Summary
Hier demonstreren we de voorbereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van tilapia-darm voor single-cell sequencing.
Abstract
Nijltilapia is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten wereldwijd en is een veelgebruikt onderzoeksmodel voor aquacultuurvisstudies. De bereiding van hoogwaardige eencellige suspensies is essentieel voor studies op single-cell niveau, zoals single-cell RNA of genome sequencing. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor aquacultuurvissoorten, met name voor de darm van tilapia. De effectieve dissociatie-enzymen variëren afhankelijk van het weefseltype. Daarom is het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol door de juiste enzym- of enzymcombinatie te selecteren om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, essentieel. Deze studie illustreert een geoptimaliseerd protocol om een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nile tilapia-darm te bereiden met een enzymcombinatie van collagenase / dispase. Deze combinatie is zeer effectief voor dissociatie met het gebruik van runderserumalbumine en DNase om celaggregatie na de spijsvertering te verminderen. De celoutput voldoet aan de vereisten voor single-cell sequencing, met 90% cel levensvatbaarheid en een hoge celconcentratie. Dit protocol kan ook worden aangepast om een eencellige suspensie uit de darmen van andere vissoorten te bereiden. Dit onderzoek biedt een efficiënt referentieprotocol en vermindert de behoefte aan aanvullende proeven bij de bereiding van eencellige suspensies voor aquacultuurvissoorten.
Introduction
Cellen zijn de fundamentele eenheden van organismen. In vergelijking met bulkweefselstudies kunnen studies op eencellig niveau de heterogeniteit van cellen weerspiegelen en informatie met een hogere resolutie opleveren1. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers single-cell sequencing-technologieën toegepast voor genoom-, transcriptoom-, epigenoom- of multi-omic-studies op eencellig niveau bij zoogdieren, zebravissen en andere modelorganismen en rapporteerden grote doorbraken 2,3,4,5,6,7 . Hoewel de meeste studies zich hebben gericht op modelorganismen, zijn er weinig referentieprotocollen of commerciële dissociatiekits voor single-cell sequencing in economische vissoorten, wat de toepassing van single-cell sequencing in aquacultuuronderzoek beperkt. Daarom is het ontwikkelen van weefseldissociatieprotocollen die hoogwaardige eencellige suspensies produceren met een hoge levensvatbaarheid van cellen en nucleïnezuurintegriteit cruciaal.
Het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol met de juiste enzym- of enzymcombinatie om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, is essentieel. Het meest effectieve enzym voor weefseldissociatie varieert afhankelijk van het weefseltype. Bij zoogdieren zijn verschillende enzymen gebruikt om eencellige suspensies te bereiden voor vaste weefsels van zoogdieren, waaronder collagenase, dispase, trypsine, papaïne, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase en trypLE 8,9. Trypsinevertering in combinatie met mechanische verstoring is vaak gebruikt om weefsels te dissociëren voor celkweek in vissen 10,11,12,13,14. Trypsine is ook gebruikt of toegevoegd aan de verteringscocktail voor weefseldissociatie in de rattendarm15 en zebraviskieuwweefsel16. Om verschillende redenen is trypsine echter niet de beste optie voor single-cell sequencing. Trypsine alleen is meestal niet effectief voor weefseldissociatie. Bovendien induceert trypsine DNA-strengbreuken 17,18 en RNA-afbraak19.
Papaïne breekt de eiwitten af die de tight junctions tussen cellen vormen. In zenuw- en gladde spiercellen van zoogdieren is papaïne efficiënter en minder destructief dan andere proteasen20,21. Net als trypsine resulteert papaïne echter in de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van de cellysis die optreedt tijdens enzymatische spijsvertering9. Elastase breekt elastine af, dat meestal wordt aangetroffen in de huid, longen, ligamenten, pezen en vasculaire weefsels22. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met collagenase, dispase of trypsine voor het dissociëren van longweefsel8. Hyaluronidase splitst de glycosidische bindingen van hyaluronaat en draagt bij aan de vertering van de extracellulaire matrix in verschillende bindweefsels en huid 9,23.
Over het algemeen zijn collagenase en dispase goede opties voor extracellulaire matrixafbraak. Ze zijn gebruikt bij de dissociatie van menselijke, muis- en zebravisdarmen24,25,26,27. Collagenase vernietigt de peptidebinding in collageen, bevordert de vertering van de extracellulaire matrix en geeft de cellen vrij in suspensie, en dus wordt collagenase vaak gebruikt voor dissociatie van vast weefsel van mens en muis, inclusief voor de lever 28,29, milt30, pancreas31 en darm 25. Dispase is een protease dat de N-terminale peptidebindingen van niet-polaire aminozuurresiduen hydrolyseert en milder is dan collagenase. Het splitst de extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine, type IV-collageen en in mindere mate type I-collageen, zonder cel-celverbindingen te beïnvloeden. Dispase wordt afzonderlijk of met andere enzymen gebruikt voor weefseldissociatie, zoals voor darm25,32, hersenen33, lever 34, enz. Bovendien zijn in de handel verkrijgbare digestiecocktails, waaronder liberase, accutase en trypLE, ook goede alternatieven voor dissociatie van vast weefsel, vooral voor de huid, lever en nieren 8,9.
Nijltilapia (Oreochromis niloticus) behoort tot de familie Cichlidae van de orde Perciformes. Het is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten in tropische en subtropische gebieden, met een jaarlijkse productie van 4,5 miljoen ton in 202235. Het is een van de best bestudeerde aquacultuurvissoorten met een goed geannoteerd genoom. Nijltilapia is een ideaal onderzoeksmodel voor aquacultuurvissoorten vanwege de korte generatietijd, het gemak van kweken en het aanpassingsvermogen aan een breed scala aan kweekomgevingen. De darm is van groot onderzoeksbelang omdat het het orgaan is van voedingsvertering en -absorptie, metabolisme en mucosale immuniteit. De darm is de habitat van microbiële populaties en is een essentieel immuunweefsel36. Het is immunologisch actief vanwege de aanwezigheid van talrijke immuunceltypen, waaronder macrofagen, B-cellen, granulocyten en T-cellen.
In de huidige studie hebben we een protocol ontwikkeld voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nijltilapia-darm om studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten te vergemakkelijken. Volgens de kenmerken van deze weefselspecifieke enzymen en voorwerk is collagenase/dispase geschikt voor het dissociëren van tilapia-darmweefsel. Het laatste enzymtype waarmee rekening moet worden gehouden bij het bereiden van eencellige suspensies is DNase-I, dat celaggregatie voorkomt door vrij DNA af te breken dat vrijkomt door dode cellyse tijdens enzymatische spijsvertering zonder apoptotische routes te initiëren9 en verhoogt de levende celopbrengst36. Bovendien wordt runderserumalbumine (BSA) aan de wasbuffer toegevoegd om celklontering te verminderen en de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren. Verschillende reagensbedrijven beschrijven BSA als een enzymstabilisator. De toevoeging van 0,04%-1% BSA aan PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) is gebruikt om een wasoplossing te ontwikkelen voor het bereiden van eencellige sequencing-suspensies zonder nadelige effecten38. De toevoeging van een lage verhouding BSA kan helpen de levensvatbaarheid van cellen te behouden en de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van cellyse te voorkomen. Dit protocol kan ook een waardevolle referentie zijn voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen uit de darmen van andere aquacultuurvissoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprotocollen tijdens deze studie zijn goedgekeurd door de Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer: HNUAUCC-2022-00063; Goedkeuringsdatum: 2022-03-03). Een lijst van de apparatuur en benodigdheden die in dit experiment zijn gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel. Een samenvatting van het huidige protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Visbereiding
- Verkrijg 6 maanden oude Nijltilapia met een gemiddeld lichaamsgewicht van 100 g uit een betrouwbare bron. Selecteer vissen die vrij zijn van tekenen van ziekte.
- Stop met het voeren van de vis 24 uur voordat u doorgaat naar de volgende stap.
OPMERKING: Visvasten vermindert het volume van de darminhoud en vergemakkelijkt de bereiding van darmsegmenten. - Spoel de vis gedurende 15 minuten in goed belucht steriel water om losjes gebonden bacteriën op het lichaamsoppervlak af te wassen.
- Euthanaseer de vis met 300 mg/L tricaïnemethaansulfonaat (MS-222) gedurende ongeveer 10 minuten totdat alle beweging stopt.
2. Reagenspreparaat
- Bereid 0,08% BSA-Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (BSA-DPBS, voor celspoeling en resuspensie). Los 0,08 g BSA (0,8% m/v) op in 100 ml 1x DPBS. Bewaren bij 4 °C en bij gebruik voorkoelen op ijs.
OPMERKING: De toevoeging van BSA is gunstig voor het minimaliseren van celklontering. De BSA-ratio kan worden verhoogd van 0,04% naar 1%, afhankelijk van de celklontercondities. - Bereid het enzymatische celdissociatiereagens.
- Verdun het collagenase/dispase met 1x PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/ml (0,1 U/ml collagenase en 0,8 U/ml dispase). Zorg ervoor dat PBS en niet DPBS wordt gebruikt.
OPMERKING: PBS levert de calciumionen die nodig zijn om het enzym goed te laten functioneren. DPBS mag niet worden gebruikt in deze stap omdat het Ca 2+/Mg2+ vrij is. Daarnaast wordt collagenase type I gebruikt in het huidige protocol. - Filtreer de verdunning door een steriel membraanfilter van 0,22 μm.
- Bereid een celdissociatiereagens dat bestaat uit een 95% volume collagenase/dispase oplossing en een 5% volume foetaal runderserum (FBS).
OPMERKING: Het dissociatiereagens moet telkens wanneer het wordt gebruikt vers worden gemaakt. Het gebruik van 5% FBS helpt de levensvatbaarheid van de cel tijdens de spijsvertering te behouden.
- Verdun het collagenase/dispase met 1x PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/ml (0,1 U/ml collagenase en 0,8 U/ml dispase). Zorg ervoor dat PBS en niet DPBS wordt gebruikt.
- Bereid trypan blauwe oplossing.
- Neem de trypan blue oplossing uit de koelkast van 4 °C en houd deze voor gebruik een paar minuten op 15-20 °C om neerslag te voorkomen.
- Filtreer de oplossing door een steriel membraan van 0,22 μm.
3. Voorbereiding van apparatuur
- Koel de gekoelde centrifuge voor gebruik voor tot 4 °C.
- Verkrijg steriele RNase-vrije centrifugebuizen van 1,5 ml, conische buizen van 50 ml, glazen pipetten en uiteinden met brede boring, membraanfilters, celzeven en alle buizen en uiteinden met een lage retentie.
- Autoclaaf glazen pipetten en dissectiegereedschappen, waaronder tangen, scharen en scalpels, en behandel ze voor met de RNase-verwijderingsoplossing om de nadelige effecten van RNase voor eencellige RNA-seq te voorkomen.
4. Weefseldissectie en celdissociatie
- Leg de geëuthanaseerde vis op ijs voor dissectie. Verzamel aseptisch 3-4 cm van het middengedeelte van de darm en snijd zoveel mogelijk vet en mesenterium weg. Verwijder voorzichtig het vet dat aan het darmoppervlak is bevestigd en de laag elastisch en kneedbaar helder slijmvlies met een tang.
OPMERKING: Het vet en mesenterium zijn bevestigd aan het buitenoppervlak van de darm. - Verwijder zoveel mogelijk vet om de nadelige effecten op het dissociatieprotocol te voorkomen. Spoel met behulp van een spuit de fragmenten meerdere keren voorzichtig af met steriel ijskoud PBS om de darminhoud en het slijm af te spoelen. Vermijd ruwe behandeling.
- Ontleed het darmsegment in kleine stukjes en breng ze over in een buis van 1,5 ml gevuld met 1 ml ijskoude PBS.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig en vervang door 1 ml ijskoud 0,08% BSA-DPBS. Resuspensie van de weefselfragmenten door zachte aspiratie met behulp van een glazen pipet. Herhaal deze stap twee keer.
- Verwijder het supernatant en verteer de weefselfragmenten met 1 ml van het enzymatische dissociatiereagens (950 μL collagenase/dispase-oplossing en 50 μL FBS) in een waterbad van 37 °C gedurende 30-60 minuten.
- Voeg bovendien 5 μL RNaseremmer (40 E/μL in de stamoplossing) toe aan het dissociatiereagens als de monsters zijn voorbereid voor eencellige RNA-sequencing.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de collagenase/dispase-mix is 1 mg/ml, inclusief collagenase bij 0,1 U/ml en dispase bij 0,8 U/ml.
- Voeg bovendien 5 μL RNaseremmer (40 E/μL in de stamoplossing) toe aan het dissociatiereagens als de monsters zijn voorbereid voor eencellige RNA-sequencing.
- Keer de buis handmatig om met intervallen van 5 minuten tijdens het waterbad van 30-60 minuten.
OPMERKING: De exacte incubatietijd varieert afhankelijk van de gebruikte weefsels. Controleer de voortgang van dissociatie onder een microscoop totdat er geen bulkweefsel wordt gezien. Plaats 10 μL van de celsuspensie op een glasplaat met een pipet en onderzoek deze onder de microscoop. Verhoog de verteringstijd als de cellen niet volledig gedissocieerd zijn. - Draai de buisjes gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 × g naar beneden en verwijder het enzymatische celdissociatiereagens voorzichtig met behulp van uiteinden met brede boring. Voeg 1 ml ijskoud 0,08% BSA-DPBS toe en pipetteer de cellen voorzichtig op en neer met behulp van een glazen pipet met brede boring gedurende 1 minuut.
- Herhaal deze stap twee keer.
OPMERKING: Pipetteren op en neer moet met zorg worden uitgevoerd met behulp van tips met een brede boring en een lage retentie om celverstoring te voorkomen.
- Herhaal deze stap twee keer.
- Maak een celzeef van 40 μm voor met 0,08% BSA-DPBS en plaats deze in een conische buis van 50 ml. Haal de celsuspensie door de zeef. Tik en spoel af met nog eens 200 μL DPBS en verzamel de suspensie aan de onderkant van de buis.
- Breng de suspensie over in een buis van 1,5 ml. Voeg 5 μL DNase I (1 E/μL) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 15-20 °C. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de celkorrel in 400 μL ijskoud DPBS (Ca 2+/Mg2+ vrij). Pipetteer voorzichtig op en neer met brede uiteinden om de cellen te mengen. Herhaal deze stap twee keer.
5. Kleuring en microscopisch onderzoek
- Voor kleuring mengt u de celsuspensie met 0,4% trypanblauwe oplossing in een verhouding van 1:1. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5-10 μL van het mengsel toe aan een hemocytometer en onderzoek onder de microscoop.
OPMERKING: Levensvatbare cellen hebben een ongekleurd cytoplasma, terwijl dode cellen een blauw cytoplasma hebben (figuur 2). - Tel de levensvatbare en dode cellen in drie verschillende velden onder de microscoop. Bereken het levensvatbaarheidspercentage van de cel door het aantal levensvatbare cellen te delen door het totale aantal cellen in een veld.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cel moet meer dan 85% zijn en de celconcentratie mag niet lager zijn dan 1 x 105-1 x 107 / ml. De achtergrond van de celsuspensie moet schoon zijn, zonder klonten, fragmenten of onzuiverheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de Nijltilapia-darm voor eencellige sequencing (figuur 1). Uit dit onderzoek blijkt dat de collagenase/dispase mix een goed dissociatie effect heeft en mild is voor darmweefsel. De selectie van het optimale verteringsenzym is essentieel voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie. In het voorbereidende werk werden de dissociatie-efficiënties van verschillende veelgebruikte enzymen vergeleken en de resultaten zijn vermeld in tabel 1. De collagenase / dispase-mix bleek een veel beter dissociatie-effect te hebben dan collagenase, dispase of trypsine alleen en verschillende andere enzymmengsels, waaronder liberase, trypsine / elastase, collagenase / elastase en collagenase / trypsine. Bovendien leverde het collagenase/dispase aan het einde van het experiment ook de meest levensvatbare cellen op.
Tijdens de incubatietijd werd de voortgang van de dissociatie gecontroleerd onder een microscoop. Na 30 minuten was het bulkweefsel bijna verdwenen en over het algemeen werd er na 45 minuten geen bulkweefsel gezien. Na de vertering filterde de celsuspensie gemakkelijk door de zeef. Volgens dit protocol toonden de trypanblauwe kleuring en microscopisch onderzoek aan dat de darmcellen een hoge levensvatbaarheid van de cellen hadden (meer dan 90%; Figuur 2, en dat de celconcentratie tot 1 x 107/ml zou kunnen zijn. De cellen werden gedispergeerd als afzonderlijke cellen. De meeste cellen waren helder en wit (levensvatbare cellen), terwijl slechts een paar donker of blauw waren (dode cellen). Dode cellen zijn donkerblauw gekleurd vanwege het gepermeabiliseerde celmembraan. De levensvatbaarheid van de cel en de celconcentratie voldeden aan de eisen van single-cell sequencing.
Figuur 1: Samenvattend stroomdiagram van de dissociatie van de Nile tilapia darm en single-cell suspensie voorbereidingsprotocollen. De reagentia worden bereid (secties 1-2) vóór de excisie van de darm. De darmen worden gehakt en centrifugaal gewassen in PBS (stappen 4.1-4.4). De weefselfragmenten worden verteerd met behulp van collagenase/dispase-oplossing in een waterbad van 37 °C om de cellen te isoleren (stappen 4.5-4.6). De verteerde celsuspensie wordt gespoeld met 0,08% BAS-DPBS en gefilterd door een celzeef van 40 μm (stappen 4.7-4.8). Na DNase I-incubatie wordt de celkorrel geresuspendeerd in DPBS (stappen 4.9-4.10). Trypan blauwe kleuring bepaalt de celconcentratie en levensvatbaarheid (rubriek 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microscopisch onderzoek van een eencellige suspensie bereid uit Nijl tilapia darmweefsel en gekleurd met trypan blauw. Levensvatbare cellen zijn wit en helder, terwijl dode cellen donker en blauw zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Enzym | Beste werkconcentratie (mg/ml) | Dissociatie effect |
| Collagenase II | 1 | +++ |
| Dispase | 0.25 | ++ |
| Trypsine | 2.5 | ++ |
| Liberase | 1 | +++ |
| * Collagenase / dispase | 1 | +++++ |
| Collagenase II/elastase | 1/1 | +++ |
| Trypsine/elastase | 2.5/0.5 | +++ |
| Trypsine/collagenase II | 1/1 | +++ |
Tabel 1: Vergelijkingsresultaten van de dissociatie-effecten van veelgebruikte spijsverteringsenzymen voor nijltilapia darm. Meer "+" symbolen vertegenwoordigen een hogere mate van dissociatie en hogere cel levensvatbaarheid. Het enzym gelabeld met "*" is een commercieel product en de beste werkoplossing van 1 mg / ml omvat 0,1 U / ml collagenase I en 0,8 U / ml dispase. De andere mengsels van enzymen werden gemengd toen ze door de onderzoekers werden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de nile tilapia darm. Vóór dissociatie is de verwijdering van vet en mesenterium uit de darm noodzakelijk, vooral voor vleesetende visdarmen met veel vet. Het gebruik van een spuit in plaats van hard schrapen om de darminhoud af te wassen, vermindert de mechanische schade aan de cellen. Om de levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, is het ook essentieel om de temperatuur op 20 °C of lager te houden voor de weefseldissectie- en spoelstappen. De wasoplossingen worden op ijs gekoeld en de centrifugetemperatuur wordt van tevoren ingesteld op 4 °C. Het belangrijkste is dat milde en efficiënte celdissociatie-enzymen voor het bestudeerde weefsel moeten worden geselecteerd. Op basis van een eerdere studie is de collagenase/dispase mix optimaal voor de Nijl tilapia darm. Deze enzymcombinatie is milder en effectiever op tilapia-darm dan trypsine, dispase of collagenase alleen. Bovendien werd 5% FBS opgenomen in het dissociatiereagens om de levensvatbaarheid van de cel tijdens de spijsvertering te behouden39. De exacte incubatietijd varieert afhankelijk van de gebruikte weefsels. De verteringstijd moet worden verlengd als het weefsel niet volledig is gedissocieerd. Bovendien vereist collagenase/dispase Ca2+ om te functioneren. Daarom wordt PBS gebruikt om het enzym te verdunnen in plaats van DPBS, dat vrij is van Ca 2+/Mg2+. Voor de wasoplossingen wordt DPBS gebruikt in het geval dat deze ionen de stroomafwaartse sequencingstappen beïnvloeden.
De meeste dissociatie-enzymen, waaronder collagenase/dispase, werken met maximale snelheid en efficiëntie bij hun optimale temperatuur, die gewoonlijk 37 °C is. Bij deze temperatuur worden genen getranscribeerd en hun expressieniveaus veranderen als reactie op het hanteren van40,41. Dit fenomeen is gemeld in verschillende studies bij zoogdieren en zebravissen. In de nier van de muis worden apoptose en stressgerelateerde genen, waaronder JUN-B, FOS en Hsp90, differentieel tot expressie gebracht onder verschillende enzymatische dissociatieomstandigheden40. De differentiële expressie van onmiddellijke vroege genen en HSP-genen is veranderd in zebravisvincellen bij verschillende dissociatieomstandigheden41. Het is aangetoond dat vroege responsgenen, waaronder meerdere leden van de FOS- en JUN-families, significant up-gereguleerd zijn na slechts enkele minuten scheiding bij 37 °C in celsuspensies bereid door de enzymatische dissociatie van zoogdierweefsels6. Daarom moeten de expressieveranderingen in apoptose en stressgerelateerde genen zorgvuldig worden overwogen voor de ScRNA-seq-gegevens. Dit nadeel kan worden ondervangen door de juiste controles te gebruiken voor de ScRNA-seq-experimenten. Een van de controles moet onder dezelfde dissociatieomstandigheden worden behandeld, zodat de artefactveranderingen in genexpressie kunnen worden gedetecteerd of vermeden.
In dit protocol wordt BSA voornamelijk aan DPBS toegevoegd om celverliezen en celklontering te minimaliseren. Verhoudingen van BSA van 0,04% tot 1% kunnen worden gebruikt om single-cell sequencing suspensies te bereiden zonder nadelige effecten38. Het gebruik van de juiste BSA-verhouding zou de celaggregatie verminderen. De juiste verhouding moet worden geoptimaliseerd voor verschillende weefsels en celklonteromstandigheden. In dit protocol voorkwam 0,08% BSA de aanhechting van de nile tilapia-darmcel. De uiteindelijke celresuspensie mag echter geen BSA bevatten om de invloed van Ca 2+/Mg2+ op de downstream-toepassingen te voorkomen.
Een andere maatregel om celaggregatie te verminderen is de toevoeging van DNase I. Gescheurde of stervende cellen geven "kleverige" DNA-moleculen af, die tot de belangrijkste oorzaken van celklontering behoren. DNase degradeert vrij DNA en minimaliseert zo celklontering. Daarom wordt het vaak gebruikt in celsuspensievoorbereiding voor single-cell sequencing42,43. Bovendien helpt zacht pipetteren met behulp van glazen pipetten of tips met brede boring de celschade te verminderen. Vooral voor eencellige RNA-seq moeten hulpmiddelen zoals scharen, buizen, glazen pipetten en celzeven RNase-vrij zijn.
Bovenal moet het hele proces van de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie worden uitgevoerd met het juiste dissociatie-enzym, moet het voorzichtig en snel bij een lage temperatuur worden uitgevoerd en moeten maatregelen worden genomen om te voorkomen dat cellen aggregeren om een hoge levensvatbaarheid en concentratie van cellen en nucleïnezuurintegriteit te bereiken. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor de bereiding van intestine eencellige suspensies voor andere vissoorten met kleine wijzigingen. Daarnaast kan dit protocol ook een waardevolle referentie bieden voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen voor andere visweefsels voor single-cell sequencing en single-cell-level studies, zoals celkweek en flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen de steun erkennen van de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) en het Research Fund Program van Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
References
- Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
- He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
- Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
- Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
- Xu, S. H., Cooke, I. M.
- Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
- Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
- Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
- Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
- Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
- Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
- Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
- Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
- Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
- Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
- FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
- Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
- Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
- Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
- Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
