Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

Published: November 1, 2021 doi: 10.3791/63157
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Neuroscience, Yale University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

Abstract

ההתפתחות וההומיאוסטזיס של אורגניזמים רב-תאיים מסתמכים על רגולציה מתואמת של נדידת תאים. נדידת תאים היא אירוע חיוני בבנייה והתחדשות של רקמות, והיא קריטית בהתפתחות העוברית, בתגובות אימונולוגיות ובריפוי פצעים. דיסרגציה של תנועתיות התא תורמת להפרעות פתולוגיות, כגון דלקת כרונית וגרורות סרטן. נדידת תאים, פלישת רקמות, אקסון וצמיחת דנדריט יוזמות כולן עם בליטות של קצה התא בתיווך אקטין פילמור. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה וחוסכת זמן להדמיה וניתוח כמותי של דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מודדת תכונות נפרדות של דינמיקת קרום קצה התא, כגון בליטות, נסיגה וקפלים, וניתן להשתמש בה כדי להעריך כיצד מניפולציות של רגולטורים actin מפתח להשפיע על בליטות קצה התא בהקשרים מגוונים.

Introduction

הגירת תאים היא תהליך קריטי השולט בהתפתחות ובתפקוד של כל האורגניזמים החיים. נדידת תאים מתרחשת הן במצבים פיזיולוגיים, כגון עוברים, ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, והן במצבים פתולוגיים, כגון גרורות סרטן ומחלות אוטואימוניות. למרות ההבדלים בסוגי התאים שלוקחים חלק באירועים נודדים שונים, כל אירועי תנועתיות התאים חולקים מנגנונים מולקולריים דומים, שנשמרו באבולוציה מפרוטוזואה ליונקים, וכוללים מנגנוני בקרה ציטו-שלדיים נפוצים שיכולים לחוש את הסביבה, להגיב לאותותים ולווסת את התנהגות התאים בתגובה1.

שלב ראשוני בנדידת תאים יכול להיות היווצרות של בליטות דינמיות מאוד בקצה המוביל של התא. מאחורי lamellipodium ניתן למצוא את lamella, אשר זוגות פועלים כדי myosin II בתיווך התכווצות ומתווך הידבקות למצע הבסיסי. Lamellipodia מושרה על ידי גירויים חוץ תאיים כגון גורמי גדילה, ציטוקינים, קולטני הידבקות תאים, מונעים על ידי פילמור actin, אשר מספק את הכוח הפיזי שדוחף את קרום הפלזמה קדימה2,3. חלבונים רבים מאותתים ומבניים היו מעורבים בכך; ביניהם הם Rho GTPases, אשר פועלים בתיאום עם אותות אחרים להפעלת חלבונים מווסת actin כגון קומפלקס Arp 2/3, חלבונים משפחתיים WASP, ובני משפחות פורמן וספיר ב lamellipodia2,4,5.

בנוסף פילמור אקטין, פעילות myosin II נדרשת ליצירת כוחות התכווצות ב lamellipodium ואת lamella הקדמי. התכווצויות אלה, המוגדרות גם כנסיגה בקצה התא, יכולות גם לנבוע מדה-פילמוריזציה של אקטין דנדריטי בפריפריה של התא והן קריטיות לפיתוח הקצה המוביל של lamellipodial ולאפשר לבלט לחוש את הגמישות של המטריצה החוץ-תאית ותאים אחרים ולקבוע את כיוון הנדידה6,7,8 . בליטות בקצה התא שאינן יכולות להיצמד למצע ייצרו קפלים של קרום היקפי, מבנים דמויי גיליון המופיעים על פני השטח הגחוניים של lamellipodia ו lamella ולנוע אחורה ביחס לכיוון הנדידה. כאשר הלמליפודיום אינו מתחבר למצע, נוצר מתחתיו למליפודיום אחורי ודוחף באופן מכני את הלאמליפודיום הראשון לכיוון פני השטח הגחוניים העליונים. חוטי האקטין בקפלים שבעבר היו מקבילים למצע הופכים כעת לאנכים לו, והרכישה ממוקמת כעת מעל למליפודיום המתקדם. ההמולה הנעה אחורה חוזרת לציטוסול ומייצגת מנגנון תאי למיחזור אקטין לאמליפודיאלי9,10.

כאן, אנו מתארים בדיקה למדידה של דינמיקת בליטה בקצה התא. בדיקת הבליטה משתמשת במיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן כדי למדוד דינמיקת בליטה בקצה תא בודד במשך 10 דקות במהלך שלב ההתפשטות של התא. דינמיקת בליטה מנותחת על ידי יצירת kymographs מסרטים אלה. באופן עקרוני, קימוגרף מקנה נתונים כמותיים מפורטים של חלקיקים נעים בעלילה מרחבית כדי להניב הבנה איכותית של הדינמיקה של קצה התא. עוצמת החלקיק הנע מותווה עבור כל ערימות התמונה בזמן לעומת תרשים חלל, כאשר ציר ה- X וציר ה- Y מייצגים זמן ומרחק, בהתאמה11. שיטה זו משתמשת בניתוח קימוגרפיה ידני עם ImageJ כדי לקבל נתונים כמותיים מפורטים, המאפשרים אחזור מידע מסרטים ותמונות במקרה של יחס אות לרעש נמוך ו/או צפיפות תכונות גבוהה, וניתוח תמונות שנרכשו במיקרוסקופיית אור ניגודיות פאזה או באיכות תמונה ירודה.

בדיקת הדינמיקה של בליטה בקצה התא המתוארת כאן היא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית. ככזה, ומכיוון שהוא הוכח בקורלציה ישירה עם העברת תאים11,12, זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לבדיקת דינמיקה של שלד cytoskeal מעורב תנועתיות התא לפני שתחליט לבצע שיטות תובעניות יותר משאבים. יתר על כן, הוא גם מאפשר מדידה כמותית של האופן שבו מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט או מבני הצלה) של חלבונים ציטוסקיליים משפיעים על הדינמיקה של השלד באמצעות פלטפורמה פשוטה. הבדיקה היא מודל מאלף לחקר הדינמיקה של השלד הציטוטי בהקשר של נדידת תאים ויכולה לשמש להבהרת המנגנונים והמולקולות שבבסיס תנועתיות התאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של אוניברסיטת בר-אילן.

הערה: תיאור גרפי שלב אחר שלב של ההליך המתואר בסעיף זה מופיע באיור 1.

1. תרבות התא

הערה: התאים המשמשים בפרוטוקול הם פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) שנוצרו מ- E11.5-13.5 עוברים של עכברי C57BL/6 מסוג בר. MEFs ראשי נוצרו על פי פרוטוקול המעבדה נסיכים13. תאים מחמישה עוברים שונים חוברו יחד והונצחו על ידי זיהום עם וקטור רטרו-ויראלי המבטא אנטיגן T גדול SV40 ואחריו בחירה עם 4 mM Histidinol במשך 3 שבועות.

  1. תאי תרבית בלוחות תרבית רקמות המכילים את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco המכיל 1 גרם / L גלוקוז, 1% גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 10% סרום בקר עוברי (FBS) (ראה טבלת חומרים), בחממה לחה עם 5% CO2 ב 37 °C (37 °FC).
  2. תרבית את התאים עד למפגש של 90%-95% ותתפצל ביחס של 1:5 כל 2-3 ימים.

2. ציפוי צלחת תחתית זכוכית

הערה: ציפוי צלחת תחתון זכוכית צריך להתבצע במכסה המנוע תרבית הרקמות בתנאים סטריליים.

  1. מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת HCl 1N במרכז צלחת זכוכית תחתונה (שולחן של חומרים) ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: שלב זה נועד להסיר שאריות מהזכוכית שעלולות להפריע להדמיה מאוחר יותר.
  2. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS (שולחן של חומרים) כל אחד.
  3. לדלל פיברונקטין (ראה טבלת חומרים) ל 10 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS. מוסיפים 200 μL של פתרון פיברונקטין מדולל למרכז הזכוכית של המנה. דגירה ב 37 °C ((אינקובטור תרבות רקמות) במשך 1 שעות.
    הערה: לחלופין, ניתן לדגור את המנה עם תחתית הזכוכית במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח שטוח.
  4. במהלך זמן הדגירה של ציפוי פיברונקטין, הכן פתרון 1% BSA (טבלת חומרים) ב- 1x PBS, סנן דרך 0.2 מיקרומטר, ודנטורה על ידי דגירה ב 70 °C (70 °F) במשך 30 דקות באמבט מים שחומם מראש.
  5. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה מצופה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS כל אחד.
  6. הוסף 2 מ"ל של פתרון BSA denatured למרכז הזכוכית ודגר במשך 1 שעה ב 37 °C (חממה תרבית רקמות).
    הערה: לחלופין, ניתן לדגור את המנה עם תחתית הזכוכית במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח שטוח.
  7. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה 3 פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS כל אחד.
    הערה: דגירה של מנות תחתית זכוכית עם פיברונקטין צריך להתבצע לפחות 1 שעות ב 37 °C (37 °F) כדי לצפות את פני השטח כראוי. זמן דגירה קצר יותר לא יכול לייצר ציפוי מתאים, וכתוצאה מכך, פנוטיפ התא לא יכול להיות קשור להפעלה integrin. שכבת ה-BSA אינה פעילה ולא תשפיע על דינמיקת הבליטה ונועדה לחסום אתרים פוטנציאליים חופשיים להידבקות תאים בלתי תלויה אינטגרין. ה- BSA חייב להיות denatured לפני הציפוי כדי למנוע ממנו גרימת אפופטוזיס התא, אשר יכול להשפיע על דינמיקה של קצה התא.

3. הכנת תאים להדמיה

  1. 16 עד 18 שעות לפני הניסוי, צלחת התאים כדי להגיע 70%-80% מפגש ביום שלמחרת. עבור MEFs, צלחת 0.7 x 106 תאים לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ יום לפני ביצוע הניסוי.
    הערה: לניסוי בליטה מוצלח, חשוב שהתאים ישמשו במהלך שלב הגדילה הלוגריתמי שלהם. כדי להשיג זאת, תאים צריכים להגיע 70%-80% מפגש ביום הניסוי. צפיפות גבוהה יותר של תאים תגרום לזמן התפשטות ארוך יותר ו/או מכשול בהחזקה במהלך הניסוי.
  2. ביום הניסוי, מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת טריפסין (טבלת חומרים) לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ ודוללים במשך 2-3 דקות בחממה של תרבית רקמות עד שהתאים מתנתקים. להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של המדיום המלא.
  3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer צלחת 20,000 תאים ב 2 מ"ל של המדיום השלם על צלחת זכוכית התחתונה מצופה כנ"ל (סעיף 2).
    הערה: מספר התאים לציפוי תלוי בגודל ובסוג התאים. עבור תאים גדולים יותר או יותר, צלחת רק 10,000 תאים יש מספיק תאים להדמיה. חשוב לבחור תאים בודדים שאינם נוגעים כמגע בין תא לתא יכולים לשנות התנהגויות של הפצת תאים-מהותיים.
  4. דגירה את הכלים התחתונים זכוכית עם תאים מצופים בחממה תרבית הרקמות במשך 15 דקות.
    הערה: במהלך שלב זה, תאים דבקים במצע הפיברונקטין ומתפשטים עליו. בעת מדידת בליטות במהלך התפשטות התא, יש לאפשר לתאים להתפשט במשך 15 דקות לאחר הציפוי ולפני ההדמיה. הדמיה יכולה להתבצע בתוך חלון זמן בין 15 דקות ל ~ 1 שעה לאחר ציפוי, ובכל מקרה, לפני התאים מתחילים לנדוד.

4. הגדרת מיקרוסקופ והדמיה

הערה: מערכות מיקרוסקופיות שונות של תאים חיים זמינות. המערכת המשמשת כאן היא מיקרוסקופ הפוך Leica AF6000 המצויד בפחמן דו חמצני ויחידות חימום ומחובר למצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-Flash 4.0 V2.

  1. הפעל את יחידת החימום לפחות 1 שעות לפני הדמיה והגדר אותו ב 37 °C (50 °F).
  2. הפעילו את יחידת הפחמן הדו-חמצני לפחות 10 דקות לפני ההדמיה והגדירו אותה ב-5% CO2.
  3. הפעל את המיקרוסקופ, המצלמה והמחשב.
  4. פתח את תוכנת רכישת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). בחר את התיקיה לשמירת תמונות שנלכדו והקלד שם קובץ. שמור כל סרט כקובץ חדש.
  5. הגדר את ההגדלה בעדשה יבשה פי 40, ניגודיות פאזה. הגדר את מרווח הזמן על 5 שניות, משך הסרט הכולל 10 דקות.
  6. לאחר 15 דקות דגירה של התאים מצופים, מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם תאים דבוקים לתוך המתאם ולתקן אותו. הכנס את המתאם עם המנה לחריץ שלו בשלב המיקרוסקופ.
  7. מורידים את כיסוי המנה ומניחים במקום זאת את מכסה הפחמן הדו-חמצני . פתח את שסתום הפחמן הדו חמצני .
    הערה: ודאו שכיסוי הפחמן הדו-חמצני נקי לפני שאתם מניחים אותו על גבי המנה התחתונה מזכוכית. כיסוי מלוכלך יפחית את איכות הסרטים. נגב את החלק התחתון של מכסה CO2 עם מגבון ללא מוך ספוג ב-70% אתנול להסרת אבק ולכלוך. יש לנגב בפעם השנייה עם מגבון יבש ללא מוך.
  8. הצג את התאים ומצא תא מתאים להדמיה. ודא שהתא נמצא בפוקוס והתחל ברכישת סרטים.

5. ניתוח תמונה

הערה: ניתוח תמונה מתבצע באמצעות ImageJ (טבלת חומרים) כדלקמן:

  1. פתח את הסרט שנרכש ב- ImageJ.
  2. בעזרת הכלי ישר בסרגל הכלים הראשי, צור שמונה שורות של 20 יחידות שרירותיות כל אחת בניצב לבליטות, כולל ה-lamella וקצה התא, בסידור רדיאלי כל 45°, כפי שמוצג באיור 2A.
  3. בסרגל הכלים הראשי, עבור אל תמונה > ערימות >. זה יניב תמונת קימוגרפיה, המתארת את התנועה של נקודות בודדות בתוך קרום התא (איור 2B). יש לבצע פעולה זו עבור כל שורה מתוך שמונה השורות בנפרד.
  4. חלץ וספור ידנית מתמונות הקימוגרף המתאימות את מספר הבלטות, הנסיגה והקפלים בכל אחד משמונת האזורים בתא, המסומנים על-ידי קווי הרשת. מספרים אלה מייצגים את תדירות הבלטות, הנסיגה והקפלים לכל 10 דקות (איור 2C, D).
    הערה: ניתן להבחין בין קפלים למבנים אחרים בהתבסס על המראה הכהה שלהם במיקרוסקופיה ניגודית פאזה ותנועתם הצנטריפטלית, שמתחילה בקצה התא ומסתיימת בגבול גוף התא, אשר ניתן לראות בסרטים שנרכשו. שים לב, כאשר מכמתים בליטה, נסיגה ותדירות וולאנים, יש לראות בסרטים בקרה לכימות ובמיוחד להגדרת קפלים.
  5. קבע את התמדה הבליטה, המרחק והמהירות על-ידי ניתוח קימוגרפיה. עבור כל אחת מהקימוגרפיות שנוצרו, ציר ה- X מייצג מרחק וציר ה- Y מייצג זמן.
  6. כדי למדוד מרחק בליטה, בצע את השלבים 5.6.1-5.6.2.
    1. צייר קו מאונך מבסיס הבליטה לפסגה הגבוהה ביותר של הבליטה. הקש M ב- ImageJ כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים.
    2. להמרת האורך מפיקסלים למיקרומטר, ודאו שיחס הפיקסל למיקרומטר ידוע.
      הערה: יחס המיקרומטר לפיקסל הוא האורך הפיזי של פיקסל במצלמת CCD / הגדלה כוללת. גודל הפיקסלים אופייני לכל סוג של מצלמה. לדוגמה, עבור המצלמה המשמשת במחקר זה, גודל הפיקסלים הוא 6.5 מיקרומטר x 6.5 מיקרומטר, האורך הפיזי הוא 6.5 מיקרומטר וההגדלה בה השתמשנו היא 40x. לכן, יחס המיקרומטר לפיקסל של המצלמה שלנו הוא 0.1625 מיקרומטר /פיקסל. בניתוח, עבור קו באורך של 30 פיקסלים, מרחק הבליטה יהיה 30 פיקסלים x 0.1625 מיקרומטר / פיקסל = 4.875 מיקרומטר (איור 3).
  7. כדי למדוד את זמן הבליטה (התמדה; משך הזמן שהבלטה מבלה בבליטה לפני החזרה), בצע את השלבים 5.7.1-5.7.2.
    1. צייר קו אופקי מתחילת הבליטה (משמאל לימין) לאזור הפסגה הגבוהה ביותר. הקש M ב- ImageJ כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים.
    2. להמרת האורך מפיקסלים לדקות, חשבו את יחס הפיקסל לדקה. ערך זה תלוי במרווח הזמן בין התמונות.
      הערה: בדוגמה זו, המרווח בין התמונות הוא 5 s, יחס המינימום/פיקסל הוא 0.0833 ואורך הקו האופקי הוא 8 פיקסלים. לכן, זמן הבליטה הוא 8 פיקסלים x 0.0833 דקה /פיקסל = 0.6664 דקה.
  8. מדוד וחשב את זמן הנסיגה בדומה לזמן הבליטה עבור קו שצויר אופקית בבסיס הבליטה שממנו שיא הבליטה הוא לבסיסו מימין (קו X2 באיור 3).
  9. חשב את מהירות הבליטה על-ידי חלוקת מרחק הבליטה לפי זמן בליטה. חשב את מהירות הנסיגה על-ידי חלוקת מרחק הבליטה על-ידי זמן נסיגה. בדוגמה זו, מהירות הבליטה מחושבת כ- 4.875 מיקרומטר / 0.6664 דקות = 7.315 מיקרומטר / דקה, ומהירות הנסיגה זהה מכיוון שהקו המייצג את הזמן הוא באותו אורך.
    הערה: בהשוואת סוגי תאים שונים, כלומר, תאים המבטאים סוג בר ומבנים מוטנטיים של אותו חלבון, חובה לבצע ניתוח עיוור, כך שלא תוכנס הטיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניסוי המתואר באיור 2, MEFs מונצחים היו מצופים על כלים עם תחתית זכוכית מצופים מראש בפיברונקטין כדי להפעיל איתותים בתיווך אינטגרין, שנחסמו על ידי BSA מפוטר, כדי לחסום אתרים פוטנציאליים חופשיים להידבקות בתאים שאינם תלויים בהפעלה אינטגרית. כדי להגיע לשלב הצמיחה הלוגריתמי במפגש של 70%-80% של תאים ביום הניסוי, 0.7 x 106 MEFs היו מצופים בלוח תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ 16 שעות לפני הניסוי. ביום הניסוי, תאים עברו טריפסין ונספרו, ו-20,000 תאים היו מצופים בצלחת זכוכית מצופה פיברונקטין/BSA. המנה הייתה דגירה במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F) כדי לאפשר התקשרות והתפשטות של התאים לפני הדמיה. לאחר הדגירה, הלוח הונח בתא אינקובטור מיקרוסקופ (37 °C (37 °C (5% CO2), ותאים בודדים צולמו באמצעות עדשה יבשה 40x באור פאזה. הדמיה בוצעה בין 15 דקות ל 1 שעה לאחר ציפוי לפני התאים החלו לנדוד. תמונות נרכשו כל 5 s במשך 10 דקות, אשר הניב 121 תמונות לכל תא (סרט משלים 1).

ניתוח תמונה בוצע באמצעות ImageJ. בעזרת הכלי ישר בסרגל הכלים הראשי, נוצרו 20 קווים ישרים שרירותיים באורך יחידה ברשת רדיאלית באותם מקומות כל 45 מעלות בכל התאים (איור 2A). כדי ליצור קימוגרפיה, השתמשנו בפקודות Image > Stack > Reslice, שהניבו תמונת קימוגרפיה המתארת את התנועה של נקודות בודדות בתוך קרום התא (איור 2B-D). מספר הבלטות, ההסתייגויות והקפלים שנוצרו במהלך 10 דקות של הסרט בכל אחד משמונת האזורים בתאים, המסומנים על ידי קווי הרשת, חולץ, נספר ידנית מתמונות הקימוגרף המתאימות, ושורטט בגרף כתדרי בליטות/נסיגה/קפלים לכל 10 דקות. התדרים הממוצעים שהושגו היו 5.1/10 דקות עבור בליטות ונסיגה ו-2.1/10 דקות לקפלים (איור 2E).

מרחק הבליטה, זמן הבליטה, זמן הנסיגה, הבליטה ומהירויות הנסיגה חושבו מהקימוגרפיות שנוצרו. בקימוגרפיה הייצוגית באיור 3, מרחק הבליטה היה 30 פיקסלים x 0.1625 מיקרומטר/פיקסל = 4.875 מיקרומטר, זמן הבליטה היה 8 פיקסלים x 0.0833 דק' /פיקסל = 0.6664 דק', זמן החזרה היה 8 פיקסלים x 0.0833 דק' /פיקסל = 0.6664 דק'. מהירויות בליטה ונסיגה חושבו כ- 4.875 מיקרומטר / 0.6664 דקות = 7.315 מיקרומטר / דקה.

בעת מדידת בליטה בקצה התא, חשוב לבחור תאים הנמצאים בשלב ההתפשטות שלהם. דוגמה לתא מתאים לניתוח מופיעה באיור 2A ובסרט משלים 1. לאחר ניתוח קימוגרפיה, ניתן להבחין בקלות בבליטה, בנסיגה ובקפלים בניסוי זה. באיור 4 מוצגת דוגמה לפיברובלסט פראי שאינו מתאים לניתוח. לאחר ניתוח קימוגרפיה, בשורות (פרוסות) 1, 3, 5, 7, למשל, בליטות ברורות לא ניתן להבחין. במקרה זה, התא סיים להתפשט אך עדיין לא התחיל לזוז, ולכן לא ניתן לראות תנועות ממברנה רבות.

Figure 1
איור 1: שלבי הניסוי של בדיקת הבליטה. (A) פתרון HCl 1N מתווסף למנה התחתונה מזכוכית למשך 20 דקות. (ב) בעקבות שטיפות ב- PBS, תמיסת פיברונקטין של 10 מיקרוגרם / מ"ל מתווספת לחלק הזכוכית של המנה ומדגרת במשך שעה אחת ב 37 °C ( C) תחתית זכוכית המנה נחסמת על ידי דגירה ב 1% BSA מפורק עבור 1 h ב 37 °C ( D) צלחת תרבית רקמות של 70%-80% פיברובלסטים קונסטרופלינים הוא טריפסיניזציה ונספר (E) 20,000 תאים מצופים בצלחת תחתית זכוכית ו (F) דגירה במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F) כדי לאפשר לתאים להתפשט. (ז) הצלחת ממוקמת בתא לח מיקרוסקופ עם 37 °C (5% CO2 ), והדמיה חיה מתבצעת על ידי מיקרוסקופיה אור ניגוד פאזה. (H) סרטים ותמונות תא נתונים לניתוח kymography על ידי תמונה J. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בדיקת בליטה של ניתוח תמונה. (A) תמונה מייצגת של MEF ב- ImageJ עם שמונה חתכים צולבים ממברנה מצוין לכימות במהלך 10 דקות. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. (B) דור של קימוגרפיה בתמונה J. (C) קימוגרפיה מייצגת מחתך שבו בליטות, נסיגה, וקפלים ניתן להבחין. (D) kymographs וכתוצאה מכך לאחר ניתוח תמונה במהלך 10 דקות בתמונה J באמצעות הפקודה Reslice . (ה) כימות של בליטות, נסיגות ותדרי קפלים לכל 10 דקות מהסרט והקימוגרף המנותחים. תדירות בליטה ממוצעת ל-10 דקות = 5.1, תדירות נסיגה ממוצעת ל-10 דקות = 5.125, תדירות הקפלים הממוצעת ל-10 דקות = 2.1. שמונה קימוגרפיות נותחו מסרט אחד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח וכימות של התמדה בבליטה, מרחק ומהירות. בקימוגרפיה הייצוגית, ציר ה- X מייצג זמן בדקה (משמאל לימין), וציר ה- Y מציג את המרחק במיקרומטר. X1 מייצג זמן בליטה (התמדה), X2 מייצג זמן נסיגה, ו- Y מייצג את מרחק הבליטה. מהירות הבליטה מחושבת על-ידי חלוקת מרחק הבליטה (Y) לפי זמן בליטה (X1). מהירות הנסיגה מחושבת על-ידי חלוקת מרחק הבליטה (Y) לפי זמן נסיגה (X2). בדוגמה זו, מרחק הבליטה היה 30 פיקסלים x 0.1625 מיקרומטר / פיקסל = 4.875 מיקרומטר, זמן הבליטה היה 8 פיקסלים x 0.0833 דקה / פיקסל = 0.6664 דקות. מהירות הבליטה/נסיגה חושבה כ- 4.875 מיקרומטר / 0.6664 דקות. = 7.315 מיקרומטר / דקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: דוגמה לתא שיש להוציאו מהניתוח. (א) דוגמה לתא שאינו מתאים לניתוח. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. (B) ניתוח הקימוגרף של תא זה מראה, במיוחד בפרוסה מחדש 1,3,5,7, ללא בליטות ברורות. במקרה זה, התא סיים להתפשט אך לא התחיל לזוז עדיין, ולכן לא ניתן לראות בליטות ממברנה רבות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט משלים 1. MEF היה מצופה על צלחת זכוכית מצופה פיברונקטין ותמונה באמצעות מיקרוסקופיית וידאו ניגודיות פאזה לשגות זמן במשך 10 דקות באמצעות 40x / 1.4 NA מטרה יבשה. הזמן מצוין בשניות. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דינמיקת בליטה בקצה התא, המורכבת מהבלטות, נסיגה וקפלים, היא גם תנאי מוקדם וגם אירוע פוטנציאלי להגבלת קצב בתנועתיות התאים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה למדידת הדינמיקה של בליטות בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מאפשרת הדמיה לזמן קצר, מייצרת כמות משמעותית של נתונים, אינה דורשת תיוג פלואורסצנטי של תאים או ציוד מיקרוסקופיה פלואורסצנטי יקר, ויכולה לשמש כשיטה ראשונית לבדיקת דינמיקה של שלד ציטוסקיל המעורבת בתנועתיות התאים לפני שתחליט לבצע שיטות תובעניות יותר למשאבים. יתר על כן, ניתן להשתמש בתאי נוקאאוט או נוקאאוט ו /או מוטציות חלבון בבדיקה זו ככלי מהיר ופשוט לזיהוי חלבונים קריטיים ומנגנוני איתות פוטנציאליים המעורבים בדינמיקה של שלד ציטוסקיל.

שימו לב, חשוב לבחור את התאים הנכונים לניתוח בליטה. תאים דוגרים במשך 15 דקות לפני שסרטים נרכשים כדי לאפשר התפשטות. אם מחליטים למדוד בליטה במהלך ההתפשטות (בניגוד למדידת בליטות במהלך ההגירה), אז רק תאים שנמצאים בשלב ההתפשטות שלהם במהלך רכישת הסרט צריך להיות בתמונה. תאים שלא התחילו להתפשט אינם מתאימים לניתוח קימוגרפיה. תאים שסיימו את שלב ההתפשטות שלהם אך לא התחילו לזוז (איור 4) לא יהיו מתאימים גם לניתוח. התנועה של הגרעין שלהם יכולה להבחין בין תאים אלה: במהלך ההתפשטות, הגרעין הוא נייח, בעוד שבמהלך נדידת התאים, הגרעין הוא דינמי ומקומם בצד האחורי של התא כדי לבנות ציר מוביל של קצה-צנטרוזום-גרעין לכיוון הנדידה. בעיה נפוצה נוספת בשלבים המאוחרים יותר של ההדמיה היא מצב שבו תאים נוגעים זה בזה. סרטים כאלה צריכים להיות מודרים מניתוח, כמו אינטראקציות ואותות של תאים שכנים יכול להפריע לדינמיקת בליטה בקצה התא.

בכתב יד זה, אנו מתארים את הניתוח של דינמיקת בליטה בקצה התא באמצעות מיקרוסקופיה אור ניגוד פאזה. שיטה זו ניתן להרחיב כדי למדוד את הדינמיקה של רכיבים תאיים עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית גם כן. שימוש נפוץ כזה בקימוגרפיה פלואורסצנטית מתואר לעתים קרובות למדידת הדינמיקה של מבנים ציטו-שלדיים בתוך תאים. לדוגמה, Dogget וברסלין השתמשו בקימוגרפיה של תאי HUVEC שעברו GFP-actin כדי לנתח דינמיקה של סיבי מתח אקטין ומחזור14.

פרוטוקול זה וכמה ניירות קודמים אחרים השתמשו פיברובלסטים מצופים על פיברונקטין לבדיקת בליטה קצה התא, כמו גם עבור בדיקות תנועתיות תאים דו ממדיות. פיברובלסטים משמשים בדרך כלל לבדיקות תנועתיות ובדיקות קשורות אחרות כגון דינמיקת הבליטה בקצה התאים, מכיוון שהם מזנכימליים ומוטיבים ויש להם מבנים ציטו-שלד ברורים כגון lamellipodia, filopodia, הידבקויות מוקד. למרות שאיננו מתארים את הבדיקה עבור סוגי תאים ומצעים אחרים, ניתן לשנות שיטה זו בקלות. לדוגמה, בתיעוד הראשון של בדיקת הדינמיקה lamella, אשר אנו ואחרים שונה כדי להפוך את התא קצה בליטה דינמיקה assay11, המחברים השתמשו קרטינוציטים מגורה לנדוד על ידי EGF בבדיקת שריטה, מדגים כי סוגים אחרים של תאים וגירויים אחרים ניתן להחיל על בדיקה זו. יתר על כן, למרות שאנו מתארים את המדידה של דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך התפשטות התא, באותה שיטה ניתן להשתמש על ידי מדידת הדינמיקה של בליטות במהלך נדידת תאים, כפי שהודגם, למשל, ב Bear et al.12 ו Hinz et al.11.

ואכן, מספר מעבדות השתמשו בבדיקה זו על MEFs כדי להבהיר את הדינמיקה הציטוסקלית ומנגנוני איתות בעבר. לדוגמה, מילר ואח ' השתמשו בעבר בבדיקת הבליטה כדי להוכיח כי Abl2 / Arg מתווך את המגע בין אקטין ומיקרוטובולות בקצה התא15. ברייס ואח ' הוכיח באמצעות הבדיקה כי תאי נוקאאוט קורטקטין יש פגיעה תנועתיות התא אשר שיתוף פנים עם פגיעה בהתמדה של בליטות lamellipodial. פגם זה נובע מליקוי בהרכבה של הידבקויות חדשות בבלטות16. Lapetina ואח ' השתמש בבדיקת בליטה קצה התא ב Abl2 / Arg נוקאאוט ותאי נוקאאוט קורטקטין שניצלו עם מוטציות של שני החלבונים כדי להבהיר Abl2 / Arg מתווך מנגנון רגולציה בליטות קצה התא17. באמצעות אותה בדיקה, מילר ואח ' הוכיחו גם כי ארג מווסת פילמור אקטין בתיווך N-WASP וכתוצאה מכך דינמיקת בליטה בקצה התא18. לאחרונה השתמשנו בבדיקת בליטה בקצה התא כדי להדגים כי טירוזין קינאז Pyk2 שאינו קולטן מווסת את הדינמיקה של בליטות ונדידת תאים עוקבת באמצעות אינטראקציות ישירות ועקיפות עם חלבון המתאם CrkII. במאמר זה, השתמשנו Pyk2-WT ו Pyk2-/- ו Crk-WT ו להפיל MEF, מוטציות הצלה, וניסויי אפיסטזיס כדי להבהיר את האינטראקציות המולקולריות ואת ההיררכיה איתות בין שני החלבונים במהלך בליטה בקצה התא. מנגנון רגולציה מורכב חדשני זה מאפשר כוונון עדין של דינמיקת בליטה בקצה התא וכתוצאה מכך העברת תאים מצד אחד יחד עם רגולציה הדוקה על תנועתיות התא מצד שני19. באמצעות בדיקת הבליטה של קצה התא, המסמכים לעיל ואחרים שבאו לאחר מכן הגדילו באופן משמעותי את הידע שלנו על מנגנוני הרגולציה של בליטות בקצה התא בפרט והעברת תאים בכלל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH MH115939, NS112121, NS105640, ו R56MH122449-01A1 (לאנתוני ג'יי קולסקה) ומהקרן הישראלית למדע (מענקים מספר 1462/17 ו-2142/21) (לחוה גיל-חן).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm cell culture plates Greiner P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Biological Industries, Israel 01-055-1A Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) Biological Industries, Israel 02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries, Israel 04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture Sigma-Aldrich F0895
Glass bottom dishes Cellvis D35-20-1.5-N 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software NIH Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2 Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000 Leica Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution Biological Industries, Israel 03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution Biological Industries, Israel 03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries, Israel 03-052-1A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
  2. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  3. Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
  4. Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
  5. Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
  6. Lee, J. M. The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).
  7. Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
  8. Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).
  9. Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
  10. Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
  11. Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
  12. Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
  13. Jacks laboratory protocol. , Available from: http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs (2021).
  14. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
  15. Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
  16. Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
  17. Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
  18. Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).
  19. Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 177 נדידת תאים למליפודיה בליטות נסיגה קפלים הדמיה חיה קימוגרפיה
מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukic, N., Saha, T., Lapetina, S.,… More

Lukic, N., Saha, T., Lapetina, S., Gendler, M., Lehmann, G., Koleske, A. J., Gil-Henn, H. Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy. J. Vis. Exp. (177), e63157, doi:10.3791/63157 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter