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Préparation de suspension unicellulaire de l’intestin de tilapia du Nil pour séquençage unicellulaire

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64688
Automatic Translation
*1, *1,3, 2, 4, 1,3, 1,3, 1,3
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous démontrons la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia pour le séquençage unicellulaire.

Abstract

Le tilapia du Nil est l’une des espèces de poissons d’eau douce les plus couramment cultivées dans le monde et constitue un modèle de recherche largement utilisé pour les études sur les poissons d’aquaculture. La préparation de suspensions unicellulaires de haute qualité est essentielle pour les études au niveau unicellulaire telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire ou du génome. Cependant, il n’existe pas de protocole prêt à l’emploi pour les espèces de poissons d’aquaculture, en particulier pour l’intestin du tilapia. Les enzymes de dissociation efficaces varient en fonction du type de tissu. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser le protocole de dissociation tissulaire en sélectionnant l’enzyme ou la combinaison d’enzymes appropriée pour obtenir suffisamment de cellules viables avec un minimum de dommages. Cette étude illustre un protocole optimisé pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil avec une combinaison enzymatique de collagénase/dispase. Cette combinaison est très efficace pour la dissociation avec l’utilisation de l’albumine sérique bovine et de la DNase pour réduire l’agrégation cellulaire après digestion. La sortie de cellule répond aux exigences de séquençage de cellules uniques, avec une viabilité cellulaire de 90% et une concentration élevée de cellules. Ce protocole peut également être modifié pour préparer une suspension unicellulaire provenant des intestins d’autres espèces de poissons. Cette recherche fournit un protocole de référence efficace et réduit le besoin d’essais supplémentaires dans la préparation de suspensions unicellulaires pour les espèces de poissons d’aquaculture.

Introduction

Les cellules sont les unités fondamentales des organismes. Par rapport aux études sur les tissus en vrac, les études au niveau d’une seule cellule peuvent refléter l’hétérogénéité cellulaire et fournir des informations à plus haute résolution1. Au cours des dernières années, les chercheurs ont appliqué des technologies de séquençage unicellulaire pour des études sur le génome, le transcriptome, l’épigénome ou multi-omiques au niveau unicellulaire chez des mammifères, des poissons-zèbres et d’autres organismes modèles et ont signalé de grandes percées 2,3,4,5,6,7 . Bien que la plupart des études se soient concentrées sur des organismes modèles, il existe peu de protocoles de référence ou de trousses de dissociation commerciales pour le séquençage unicellulaire chez les espèces de poissons économiques, ce qui limite l’application du séquençage unicellulaire dans la recherche aquacole. Par conséquent, il est crucial de développer des protocoles de dissociation tissulaire qui produisent des suspensions unicellulaires de haute qualité avec une viabilité cellulaire élevée et une intégrité des acides nucléiques.

Il est essentiel d’optimiser le protocole de dissociation tissulaire avec l’enzyme ou la combinaison enzymatique appropriée pour obtenir suffisamment de cellules viables avec un minimum de dommages. L’enzyme la plus efficace pour la dissociation tissulaire varie en fonction du type de tissu. Chez les mammifères, plusieurs enzymes ont été utilisées pour préparer des suspensions unicellulaires pour les tissus solides des mammifères, notamment la collagénase, la dispase, la trypsine, la papaïne, l’élastase, la hyaluronidase, la liberase, l’accutase et la trypLE 8,9. La digestion de la trypsine combinée à une perturbation mécanique a été couramment utilisée pour dissocier les tissus pour la culture cellulaire chez les poissons 10,11,12,13,14. La trypsine a également été utilisée ou ajoutée dans le cocktail de digestion pour la dissociation des tissus dans l’intestin du rat15 et le tissu branchial du poisson zèbre16. Cependant, pour plusieurs raisons, la trypsine n’est pas la meilleure option pour le séquençage unicellulaire. La trypsine seule est généralement inefficace pour la dissociation tissulaire. De plus, la trypsine induit des ruptures de brinsd’ADN 17,18 et une dégradation de l’ARN 19.

La papaïne dégrade les protéines qui composent les jonctions serrées entre les cellules. Dans les cellules nerveuses et musculaires lisses des mammifères, la papaïne est plus efficace et moins destructrice que les autres protéases20,21. Cependant, comme la trypsine, la papaïne entraîne l’agrégation libre des cellules induite par l’ADN en raison de la lyse cellulaire qui se produit pendant la digestion enzymatique9. L’élastase décompose l’élastine, qui se trouve généralement dans la peau, les poumons, les ligaments, les tendons et les tissus vasculaires22. Il est souvent utilisé en association avec la collagénase, la dispase, ou la trypsine pour dissocier le tissu pulmonaire8. La hyaluronidase clive les liaisons glycosidiques de l’hyaluronane, contribuant à la digestion de la matrice extracellulaire dans divers tissus conjonctifs et la peau 9,23.

En général, la collagénase et la dispase sont de bonnes options pour la dégradation de la matrice extracellulaire. Ils ont été utilisés dans la dissociation des intestins humains, de souris et de poisson zèbre24,25,26,27. La collagénase détruit la liaison peptidique dans le collagène, favorise la digestion de la matrice extracellulaire et libère les cellules en suspension, et, par conséquent, la collagénase est souvent utilisée pour la dissociation des tissus solides humains et murins, y compris pour le foie 28,29, la rate30, le pancréas31 et l’intestin 25. La dispase est une protéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques N-terminales des résidus d’acides aminés non polaires et est plus douce que la collagénase. Il clive les composants de la matrice extracellulaire, tels que la fibronectine, le collagène de type IV et, dans une moindre mesure, le collagène de type I, sans affecter les jonctions cellule-cellule. Dispase est utilisé séparément ou avec d’autres enzymes pour la dissociation tissulaire, comme pour l’intestin25,32, le cerveau33, le foie34, etc. En outre, les cocktails de digestion disponibles dans le commerce, y compris la liberase, l’accutase et le trypLE, sont également de bonnes alternatives pour la dissociation des tissus solides, en particulier pour la peau, le foie et les reins 8,9.

Le tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) appartient à la famille des Cichlidae de l’ordre des Perciformes. C’est l’une des espèces de poissons d’eau douce les plus cultivées dans les zones tropicales et subtropicales, avec une production annuelle de 4,5 millions de tonnes en 202235. C’est l’une des espèces de poissons d’aquaculture les mieux étudiées avec un génome bien annoté. Le tilapia du Nil est un modèle de recherche idéal pour les espèces de poissons d’aquaculture en raison de son temps de génération court, de sa facilité d’élevage et de son adaptabilité à un large éventail d’environnements d’élevage. L’intestin est d’un grand intérêt pour la recherche car c’est l’organe de la digestion et de l’absorption de la nutrition, du métabolisme et de l’immunité muqueuse. L’intestin est l’habitat des populations microbiennes et constitue un tissu immunitaire essentiel36. Il est immunologiquement actif en raison de la présence de nombreux types de cellules immunitaires, y compris les macrophages, les cellules B, les granulocytes et les cellules T.

Dans la présente étude, nous avons développé un protocole pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil afin de faciliter les études au niveau unicellulaire chez les espèces de poissons d’aquaculture. Selon les caractéristiques de ces enzymes spécifiques aux tissus et les travaux préliminaires, la collagénase / dispase est appropriée pour dissocier le tissu intestinal du tilapia. Le dernier type d’enzyme à considérer dans la préparation de suspensions unicellulaires est la DNase-I, qui empêche l’agrégation cellulaire en dégradant l’ADN libre libéré par lyse des cellules mortes pendant la digestion enzymatique sans initier de voies apoptotiques9 et augmente le rendement en cellules vivantes36. De plus, de l’albumine sérique bovine (BSA) est ajoutée au tampon de lavage pour réduire l’agglutination cellulaire et améliorer la viabilité cellulaire. Plusieurs sociétés de réactifs décrivent BSA comme un stabilisateur enzymatique. L’ajout de BSA à 0,04%-1% au PBS (solution saline tamponnée au phosphate) a été utilisé pour développer une solution de lavage permettant de préparer des suspensions de séquençage unicellulaire sans effets indésirables38. L’ajout d’un faible ratio de BSA pourrait aider à maintenir la viabilité cellulaire et à éviter l’agrégation libre induite par l’ADN des cellules due à la lyse cellulaire. Ce protocole peut également fournir une référence précieuse pour le développement de protocoles de dissociation cellulaire des intestins d’autres espèces de poissons d’aquaculture.

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Protocol

Tous les protocoles sur les animaux au cours de cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Hainan (numéro de protocole : HNUAUCC-2022-00063; Date d’approbation : 2022-03-03). Une liste de l’équipement et des fournitures utilisés dans cette expérience se trouve dans le tableau des matériaux. Un résumé du protocole actuel est illustré à la figure 1.

1. Préparation du poisson

  1. Obtenez un tilapia du Nil âgé de 6 mois avec un poids corporel moyen de 100 g à partir d’une source fiable. Choisissez des poissons exempts de tout signe de maladie.
  2. Arrêtez de nourrir les poissons 24 h avant de passer à l’étape suivante.
    NOTE: Le jeûne du poisson réduit le volume du contenu intestinal et facilite la préparation des segments intestinaux.
  3. Rincez le poisson dans de l’eau stérile bien aérée pendant 15 minutes pour éliminer les bactéries lâches à la surface du corps.
  4. Euthanasier le poisson avec 300 mg/L de méthanesulfonate de tricaïne (MS-222) pendant environ 10 minutes jusqu’à ce que tout mouvement cesse.

2. Préparation du réactif

  1. Préparer la solution saline tamponnée au phosphate de BSA-Dulbecco à 0,08 % (BSA-DPBS, pour le rinçage cellulaire et la remise en suspension). Dissoudre 0,08 g de BSA (0,8 % p/v) dans 100 mL de 1x DPBS. Conserver à 4 °C et prérefroidir sur de la glace lorsqu’il est utilisé.
    REMARQUE: L’ajout de BSA est bénéfique pour minimiser l’agglutination cellulaire. Le rapport BSA peut être augmenté de 0,04% à 1% selon les conditions d’agglutination cellulaire.
  2. Préparer le réactif de dissociation cellulaire enzymatique.
    1. Diluer la collagénase/dispase avec 1x PBS jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL (0,1 U/mL de collagénase et 0,8 U/mL de dispase). Assurez-vous que PBS et non DPBS est utilisé.
      REMARQUE: PBS fournit les ions calcium nécessaires au bon fonctionnement de l’enzyme. DPBS ne doit pas être utilisé dans cette étape car il est Ca 2+/Mg2+ libre. De plus, la collagénase de type I est utilisée dans le protocole actuel.
    2. Filtrer la dilution à travers un filtre à membrane stérile de 0,22 μm.
    3. Préparer un réactif de dissociation cellulaire composé d’un volume de 95 % de solution de collagénase/dispase et d’un volume de 5 % de sérum fœtal bovin (FBS).
      REMARQUE: Le réactif de dissociation doit être rendu frais chaque fois qu’il est utilisé. L’utilisation de 5% FBS aide à maintenir la viabilité cellulaire pendant la digestion.
  3. Préparer la solution de bleu trypan.
    1. Prenez la solution de bleu trypan du réfrigérateur à 4 °C et conservez-la à 15-20 °C pendant quelques minutes avant de l’utiliser pour éviter les précipitations.
    2. Filtrer la solution à travers une membrane stérile de 0,22 μm.

3. Préparation de l’équipement

  1. Prérefroidir la centrifugeuse réfrigérée à 4 °C avant utilisation.
  2. Procurez-vous des tubes centrifugés stériles de 1,5 mL sans RNase, des tubes coniques de 50 mL, des pipettes et des embouts en verre de grand calibre, des filtres à membrane, des crépines cellulaires et tous les tubes et embouts à faible rétention.
  3. Autoclave pipettes en verre et outils de dissection, y compris les pinces, les ciseaux et les scalpels, et les prétraiter avec la solution d’élimination de la RNase pour prévenir les effets indésirables de la RNase pour le séquençage de l’ARN unicellulaire.

4. Dissection tissulaire et dissociation cellulaire

  1. Mettez le poisson euthanasié sur la glace pour la dissection. De manière aseptique, recueillir 3-4 cm de la section médiane de l’intestin et exciser autant de graisse et de mésentère que possible. Retirez soigneusement la graisse attachée à la surface intestinale et la couche de muqueuse claire élastique et malléable avec une pince.
    REMARQUE: La graisse et le mésentère sont attachés à la surface externe de l’intestin.
  2. Enlevez autant de graisse que possible pour éviter ses effets indésirables sur le protocole de dissociation. À l’aide d’une seringue, rincer doucement les fragments avec du PBS glacé stérile plusieurs fois pour laver le contenu intestinal et le mucus. Évitez les manipulations brutales.
  3. Disséquez le segment de l’intestin en petits morceaux et transférez-les dans un tube de 1,5 mL rempli de 1 mL de PBS glacé.
  4. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirer délicatement le surnageant et le remplacer par 1 mL de BSA-DPBS glacé à 0,08 %. Remettez les fragments de tissu en suspension par aspiration douce à l’aide d’une pipette en verre. Répétez cette étape deux fois.
  5. Retirer le surnageant et digérer les fragments de tissu en utilisant 1 mL du réactif de dissociation enzymatique (950 μL de solution de collagénase/dispase et 50 μL de FBS) dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 à 60 min.
    1. De plus, ajouter 5 μL d’inhibiteur de la RNase (40 U/μL dans la solution mère) au réactif de dissociation si les échantillons sont préparés pour le séquençage de l’ARN unicellulaire.
      REMARQUE : La concentration finale du mélange collagénase/dispase est de 1 mg/mL, y compris la collagénase à 0,1 U/mL et la dispase à 0,8 U/mL.
  6. Retourner manuellement le tube à intervalles de 5 minutes pendant le bain-marie de 30 à 60 minutes.
    NOTE: Le temps d’incubation exact varie en fonction des tissus utilisés. Vérifiez la progression de la dissociation au microscope jusqu’à ce qu’aucun tissu volumineux ne soit observé. Placez 10 μL de la suspension cellulaire sur une lame de verre à l’aide d’une pipette et examinez-la au microscope. Augmentez le temps de digestion si les cellules ne sont pas complètement dissociées.
  7. Faire tourner les tubes à 300 × g pendant 5 min à 4 °C et retirer délicatement le réactif de dissociation cellulaire enzymatique à l’aide d’embouts de large alésage. Ajouter 1 mL de BSA-DPBS glacé à 0,08 % et pipeter doucement les cellules de haut en bas à l’aide d’une pipette en verre de gros calibre pendant 1 min.
    1. Répétez cette étape deux fois.
      REMARQUE: Le pipetage de haut en bas doit être effectué avec soin en utilisant des embouts de faible alésage et de faible rétention pour éviter la perturbation cellulaire.
  8. Pré-mouiller une crépine cellulaire de 40 μm avec 0,08% de BSA-DPBS et placez-la dans un tube conique de 50 mL. Passez la suspension cellulaire à travers la passoire. Tapoter et rincer avec 200 μL de DPBS supplémentaires et recueillir la suspension au fond du tube.
  9. Transférer la suspension dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 5 μL de DNase I (1 U/μL) et incuber pendant 15 min à 15-20 °C. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
  10. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de la cellule dans 400 μL de DPBS glacé (Ca 2+/Mg2+ libre). Pipeter doucement de haut en bas avec des embouts de large alésage pour mélanger les cellules. Répétez cette étape deux fois.

5. Coloration et examen microscopique

  1. Pour la coloration, mélanger la suspension cellulaire avec une solution de bleu de trypan à 0,4% dans un rapport de 1:1. Incuber pendant 3 min à température ambiante.
  2. Ajouter 5-10 μL du mélange sur un hémocytomètre, et examiner au microscope.
    REMARQUE : Les cellules viables auront un cytoplasme non coloré, tandis que les cellules mortes auront un cytoplasme bleu (Figure 2).
  3. Comptez les cellules viables et mortes dans trois champs différents au microscope. Calculez le pourcentage de viabilité cellulaire en divisant le nombre de cellules viables par le nombre total de cellules dans un champ.
    REMARQUE : La viabilité cellulaire doit être supérieure à 85 % et la concentration cellulaire ne doit pas être inférieure à 1 x 105-1 x 107/mL. Le fond de suspension cellulaire doit être propre, sans touffes, fragments ou impuretés.

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Representative Results

Ce protocole décrit la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil pour le séquençage unicellulaire (Figure 1). Cette recherche montre que le mélange collagénase/dispase a un bon effet de dissociation et est doux pour les tissus intestinaux. La sélection de l’enzyme de digestion optimale est essentielle pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité. Dans les travaux préliminaires, les efficacités de dissociation de plusieurs enzymes couramment utilisées ont été comparées, et les résultats sont énumérés dans le tableau 1. Il a été vérifié que le mélange collagénase / dispase avait un bien meilleur effet de dissociation que la collagénase, la dispase ou la trypsine seule et plusieurs autres mélanges enzymatiques, y compris la liberase, la trypsine / élastase, la collagénase / élastase et la collagénase / trypsine. De plus, la collagénase / dispase a également produit les cellules les plus viables à la fin de l’expérience.

Pendant le temps d’incubation, la progression de la dissociation a été vérifiée au microscope. Après 30 minutes, le tissu en vrac avait presque disparu et, en général, aucun tissu en vrac n’était observé après 45 minutes. Après digestion, la suspension cellulaire filtrait facilement à travers la passoire. Suite à ce protocole, la coloration au bleu de trypan et l’examen microscopique ont montré que les cellules intestinales avaient une viabilité cellulaire élevée (plus de 90%; Figure 2, et que la concentration cellulaire pourrait aller jusqu’à 1 x 107/mL. Les cellules ont été dispersées en cellules individuelles. La plupart des cellules étaient brillantes et blanches (cellules viables), tandis que seules quelques-unes étaient sombres ou bleues (cellules mortes). Les cellules mortes sont colorées en bleu foncé à cause de la membrane cellulaire perméabilisée. La viabilité et la concentration cellulaires répondaient aux exigences du séquençage unicellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Organigramme sommaire des protocoles de dissociation intestinale du tilapia du Nil et de préparation de suspension unicellulaire. Les réactifs sont préparés (sections 1-2) avant l’excision de l’intestin. Les intestins sont hachés et lavés par centrifugation dans du PBS (étapes 4.1-4.4). Les fragments de tissu sont digérés à l’aide d’une solution de collagénase/dispase dans un bain-marie à 37 °C pour isoler les cellules (étapes 4.5-4.6). La suspension cellulaire digérée est rincée avec 0,08% de BAS-DPBS et filtrée à travers une crépine cellulaire de 40 μm (étapes 4.7-4.8). Après l’incubation de la DNase I, la pastille cellulaire est remise en suspension dans DPBS (étapes 4.9-4.10). La coloration au bleu de trypan détermine la concentration et la viabilité de la cellule (section 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Examen microscopique d’une suspension unicellulaire préparée à partir de tissu intestinal de tilapia du Nil et colorée au bleu de trypan. Les cellules viables sont blanches et brillantes, tandis que les cellules mortes sont sombres et bleues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enzyme Meilleure concentration de travail (mg/mL) Effet de dissociation
Collagénase II 1 +++
Dispase 0.25 ++
Trypsine 2.5 ++
Liberase 1 +++
*Collagénase/dispase 1 +++++
Collagénase II/élastase 1/1 +++
Trypsine/élastase 2.5/0.5 +++
Trypsine/collagénase II 1/1 +++

Tableau 1 : Résultats comparatifs des effets de dissociation des enzymes de digestion couramment utilisées pour l’intestin du tilapia du Nil. Plus de symboles « + » représentent un degré plus élevé de dissociation et une plus grande viabilité cellulaire. L’enzyme marquée d’un « * » est un produit commercial, et la solution la plus efficace de 1 mg/mL comprend 0,1 U/mL de collagénase I et 0,8 U/mL de dispase. Les autres mélanges d’enzymes ont été mélangés lorsqu’ils ont été utilisés par les chercheurs.

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Discussion

Ce protocole décrit la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil. Avant la dissociation, l’élimination de la graisse et du mésentère de l’intestin est nécessaire, en particulier pour les intestins de poisson carnivores avec beaucoup de graisse. L’utilisation d’une seringue au lieu d’un grattage dur pour laver le contenu intestinal réduit les dommages mécaniques aux cellules. Pour assurer la viabilité cellulaire, il est également essentiel de maintenir la température à 20 °C ou moins pour les étapes de dissection tissulaire et de rinçage. Les solutions de lavage sont refroidies sur de la glace et la température de la centrifugeuse est réglée à 4 °C à l’avance. Plus important encore, des enzymes de dissociation cellulaire douces et efficaces pour le tissu étudié doivent être sélectionnées. Sur la base d’une étude précédente, le mélange collagénase / dispase est optimal pour l’intestin du tilapia du Nil. Cette combinaison d’enzymes est plus douce et plus efficace sur l’intestin du tilapia que la trypsine, la dispase ou la collagénase seules. De plus, 5% FBS a été inclus dans le réactif de dissociation pour maintenir la viabilité cellulaire pendant la digestion39. Le temps d’incubation exact varie en fonction des tissus utilisés. Le temps de digestion doit être augmenté si le tissu n’est pas complètement dissocié. De plus, la collagénase/dispase nécessite du Ca2+ pour fonctionner. Par conséquent, PBS est utilisé pour diluer l’enzyme plutôt que DPBS, qui est exempt de Ca 2+ / Mg2+. Pour les solutions de lavage, le DPBS est utilisé dans le cas où ces ions influencent les étapes de séquençage en aval.

La plupart des enzymes de dissociation, y compris la collagénase/dispase, fonctionnent avec une vitesse et une efficacité maximales à leur température optimale, qui est généralement de 37 °C. À cette température, les gènes sont transcrits et leurs niveaux d’expression changent en réponse à la manipulationde 40,41. Ce phénomène a été rapporté dans plusieurs études chez des mammifères et des poissons-zèbres. Dans le rein de souris, l’apoptose et les gènes liés au stress, y compris JUN-B, FOS et Hsp90, sont exprimés différemment dans différentes conditions de dissociation enzymatique40. L’expression différentielle des gènes précoces immédiats et des gènes HSP est altérée dans les cellules des nageoires du poisson zèbre dans différentes conditions de dissociation41. Il a été démontré que les gènes de réponse précoce, y compris plusieurs membres des familles FOS et JUN, sont significativement régulés à la hausse après seulement quelques minutes de séparation à 37 °C dans des suspensions cellulaires préparées par la dissociation enzymatique de tissus de mammifères6. Par conséquent, les changements d’expression dans l’apoptose et les gènes liés au stress doivent être soigneusement pris en compte pour les données ScRNA-seq. Cet inconvénient peut être surmonté en utilisant des contrôles appropriés pour les expériences ScRNA-seq. L’un des témoins doit être traité dans les mêmes conditions de dissociation afin que les changements d’artefact dans l’expression génique puissent être détectés ou évités.

Dans ce protocole, BSA est ajouté à DPBS principalement pour minimiser les pertes cellulaires et l’agglutination cellulaire. Des ratios de BSA de 0,04% à 1% peuvent être utilisés pour préparer des suspensions de séquençage unicellulaire sans effets indésirables38. L’utilisation de la proportion correcte de BSA réduirait l’agrégation cellulaire. Le rapport approprié doit être optimisé pour différents tissus et conditions d’agglutination cellulaire. Dans ce protocole, 0,08% de BSA a empêché la fixation des cellules intestinales du tilapia du Nil. Cependant, la remise en suspension finale de la cellule ne doit pas contenir de BSA pour éviter l’influence de Ca 2+/Mg2+ sur les applications en aval.

Une autre mesure visant à réduire l’agrégation cellulaire est l’ajout de DNase I. Les cellules rompues ou mourantes libèrent des molécules d’ADN « collantes », qui sont parmi les principales causes de l’agglutination cellulaire. La DNase dégrade l’ADN libre et, ainsi, minimise l’agglutination cellulaire. Par conséquent, il est couramment utilisé dans la préparation de suspension cellulaire pour le séquençage unicellulaire42,43. De plus, un pipetage doux à l’aide de pipettes ou d’embouts en verre de grand calibre aide à réduire les dommages aux cellules. En particulier pour le séquençage d’ARN unicellulaire, les outils tels que les ciseaux, les tubes, les pipettes en verre et les crépines cellulaires doivent être exempts de RNase.

Avant tout, l’ensemble du processus de préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité doit être effectué avec l’enzyme de dissociation appropriée, doit être effectué doucement et rapidement à basse température et doit inclure des mesures visant à empêcher les cellules de s’agréger afin d’atteindre une viabilité et une concentration cellulaires élevées et une intégrité des acides nucléiques. Ce protocole peut également être utilisé pour la préparation de suspensions unicellulaires intestinales pour d’autres espèces de poissons avec des modifications mineures. En outre, ce protocole peut également fournir une référence précieuse pour le développement de protocoles de dissociation cellulaire pour d’autres tissus de poissons pour le séquençage unicellulaire et les études au niveau unicellulaire, telles que la culture cellulaire et la cytométrie en flux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent remercier la Fondation provinciale des sciences naturelles de Hainan de Chine (NO. 320QN211) et le programme de fonds de recherche du Laboratoire clé du Guangdong pour le contrôle des maladies des animaux aquatiques et la culture saine de Chine (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

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Préparation de suspension unicellulaire de l’intestin de tilapia du Nil pour séquençage unicellulaire
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Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).

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