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सिंगल-सेल सीक्वेंसिंग के लिए नाइल तिलापिया आंत से सिंगल-सेल सस्पेंशन तैयारी

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64688
Automatic Translation
*1, *1,3, 2, 4, 1,3, 1,3, 1,3
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए तिलापिया आंत के उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी का प्रदर्शन करते हैं।

Abstract

नील तिलापिया दुनिया भर में सबसे अधिक सुसंस्कृत मीठे पानी की मछली प्रजातियों में से एक है और जलीय कृषि मछली अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला शोध मॉडल है। एकल-कोशिका आरएनए या जीनोम अनुक्रमण जैसे एकल-कोशिका स्तर के अध्ययन के लिए उच्च-गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन की तैयारी आवश्यक है। हालांकि, जलीय कृषि मछली प्रजातियों के लिए कोई उपयोग के लिए तैयार प्रोटोकॉल नहीं है, विशेष रूप से तिलापिया की आंत के लिए। ऊतक प्रकार के आधार पर प्रभावी पृथक्करण एंजाइम भिन्न होते हैं। इसलिए, न्यूनतम क्षति के साथ पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त एंजाइम या एंजाइम संयोजन का चयन करके ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल का अनुकूलन आवश्यक है। यह अध्ययन नील तिलापिया आंत से एक उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन को तैयार करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल को दर्शाता है, जिसमें कोलेजनेस / डिस्पेस के एंजाइम संयोजन के साथ होता है। पाचन के बाद सेल एकत्रीकरण को कम करने के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन और डीनेस के उपयोग के साथ पृथक्करण के लिए यह संयोजन अत्यधिक प्रभावी है। सेल आउटपुट 90% सेल व्यवहार्यता और उच्च सेल एकाग्रता के साथ एकल-सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यकताओं को पूरा करता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य मछली प्रजातियों की आंतों से एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। यह शोध एक कुशल संदर्भ प्रोटोकॉल प्रदान करता है और जलीय कृषि मछली प्रजातियों के लिए एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी में अतिरिक्त परीक्षणों की आवश्यकता को कम करता है।

Introduction

कोशिकाएं जीवों की मूलभूत इकाइयाँ हैं। थोक-ऊतक अध्ययनों की तुलना में, एकल-कोशिका स्तर के अध्ययन सेल विषमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं और उच्च-रिज़ॉल्यूशनजानकारी प्रदान कर सकते हैं। हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं ने स्तनधारियों, ज़ेबराफिश और अन्य मॉडल जीवों में एकल-कोशिका स्तर पर जीनोम, ट्रांसक्रिपटम, एपिजेनोम, या मल्टी-ओमिक अध्ययनों के लिए एकल-कोशिका अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को लागू किया है और 2,3,4,5,6,7 की बड़ी सफलताओं की सूचना दी है।. जबकि अधिकांश अध्ययनों ने मॉडल जीवों पर ध्यान केंद्रित किया है, आर्थिक मछली प्रजातियों में एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए कुछ संदर्भ प्रोटोकॉल या वाणिज्यिक पृथक्करण किट हैं, जो जलीय कृषि अनुसंधान में एकल-कोशिका अनुक्रमण के आवेदन को सीमित करता है। इसलिए, ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल विकसित करना जो उच्च सेल व्यवहार्यता और न्यूक्लिक एसिड अखंडता के साथ उच्च गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन का उत्पादन करता है, महत्वपूर्ण है।

न्यूनतम क्षति के साथ पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त एंजाइम या एंजाइम संयोजन के साथ ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल का अनुकूलन आवश्यक है। ऊतक पृथक्करण के लिए सबसे प्रभावी एंजाइम ऊतक प्रकार के आधार पर भिन्न होता है। स्तनधारियों में, स्तनधारी ठोस ऊतकों के लिए एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए कई एंजाइमों का उपयोग किया गया है, जिसमें कोलेजनेज़, डिस्पास, ट्रिप्सिन, पपैन, इलास्टेस, हाइलूरोनिडेज़, लिबरेज, एक्यूटेज़ और ट्राइप्ले 8,9 शामिल हैं। यांत्रिक व्यवधान के साथ संयुक्त ट्रिप्सिन पाचन का उपयोग आमतौर पर मछली10,11,12,13,14 में सेल कल्चर के लिए ऊतकों को अलग करने के लिए किया जाता है। ट्रिप्सिन का उपयोग चूहे की आंत15 और ज़ेब्राफिश गिल ऊतक16 में ऊतक पृथक्करण के लिए पाचन कॉकटेल में भी किया गया है। हालांकि, कई कारणों से, ट्रिप्सिन एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए सबसे अच्छा विकल्प नहीं है। अकेले ट्रिप्सिन आमतौर पर ऊतक पृथक्करण के लिए अप्रभावी होता है। इसके अतिरिक्त, ट्रिप्सिन डीएनए स्ट्रैंडको 17,18 और आरएनए गिरावट 19 को प्रेरित करता है।

पपैन प्रोटीन को नीचा दिखाता है जो कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शन बनाते हैं। स्तनधारी तंत्रिका और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में, पपैन अन्य प्रोटीज20,21 की तुलना में अधिक कुशल और कम विनाशकारी है। हालांकि, ट्रिप्सिन की तरह, पपैन के परिणामस्वरूप सेल लाइसिस के कारण कोशिकाओं के मुक्त डीएनए-प्रेरित एकत्रीकरण होता है जो एंजाइमेटिक पाचन9 के दौरान होता है। इलास्टेस इलास्टिन को तोड़ता है, जो आमतौर पर त्वचा, फेफड़े, स्नायुबंधन, टेंडन और संवहनी ऊतकों में पाया जाताहै। यह अक्सर फेफड़ोंके ऊतकों को अलग करने के लिए कोलेजनेज, डिस्पेस, या ट्रिप्सिन के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है। Hyaluronidase Hyaluronan के ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड को छोड़ देता है, जो विभिन्न संयोजी ऊतकों और त्वचा में बाह्य मैट्रिक्स के पाचन में योगदान देता है 9,23.

सामान्य तौर पर, कोलेजनेज और डिस्पेस बाह्य मैट्रिक्स टूटने के लिए अच्छे विकल्प हैं। उनका उपयोग मानव, माउस और जेब्राफिश आंतों 24,25,26,27 के पृथक्करण में किया गया है। कोलेजनेस कोलेजन में पेप्टाइड बंधन को नष्ट कर देता है, बाह्य मैट्रिक्स के पाचन को बढ़ावा देता है, और कोशिकाओं को निलंबन में छोड़ देता है, और, इस प्रकार, कोलेजनेज का उपयोग अक्सर मानव और माउस ठोस ऊतक पृथक्करण के लिए किया जाता है, जिसमें यकृत28,29, प्लीहा30, अग्न्याशय31 और आंत 25 शामिल हैं।. डिस्पेस एक प्रोटीज है जो नॉनपोलर अमीनो एसिड अवशेषों के एन-टर्मिनल पेप्टाइड बॉन्ड को हाइड्रोलाइज करता है और कोलेजनेस की तुलना में हल्का है। यह सेल-सेल जंक्शनों को प्रभावित किए बिना फाइब्रोनेक्टिन, टाइप IV कोलेजन, और कुछ हद तक, टाइप 1 कोलेजन जैसे बाह्य मैट्रिक्स घटकों को छोड़ देता है। डिस्पेस का उपयोग ऊतक पृथक्करण के लिए अलग से या अन्य एंजाइमों के साथ किया जाता है, जैसे कि आंत25,32, मस्तिष्क33, यकृत34, आदि। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पाचन कॉकटेल, जिसमें लिबरेज, एक्यूटेस और ट्राइप्ले शामिल हैं, ठोस ऊतक पृथक्करण के लिए भी अच्छे विकल्प हैं, खासकर त्वचा, यकृतऔर गुर्दे 8,9 के लिए।

नाइल तिलापिया (ओरियोक्रोमिस निलोटिकस) पर्सिफोर्म्स क्रम के सिक्लिडे परिवार से संबंधित है। यह उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में सबसे सुसंस्कृत मीठे पानी की मछली प्रजातियों में से एक है, जिसका वार्षिक उत्पादन 202235 में 4.5 मिलियन टन है। यह एक अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम के साथ सबसे अच्छी तरह से अध्ययन की गई जलीय कृषि मछली प्रजातियों में से एक है। नील तिलापिया अपनी छोटी पीढ़ी के समय, पालन में आसानी और पालन वातावरण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलनशीलता के कारण जलीय कृषि मछली प्रजातियों के लिए एक आदर्श अनुसंधान मॉडल है। आंत बहुत शोध रुचि का है क्योंकि यह पोषण, पाचन और अवशोषण, चयापचय और श्लैष्मिक प्रतिरक्षा का अंग है। आंत माइक्रोबियल आबादी का निवास स्थान है और एक आवश्यक प्रतिरक्षा ऊतकहै। मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, ग्रैनुलोसाइट्स और टी कोशिकाओं सहित कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की उपस्थिति के कारण यह प्रतिरक्षात्मक रूप से सक्रिय है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने जलीय कृषि मछली प्रजातियों में एकल-कोशिका स्तर के अध्ययन की सुविधा के लिए नील तिलापिया आंत से उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। इन ऊतक-विशिष्ट एंजाइमों और प्रारंभिक कार्य की विशेषताओं के अनुसार, तिलपिया आंत ऊतक को अलग करने के लिए कोलेजनेज / डिस्पेस उपयुक्त है। एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने में विचार करने के लिए अंतिम एंजाइम प्रकार DNase-I है, जो एपोप्टोटिक मार्ग9 शुरू किए बिना एंजाइमेटिक पाचन के दौरान मृत सेल लाइसिस के माध्यम से जारी मुक्त डीएनए को कम करके सेल एकत्रीकरण को रोकता है और जीवित सेल उपज36 को बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, सेल क्लंपिंग को कम करने और सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को वॉशिंग बफर में जोड़ा जाता है। कई अभिकर्मक कंपनियां बीएसए को एंजाइम स्टेबलाइजर के रूप में वर्णित करती हैं। पीबीएस (फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन) में 0.04% -1% बीएसए को जोड़ने का उपयोगप्रतिकूल प्रभावों के बिना एकल-सेल अनुक्रमण निलंबन तैयार करने के लिए एक वाशिंग समाधान विकसित करने के लिए किया गया है। बीएसए के कम अनुपात को जोड़ने से सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने और सेल लाइसिस के कारण कोशिकाओं के मुक्त डीएनए-प्रेरित एकत्रीकरण से बचने में मदद मिल सकती है। यह प्रोटोकॉल अन्य जलीय कृषि मछली प्रजातियों की आंतों से सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ भी प्रदान कर सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन के दौरान सभी पशु प्रोटोकॉल को हैनान विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या: एचएनयूएयूसीसी-2022-00063) द्वारा अनुमोदित किया गया था; अनुमोदन तिथि: 2022-03-03)। इस प्रयोग में उपयोग किए गए उपकरणों और आपूर्ति की एक सूची सामग्री की तालिका में पाई जा सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल का सारांश चित्र 1 में चित्रित किया गया है।

1. मछली की तैयारी

  1. एक विश्वसनीय स्रोत से 100 ग्राम के औसत शरीर के वजन के साथ 6 महीने का नील तिलापिया प्राप्त करें। उन मछलियों का चयन करें जो बीमारी के किसी भी लक्षण से मुक्त हैं।
  2. अगले चरण में जाने से पहले 24 घंटे मछली को खिलाना बंद कर दें।
    नोट: मछली उपवास आंतों की सामग्री की मात्रा को कम करता है और आंतों के खंडों की तैयारी की सुविधा प्रदान करता है।
  3. शरीर की सतह पर ढीले बैक्टीरिया को धोने के लिए मछली को 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से वातित बाँझ पानी में कुल्ला करें।
  4. मछली को 300 मिलीग्राम / एल ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट (एमएस -222) के साथ लगभग 10 मिनट के लिए इच्छामृत्यु करें जब तक कि सभी आंदोलन बंद न हो जाएं।

2. अभिकर्मक तैयारी

  1. सेल कुल्ला और रिसस्पेंशन के लिए 0.08% बीएसए-डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (बीएसए-डीपीबीएस) तैयार करें। 1x DPBS के 100 mL में BSA के 0.08 g (0.8% w/v) को घोलें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और उपयोग किए जाने पर बर्फ पर प्री-कूल करें।
    नोट: सेल क्लंपिंग को कम करने के लिए बीएसए को जोड़ना फायदेमंद है। सेल क्लंपिंग स्थितियों के अनुसार बीएसए अनुपात को 0.04% से 1% तक बढ़ाया जा सकता है।
  2. एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण अभिकर्मक तैयार करें।
    1. 1x PBS के साथ कोलेजनेज़ / डिस्पेस को 1 मिलीग्राम / एमएल (0.1 यू / एमएल कोलेजनेस और 0.8 यू / एमएल डिस्पेस) की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। सुनिश्चित करें कि पीबीएस का उपयोग किया जाता है न कि डीपीबीएस का।
      नोट: पीबीएस एंजाइम को ठीक से काम करने के लिए आवश्यक कैल्शियम आयन प्रदान करता है। इस चरण में DPBS का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह Ca 2 + / Mg2 + मुक्त है। इसके अतिरिक्त, वर्तमान प्रोटोकॉल में कोलेजनेस टाइप 1 का उपयोग किया जाता है।
    2. एक बाँझ 0.22 μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से कमजोर पड़ने को फ़िल्टर करें।
    3. एक सेल पृथक्करण अभिकर्मक तैयार करें जो कोलेजनेज / डिस्पेस समाधान की 95% मात्रा और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) की 5% मात्रा से बना है।
      नोट: पृथक्करण अभिकर्मक को हर बार उपयोग किए जाने पर ताजा बनाया जाना चाहिए। 5% एफबीएस का उपयोग पाचन के दौरान सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने में मदद करता है।
  3. ट्राइपैन ब्लू घोल तैयार करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से ट्राइपैन ब्लू घोल लें, और वर्षा को रोकने के लिए उपयोग करने से पहले कुछ मिनट के लिए इसे 15-20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. एक बाँझ 0.22 μm झिल्ली के माध्यम से घोल को फ़िल्टर करें।

3. उपकरण की तैयारी

  1. उपयोग करने से पहले प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-ठंडा करें।
  2. बाँझ आरएनएस-मुक्त 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, वाइड-बोर ग्लास पिपेट और टिप्स, झिल्ली फिल्टर, सेल स्ट्रेनर, और सभी कम प्रतिधारण ट्यूब और युक्तियां प्राप्त करें।
  3. ऑटोक्लेव ग्लास पिपेट और विच्छेदन उपकरण, जिसमें फोर्स, कैंची और स्केलपेल शामिल हैं, और एकल-सेल आरएनए-सेक के लिए आरएनएस के प्रतिकूल प्रभावों को रोकने के लिए आरएनएस हटाने के समाधान के साथ उनका पूर्व-उपचार करें।

4. ऊतक विच्छेदन और कोशिका पृथक्करण

  1. विच्छेदन के लिए इच्छामृत्यु मछली को बर्फ पर रखें। सड़न रोकनेवाला रूप से, आंत के मध्य-खंड के 3-4 सेमी एकत्र करें, और जितना संभव हो उतना वसा और मेसेंटरी का उत्पादन करें। आंतों की सतह से जुड़ी वसा और लोचदार और निंदनीय स्पष्ट श्लेष्म की परत को बल के साथ सावधानीपूर्वक हटा दें।
    नोट: वसा और मेसेंटरी आंत की बाहरी सतह से जुड़े होते हैं।
  2. पृथक्करण प्रोटोकॉल पर इसके प्रतिकूल प्रभावों को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना वसा निकालें। एक सिरिंज का उपयोग करके, आंतों की सामग्री और बलगम को धोने के लिए कई बार बाँझ बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ टुकड़ों को धीरे से कुल्ला करें। मोटे तौर पर संभालने से बचें।
  3. आंत के खंड को छोटे टुकड़ों में विच्छेदित करें, और उन्हें 1.5 एमएल बर्फ-ठंडे पीबीएस से भरे 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को धीरे से निकालें, और 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 0.08% बीएसए-डीपीबीएस के साथ बदलें। कांच के पिपेट का उपयोग करके कोमल आकांक्षा द्वारा ऊतक के टुकड़ों को फिर से निलंबित करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  5. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एंजाइमेटिक पृथक्करण अभिकर्मक (950 μL कोलेजनेस / डिस्पेस समाधान और 50 μL FBS) के 1 मिलीलीटर का उपयोग करके ऊतक के टुकड़ों को पचाएं।
    1. इसके अतिरिक्त, यदि नमूने एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण के लिए तैयार किए जाते हैं, तो पृथक्करण अभिकर्मक में 5 μL RNase अवरोधक (स्टॉक समाधान में 40 U / μL) जोड़ें।
      नोट: कोलेजनेस / डिस्पैस मिश्रण की अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल है, जिसमें 0.1 यू / एमएल पर कोलेजनेस और 0.8 यू / एमएल पर डिस्पेसेज शामिल हैं।
  6. 30-60 मिनट के पानी के स्नान के दौरान 5 मिनट के अंतराल पर ट्यूब को मैन्युअल रूप से इनवर्ट करें।
    नोट: सटीक इनक्यूबेशन समय उपयोग किए गए ऊतकों के अनुसार भिन्न होता है। माइक्रोस्कोप के तहत पृथक्करण की प्रगति की जांच करें जब तक कि कोई थोक ऊतक न दिखे। सेल सस्पेंशन के 10 μL को एक पिपेट के साथ एक ग्लास स्लाइड पर रखें, और माइक्रोस्कोप के नीचे इसकी जांच करें। यदि कोशिकाएं पूरी तरह से अलग नहीं होती हैं तो पाचन का समय बढ़ाएं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर ट्यूबों को घुमाएं, और धीरे-धीरे वाइड-बोर टिप्स का उपयोग करके एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण अभिकर्मक को हटा दें। 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 0.08% बीएसए-डीपीबीएस जोड़ें, और 1 मिनट के लिए एक चौड़े बोर ग्लास पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    1. इस चरण को दो बार दोहराएं।
      नोट: सेल व्यवधान को रोकने के लिए वाइड-बोर और कम-प्रतिधारण युक्तियों का उपयोग करके ऊपर और नीचे पिपेटिंग को देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।
  8. 0.08% बीएसए-डीपीबीएस के साथ 40 μm सेल छन्नी को प्री-वेट करें, और इसे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखें। छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें। अतिरिक्त 200 μL DPBS के साथ टैप और कुल्ला करें, और ट्यूब के निचले भाग में निलंबन एकत्र करें।
  9. निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। DNase I (1 U / μL) के 5 μL जोड़ें, और 15-20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  10. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और सेल गोली को 400 μL बर्फ-ठंडे DPBS (Ca 2 + / Mg2 + मुक्त) में फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को मिलाने के लिए चौड़े बोर युक्तियों के साथ धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।

5. धुंधला और सूक्ष्म परीक्षा

  1. धुंधला होने के लिए, सेल सस्पेंशन को 1: 1 अनुपात में 0.4% ट्राइपैन ब्लू घोल के साथ मिलाएं। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. हेमोसाइटोमीटर पर मिश्रण के 5-10 μL जोड़ें, और माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें।
    नोट: व्यवहार्य कोशिकाओं में बिना दाग वाले साइटोप्लाज्म होंगे, जबकि मृत कोशिकाओं में एक नीला साइटोप्लाज्म होगा (चित्रा 2)।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत तीन अलग-अलग क्षेत्रों में व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं की गणना करें। एक क्षेत्र में कोशिकाओं की कुल संख्या से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके सेल व्यवहार्यता प्रतिशत की गणना करें।
    नोट: सेल व्यवहार्यता 85% से अधिक होनी चाहिए, और सेल एकाग्रता 1 x 105-1 x 107 / mL से कम नहीं होनी चाहिए। सेल निलंबन पृष्ठभूमि साफ होनी चाहिए, बिना झुरमुट, टुकड़े या अशुद्धियों के।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल एकल-कोशिका अनुक्रमण (चित्रा 1) के लिए नील तिलापिया आंत के उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी का वर्णन करता है। इस शोध से पता चलता है कि कोलेजनेज / डिस्पेस मिश्रण का एक अच्छा पृथक्करण प्रभाव होता है और आंत के ऊतकों के लिए हल्का होता है। उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए इष्टतम पाचन एंजाइम का चयन आवश्यक है। प्रारंभिक कार्य में, कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों की पृथक्करण क्षमता की तुलना की गई थी, और परिणाम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। कोलेजनेज/ डिस्पेस मिश्रण को अकेले कोलेजनेज, डिस्पेस, या ट्रिप्सिन और कई अन्य एंजाइम मिश्रणों की तुलना में बेहतर पृथक्करण प्रभाव के लिए सत्यापित किया गया था, जिसमें लिबरेज, ट्रिप्सिन / इलास्टेस, कोलेजनेज / इलास्टेस, और कोलेजनेस / ट्रिप्सिन शामिल हैं। इसके अलावा, कोलेजनेज / डिस्पेस ने प्रयोग के अंत में सबसे व्यवहार्य कोशिकाओं का भी उत्पादन किया।

इनक्यूबेशन समय के दौरान, एक माइक्रोस्कोप के तहत पृथक्करण की प्रगति की जांच की गई थी। 30 मिनट के बाद, थोक ऊतक लगभग चला गया था, और आम तौर पर, 45 मिनट के बाद कोई थोक ऊतक नहीं देखा गया था। पाचन के बाद, सेल निलंबन आसानी से छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के बाद, ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग और माइक्रोस्कोपिक परीक्षा से पता चला कि आंतों की कोशिकाओं में उच्च सेल व्यवहार्यता (90% से अधिक) थी। चित्रा 2, और यह कि सेल एकाग्रता 1 x 107 / एमएल तक हो सकती है। कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं के रूप में फैलाया गया था। अधिकांश कोशिकाएं उज्ज्वल और सफेद (व्यवहार्य कोशिकाएं) थीं, जबकि केवल कुछ गहरे या नीले (मृत कोशिकाएं) थीं। परमेबिलाइज्ड सेल झिल्ली के कारण मृत कोशिकाओं को गहरे नीले रंग से रंगा जाता है। सेल व्यवहार्यता और सेल एकाग्रता ने एकल-सेल अनुक्रमण की आवश्यकताओं को पूरा किया।

Figure 1
चित्र 1: नील तिलापिया आंत पृथक्करण और एकल-कोशिका निलंबन तैयारी प्रोटोकॉल का सारांश प्रवाह आरेख। अभिकर्मकों को आंत के छांटने से पहले तैयार किया जाता है (खंड 1-2)। पीबीएस (चरण 4.1-4.4) में आंतों को कीमा और केन्द्रापसारक रूप से धोया जाता है। कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोलेजनेस / डिस्पेस समाधान का उपयोग करके ऊतक के टुकड़े पचाए जाते हैं (चरण 4.5-4.6)। पचे हुए सेल निलंबन को 0.08% बीएएस-डीपीबीएस के साथ धोया जाता है और 40 μm सेल स्ट्रेनर (चरण 4.7-4.8) के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। DNase I इनक्यूबेशन के बाद, सेल गोली को DPBS (चरण 4.9-4.10) में पुन: निलंबित कर दिया जाता है। ट्राइपैन ब्लू धुंधलापन सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता को निर्धारित करता है (खंड 5)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: नील तिलापिया आंतों के ऊतकों से तैयार एकल-कोशिका निलंबन की सूक्ष्म परीक्षा और ट्राइपैन नीले रंग से सना हुआ। व्यवहार्य कोशिकाएं सफेद और उज्ज्वल होती हैं, जबकि मृत कोशिकाएं गहरे और नीले रंग की होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

किण्वक सबसे अच्छा काम एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) पृथक्करण प्रभाव
कोलेजनेस II। 1 +++
Dispase 0.25 ++
ट्रिप्सिन 2.5 ++
लिबेरेस 1 +++
* कोलेजनेज/ 1 +++++
कोलेजनेस II/ 1/1 +++
ट्रिप्सिन / इलास्टेस 2.5/0.5 +++
ट्रिप्सिन/कोलेजनेस II। 1/1 +++

तालिका 1: नील तिलापिया आंत के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले पाचन एंजाइमों के पृथक्करण प्रभावों के तुलनात्मक परिणाम। अधिक "+" प्रतीक उच्च स्तर के पृथक्करण और उच्च सेल व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व करते हैं। "*" के साथ लेबल किया गया एंजाइम एक वाणिज्यिक उत्पाद है, और 1 मिलीग्राम / एमएल सबसे अच्छा काम करने वाले समाधान में 0.1 यू / एमएल कोलेजनेस आई और 0.8 यू / एमएल डिस्स्पेस शामिल हैं। शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किए जाने पर एंजाइमों के अन्य मिश्रण मिश्रित किए गए थे।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल नील तिलापिया आंत के उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी का वर्णन करता है। पृथक्करण से पहले, आंत से वसा और मेसेंटरी को हटाना आवश्यक है, खासकर मांसाहारी मछली की आंतों के लिए बहुत वसा के साथ। आंतों की सामग्री को धोने के लिए हार्ड स्क्रैपिंग के बजाय सिरिंज का उपयोग करने से कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति कम हो जाती है। सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक विच्छेदन और कुल्ला करने के चरणों के लिए तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे बनाए रखना भी आवश्यक है। धोने के समाधान को बर्फ पर ठंडा किया जाता है, और सेंट्रीफ्यूज तापमान को पहले से 4 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित किया जाता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, अध्ययन ऊतक के लिए हल्के और कुशल सेल पृथक्करण एंजाइमों का चयन किया जाना चाहिए। पिछले अध्ययन के आधार पर, नील तिलापिया आंत के लिए कोलेजनेज / डिस्पेस मिश्रण इष्टतम है। यह एंजाइम संयोजन अकेले ट्रिप्सिन, डिस्पेस या कोलेजनेस की तुलना में तिलापिया आंत पर हल्का और अधिक प्रभावी है। इसके अतिरिक्त, पाचन के दौरान सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए पृथक्करण अभिकर्मक में 5% एफबीएस को शामिल किया गयाथा। उपयोग किए गए ऊतकों के अनुसार सटीक इनक्यूबेशन समय भिन्न होता है। यदि ऊतक पूरी तरह से अलग नहीं होता है तो पाचन समय को बढ़ाने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, कोलेजनेज / डिस्पेस को कार्य करने के लिए सीए2 + की आवश्यकता होती है। इसलिए, पीबीएस का उपयोग डीपीबीएस के बजाय एंजाइम को पतला करने के लिए किया जाता है, जो सीए 2 +/ मिलीग्राम2 + से मुक्त है। धोने के समाधान के लिए, डीपीबीएस का उपयोग तब किया जाता है जब ये आयन डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण चरणों को प्रभावित करते हैं।

अधिकांश पृथक्करण एंजाइम, जिनमें कोलेजनेस / डिस्पैस शामिल हैं, अपने इष्टतम तापमान पर अधिकतम गति और दक्षता के साथ काम करते हैं, जो आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस होता है। इस तापमान पर, जीन को स्थानांतरित किया जाता है, और40,41 को संभालने के जवाब में उनकी अभिव्यक्ति का स्तर बदल जाता है। स्तनधारियों और ज़ेबराफिश में कई अध्ययनों में इस घटना की सूचना दी गई है। माउस किडनी में, जून-बी, एफओएस और एचएसपी 90 सहित एपोप्टोसिस और तनाव से संबंधित जीन अलग-अलग एंजाइमेटिकपृथक्करण स्थितियों के तहत अलग-अलग व्यक्त किए जाते हैं। तत्काल प्रारंभिक जीन और एचएसपी जीन की अंतर अभिव्यक्ति को विभिन्नपृथक्करण स्थितियों में जेब्राफिश फिन कोशिकाओं में बदल दिया जाता है। यह दिखाया गया है कि एफओएस और जून परिवारों के कई सदस्यों सहित प्रारंभिक प्रतिक्रिया जीन, स्तनधारी ऊतकोंके एंजाइमेटिक पृथक्करण द्वारा तैयार सेल निलंबन में 37 डिग्री सेल्सियस पर अलगाव के केवल कुछ मिनटों के बाद काफी ऊपर-विनियमित होते हैं। इसलिए, एपोप्टोसिस और तनाव से संबंधित जीन में अभिव्यक्ति परिवर्तन को एससीआरएनए-सेक डेटा के लिए सावधानीपूर्वक माना जाना चाहिए। एससीआरएनए-सेक प्रयोगों के लिए उपयुक्त नियंत्रण का उपयोग करके इस नुकसान को दूर किया जा सकता है। नियंत्रणों में से एक को एक ही पृथक्करण स्थितियों के तहत इलाज किया जाना चाहिए ताकि जीन अभिव्यक्ति में विरूपण साक्ष्य परिवर्तनों का पता लगाया जा सके या बचा जा सके।

इस प्रोटोकॉल में, बीएसए को डीपीबीएस में मुख्य रूप से सेल नुकसान और सेल क्लंपिंग को कम करने के लिए जोड़ा जाता है। 0.04% से 1% तक बीएसए के अनुपात का उपयोगप्रतिकूल प्रभाव ों के बिना एकल-सेल अनुक्रमण निलंबन तैयार करने के लिए किया जा सकता है। सही बीएसए अनुपात का उपयोग करने से सेल एकत्रीकरण कम हो जाएगा। उपयुक्त अनुपात को विभिन्न ऊतकों और सेल क्लंपिंग स्थितियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, 0.08% बीएसए ने नील तिलापिया आंत कोशिका लगाव को रोका। हालांकि, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर सीए 2 + / एमजी2 + के प्रभाव से बचने के लिए अंतिम सेल रिसस्पेंशन में बीएसए शामिल नहीं होना चाहिए।

कोशिका एकत्रीकरण को कम करने के लिए एक और उपाय DNase I को जोड़ना है। टूटी हुई या मरने वाली कोशिकाएं "चिपचिपा" डीएनए अणुओं को छोड़ती हैं, जो सेल क्लंपिंग के प्रमुख कारणों में से हैं। DNase मुक्त डीएनए को नीचा दिखाता है और इस प्रकार, सेल क्लंपिंग को कम करता है। इसलिए, यह आमतौर पर एकल-कोशिका अनुक्रमण42,43 के लिए सेल निलंबन तैयारी में उपयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, वाइड-बोर ग्लास पिपेट या टिप्स का उपयोग करके कोमल पाइपिंग सेल क्षति को कम करने में मदद करता है। विशेष रूप से एकल-सेल आरएनए-सेक के लिए, कैंची, ट्यूब, ग्लास पिपेट और सेल स्ट्रेनर जैसे उपकरण आरएनएस-मुक्त होने चाहिए।

इन सबसे ऊपर, एक उच्च गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन की तैयारी की पूरी प्रक्रिया उचित पृथक्करण एंजाइम के साथ की जानी चाहिए, कम तापमान पर धीरे से और जल्दी से किया जाना चाहिए, और उच्च सेल व्यवहार्यता और एकाग्रता और न्यूक्लिक एसिड अखंडता प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को एकत्र करने से रोकने के उपाय शामिल होने चाहिए। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मामूली संशोधनों के साथ अन्य मछली प्रजातियों के लिए आंत एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एकल-कोशिका अनुक्रमण और एकल-सेल-स्तरीय अध्ययन, जैसे सेल संस्कृति और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए अन्य मछली के ऊतकों के लिए सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ भी प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक चीन के हैनान प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 320क्यूएन 211) और चीन के जलीय पशु रोग नियंत्रण और स्वस्थ संस्कृति के गुआंग्डोंग प्रांतीय कुंजी प्रयोगशाला के अनुसंधान निधि कार्यक्रम (NO. PBEA2021ZD01) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.

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