Summary
Här demonstrerar vi beredningen av en högkvalitativ encellssuspension av tilapiatall för encellssekvensering.
Abstract
Niltilapia är en av de mest odlade sötvattensfiskarterna i världen och är en allmänt använd forskningsmodell för vattenbruksfiskstudier. Beredningen av högkvalitativa encellssuspensioner är avgörande för studier på encellsnivå, såsom encells-RNA eller genomsekvensering. Det finns dock inget färdigt protokoll för vattenbruksfiskarter, särskilt för tarmarna av tilapia. De effektiva dissociationsenzymerna varierar beroende på vävnadstyp. Därför är det viktigt att optimera vävnadsdissociationsprotokollet genom att välja lämplig enzym- eller enzymkombination för att erhålla tillräckligt med livskraftiga celler med minimal skada. Denna studie illustrerar ett optimerat protokoll för att förbereda en högkvalitativ encellssuspension från Niltilapiatall med en enzymkombination av kollagenas / dispas. Denna kombination är mycket effektiv för dissociation med användning av bovint serumalbumin och DNas för att minska cellaggregering efter matsmältning. Cellutgången uppfyller kraven för encellssekvensering, med 90% cellviabilitet och hög cellkoncentration. Detta protokoll kan också modifieras för att förbereda en encellssuspension från tarmarna hos andra fiskarter. Denna forskning ger ett effektivt referensprotokoll och minskar behovet av ytterligare försök vid framställning av encellssuspensioner för vattenbruksfiskarter.
Introduction
Celler är de grundläggande enheterna av organismer. Jämfört med bulkvävnadsstudier kan studier på encellsnivå återspegla cellheterogenitet och ge information med högre upplösning1. Under de senaste åren har forskare tillämpat encellssekvenseringsteknik för genom-, transkriptom-, epigenom- eller multi-omic-studier på encellsnivå hos däggdjur, zebrafiskar och andra modellorganismer och rapporterade stora genombrott 2,3,4,5,6,7 . Medan de flesta studier har fokuserat på modellorganismer finns det få referensprotokoll eller kommersiella dissociationssatser för encellssekvensering i ekonomiska fiskarter, vilket begränsar tillämpningen av encellssekvensering i vattenbruksforskning. Därför är det avgörande att utveckla vävnadsdissociationsprotokoll som producerar högkvalitativa encellssuspensioner med hög cellviabilitet och nukleinsyraintegritet.
Det är viktigt att optimera vävnadsdissociationsprotokollet med lämplig enzym- eller enzymkombination för att erhålla tillräckligt med livskraftiga celler med minimal skada. Det mest effektiva enzymet för vävnadsdissociation varierar beroende på vävnadstyp. Hos däggdjur har flera enzymer använts för att framställa encellssuspensioner för fast vävnad från däggdjur, inklusive kollagenas, dispas, trypsin, papain, elastas, hyaluronidas, liberas, accutas och trypLE 8,9. Trypsin matsmältning i kombination med mekanisk störning har vanligen använts för att dissociera vävnader för cellodling i fisk 10,11,12,13,14. Trypsin har också använts eller tillsatts i matsmältningen cocktail för vävnadsdissociation i råtttarmen15 och zebrafisk gillvävnad16. Men av flera skäl är trypsin inte det bästa alternativet för encellssekvensering. Trypsin ensam är vanligtvis ineffektivt för vävnadsdissociation. Dessutom inducerar trypsin DNA-strängbrott 17,18 och RNA-nedbrytning19.
Papain bryter ner proteinerna som utgör de snäva korsningarna mellan celler. I däggdjursnerver och glattmuskelceller är papain effektivare och mindre destruktiv än andra proteaser20,21. Men som trypsin resulterar papain i den fria DNA-inducerade aggregeringen av celler på grund av celllysen som uppstår under enzymatisk matsmältning9. Elastas bryter ner elastin, som vanligtvis finns i hud, lungor, ligament, senor och kärlvävnader22. Det används ofta i kombination med kollagenas, dispase eller trypsin för dissocierande lungvävnad8. Hyaluronidas klyver hyaluronans glykosidbindningar, vilket bidrar till matsmältningen av den extracellulära matrisen i olika bindväv och hud 9,23.
I allmänhet är kollagenas och dispase bra alternativ för extracellulär matrisnedbrytning. De har använts vid dissociation av humana, mus- och zebrafisktarmar24,25,26,27. Kollagenas förstör peptidbindningen i kollagen, främjar matsmältningen av den extracellulära matrisen och frigör cellerna i suspension, och sålunda används kollagenas ofta för dissociation av fast vävnad hos människa och mus, inklusive för levern 28,29, mjälte30, bukspottkörtel31 och tarm 25. Dispase är ett proteas som hydrolyserar de N-terminala peptidbindningarna av icke-polära aminosyrarester och är mildare än kollagenas. Det klyver de extracellulära matriskomponenterna, såsom fibronektin, typ IV-kollagen och i mindre utsträckning typ I-kollagen, utan att påverka cell-cellkorsningar. Dispase används separat eller tillsammans med andra enzymer för vävnadsdissociation, såsom för tarm25,32, hjärna33, lever34, etc. Dessutom är kommersiellt tillgängliga matsmältningscocktails, inklusive liberas, accutas och trypLE, också bra alternativ för dissociation av fast vävnad, särskilt för hud, lever och njure 8,9.
Niltilapia (Oreochromis niloticus) tillhör familjen Cichlidae av ordningen Perciformes. Det är en av de mest odlade sötvattensfiskarterna i tropiska och subtropiska områden, med en årlig produktion på 4,5 miljoner ton 202235. Det är en av de bäst studerade vattenbruksfiskarterna med ett väl annoterat genom. Nile tilapia är en idealisk forskningsmodell för vattenbruksfiskarter på grund av dess korta generationstid, enkla uppfödning och anpassningsförmåga till ett brett spektrum av uppfödningsmiljöer. Tarmen är av stort forskningsintresse eftersom det är näringsorganet, matsmältning och absorption, metabolism och slemhinneimmunitet. Tarmen är livsmiljön för mikrobiella populationer och är en viktig immunvävnad36. Det är immunologiskt aktivt på grund av närvaron av många immuncellstyper, inklusive makrofager, B-celler, granulocyter och T-celler.
I den aktuella studien utvecklade vi ett protokoll för att förbereda en högkvalitativ encellssuspension från Niltilapiatarmen för att underlätta studier på encellsnivå i vattenbruksfiskarter. Enligt egenskaperna hos dessa vävnadsspecifika enzymer och förarbete är kollagenas / dispas lämpligt för dissociering av tilapia tarmvävnad. Den slutliga enzymtypen att överväga vid framställning av encellssuspensioner är DNase-I, som förhindrar cellaggregering genom att bryta ned fritt DNA som frigörs genom död celllys under enzymatisk nedbrytning utan att initiera apoptotiska vägar9 och ökar utbytet av levande celler36. Dessutom tillsätts bovint serumalbumin (BSA) till tvättbufferten för att minska cellklumpar och förbättra cellviabiliteten. Flera reagensföretag beskriver BSA som en enzymstabilisator. Tillsatsen av 0,04% -1% BSA till PBS (fosfatbuffrad saltlösning) har använts för att utveckla en tvättlösning för beredning av encellssekvenseringssuspensioner utan negativa effekter38. Tillägget av en låg kvot BSA kan bidra till att upprätthålla cellviabiliteten och undvika fri DNA-inducerad aggregering av celler på grund av celllys. Detta protokoll kan också ge en värdefull referens för att utveckla celldissociationsprotokoll från tarmarna hos andra vattenbruksfiskarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll under denna studie godkändes av Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnummer: HNUAUCC-2022-00063; Datum för godkännande: 2022-03-03). En lista över utrustning och förnödenheter som används i detta experiment finns i materialtabellen. En sammanfattning av det aktuella protokollet illustreras i figur 1.
1. Beredning av fisk
- Skaffa 6 månader gammal Nile tilapia med en genomsnittlig kroppsvikt på 100 g från en pålitlig källa. Välj fisk som är fri från tecken på sjukdom.
- Sluta mata fisken 24 timmar innan du fortsätter till nästa steg.
OBS: Fiskfasta minskar volymen av tarminnehåll och underlättar beredningen av tarmsegment. - Skölj fisken i väl luftat sterilt vatten i 15 minuter för att tvätta bort löst bundna bakterier på kroppsytan.
- Avliva fisken med 300 mg/L trikainmetansulfonat (MS-222) i ca 10 min tills all rörelse upphör.
2. Beredning av reagens
- Förbered 0,08% BSA-Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (BSA-DPBS, för cellsköljning och resuspension). Lös 0,08 g BSA (0,8 % vikt/volym) i 100 ml 1x DPBS. Förvaras vid 4 °C och förkyls på is vid användning.
OBS: Tillsatsen av BSA är fördelaktig för att minimera cellklumpning. BSA-kvoten kan ökas från 0,04% till 1% beroende på cellklumpningsförhållandena. - Förbered det enzymatiska celldissociationsreagenset.
- Späd kollagenas/dispasen med 1x PBS till en slutlig koncentration på 1 mg/ml (0,1 E/ml kollagenas och 0,8 E/ml dispase). Se till att PBS och inte DPBS används.
PBS ger de kalciumjoner som behövs för att enzymet ska fungera korrekt. DPBS bör inte användas i detta steg eftersom det är Ca 2+/Mg2+ fritt. Dessutom används kollagenas typ I i det nuvarande protokollet. - Filtrera spädningen genom ett sterilt membranfilter på 0,22 μm.
- Bered ett celldissociationsreagens som består av en 95% volym kollagenas / dispaslösning och en 5% volym fetalt bovint serum (FBS).
OBS: Dissociationsreagenset ska göras färskt varje gång det används. Användning av 5% FBS hjälper till att upprätthålla cellens livskraft under matsmältningen.
- Späd kollagenas/dispasen med 1x PBS till en slutlig koncentration på 1 mg/ml (0,1 E/ml kollagenas och 0,8 E/ml dispase). Se till att PBS och inte DPBS används.
- Förbered trypan blå lösning.
- Ta trypanblå lösning från kylskåpet på 4 °C och förvara den vid 15-20 °C i några minuter före användning för att förhindra utfällning.
- Filtrera lösningen genom ett sterilt 0,22 μm membran.
3. Förberedelse av utrustning
- Förkyl den kylda centrifugen till 4 °C före användning.
- Skaffa sterila RNase-fria 1,5 ml centrifugrör, 50 ml koniska rör, bredborrade glaspipetter och spetsar, membranfilter, cellsilar och alla rör och spetsar med låg retention.
- Autoklavglaspipetter och dissektionsverktyg, inklusive pincett, sax och skalpeller, och förbehandla dem med RNase-borttagningslösningen för att förhindra de negativa effekterna av RNas för encells-RNA-seq.
4. Vävnadsdissektion och celldissociation
- Lägg den avlivade fisken på is för dissektion. Aseptiskt samla 3-4 cm av tarmens mittsektion och punktbeskatta så mycket fett och mesenteri som möjligt. Ta försiktigt bort fettet som är fäst vid tarmytan och skiktet av elastisk och formbar klar slemhinna med pincett.
OBS: Fettet och mesenteriet är fästa vid tarmens yttre yta. - Ta bort så mycket fett som möjligt för att förhindra dess negativa effekter på dissociationsprotokollet. Skölj försiktigt fragmenten med steril iskall PBS flera gånger med en spruta för att tvätta bort tarminnehållet och slem. Undvik grov hantering.
- Dissekera tarmsegmentet i små bitar och överför dem till ett 1,5 ml rör fyllt med 1 ml iskall PBS.
- Centrifugera vid 300 × g i 5 min vid 4 °C. Ta försiktigt bort supernatanten och ersätt med 1 ml iskall 0,08 % BSA-DPBS. Resuspendera vävnadsfragmenten genom försiktig aspiration med en glaspipett. Upprepa detta steg två gånger.
- Ta bort supernatanten och smält vävnadsfragmenten med 1 ml enzymatiskt dissociationsreagens (950 μL kollagenas/dispaslösning och 50 μL FBS) i ett 37 °C vattenbad i 30-60 minuter.
- Tillsätt dessutom 5 μL RNas-hämmare (40 E/μL i stamlösningen) till dissociationsreagenset om proverna bereds för encells-RNA-sekvensering.
OBS: Den slutliga koncentrationen av kollagenas / dispasblandningen är 1 mg / ml, inklusive kollagenas vid 0,1 U / ml och dispase vid 0,8 U / ml.
- Tillsätt dessutom 5 μL RNas-hämmare (40 E/μL i stamlösningen) till dissociationsreagenset om proverna bereds för encells-RNA-sekvensering.
- Vänd röret manuellt med 5 minuters intervall under 30-60 min vattenbad.
OBS: Den exakta inkubationstiden varierar beroende på vilka vävnader som används. Kontrollera utvecklingen av dissociation under ett mikroskop tills ingen bulkvävnad ses. Placera 10 μL av cellsuspensionen på en glasskiva med en pipett och undersök den under mikroskopet. Öka matsmältningstiden om cellerna inte är helt dissocierade. - Snurra ner rören vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C och avlägsna försiktigt det enzymatiska celldissociationsreagenset med bredborrade spetsar. Tillsätt 1 ml iskall 0,08% BSA-DPBS och pipettera försiktigt cellerna upp och ner med en bredborrad glaspipett i 1 min.
- Upprepa detta steg två gånger.
OBS: Pipetting upp och ner bör utföras med försiktighet med hjälp av bredborrade och låga retentionsspetsar för att förhindra cellavbrott.
- Upprepa detta steg två gånger.
- Förfukta en 40 μm cellsil med 0,08% BSA-DPBS och placera den i ett 50 ml koniskt rör. För cellsuspensionen genom silen. Knacka och skölj med ytterligare 200 μL DPBS och samla upp suspensionen i botten av röret.
- Överför suspensionen till ett 1,5 ml rör. Tillsätt 5 μl DNas I (1 E/μl) och inkubera i 15 minuter vid 15–20 °C. Centrifugera vid 300 × g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 400 μL iskall DPBS (Ca 2+/Mg2+ fri). Pipettera försiktigt upp och ner med bredborrade spetsar för att blanda cellerna. Upprepa detta steg två gånger.
5. Färgning och mikroskopisk undersökning
- För färgning, blanda cellsuspensionen med 0,4% trypanblå lösning i förhållandet 1: 1. Inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5-10 μL av blandningen på en hemocytometer och undersök under mikroskopet.
OBS: Livskraftiga celler kommer att ha ofärgad cytoplasma, medan döda celler kommer att ha en blå cytoplasma (figur 2). - Räkna de livskraftiga och döda cellerna i tre olika fält under mikroskopet. Beräkna cellviabilitetsprocenten genom att dividera antalet viabla celler med det totala antalet celler i ett fält.
OBS: Cellviabiliteten bör vara mer än 85% och cellkoncentrationen bör inte vara mindre än 1 x 105-1 x 107 / ml. Cellsuspensionsbakgrunden ska vara ren, utan klumpar, fragment eller föroreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver beredningen av en högkvalitativ encellssuspension av Niltilapiatall för encellssekvensering (figur 1). Denna forskning visar att kollagenas / dispasblandningen har en god dissociationseffekt och är mild för tarmvävnad. Valet av det optimala matsmältningsenzymet är avgörande för framställning av en högkvalitativ encellssuspension. I det preliminära arbetet jämfördes dissociationseffektiviteten hos flera vanliga enzymer och resultaten listas i tabell 1. Kollagenas / dispasblandningen verifierades för att ha en mycket bättre dissociationseffekt än kollagenas, dispase eller trypsin ensam och flera andra enzymblandningar, inklusive liberas, trypsin / elastas, kollagenas / elastas och kollagenas / trypsin. Dessutom gav kollagenas / dispase också de mest livskraftiga cellerna i slutet av experimentet.
Under inkubationstiden kontrollerades dissociationens framsteg under ett mikroskop. Efter 30 minuter var bulkvävnaden nästan borta, och i allmänhet sågs ingen bulkvävnad efter 45 minuter. Efter matsmältningen filtrerades cellsuspensionen lätt genom silen. Efter detta protokoll visade trypanblå färgning och mikroskopisk undersökning att tarmcellerna hade hög cellviabilitet (mer än 90%; Figur 2, och att cellkoncentrationen kan vara upp till 1 x 107/ml. Cellerna dispergerades som enskilda celler. De flesta celler var ljusa och vita (livskraftiga celler), medan endast ett fåtal var mörka eller blå (döda celler). Döda celler färgas mörkblå på grund av det permeabiliserade cellmembranet. Cellviabiliteten och cellkoncentrationen uppfyllde kraven för encellssekvensering.
Figur 1: Sammanfattande flödesdiagram över Nilens tilapia tarmdissociation och encellssuspensionsberedningsprotokoll. Reagenserna framställs (avsnitt 1-2) före tarmens excision. Tarmarna mals och tvättas centrifugalt i PBS (steg 4.1-4.4). Vävnadsfragmenten smälts med kollagenas/dispaslösning i ett 37 °C vattenbad för att isolera cellerna (steg 4.5-4.6). Den rötade cellsuspensionen sköljs med 0,08% BAS-DPBS och filtreras genom en 40 μm cellsil (steg 4.7-4.8). Efter DNas I-inkubation suspenderas cellpelleten igen i DPBS (steg 4.9-4.10). Trypan blå färgning bestämmer cellkoncentrationen och livskraften (avsnitt 5). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikroskopisk undersökning av en encellssuspension framställd av Nile tilapia tarmvävnad och färgad med trypanblått. Livskraftiga celler är vita och ljusa, medan döda celler är mörka och blåa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Enzym | Bästa arbetskoncentration (mg/ml) | Dissociationseffekt |
| Kollagenas II | 1 | +++ |
| Dispase | 0.25 | ++ |
| Trypsin | 2.5 | ++ |
| Liberase | 1 | +++ |
| *Kollagenas/dispase | 1 | +++++ |
| Kollagenas II/elastas | 1/1 | +++ |
| Trypsin/elastas | 2.5/0.5 | +++ |
| Trypsin/kollagenas II | 1/1 | +++ |
Tabell 1: Jämförelseresultat av dissociationseffekterna av vanliga matsmältningsenzymer för Niltilapia tarmen. Fler "+" -symboler representerar en högre grad av dissociation och högre cellviabilitet. Enzymet märkt med "*" är en kommersiell produkt, och den 1 mg / ml bästa arbetslösningen innehåller 0,1 U / ml kollagenas I och 0,8 U / ml dispase. De andra blandningarna av enzymer blandades när de användes av forskarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver beredningen av en högkvalitativ encellssuspension av Niltilapia tarmen. Före dissociation är avlägsnande av fett och mesenteri från tarmen nödvändigt, särskilt för köttätande fisktarmar med mycket fett. Att använda en spruta istället för hård skrapning för att tvätta bort tarminnehållet minskar den mekaniska skadan på cellerna. För att säkerställa cellens livskraft är det också viktigt att hålla temperaturen vid 20 °C eller lägre för vävnadsdissektion och sköljsteg. Tvättlösningarna kyls på is och centrifugtemperaturen justeras till 4 °C i förväg. Viktigast av allt bör milda och effektiva celldissociationsenzymer för den studerade vävnaden väljas. Baserat på en tidigare studie är kollagenas / dispasblandningen optimal för Niltilapia-tarmen. Denna enzymkombination är mildare och effektivare på tilapia tarmen än trypsin, dispase eller kollagenas ensam. Dessutom inkluderades 5% FBS i dissociationsreagenset för att bibehålla cellviabiliteten under matsmältningen39. Den exakta inkubationstiden varierar beroende på vilka vävnader som används. Digestionstiden måste ökas om vävnaden inte är helt dissocierad. Dessutom kräver kollagenas / dispase Ca2+ för att fungera. Därför används PBS för att späda enzymet snarare än DPBS, som är fritt från Ca 2+/Mg2+. För tvättlösningarna används DPBS om dessa joner påverkar sekvenseringsstegen nedströms.
De flesta dissociationsenzymer, inklusive kollagenas / dispas, arbetar med maximal hastighet och effektivitet vid sin optimala temperatur, som vanligtvis är 37 ° C. Vid denna temperatur transkriberas gener och deras uttrycksnivåer förändras som svar på hanteringav 40,41. Detta fenomen har rapporterats i flera studier på däggdjur och zebrafiskar. I musnjurarna uttrycks apoptos och stressrelaterade gener inklusive JUN-B, FOS och Hsp90 differentiellt under olika enzymatiska dissociationsförhållanden40. Differentialuttrycket av omedelbara tidiga gener och HSP-gener förändras i zebrafiskfenceller vid olika dissociationsförhållanden41. Det har visats att tidiga responsgener, inklusive flera medlemmar av familjerna FOS och JUN, är signifikant uppreglerade efter bara några minuters separation vid 37 °C i cellsuspensioner framställda genom enzymatisk dissociation av däggdjursvävnader6. Därför bör uttrycksförändringar i apoptos och stressrelaterade gener övervägas noggrant för ScRNA-seq-data. Denna nackdel kan övervinnas genom att använda lämpliga kontroller för ScRNA-seq-experimenten. En av kontrollerna bör behandlas under samma dissociationsbetingelser så att artefaktförändringar i genuttryck kan detekteras eller undvikas.
I detta protokoll läggs BSA till DPBS främst för att minimera cellförluster och cellklumpar. Förhållanden av BSA från 0,04% till 1% kan användas för att förbereda encellssekvenseringssuspensioner utan negativa effekter38. Att använda rätt BSA-andel skulle minska cellaggregeringen. Det lämpliga förhållandet bör optimeras för olika vävnads- och cellklumpningsförhållanden. I detta protokoll förhindrade 0,08% BSA Nile tilapia tarmcellsbindning. Den slutliga cellresuspensionen bör dock inte innehålla BSA för att undvika påverkan av Ca 2+/Mg2+ på nedströmsapplikationerna.
En annan åtgärd för att minska cellaggregering är tillsatsen av DNas I. Brutna eller döende celler frigör "klibbiga" DNA-molekyler, som är bland de främsta orsakerna till cellklumpning. DNas bryter ner fritt DNA och minimerar därmed cellklumpning. Därför används det vanligtvis i cellsuspensionsberedning för encellssekvensering42,43. Dessutom bidrar skonsam pipettering med bredborrade glaspipetter eller spetsar till att minska cellskador. Speciellt för encells-RNA-seq måste verktyg som sax, rör, glaspipetter och cellsilar vara RNase-fria.
Framför allt bör hela processen med framställning av en högkvalitativ encellssuspension göras med lämpligt dissociationsenzym, bör utföras försiktigt och snabbt vid låg temperatur och bör innehålla åtgärder för att förhindra att celler aggregerar för att uppnå hög cellviabilitet och koncentration och nukleinsyraintegritet. Detta protokoll kan också användas för beredning av tarmencellssuspensioner för andra fiskarter med mindre modifieringar. Dessutom kan detta protokoll också ge en värdefull referens för att utveckla celldissociationsprotokoll för andra fiskvävnader för encellssekvensering och studier på encellsnivå, såsom cellodling och flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna stöd från Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) och Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
References
- Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
- He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
- Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
- Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
- Xu, S. H., Cooke, I. M.
- Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
- Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
- Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
- Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
- Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
- Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
- Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
- Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
- Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
- Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
- FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
- Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
- Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
- Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
- Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
