Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64688
Automatic Translation
*1, *1,3, 2, 4, 1,3, 1,3, 1,3
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מדגימים את הכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון לריצוף תא בודד.

Abstract

אמנון הנילוס הוא אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים הנפוצים ביותר בעולם והוא מודל מחקר נפוץ לחקר דגי חקלאות ימית. הכנת תרחיפים איכותיים של תא בודד חיונית למחקרים ברמת התא הבודד כגון RNA של תא בודד או ריצוף גנום. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש עבור מיני דגים חקלאות ימית, במיוחד עבור המעי של אמנון. אנזימי הדיסוציאציה היעילים משתנים בהתאם לסוג הרקמה. לכן, אופטימיזציה של פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות על ידי בחירת שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי היא חיונית. מחקר זה מדגים פרוטוקול אופטימלי להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי אמנון הנילוס עם שילוב אנזים של collagenase/dispase. שילוב זה יעיל מאוד לדיסוציאציה עם שימוש באלבומין בסרום בקר ו- DNase להפחתת צבירת תאים לאחר העיכול. תפוקת התא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם 90% כדאיות התא וריכוז תאים גבוה. פרוטוקול זה יכול גם להשתנות כדי להכין תרחיף חד-תאי מהמעיים של מיני דגים אחרים. מחקר זה מספק פרוטוקול ייחוס יעיל ומפחית את הצורך בניסויים נוספים בהכנת תרחיפים חד-תאיים למיני דגים של חקלאות ימית.

Introduction

תאים הם היחידות הבסיסיות של אורגניזמים. בהשוואה למחקרי רקמות בתפזורת, מחקרים ברמת תא בודד יכולים לשקף הטרוגניות של תאים ולספק מידע ברזולוציה גבוהה יותר1. בשנים האחרונות, חוקרים יישמו טכנולוגיות ריצוף חד-תאי עבור גנום, שעתוק, אפיגנום או מחקרים רב-אומיים ברמת התא הבודד ביונקים, דגי זברה ואורגניזמים מודל אחרים ודיווחו על פריצות דרך גדולות 2,3,4,5,6,7 . בעוד שרוב המחקרים התמקדו באורגניזמים מודלים, יש מעט פרוטוקולי ייחוס או ערכות דיסוציאציה מסחריות לריצוף חד-תאי במיני דגים כלכליים, מה שמגביל את היישום של ריצוף חד-תאי במחקר חקלאות ימית. לכן, פיתוח פרוטוקולים לדיסוציאציה של רקמות המייצרים תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה עם כדאיות גבוהה של תאים ושלמות חומצות גרעין הוא חיוני.

מיטוב פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות עם שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי הוא חיוני. האנזים היעיל ביותר לדיסוציאציה של רקמות משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ביונקים נעשה שימוש במספר אנזימים להכנת תרחיפים חד-תאיים לרקמות מוצקות של יונקים, כולל קולגן, דיספאז, טריפסין, פפאין, אלסטאז, היאלורונידאז, ליבראז, אקוטאז וטריפול 8,9. עיכול טריפסין בשילוב עם הפרעה מכנית שימש בדרך כלל כדי לנתק רקמות לתרבית תאים בדגים 10,11,12,13,14. טריפסין שימש או נוסף גם לקוקטייל העיכול לדיסוציאציה של רקמות במעי החולדה15 וברקמת הזימים של דג הזברה16. עם זאת, מכמה סיבות, טריפסין אינו האפשרות הטובה ביותר עבור ריצוף תא יחיד. טריפסין לבדו בדרך כלל אינו יעיל לדיסוציאציה של רקמות. בנוסף, טריפסין גורם לשבירת גדיל DNA 17,18 ולפירוק RNA19.

פפאין מפרק את החלבונים המרכיבים את הצמתים הצפופים בין התאים. בעצב יונקים ובתאי שריר חלקים, פפאין יעיל יותר והרסני פחות מפרוטאזות אחרות20,21. עם זאת, כמו טריפסין, פפאין גורם לצבירה חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה התא המתרחשת במהלך עיכול אנזימטי9. אלסטאז מפרק אלסטין, הנמצא בדרך כלל בעור, בריאות, ברצועות, בגידים וברקמות כלי הדם22. לעתים קרובות משתמשים בו בשילוב עם collagenase, dispase או טריפסין לניתוק רקמת ריאה8. היאלורונידאז קוטע את הקשרים הגליקוזידים של היאלורונן, ותורם לעיכול המטריצה החוץ תאית ברקמות חיבור שונות ובעור 9,23.

באופן כללי, collagenase ו dispase הם אפשרויות טובות עבור פירוק מטריצה תאיים. הם שימשו בדיסוציאציה של מעיים אנושיים, עכברים ודגי זברה24,25,26,27. Collagenase הורס את הקשר הפפטידי בקולגן, מקדם את העיכול של המטריצה החוץ תאית ומשחרר את התאים לתרחיף, ולכן collagenase משמש לעתים קרובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות של בני אדם ועכברים, כולל עבור הכבד 28,29, טחול30, לבלב31 ומעי 25. דיספאז הוא פרוטאז שמבצע הידרוליזה של קשרי פפטיד N-טרמינליים של שאריות חומצות אמינו לא קוטביות, והוא עדין יותר מקולגן. הוא מבקע את מרכיבי המטריקס החוץ תאיים, כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן מסוג IV, ובמידה פחותה קולגן מסוג I, מבלי להשפיע על הצטלבויות התא. דיספאז משמש בנפרד או עם אנזימים אחרים לדיסוציאציה של רקמות, כגון עבור מעי25,32, מוח33, כבד 34 וכו '. נוסף על כך, קוקטיילים מסחריים לעיכול, כולל ליבראז, אקוטאז וטריפל, הם גם חלופות טובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות, במיוחד עבור העור, הכבד והכליות 8,9.

אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus) שייך למשפחה Cichlidae של הסדר Perciformes. זהו אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים ביותר באזורים טרופיים וסובטרופיים, עם ייצור שנתי של 4.5 מיליון טון בשנת 202235. זהו אחד ממיני דגי החקלאות הימית הנחקרים ביותר עם גנום מבואר היטב. אמנון הנילוס הוא מודל מחקר אידיאלי עבור מיני דגים בחקלאות ימית בשל זמן הייצור הקצר שלו, קלות הגידול שלו ויכולת ההסתגלות למגוון רחב של סביבות גידול. המעי הוא בעל עניין מחקרי רב שכן הוא איבר התזונה, העיכול והספיגה, חילוף החומרים ומערכת החיסון הרירית. המעי הוא בית הגידול של אוכלוסיות מיקרוביאליות והוא רקמת חיסון חיונית36. הוא פעיל מבחינה חיסונית בשל נוכחותם של סוגים רבים של תאי חיסון, כולל מקרופאגים, תאי B, גרנולוציטים ותאי T.

במחקר הנוכחי פיתחנו פרוטוקול להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי האמנון של הנילוס כדי להקל על מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגי חקלאות ימית. על פי המאפיינים של אנזימים ספציפיים לרקמות אלה ועבודה ראשונית, collagenase/dispase מתאים לניתוק רקמת מעי אמנון. סוג האנזים האחרון שיש לקחת בחשבון בהכנת תרחיפים חד-תאיים הוא DNase-I, המונע צבירת תאים על ידי פירוק דנ"א חופשי המשתחרר דרך ליזה של תאים מתים במהלך עיכול אנזימטי מבלי ליזום מסלולים אפופטוטיים9 ומגביר את תפוקת התא החי36. בנוסף, אלבומין בסרום בקר (BSA) מתווסף למאגר הכביסה כדי להפחית את גושי התאים ולשפר את כדאיות התא. מספר חברות ריאגנטים מתארות BSA כמייצב אנזים. תוספת של 0.04%-1% BSA ל-PBS (מלח חוצץ פוספט) שימשה לפיתוח פתרון שטיפה להכנת מתלי ריצוף חד-תאי ללא תופעות לוואי38. תוספת של יחס נמוך של BSA יכולה לעזור לשמור על כדאיות התא ולמנוע הצטברות חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה של תאים. פרוטוקול זה יכול גם לספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים מהמעיים של מיני דגים אחרים בחקלאות ימית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים במהלך מחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת היינאן (מספר פרוטוקול: HNUAUCC-2022-00063; תאריך אישור: 2022-03-03). רשימה של הציוד והאספקה ששימשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת החומרים. סיכום הפרוטוקול הנוכחי מתואר באיור 1.

1. הכנת דגים

  1. להשיג אמנון נילוס בן 6 חודשים עם משקל גוף ממוצע של 100 גרם ממקור אמין. בחר דגים ללא כל סימני מחלה.
  2. הפסיקו להאכיל את הדגים 24 שעות לפני שתמשיכו לשלב הבא.
    הערה: צום דגים מפחית את נפח תוכן המעי ומקל על הכנת מקטעי מעיים.
  3. שטפו את הדגים במים סטריליים מאווררים היטב במשך 15 דקות כדי לשטוף חיידקים הקשורים באופן רופף על פני הגוף.
  4. הרדימו את הדג עם 300 מ"ג/ליטר טריקאין מתאן-סולפונט (MS-222) למשך כ-10 דקות עד שכל התנועה תיפסק.

2. הכנת מגיב

  1. הכן 0.08% מלח חוצץ פוספט של BSA-Dulbecco (BSA-DPBS, לשטיפת תאים והשעיה). יש להמיס 0.08 גרם BSA (0.8% w/v) ב-100 מ"ל של DPBS אחד. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולקרר מראש על קרח בעת השימוש.
    הערה: התוספת של BSA מועילה למזעור גושי תאים. ניתן להגדיל את יחס BSA מ -0.04% ל -1% בהתאם לתנאי גושי התא.
  2. הכינו את מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התא.
    1. לדלל את collagenase / dispase עם 1x PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל (0.1 U/mL collagenase ו 0.8 U/mL dispase). ודא שנעשה שימוש ב- PBS ולא ב- DPBS.
      הערה: PBS מספק את יוני הסידן הדרושים לתפקוד תקין של האנזים. אין להשתמש ב- DPBS בשלב זה מכיוון שהוא נטול Ca 2+/Mg2+. בנוסף, collagenase סוג I משמש בפרוטוקול הנוכחי.
    2. מסננים את הדילול דרך מסנן קרום סטרילי של 0.22 מיקרומטר.
    3. הכינו מגיב דיסוציאציה תאי המורכב מנפח של 95% של תמיסת קולגן/דיספאס ונפח של 5% של סרום בקר עוברי (FBS).
      הערה: מגיב הדיסוציאציה צריך להיות טרי בכל פעם שהוא בשימוש. שימוש ב-5% FBS מסייע לשמור על יכולת הקיום של התא במהלך העיכול.
  3. הכינו תמיסת טריפאן כחולה.
    1. קח את הפתרון הכחול טריפאן מן המקרר 4 ° C, ולשמור אותו על 15-20 ° C במשך כמה דקות לפני השימוש כדי למנוע משקעים.
    2. סנן את התמיסה דרך קרום סטרילי של 0.22 מיקרומטר.

3. הכנת ציוד

  1. מצננים מראש את הצנטריפוגה בקירור ל-4°C לפני השימוש.
  2. השג צינורות צנטריפוגות סטריליים ללא RNase 1.5 מ"ל, צינורות חרוטיים 50 מ"ל, פיפטות וקצוות זכוכית רחבים, מסנני ממברנה, מסננות תאים וכל צינורות השימור הנמוכים והקצוות.
  3. פיפטות זכוכית אוטוקלאביות וכלי דיסקציה, כולל מלקחיים, מספריים ואזמלים, ולטפל בהם מראש עם תמיסת הסרת RNase כדי למנוע את ההשפעות השליליות של RNase עבור RNA-seq תא יחיד.

4. דיסקציה של רקמות ודיסוציאציה של תאים

  1. הניחו את הדג המרדים על קרח לנתיחה. Aseptically, לאסוף 3-4 ס"מ של החלק האמצעי של המעי, הבלו כמו שומן mesentery ככל האפשר. בזהירות להסיר את השומן מחובר פני השטח של המעי ואת שכבת רירית אלסטי גמיש ברור עם מלקחיים.
    הערה: השומן והמזנטריה מחוברים לפני השטח החיצוניים של המעי.
  2. הסר כמה שיותר שומן כדי למנוע את ההשפעות השליליות שלה על פרוטוקול הדיסוציאציה. באמצעות מזרק, לשטוף בעדינות את השברים עם PBS סטרילי קר כקרח מספר פעמים כדי לשטוף את תוכן המעי ואת הריר. הימנע מטיפול גס.
  3. לנתח את קטע המעי לחתיכות קטנות, ולהעביר אותם צינור 1.5 מ"ל מלא 1 מ"ל של PBS קר כקרח.
  4. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F). הסר את הסופרנאטנט בעדינות, והחלף ב-1 מ"ל של 0.08% BSA-DPBS קר כקרח. השהה מחדש את שברי הרקמה על ידי שאיפה עדינה באמצעות פיפטה זכוכית. חזור על שלב זה פעמיים.
  5. הסר את supernatant, ולעכל את שברי הרקמה באמצעות 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה אנזימטי (950 μL של collagenase / dispase פתרון ו 50 μL של FBS) באמבט מים 37 ° C במשך 30-60 דקות.
    1. בנוסף, הוסף 5 μL של מעכב RNase (40 U/μL בתמיסת המלאי) למגיב הדיסוציאציה אם הדגימות מוכנות לריצוף RNA חד-תאי.
      הערה: הריכוז הסופי של תערובת collagenase/dispase הוא 1 מ"ג/מ"ל, כולל collagenase ב-0.1 U/mL ו-dispase ב-0.8 U/mL.
  6. הפוך ידנית את הצינור במרווחים של 5 דקות במהלך אמבט המים של 30-60 דקות.
    הערה: זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לרקמות המשמשות. בדוק את התקדמות הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ עד שלא נראית רקמה בתפזורת. מניחים 10 μL של תרחיף התא על מגלשת זכוכית עם פיפטה, ולבחון אותו תחת המיקרוסקופ. הגדל את זמן העיכול אם התאים אינם מנותקים לחלוטין.
  7. סובב את הצינורות ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ובעדינות להסיר את מגיב דיסוציאציה תאים אנזימטי באמצעות קצוות רחבים. הוסיפו 1 מ"ל של BSA-DPBS 0.08% קר כקרח, והפייטו בעדינות את התאים מעלה ומטה באמצעות פיפטה רחבה מזכוכית למשך דקה אחת.
    1. חזור על שלב זה פעמיים.
      הערה: יש לבצע את הפיטינג למעלה ולמטה בזהירות באמצעות קצוות רחבים ובעלי שימור נמוך כדי למנוע הפרעה לתאים.
  8. הרטיבו מראש מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר עם 0.08% BSA-DPBS, והכניסו אותה לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. מעבירים את מתלה התא דרך המסננת. יש לטפוח ולשטוף עם DPBS נוסף של 200 μL, ולאסוף את המתלה בתחתית הצינור.
  9. מעבירים את המתלה לצינור בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 5 μL של DNase I (1 U/μL), ודגור במשך 15 דקות ב 15-20 ° C. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
  10. הסר את supernatant, ו resuspend את גלולת התא ב 400 μL של DPBS קר כקרח (Ca 2+/Mg2+ חינם). פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עם קצוות רחבים כדי לערבב את התאים. חזור על שלב זה פעמיים.

5. צביעה ובדיקה מיקרוסקופית

  1. להכתמה, ערבבו את מתלה התא עם תמיסת טריפאן כחולה 0.4% ביחס של 1:1. יש לדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. מוסיפים 5-10 μL מהתערובת על המוציטומטר, ובודקים תחת המיקרוסקופ.
    הערה: לתאים בני קיימא תהיה ציטופלסמה לא מוכתמת, בעוד שלתאים מתים תהיה ציטופלסמה כחולה (איור 2).
  3. ספרו את התאים החיים והמתים בשלושה שדות שונים תחת המיקרוסקופ. חשב את אחוז הכדאיות של התא על-ידי חלוקת מספר התאים בני קיימא במספר התאים הכולל בשדה.
    הערה: כדאיות התא צריכה להיות יותר מ- 85%, וריכוז התא לא צריך להיות קטן מ- 1 x 105-1 x 107/mL. רקע תרחיף התא צריך להיות נקי, ללא גושים, שברים או זיהומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי (איור 1). מחקר זה מראה כי לתערובת collagenase/dispase יש אפקט דיסוציאציה טוב והיא קלה לרקמת המעי. הבחירה של אנזים העיכול האופטימלי חיונית להכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה. בעבודה הראשונית הושוותה יעילות הדיסוציאציה של מספר אנזימים נפוצים, והתוצאות מפורטות בטבלה 1. תערובת collagenase/dispase אומתה כבעלת אפקט דיסוציאציה הרבה יותר טוב מאשר collagenase, dispase או טריפסין בלבד ומספר תערובות אנזימים אחרות, כולל liberase, טריפסין/אלסטאז, collagenase/elastase ו-collagenase/trypsin. יתר על כן, collagenase / dispase גם הניב את התאים קיימא ביותר בסוף הניסוי.

בזמן הדגירה נבדקה התקדמות הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. לאחר 30 דקות, הרקמה בתפזורת כמעט נעלמה, ובאופן כללי, לא נראתה רקמה בתפזורת לאחר 45 דקות. לאחר העיכול, תרחיף התא הסתנן דרך המסננת בקלות. בעקבות פרוטוקול זה, הצביעה הכחולה של טריפאן והבדיקה המיקרוסקופית הראו כי תאי המעי היו בעלי כדאיות תאים גבוהה (יותר מ -90%; איור 2, וכי ריכוז התא יכול להיות עד 1 x 107/mL. התאים פוזרו כתאים בודדים. רוב התאים היו בהירים ולבנים (תאים בני קיימא), בעוד שרק מעטים היו כהים או כחולים (תאים מתים). תאים מתים מוכתמים בכחול כהה בגלל קרום התא החדיר. כדאיות התא וריכוז התא סיפקו את הדרישות של ריצוף תא יחיד.

Figure 1
איור 1: דיאגרמת זרימה מסכמת של דיסוציאציה של מעי אמנון הנילוס ופרוטוקולי הכנת תרחיף חד-תאי. הריאגנטים מוכנים (סעיפים 1-2) לפני כריתת המעי. המעיים טחונים ונשטפים באופן צנטריפוגלי ב-PBS (שלבים 4.1-4.4). שברי הרקמה מתעכלים באמצעות תמיסת collagenase/dispase באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי לבודד את התאים (שלבים 4.5-4.6). תרחיף התאים המעוכל נשטף עם 0.08% BAS-DPBS ומסונן דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר (שלבים 4.7-4.8). לאחר דגירה של DNase I, גלולת התא מושהית מחדש ב-DPBS (שלבים 4.9-4.10). צביעה כחולה טריפאן קובעת את ריכוז התא ואת הכדאיות (סעיף 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בדיקה מיקרוסקופית של תרחיף חד-תאי שהוכן מרקמת מעי אמנון הנילוס ומוכתם בכחול טריפאן. תאים בני קיימא הם לבנים ובהירים, ואילו תאים מתים הם כהים וכחולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אנזים ריכוז העבודה הטוב ביותר (מ"ג/מ"ל) אפקט הדיסוציאציה
קולגנאז II 1 +++
דיספסי 0.25 ++
טריפסין 2.5 ++
ליבראסה 1 +++
*קולגןאז/דיספאס 1 +++++
Collagenase II/אלסטאז 1/1 +++
טריפסין/אלסטאז 2.5/0.5 +++
טריפסין/קולגנאז II 1/1 +++

טבלה 1: תוצאות השוואה של השפעות הדיסוציאציה של אנזימי עיכול נפוצים במעי אמנון הנילוס. יותר סמלי "+" מייצגים רמה גבוהה יותר של דיסוציאציה ויכולת קיום גבוהה יותר של תאים. האנזים המסומן עם "*" הוא מוצר מסחרי, והפתרון הטוב ביותר של 1 מ"ג/מ"ל כולל 0.1 U/mL collagenase I ו-0.8 U/mL dispase. התערובות האחרות של אנזימים היו מעורבבות כאשר הן שימשו את החוקרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס. לפני הדיסוציאציה, הסרת שומן ומזנטריה מהמעי היא הכרחית, במיוחד עבור מעיים דגים טורפים עם שומן רב. שימוש במזרק במקום גירוד קשה כדי לשטוף את תוכן המעי מפחית את הנזק המכני לתאים. כדי להבטיח את כדאיות התא, חיוני גם לשמור על הטמפרטורה ב -20 מעלות צלזיוס ומטה עבור שלבי הדיסקציה והשטיפה של הרקמות. פתרונות הכביסה מקוררים על קרח, וטמפרטורת הצנטריפוגות מותאמת ל -4 מעלות צלזיוס מראש. והכי חשוב, יש לבחור אנזימי דיסוציאציה תאיים קלים ויעילים עבור הרקמה הנחקרת. בהתבסס על מחקר קודם, תערובת collagenase/dispase היא אופטימלית למעי אמנון הנילוס. שילוב אנזימים זה עדין ויעיל יותר על מעי האמנון מאשר טריפסין, דיספאז או קולגנאז בלבד. בנוסף, 5% FBS נכללו בריאגנט הדיסוציאציה כדי לשמור על כדאיות התא במהלך העיכול39. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לרקמות המשמשות. זמן העיכול צריך להיות מוגבר אם הרקמה אינה מנותקת לחלוטין. בנוסף, collagenase/dispase דורש Ca2+ כדי לתפקד. לכן, PBS משמש לדלל את האנזים ולא DPBS, אשר ללא Ca 2+/Mg2+. עבור פתרונות שטיפה, DPBS משמש במקרה יונים אלה משפיעים על שלבי הרצף במורד הזרם.

רוב אנזימי הדיסוציאציה, כולל collagenase/dispase, פועלים במהירות וביעילות מרביות בטמפרטורה האופטימלית שלהם, שהיא בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה זו, גנים משועתקים, ורמות הביטוי שלהם משתנות בתגובה לטיפול40,41. תופעה זו דווחה במספר מחקרים ביונקים ודגי זברה. בכליה של עכבר, אפופטוזיס וגנים הקשורים ללחץ כולל JUN-B, FOS ו- Hsp90 באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתנאי דיסוציאציה אנזימטיים שונים40. הביטוי הדיפרנציאלי של גנים מוקדמים מיידיים וגנים HSP משתנה בתאי סנפיר דג זברה בתנאי דיסוציאציה שונים41. הוכח כי גנים של תגובה מוקדמת, כולל חברים רבים במשפחות FOS ו- JUN, מווסתים באופן משמעותי לאחר מספר דקות בלבד של הפרדה ב -37 מעלות צלזיוס במתלי תאים שהוכנו על ידי הדיסוציאציה האנזימטית של רקמות יונקים6. לכן, יש לשקול בזהירות את שינויי הביטוי באפופטוזיס ובגנים הקשורים ללחץ עבור נתוני ScRNA-seq. ניתן להתגבר על חסרון זה על ידי שימוש בבקרות מתאימות לניסויי ScRNA-seq. אחת הבקרות צריכה להיות מטופלת באותם תנאי דיסוציאציה, כך שניתן יהיה לזהות או להימנע משינויים בביטוי הגנים.

בפרוטוקול זה, BSA מתווסף ל- DPBS בעיקר כדי למזער אובדן תאים וגושי תאים. יחסים של BSA בין 0.04% ל -1% יכולים לשמש להכנת השעיות ריצוף תא יחיד ללא תופעות לוואי38. שימוש ביחס BSA הנכון יפחית את צבירת התאים. היחס המתאים צריך להיות מותאם לרקמות שונות ולתנאי הצטברות תאים. בפרוטוקול זה, 0.08% BSA מנע חיבור תאי מעי אמנון הנילוס. עם זאת, מתלה התא הסופי לא אמור להכיל BSA כדי למנוע את ההשפעה של Ca 2+/Mg2+ על היישומים במורד הזרם.

אמצעי נוסף להפחתת צבירת תאים הוא תוספת של DNase I. תאים קרועים או גוססים משחררים מולקולות דנ"א "דביקות", שהן בין הגורמים העיקריים להיווצרות תאים. DNase מפרק DNA חופשי, ובכך ממזער את גושי התא. לכן, הוא נפוץ בהכנת תרחיף תאים לריצוף תא בודד42,43. בנוסף, פיפטינג עדין באמצעות פיפטות או קצוות זכוכית רחבים מסייע להפחית את הנזק לתאים. במיוחד עבור RNA-seq חד-תאי, כלים כגון מספריים, צינורות, פיפטות זכוכית ומסננות תאים חייבים להיות נטולי RNase.

מעל לכל, כל תהליך ההכנה של תרחיף חד תאי באיכות גבוהה צריך להיעשות עם אנזים דיסוציאציה המתאים, צריך להתבצע בעדינות ובמהירות בטמפרטורה נמוכה, וצריך לכלול אמצעים למניעת תאים מצטברים על מנת להשיג כדאיות תאים גבוהה וריכוז שלמות חומצת גרעין. פרוטוקול זה יכול לשמש גם להכנת תרחיפים חד-תאיים במעי עבור מיני דגים אחרים עם שינויים קלים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול גם לספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים עבור רקמות דגים אחרות עבור ריצוף תא בודד ומחקרים ברמת התא היחיד, כגון תרבית תאים וציטומטריית זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להכיר בתמיכת הקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן של סין (NO. 320QN211) ותוכנית קרן המחקר של מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג לבקרת מחלות בעלי חיים ימיים ותרבות בריאה של סין (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 192 אמנון הנילוס מעי דיסוציאציה של רקמות הכנת תרחיף חד-תאי
הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, P., Zhou, Y., Wang, B.,… More

Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter