Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die dynamischen Parameter (Vorsprünge, Retraktionen, Rüschen) von Vorsprüngen am Rand von sich ausbreitenden Zellen zu messen.

Zusammenfassung

Die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen beruht auf einer koordinierten Regulation der Zellmigration. Die Zellmigration ist ein wesentliches Ereignis beim Aufbau und der Regeneration von Geweben und entscheidend für die Embryonalentwicklung, die immunologischen Reaktionen und die Wundheilung. Eine Dysregulation der Zellmotilität trägt zu pathologischen Störungen wie chronischen Entzündungen und Krebsmetastasen bei. Zellmigration, Gewebeinvasion, Axon- und Dendritenauswuchs beginnen alle mit Aktinpolymerisations-vermittelten Zellrandvorsprüngen. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode zur bildgebenden und quantitativen Analyse der Zellkantenprotrusionsdynamik während der Ausbreitung. Diese Methode misst diskrete Merkmale der Zellkantenmembrandynamik, wie Vorsprünge, Rückzug und Rüschen, und kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie sich Manipulationen von Schlüssel-Aktinregulatoren auf Zellkantenvorsprünge in verschiedenen Kontexten auswirken.

Einleitung

Die Zellmigration ist ein kritischer Prozess, der die Entwicklung und Funktion aller lebenden Organismen steuert. Die Zellmigration tritt sowohl unter physiologischen Bedingungen wie Embryogenese, Wundheilung und Immunantwort als auch unter pathologischen Zuständen wie Krebsmetastasen und Autoimmunerkrankungen auf. Trotz Unterschieden in den Zelltypen, die an verschiedenen Migrationsereignissen beteiligt sind, teilen alle Zellmotilitätsereignisse ähnliche molekulare Mechanismen, die in der Evolution von Protozoen zu Säugetieren konserviert wurden und gemeinsame zytoskelettale Kontrollmechanismen beinhalten, die die Umgebung erfassen, auf Signale reagieren und das Zell....

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom institutionellen Animal Care and Use Committee (IACUC) der Bar-Ilan-Universität genehmigt.

HINWEIS: Eine grafische Schritt-für-Schritt-Darstellung des in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Zellkultur

HINWEIS: Die im Protokoll verwendeten Zellen sind embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus, die aus E11,5-13,5-Embryonen von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen erzeugt wurden. Primäre MEFs wurden gemäß dem ^{Jacks-Laborprotokoll13 erzeugt.}

Ergebnisse

In dem in Abbildung 2 beschriebenen Experiment wurden immortalisierte MEFs auf Glasbodenschalen plattiert, die mit Fibronektin vorbeschichtet waren, um die durch denaturierte BSA blockierte integrinvermittelte Signalübertragung zu aktivieren, um freie potenzielle Stellen für die Zelladhäsion zu blockieren, die nicht von der Integrinaktivierung abhängig ist. Um die logarithmische Wachstumsphase bei 70%-80% Zusammenfluss von Zellen am Tag des Experiments zu erreichen, wurden 16 h vor dem Exper.......

Diskussion

Die Zellkanten-Protrusionsdynamik, bestehend aus Vorsprüngen, Rückzug und Rüschen, ist sowohl eine Voraussetzung als auch ein potenzielles geschwindigkeitsbegrenzendes Ereignis in der Zellmotilität. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode zur Messung der Dynamik von Zellrandvorsprüngen während der Ausbreitung. Diese Methode ermöglicht eine kurzzeitige Bildgebung, generiert eine erhebliche Datenmenge, erfordert keine fluoreszierende Markierung von Zellen oder teure Fluoreszenzmikroskopiegeräte und könnte a.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm Zellkulturplatten	Greiner	P7612-360EA
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium enthält hohe Glukose (4,5 g/L D-Glukose)
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fötales Rinderserum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronektin aus menschlichem Plasma, flüssig, 0,1%, geeignet für Zellkultur	Sigma-Aldrich	F0895
Glasbodenschalen	Cellvis	D35-20-1,5-N	35 mm Glasbodenschale, Schalengröße 35 mm, Vertiefungsgröße 20 mm, #1,5 Deckglas (0,16-0,19 mm).
ImageJ Software	NIH		Verfügbar unter: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Mikroskopaufnahmesoftware ausgestattet mit einem ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverses Hellfeldmikroskop (40x, NA 1.3 ) ausgestattet mit Phasenkontrastoptik, einem Inkubator und einer CO2-Einheit mit LAS AF-Erfassungssoftware ausgestattet mit einem ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS-Kamera .
L-Glutamin-Lösung	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS-Kamera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA-Lösung B (0,25%), EDTA (0,05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A