Summary
Здесь мы демонстрируем приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника тилапии для одноклеточного секвенирования.
Abstract
Нильская тилапия является одним из наиболее часто культивируемых видов пресноводных рыб во всем мире и является широко используемой исследовательской моделью для изучения аквакультуры рыб. Приготовление высококачественных одноклеточных суспензий имеет важное значение для исследований на уровне одной клетки, таких как одноклеточная РНК или секвенирование генома. Тем не менее, не существует готового к использованию протокола для видов рыб аквакультуры, особенно для кишечника тилапии. Эффективные ферменты диссоциации варьируются в зависимости от типа ткани. Поэтому оптимизация протокола диссоциации тканей путем выбора соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Это исследование иллюстрирует оптимизированный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии с комбинацией ферментов коллагеназы / диспазы. Эта комбинация очень эффективна для диссоциации с использованием бычьего сывороточного альбумина и ДНКазы для уменьшения агрегации клеток после пищеварения. Клеточный выход удовлетворяет требованиям к секвенированию отдельных клеток, с 90% жизнеспособностью клеток и высокой концентрацией клеток. Этот протокол также может быть модифицирован для приготовления одноклеточной суспензии из кишечника других видов рыб. Это исследование обеспечивает эффективный эталонный протокол и снижает потребность в дополнительных испытаниях при приготовлении одноклеточных суспензий для видов рыб аквакультуры.
Introduction
Клетки являются фундаментальными единицами организмов. По сравнению с исследованиями объемных тканей, исследования на уровне отдельных клеток могут отражать гетерогенность клеток и предоставлять информацию с более высоким разрешением1. В последние годы исследователи применили технологии секвенирования отдельных клеток для геномных, транскриптомных, эпигеномных или мультиомных исследований на уровне отдельных клеток у млекопитающих, рыбок данио-рерио и других модельных организмов и сообщили о больших прорывах 2,3,4,5,6,7 . В то время как большинство исследований было сосредоточено на модельных организмах, существует несколько справочных протоколов или коммерческих наборов для диссоциации для секвенирования отдельных клеток у хозяйственных видов рыб, что ограничивает применение секвенирования отдельных клеток в исследованиях аквакультуры. Поэтому разработка протоколов диссоциации тканей, которые производят высококачественные одноклеточные суспензии с высокой жизнеспособностью клеток и целостностью нуклеиновых кислот, имеет решающее значение.
Оптимизация протокола диссоциации тканей с помощью соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Наиболее эффективный фермент для диссоциации тканей варьируется в зависимости от типа ткани. У млекопитающих для приготовления одноклеточных суспензий твердых тканей млекопитающих использовалось несколько ферментов, включая коллагеназу, диспазу, трипсин, папаин, эластазу, гиалуронидазу, либеразу, аккутазу и трипЛЕ 8,9. Переваривание трипсина в сочетании с механическим нарушением обычно используется для диссоциации тканей для культивирования клеток у рыб 10,11,12,13,14. Трипсин также использовался или добавлялся в коктейль пищеварения для диссоциации тканей в кишечнике15 крыс и жаберной ткани16 рыбок данио. Однако по ряду причин трипсин не является лучшим вариантом для секвенирования отдельных клеток. Трипсин сам по себе обычно неэффективен для диссоциации тканей. Кроме того, трипсин индуцирует разрывы цепи ДНК 17,18 и деградацию РНК19.
Папаин разлагает белки, из которых состоят плотные соединения между клетками. В нервных и гладких мышечных клетках млекопитающих папаин более эффективен и менее разрушителен, чем другие протеазы20,21. Однако, как и трипсин, папаин приводит к свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток, который происходит во время ферментативного пищеварения9. Эластаза расщепляет эластин, который обычно содержится в коже, легких, связках, сухожилиях и сосудистых тканях22. Он часто используется в сочетании с коллагеназой, диспазой или трипсином для диссоциации легочной ткани8. Гиалуронидаза расщепляет гликозидные связи гиалуронана, способствуя перевариванию внеклеточного матрикса в различных соединительных тканях и коже 9,23.
В целом, коллагеназа и диспаза являются хорошими вариантами для разрушения внеклеточного матрикса. Они использовались при диссоциации кишечника человека, мышей и рыбок данио-рерио24,25,26,27. Коллагеназа разрушает пептидную связь в коллагене, способствует перевариванию внеклеточного матрикса и высвобождает клетки в суспензию, и, таким образом, коллагеназа часто используется для диссоциации твердых тканей человека и мыши, в том числе для печени 28,29, селезенки30, поджелудочной железы31 и кишечника 25. Диспаза представляет собой протеазу, которая гидролизует N-концевые пептидные связи неполярных аминокислотных остатков и мягче, чем коллагеназа. Он расщепляет компоненты внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, коллаген IV типа и, в меньшей степени, коллаген I типа, не влияя на межклеточные соединения. Диспаза используется отдельно или с другими ферментами для диссоциации тканей, таких как кишечник25,32, мозг33, печень 34 и т. Д. Кроме того, коммерчески доступные коктейли для пищеварения, включая либеразу, аккутазу и trypLE, также являются хорошей альтернативой диссоциации твердых тканей, особенно для кожи, печени и почек 8,9.
Нильская тилапия (Oreochromis niloticus) относится к семейству цихловых отряда окунеобразных. Это один из самых культивируемых видов пресноводных рыб в тропических и субтропических районах с годовым производством 4,5 миллиона тонн в 2022 году35. Это один из наиболее изученных видов рыб аквакультуры с хорошо аннотированным геномом. Нильская тилапия является идеальной исследовательской моделью для видов рыб аквакультуры из-за ее короткого времени генерации, простоты выращивания и приспособляемости к широкому спектру условий выращивания. Кишечник представляет большой исследовательский интерес, так как является органом питания, пищеварения и всасывания, обмена веществ и иммунитета слизистой оболочки. Кишечник является средой обитания микробных популяций и является важной иммунной тканью36. Он иммунологически активен благодаря наличию многочисленных типов иммунных клеток, включая макрофаги, В-клетки, гранулоциты и Т-клетки.
В текущем исследовании мы разработали протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для облегчения исследований на уровне отдельных клеток у видов рыб аквакультуры. В соответствии с характеристиками этих тканеспецифических ферментов и предварительной работой, коллагеназа / диспаза подходит для диссоциации ткани кишечника тилапии. Последним типом фермента, который следует учитывать при приготовлении одноклеточных суспензий, является ДНКаза-I, которая предотвращает агрегацию клеток путем разложения свободной ДНК, высвобождаемой в результате лизиса мертвых клеток во время ферментативного переваривания, без инициирования апоптотических путей9 и увеличивает выход живых клеток36. Кроме того, бычий сывороточный альбумин (BSA) добавляется в буфер для промывки, чтобы уменьшить слипание клеток и улучшить жизнеспособность клеток. Несколько компаний-производителей реагентов описывают BSA как стабилизатор ферментов. Добавление 0,04%-1% BSA к PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) было использовано для разработки промывочного раствора для приготовления суспензий одноклеточного секвенирования без побочных эффектов38. Добавление низкого соотношения BSA может помочь сохранить жизнеспособность клеток и избежать свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток. Этот протокол также может служить ценным справочным материалом для разработки протоколов диссоциации клеток из кишечника других видов рыб аквакультуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы на животных во время этого исследования были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Хайнаньского университета (номер протокола: HNUAUCC-2022-00063; Дата утверждения: 2022-03-03). Список оборудования и расходных материалов, использованных в этом эксперименте, можно найти в Таблице материалов. Краткое изложение текущего протокола проиллюстрировано на рисунке 1.
1. Подготовка рыбы
- Получите 6-месячную нильскую тилапию со средней массой тела 100 г из надежного источника. Выбирайте рыбу, на которой нет никаких признаков болезней.
- Прекратите кормление рыбы за 24 часа, прежде чем переходить к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбное голодание уменьшает объем кишечного содержимого и облегчает подготовку кишечных сегментов. - Промойте рыбу в хорошо аэрированной стерильной воде в течение 15 минут, чтобы смыть неплотно связанные бактерии с поверхности тела.
- Усыпьте рыбу 300 мг / л трикаина метансульфоната (MS-222) в течение примерно 10 минут, пока все движения не прекратятся.
2. Приготовление реагентов
- Приготовьте 0,08% фосфатно-буферный физиологический раствор BSA-Dulbecco (BSA-DPBS, для промывки клеток и ресуспендирования). Растворите 0,08 г BSA (0,8% мас./об.) в 100 мл 1x DPBS. Хранить при температуре 4 °C и предварительно охладить на льду при использовании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление BSA полезно для минимизации слипания клеток. Коэффициент BSA может быть увеличен с 0,04% до 1% в зависимости от условий слипания клеток. - Приготовьте ферментативный реагент для диссоциации клеток.
- Разбавьте коллагеназу / диспазу 1x PBS до конечной концентрации 1 мг / мл (0,1 Ед / мл коллагеназы и 0,8 Ед / мл диспазы). Убедитесь, что используется PBS, а не DPBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: PBS обеспечивает ионы кальция, необходимые для правильного функционирования фермента. DPBS не следует использовать на этом этапе, потому что он не содержит Ca 2+/Mg2+. Кроме того, в текущем протоколе используется коллагеназа I типа. - Отфильтруйте разбавление через стерильный мембранный фильтр 0,22 мкм.
- Приготовьте реагент для диссоциации клеток, состоящий из 95% объема раствора коллагеназы/диспазы и 5% объема эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциационный реагент следует делать свежим каждый раз, когда он используется. Использование 5% FBS помогает поддерживать жизнеспособность клеток во время пищеварения.
- Разбавьте коллагеназу / диспазу 1x PBS до конечной концентрации 1 мг / мл (0,1 Ед / мл коллагеназы и 0,8 Ед / мл диспазы). Убедитесь, что используется PBS, а не DPBS.
- Приготовьте раствор трипанового синего.
- Возьмите раствор трипанового синего из холодильника с температурой 4 ° C и держите его при температуре 15-20 ° C в течение нескольких минут перед использованием, чтобы предотвратить осаждение.
- Раствор фильтруют через стерильную мембрану 0,22 мкм.
3. Подготовка оборудования
- Перед использованием предварительно охладите охлажденную центрифугу до 4 °C.
- Приобретите стерильные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл без РНКазы, конические пробирки объемом 50 мл, стеклянные пипетки и наконечники с широким отверстием, мембранные фильтры, клеточные сетчатые фильтры и все пробирки и наконечники с низким удержанием.
- Автоклавные стеклянные пипетки и инструменты для рассечения, включая щипцы, ножницы и скальпели, и предварительно обработайте их раствором для удаления РНКазы, чтобы предотвратить неблагоприятное воздействие РНКазы на секвенирование одноклеточной РНК.
4. Рассечение тканей и диссоциация клеток
- Положите усыпленную рыбу на лед для вскрытия. Асептически соберите 3-4 см среднего отдела кишечника и иссеките как можно больше жира и брыжейки. Аккуратно удалите жир, прикрепленный к поверхности кишечника, и слой эластичной и податливой прозрачной слизистой оболочки с помощью щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жир и брыжейка прикрепляются к внешней поверхности кишечника. - Удалите как можно больше жира, чтобы предотвратить его неблагоприятное воздействие на протокол диссоциации. С помощью шприца аккуратно промойте фрагменты стерильным ледяным PBS несколько раз, чтобы смыть содержимое кишечника и слизь. Избегайте грубого обращения.
- Рассеките сегмент кишечника на мелкие кусочки и перенесите их в пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 1 мл ледяного PBS.
- Центрифуга при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость и замените ее 1 мл ледяного 0,08% BSA-DPBS. Ресуспендируйте фрагменты ткани путем легкой аспирации с помощью стеклянной пипетки. Повторите этот шаг дважды.
- Удалите надосадочную жидкость и переварите фрагменты ткани, используя 1 мл реагента ферментативной диссоциации (950 мкл раствора коллагеназы/диспазы и 50 мкл FBS) на водяной бане при 37 °C в течение 30-60 мин.
- Дополнительно добавляют 5 мкл ингибитора РНКазы (40 ЕД/мкл в исходном растворе) к диссоциативному реагенту, если образцы подготовлены для секвенирования одноклеточной РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация смеси коллагеназы и диспазы составляет 1 мг/мл, включая коллагеназу в дозе 0,1 ЕД/мл и диспазу в дозе 0,8 ЕД/мл.
- Дополнительно добавляют 5 мкл ингибитора РНКазы (40 ЕД/мкл в исходном растворе) к диссоциативному реагенту, если образцы подготовлены для секвенирования одноклеточной РНК.
- Вручную переворачивайте трубку с интервалом в 5 минут во время 30-60-минутной водяной бани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точное время инкубации варьируется в зависимости от используемых тканей. Проверяйте ход диссоциации под микроскопом до тех пор, пока не будет видна объемная ткань. Поместите 10 мкл клеточной суспензии на предметное стекло с помощью пипетки и исследуйте ее под микроскопом. Увеличьте время пищеварения, если клетки не полностью диссоциированы. - Открутите пробирки при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C и осторожно удалите ферментативный реагент для диссоциации клеток с помощью широкопроходных наконечников. Добавьте 1 мл ледяного 0,08% BSA-DPBS и аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз с помощью стеклянной пипетки с широким отверстием в течение 1 минуты.
- Повторите этот шаг дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование вверх и вниз следует выполнять с осторожностью с использованием наконечников с широким отверстием и низким удержанием, чтобы предотвратить разрушение клеток.
- Повторите этот шаг дважды.
- Предварительно смочите клеточный сетчатый фильтр размером 40 мкм 0,08% BSA-DPBS и поместите его в коническую пробирку объемом 50 мл. Пропустите клеточную суспензию через ситечко. Постучите и промойте дополнительными 200 мкл DPBS и соберите суспензию на дне пробирки.
- Перенесите суспензию в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 5 мкл ДНКазы I (1 ЕД/мкл) и инкубируйте в течение 15 мин при 15-20 °C. Центрифуга при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл ледяного DPBS (Ca 2+/Mg2+ свободно). Аккуратно проведите пипеткой вверх и вниз с широкими наконечниками, чтобы перемешать клетки. Повторите этот шаг дважды.
5. Окрашивание и микроскопическое исследование
- Для окрашивания смешайте клеточную суспензию с 0,4% раствором трипанового синего в соотношении 1:1. Выдерживать 3 минуты при комнатной температуре.
- Добавьте 5-10 мкл смеси на гемоцитометр и исследуйте под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные клетки будут иметь неокрашенную цитоплазму, в то время как мертвые клетки будут иметь синюю цитоплазму (рис. 2). - Подсчитайте жизнеспособные и мертвые клетки в трех разных полях под микроскопом. Рассчитайте процент жизнеспособности клеток, разделив количество жизнеспособных клеток на общее количество клеток в поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток должна быть более 85%, а концентрация клеток должна быть не менее 1 x 105-1 x 107 / мл. Фон клеточной суспензии должен быть чистым, без комков, фрагментов и примесей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии для одноклеточного секвенирования (рис. 1). Это исследование показывает, что смесь коллагеназы и диспазы обладает хорошим диссоциативным эффектом и мягко воздействует на ткани кишечника. Выбор оптимального фермента пищеварения имеет важное значение для приготовления высококачественной одноклеточной суспензии. В предварительной работе сравнивалась эффективность диссоциации нескольких широко используемых ферментов, и результаты приведены в таблице 1. Было подтверждено, что смесь коллагеназы / диспазы обладает гораздо лучшим эффектом диссоциации, чем коллагеназа, диспаза или трипсин отдельно и несколько других ферментных смесей, включая либеразу, трипсин / эластазу, коллагеназу / эластазу и коллагеназу / трипсин. Более того, коллагеназа / диспаза также дала наиболее жизнеспособные клетки в конце эксперимента.
Во время инкубации ход диссоциации проверяли под микроскопом. Через 30 минут объемная ткань почти исчезла, и, как правило, через 45 минут объемная ткань не была замечена. После переваривания клеточная суспензия легко фильтруется через ситечко. Следуя этому протоколу, окрашивание трипановым синим и микроскопическое исследование показали, что клетки кишечника имеют высокую жизнеспособность клеток (более 90%; Рисунок 2, и что концентрация в клетках может составлять до 1 x 107 / мл. Клетки были рассредоточены как одиночные клетки. Большинство клеток были яркими и белыми (жизнеспособные клетки), тогда как лишь немногие были темными или синими (мертвые клетки). Мертвые клетки окрашиваются в темно-синий цвет из-за проницаемой клеточной мембраны. Жизнеспособность и концентрация клеток удовлетворяли требованиям секвенирования отдельных клеток.
Рисунок 1: Сводная блок-схема протоколов диссоциации кишечника нильской тилапии и приготовления одноклеточной суспензии. Реагенты готовят (секции 1-2) перед иссечением кишечника. Кишечник измельчают и центробежно промывают в PBS (этапы 4.1-4.4). Фрагменты тканей переваривают с использованием раствора коллагеназы/диспазы на водяной бане при температуре 37 °C для выделения клеток (этапы 4,5-4,6). Суспензию расщепленных клеток промывают 0,08% BAS-DPBS и фильтруют через клеточный фильтр 40 мкм (этапы 4.7-4.8). После инкубации ДНКазы I клеточную гранулу ресуспендируют в DPBS (этапы 4.9-4.10). Окрашивание трипановым синим определяет концентрацию и жизнеспособность клеток (раздел 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микроскопическое исследование одноклеточной суспензии, приготовленной из ткани кишечника нильской тилапии и окрашенной трипановым синим. Жизнеспособные клетки белые и яркие, тогда как мертвые клетки темные и синие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Фермент | Лучшая рабочая концентрация (мг/мл) | Эффект диссоциации |
| Коллагеназа II | 1 | +++ |
| Dispase | 0.25 | ++ |
| Трипсин | 2.5 | ++ |
| Либераза | 1 | +++ |
| * Коллагеназа / диспаза | 1 | +++++ |
| Коллагеназа II/эластаза | 1/1 | +++ |
| Трипсин/эластаза | 2.5/0.5 | +++ |
| Трипсин/коллагеназа II | 1/1 | +++ |
Таблица 1: Результаты сравнения эффектов диссоциации обычно используемых ферментов пищеварения для кишечника нильской тилапии. Большее количество символов «+» представляет собой более высокую степень диссоциации и более высокую жизнеспособность клеток. Фермент, помеченный знаком «*», является коммерческим продуктом, и лучший рабочий раствор в дозе 1 мг/мл включает 0,1 ЕД/мл коллагеназы I и 0,8 ЕД/мл диспазы. Другие смеси ферментов были смешаны, когда они использовались исследователями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии. Перед диссоциацией необходимо удаление жира и брыжейки из кишечника, особенно для толстоядных рыб с большим количеством жира. Использование шприца вместо жесткого соскабливания для смывания содержимого кишечника уменьшает механическое повреждение клеток. Чтобы обеспечить жизнеспособность клеток, также важно поддерживать температуру на уровне 20 °C или ниже для этапов рассечения тканей и промывки. Моющие растворы охлаждаются на льду, а температура центрифуги заранее доводится до 4 °C. Самое главное, следует выбрать мягкие и эффективные ферменты диссоциации клеток для исследуемой ткани. Основываясь на предыдущем исследовании, смесь коллагеназы и диспазы оптимальна для кишечника нильской тилапии. Эта комбинация ферментов мягче и эффективнее воздействует на кишечник тилапии, чем только трипсин, диспаза или коллагеназа. Кроме того, 5% FBS был включен в диссоциативный реагент для поддержания жизнеспособности клеток во время пищеварения39. Точное время инкубации варьируется в зависимости от используемых тканей. Время пищеварения необходимо увеличить, если ткань не полностью диссоциирована. Кроме того, для функционирования коллагеназы/диспазы требуется Ca2+. Поэтому PBS используется для разбавления фермента, а не DPBS, который не содержит Ca 2 + / Mg2 +. Для моющих растворов DPBS используется в случае, если эти ионы влияют на последующие этапы секвенирования.
Большинство ферментов диссоциации, включая коллагеназу / диспазу, работают с максимальной скоростью и эффективностью при оптимальной температуре, которая обычно составляет 37 ° C. При этой температуре гены транскрибируются, и уровни их экспрессии изменяются в ответ на обработку40,41. Об этом явлении сообщалось в нескольких исследованиях на млекопитающих и рыбках данио. В почках мыши апоптоз и гены, связанные со стрессом, включая JUN-B, FOS и Hsp90, дифференциально экспрессируются в различных условиях ферментативной диссоциации40. Дифференциальная экспрессия непосредственных ранних генов и генов HSP изменяется в плавниковых клетках рыбок данио-рерио при различных условиях диссоциации41. Было показано, что гены раннего ответа, включая нескольких членов семейств FOS и JUN, значительно повышаются после всего лишь нескольких минут разделения при 37 ° C в клеточных суспензиях, полученных ферментативной диссоциацией тканей млекопитающих6. Следовательно, изменения экспрессии в генах, связанных с апоптозом и стрессом, должны быть тщательно рассмотрены для данных ScRNA-seq. Этот недостаток можно преодолеть, используя соответствующие средства контроля для экспериментов ScRNA-seq. Один из контрольных элементов следует рассматривать в тех же условиях диссоциации, чтобы можно было обнаружить или избежать артефактных изменений в экспрессии генов.
В этом протоколе BSA добавляется к DPBS в первую очередь для минимизации потерь клеток и слипания клеток. Соотношения BSA от 0,04% до 1% можно использовать для приготовления суспензий одноклеточного секвенирования без побочных эффектов38. Использование правильной пропорции BSA уменьшит агрегацию клеток. Соответствующее соотношение должно быть оптимизировано для различных тканей и условий слипания клеток. В этом протоколе 0,08% BSA предотвращали прикрепление клеток кишечника нильской тилапии. Однако конечная ресуспендирование клеток не должно содержать BSA, чтобы избежать влияния Ca2 + / Mg2+ на последующие приложения.
Другой мерой по уменьшению агрегации клеток является добавление ДНКазы I. Разорванные или умирающие клетки высвобождают «липкие» молекулы ДНК, которые являются одной из основных причин слипания клеток. ДНКаза разлагает свободную ДНК и, таким образом, сводит к минимуму слипание клеток. Поэтому он обычно используется при приготовлении клеточной суспензии для секвенирования отдельных клеток42,43. Кроме того, щадящее пипетирование с использованием широкопроходных стеклянных пипеток или наконечников помогает уменьшить повреждение клеток. Специально для секвенирования одноклеточной РНК такие инструменты, как ножницы, трубки, стеклянные пипетки и клеточные ситечки, должны быть свободны от РНКазы.
Прежде всего, весь процесс приготовления высококачественной одноклеточной суспензии должен выполняться с использованием соответствующего фермента диссоциации, должен выполняться осторожно и быстро при низкой температуре и должен включать меры по предотвращению агрегации клеток с целью достижения высокой жизнеспособности и концентрации клеток и целостности нуклеиновых кислот. Этот протокол также может быть использован для приготовления кишечных одноклеточных суспензий для других видов рыб с незначительными изменениями. Кроме того, этот протокол также может служить ценным справочным материалом для разработки протоколов диссоциации клеток для других тканей рыб для секвенирования отдельных клеток и исследований на уровне отдельных клеток, таких как культивирование клеток и проточная цитометрия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность за поддержку со стороны Фонда естественных наук провинции Хайнань Китая (No 320QN211) и Программы исследовательского фонда ключевой лаборатории провинции Гуандун по борьбе с болезнями водных животных и здоровой культуре Китая (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
References
- Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
- He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
- Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
- Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
- Xu, S. H., Cooke, I. M.
- Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
- Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
- Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
- Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
- Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
- Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
- Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
- Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
- Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
- Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
- FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
- Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
- Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
- Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
- Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
