cellulaire, il est important de choisir des cellules qui sont dans leur phase d’étalement. Un exemple de cellule appropriée pour l’analyse apparaît à la figure 2A et au film supplémentaire 1. Après l’analyse par kymographie, les protubérances, les rétractions et les volants peuvent être facilement distingués dans cette expérience. Un exemple de fibroblaste de type sauvage qui n’est pas approprié pour l’analyse est illustré à la figure 4. Après l’analyse par kymographie, dans les lignes (tranches) 1, 3, 5, 7, par exemple, les protubérances claires ne peuvent pas être distinguées. Dans ce cas, la cellule a fini de se propager mais n’a pas encore commencé à bouger, et donc peu de mouvements membranaires peuvent être observés.
Figure 1 : Étapes expérimentales du test de saillie. (A) Une solution de HCl à 1N est ajoutée à la boîte à fond de verre pendant 20 min. (B) Après lavage dans du PBS, une solution de fibronectine à 10 μg/mL est ajoutée à la partie en verre de la boîte et incubée pendant 1 h à 37 °C. (C) Le fond en verre à vaisselle est bloqué par incubation dans du BSA dénaturé à 1 % pendant 1 h à 37 °C. (D) Une plaque de culture tissulaire de fibroblastes confluents à 70 % à 80 % est trypsinisée et comptée (E) 20 000 cellules sont plaquées dans un plat à fond de verre et (F) incubées pendant 15 min à 37 °C pour permettre aux cellules de se propager. (G) La plaque est placée dans une chambre humide de microscope avec 37 °C dans 5% de CO2, et l’imagerie en direct est réalisée par microscopie optique à contraste de phase. (H) Les films et les images de cellules sont soumis à une analyse de kymographie par Image J. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Analyse d’images de dosage de protrusion. (A) Image représentative du MEF dans l’image J avec huit sections transversales de membrane indiquées pour la quantification pendant 10 min. Barre d’échelle, 20 μm. (B) Génération d’un kymographe dans l’image J. (C) Kymographe représentatif à partir de la section transversale sur laquelle les protubérances, les rétractions et les volants peuvent être distingués. (D) Kymographes résultants après analyse d’image pendant 10 min dans l’image J à l’aide de la commande Reslice. (E) Quantification des fréquences des protubérances, des rétractions et des volants par 10 min à partir du film et du kymographe analysés. Fréquence moyenne de saillie par 10 min = 5,1, fréquence moyenne de rétraction par 10 min = 5,125, fréquence moyenne des volants par 10 min = 2,1. Huit kymographes ont été analysés à partir d’un film. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse et quantification de la persistance, de la distance et de la vitesse de la saillie. Dans le kymographe représentatif, l’axe X représente le temps en min (de gauche à droite), et l’axe Y montre la distance en μm. X1 représente le temps de saillie (persistance), X2 représente le temps de rétraction et Y représente la distance de saillie. La vitesse de saillie est calculée en divisant la distance de saillie (Y) par le temps de saillie (X1). La vitesse de rétraction est calculée en divisant la distance de saillie (Y) par le temps de rétraction (X2). Dans cet exemple, la distance de saillie était de 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, le temps de saillie était de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min., le temps de rétraction était de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. La vitesse de saillie/rétraction a été calculée comme étant de 4,875 μm/0,6664 min. = 7,315 μm/min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Exemple d’une cellule à exclure de l’analyse. (A) Exemple d’une cellule qui n’est pas appropriée pour l’analyse. Barre d’échelle, 20 μm. (B) L’analyse kymographique de cette cellule ne montre, en particulier dans la re-tranche 1,3,5,7, aucune saillie claire. Dans ce cas, la cellule a fini de se propager mais n’a pas encore commencé à bouger, et donc peu de protubérances membranaires peuvent être observées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film supplémentaire 1. Le MEF a été plaqué sur une boîte à fond de verre recouverte de fibronectine et imagé à l’aide d’une microscopie vidéo à contraste de phase en accéléré pendant 10 minutes à l’aide d’un objectif sec 40x/1,4 NA. Le temps est indiqué en secondes. Barre d’échelle, 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
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Discussion
La dynamique de la saillie du bord cellulaire, composée de protubérances, de rétractions et de volants, est à la fois une condition préalable et un événement limitant le débit potentiel dans la motilité cellulaire. Nous décrivons ici une méthode rapide et simple pour mesurer la dynamique des protubérances du bord cellulaire pendant l’étalement. Cette méthode permet une imagerie à court terme, génère une quantité importante de données, ne nécessite pas de marquage fluorescent des cellules ou d’équipement de microscopie fluorescente coûteux, et pourrait être utilisée comme méthode préliminaire pour tester la dynamique du cytosquelette impliquée dans la motilité cellulaire avant de décider d’effectuer des méthodes plus exigeantes en ressources. De plus, on peut utiliser des cellules knock-out ou knockdown et/ou des mutants protéiques dans ce test comme un outil rapide et simple pour identifier les protéines critiques et les mécanismes de signalisation potentiels impliqués dans la dynamique du cytosquelette.
Il est à noter qu’il est important de choisir les bonnes cellules pour l’analyse de la saillie. Les cellules sont incubées pendant 15 minutes avant que les films ne soient acquis pour permettre la propagation. Si l’on décide de mesurer la saillie pendant l’étalement (par opposition à la mesure des protubérances pendant la migration), seules les cellules qui sont dans leur phase d’étalement lors de l’acquisition du film doivent être imagées. Les cellules qui n’ont pas commencé à se propager ne conviennent pas à l’analyse par kymographie. Les cellules qui ont terminé leur phase d’épandage mais qui n’ont pas commencé à se déplacer (figure 4) ne seront pas non plus appropriées pour l’analyse. Le mouvement de leur noyau peut distinguer ces cellules: pendant la propagation, le noyau est stationnaire, tandis que pendant la migration cellulaire, le noyau est dynamique et se localise à l’arrière de la cellule pour construire un axe bord-centrosome-noyau d’attaque vers la direction de la migration. Un autre problème courant dans les derniers stades de l’imagerie est une situation dans laquelle les cellules se touchent. De tels films doivent être exclus de l’analyse, car les interactions et les signaux des cellules voisines peuvent interférer avec la dynamique de la saillie du bord cellulaire.
Dans ce manuscrit, nous décrivons l’analyse de la dynamique de la saillie cellule-bord à l’aide de la microscopie optique à contraste de phase. Cette méthode peut également être étendue pour mesurer la dynamique des composants intracellulaires avec la microscopie à fluorescence. Une telle utilisation courante de la kymographie fluorescente est souvent décrite pour mesurer la dynamique des structures cytosquelettiques dans les cellules. Par exemple, Dogget et Breslin ont utilisé la kymographie des cellules HUVEC transfectées par la GFP-actine pour analyser la dynamique et le renouvellement des fibres de stress de l’actine14.
Ce protocole et plusieurs autres articles précédents utilisaient des fibroblastes plaqués sur la fibronectine pour le test de saillie du bord cellulaire ainsi que pour les tests de motilité cellulaire bidimensionnels. Les fibroblastes sont couramment utilisés pour les tests de motilité et d’autres tests connexes tels que le test de dynamique de la saillie du bord cellulaire, car ils sont mésenchymateux et mobiles et ont des structures cytosquelettiques claires telles que la lamellipodie, les filopodes et les adhérences focales. Bien que nous ne décrivions pas le test pour d’autres types de cellules et substrats, cette méthode pourrait facilement être modifiée. Par exemple, dans la première documentation du test de dynamique de la lamelle, que nous et d’autres avons modifié pour devenir le test de dynamique de la saillie du bord cellulaire11, les auteurs ont utilisé des kératinocytes stimulés pour migrer par EGF dans un test de grattage, démontrant que d’autres types de cellules et d’autres stimulations pouvaient être appliqués à ce test. De plus, bien que nous décrivions la mesure de la dynamique de la saillie des bords cellulaires pendant l’étalement cellulaire, la même méthode pourrait être utilisée en mesurant la dynamique des protubérances pendant la migration des cellules, comme démontré, par exemple, dans Bear et al.12 et Hinz et al.11.
En effet, plusieurs laboratoires ont utilisé ce test sur les MEF pour élucider la dynamique du cytosquelette et les mécanismes de signalisation dans le passé. Par exemple, Miller et coll. avaient déjà utilisé le test de saillie pour démontrer qu’Abl2/Arg intervient dans le contact entre l’actine et les microtubules au bord de la cellule15. Bryce et al. ont démontré à l’aide du test que les cellules knockdown de cortactine ont une motilité cellulaire altérée qui coïncide avec une altération de la persistance des protubérances lamellipodiales. Ce défaut résulte d’une altération de l’assemblage de nouvelles adhérences dans les protubérances16. Lapetina et al. ont utilisé le test de protrusion cellule-bord dans les cellules Abl2/Arg knockout et cortactine knockdown sauvées avec des mutants des deux protéines pour élucider un mécanisme de régulation Médié par Abl2/Arg protubérances cellule-bord17. En utilisant le même test, Miller et al. ont également démontré que Arg régule la polymérisation de l’actine médiée par N-WASP et la dynamique de protrusion du bord cellulaire qui en résulte18. Nous avons récemment utilisé le test de protrusion du bord cellulaire pour démontrer que la tyrosine kinase pyk2 non réceptrice régule la dynamique des protubérances et de la migration cellulaire ultérieure via des interactions directes et indirectes avec la protéine adaptatrice CrkII. Dans cet article, nous avons utilisé Pyk2-WT et Pyk2-/- et Crk-WT et knockdown MEF, des mutants de sauvetage et des expériences d’épistase pour élucider les interactions moléculaires et la hiérarchie de signalisation entre les deux protéines pendant la saillie du bord cellulaire. Ce nouveau mécanisme de régulation complexe permet d’affiner la dynamique de la protrusion du bord cellulaire et la migration cellulaire qui en résulte, d’une part, ainsi qu’une régulation étroite de la motilité cellulaire, d’autre part19. En utilisant le test de protrusion cellule-bord, les articles ci-dessus et d’autres qui ont suivi ont considérablement augmenté nos connaissances sur les mécanismes de régulation des protubérances cellule-bord en particulier et de la migration cellulaire en général.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions NIH MH115939, NS112121, NS105640 et R56MH122449-01A1 (à Anthony J. Koleske) et de la Fondation israélienne pour la science (subventions numéros 1462/17 et 2142/21) (à Hava Gil-Henn).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
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