Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحضير معلق أحادي الخلية من أمعاء البلطي النيلي لتسلسل الخلية الواحدة

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64688
Automatic Translation
*1, *1,3, 2, 4, 1,3, 1,3, 1,3
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نوضح إعداد تعليق أحادي الخلية عالي الجودة لأمعاء البلطي لتسلسل الخلية الواحدة.

Abstract

البلطي النيلي هو واحد من أكثر أنواع أسماك المياه العذبة شيوعا في جميع أنحاء العالم، وهو نموذج بحثي يستخدم على نطاق واسع لدراسات أسماك الاستزراع المائي. يعد تحضير معلقات أحادية الخلية عالية الجودة أمرا ضروريا للدراسات على مستوى الخلية الواحدة مثل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو تسلسل الجينوم. ومع ذلك، لا يوجد بروتوكول جاهز للاستخدام لأنواع أسماك الاستزراع المائي، وخاصة لأمعاء البلطي. تختلف إنزيمات التفكك الفعالة حسب نوع الأنسجة. لذلك ، من الضروري تحسين بروتوكول تفكك الأنسجة عن طريق اختيار تركيبة الإنزيم أو الإنزيم المناسبة للحصول على خلايا قابلة للحياة كافية بأقل قدر من الضرر. توضح هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لإعداد معلق أحادي الخلية عالي الجودة من أمعاء البلطي النيلي مع مزيج إنزيم من كولاجيناز / ديسباز. هذا المزيج فعال للغاية للتفكك باستخدام ألبومين مصل البقر و DNase لتقليل تراكم الخلايا بعد الهضم. يلبي إخراج الخلية متطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع قابلية بقاء الخلية بنسبة 90٪ وتركيز الخلية العالي. يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لإعداد تعليق أحادي الخلية من أمعاء أنواع الأسماك الأخرى. يوفر هذا البحث بروتوكولا مرجعيا فعالا ويقلل من الحاجة إلى تجارب إضافية في تحضير معلقات وحيدة الخلية لأنواع أسماك الاستزراع المائي.

Introduction

الخلايا هي الوحدات الأساسية للكائنات الحية. مقارنة بدراسات الأنسجة السائبة ، يمكن أن تعكس الدراسات على مستوى الخلية الواحدة عدم تجانس الخلية وتوفر معلومات عالية الدقة1. في السنوات الأخيرة ، طبق الباحثون تقنيات تسلسل الخلية الواحدة لدراسات الجينوم أو النسخ أو epigenome أو multi-omic على مستوى الخلية الواحدة في الثدييات وأسماك الزرد والكائنات النموذجية الأخرى وأبلغوا عن اختراقات كبيرة2،3،4،5،6،7. وفي حين ركزت معظم الدراسات على الكائنات النموذجية، إلا أن هناك عددا قليلا من البروتوكولات المرجعية أو مجموعات التفكك التجارية لتسلسل الخلية الواحدة في أنواع الأسماك الاقتصادية، مما يحد من تطبيق تسلسل الخلية الواحدة في بحوث تربية الأحياء المائية. لذلك ، فإن تطوير بروتوكولات تفكك الأنسجة التي تنتج معلقات أحادية الخلية عالية الجودة مع قابلية عالية للخلية وسلامة الحمض النووي أمر بالغ الأهمية.

من الضروري تحسين بروتوكول تفكك الأنسجة باستخدام الإنزيم المناسب أو تركيبة الإنزيم للحصول على خلايا قابلة للحياة كافية بأقل قدر من الضرر. يختلف الإنزيم الأكثر فعالية لتفكك الأنسجة حسب نوع الأنسجة. في الثدييات ، تم استخدام العديد من الإنزيمات لإعداد معلقات أحادية الخلية للأنسجة الصلبة للثدييات ، بما في ذلك كولاجيناز ، ديسباز ، تربسين ، غراء ، إيلاستاز ، هيالورونيداز ، ليبراز ، أكوتاز ، و trypLE 8,9. يشيع استخدام هضم التربسين جنبا إلى جنب مع الاضطراب الميكانيكي لفصل الأنسجة لزراعة الخلايا في الأسماك10،11،12،13،14. كما تم استخدام التربسين أو إضافته إلى كوكتيل الهضم لتفكك الأنسجة في أمعاء الفئران15 والأنسجة الخيشومية الزرد16. ومع ذلك ، لعدة أسباب ، التربسين ليس الخيار الأفضل لتسلسل خلية واحدة. التربسين وحده عادة ما يكون غير فعال لتفكك الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يحفز التربسين فواصل حبلا الحمض النووي 17,18 وتدهور الحمض النوويالريبي 19.

غراء يحلل البروتينات التي تشكل الوصلات الضيقة بين الخلايا. في خلايا الأعصاب والعضلات الملساء في الثدييات ، يكون غراء أكثر كفاءة وأقل تدميرا من البروتياز الأخرى20,21. ومع ذلك ، مثل التربسين ، ينتج عن غراء تجميع الخلايا الحر الناجم عن الحمض النووي بسبب تحلل الخلايا الذي يحدث أثناء الهضم الأنزيمي9. يكسر الإيلاستاز الإيلاستين ، والذي يوجد عادة في الجلد والرئتين والأربطة والأوتار والأنسجة الوعائية22. غالبا ما يستخدم مع كولاجيناز أو ديسباز أو تربسين لفصل أنسجة الرئة8. يشق الهيالورونيداز الروابط الجليكوسيدية للهيالورونان ، مما يساهم في هضم المصفوفة خارج الخلية في مختلف الأنسجة الضامة والجلد 9,23.

بشكل عام ، يعد كولاجيناز وديسباز خيارات جيدة لانهيار المصفوفة خارج الخلية. تم استخدامها في تفكك أمعاء الإنسان والفأر وسمك الزرد24،25،26،27. يدمر كولاجيناز رابطة الببتيد في الكولاجين ، ويعزز هضم المصفوفة خارج الخلية ، ويطلق الخلايا في تعليق ، وبالتالي ، غالبا ما يستخدم كولاجيناز لتفكك الأنسجة الصلبة للإنسان والفأر ، بما في ذلك الكبد28،29 ، الطحال 30 ، البنكرياس31 ، والأمعاء 25. Dispase هو بروتياز يحلل روابط الببتيد N-terminal لبقايا الأحماض الأمينية غير القطبية وهو أكثر اعتدالا من الكولاجيناز. إنه يشق مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مثل الفبرونيكتين ، والكولاجين من النوع الرابع ، وبدرجة أقل ، الكولاجين من النوع الأول ، دون التأثير على تقاطعات الخلايا الخلوية. يستخدم Dispase بشكل منفصل أو مع إنزيمات أخرى لتفكك الأنسجة ، مثل الأمعاء25,32 ، الدماغ33 ، الكبد 34 ، إلخ. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كوكتيلات الهضم المتاحة تجاريا ، بما في ذلك liberase و accutase و trypLE ، هي أيضا بدائل جيدة لتفكك الأنسجة الصلبة ، خاصة للجلد والكبد والكلى 8,9.

ينتمي البلطي النيلي (Oreochromis niloticus) إلى عائلة Cichlidae من رتبة Perciformes. وهي واحدة من أكثر أنواع أسماك المياه العذبة استزراعا في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية ، حيث يبلغ إنتاجها السنوي 4.5 مليون طن في عام 202235. إنه أحد أفضل أنواع أسماك الاستزراع المائي التي تمت دراستها مع جينوم مشروح جيدا. يعتبر البلطي النيلي نموذجا بحثيا مثاليا لأنواع أسماك الاستزراع المائي نظرا لقصر وقت توليده، وسهولة تربيته، وقدرته على التكيف مع مجموعة واسعة من بيئات التربية. الأمعاء ذات أهمية بحثية كبيرة لأنها عضو التغذية الهضم والامتصاص والتمثيل الغذائي والمناعة المخاطية. الأمعاء هي موطن السكان الميكروبية وهي نسيج مناعي أساسي36. وهو نشط مناعيا بسبب وجود العديد من أنواع الخلايا المناعية ، بما في ذلك الضامة والخلايا البائية والخلايا المحببة والخلايا التائية.

في الدراسة الحالية، قمنا بتطوير بروتوكول لإعداد معلق أحادي الخلية عالي الجودة من أمعاء البلطي النيلي لتسهيل الدراسات على مستوى الخلية الواحدة في أنواع أسماك الاستزراع المائي. وفقا لخصائص هذه الإنزيمات الخاصة بالأنسجة والعمل الأولي ، فإن كولاجيناز / ديسباز مناسب لفصل أنسجة أمعاء البلطي. النوع الأخير من الإنزيم الذي يجب مراعاته عند تحضير معلقات الخلية الواحدة هو DNase-I ، الذي يمنع تراكم الخلايا عن طريق تحلل الحمض النووي الحر المنطلق من خلال تحلل الخلايا الميتة أثناء الهضم الأنزيمي دون بدء مسارات موت الخلايا المبرمج9 ويزيد من إنتاجية الخلايا الحية36. بالإضافة إلى ذلك ، يضاف ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى المخزن المؤقت للغسيل لتقليل تكتل الخلايا وتحسين صلاحية الخلية. تصف العديد من شركات الكواشف BSA بأنها مثبت للإنزيم. تم استخدام إضافة 0.04٪ -1٪ BSA إلى PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) لتطوير محلول غسيل لإعداد معلقات تسلسل أحادية الخلية دون آثار ضارة38. يمكن أن تساعد إضافة نسبة منخفضة من BSA في الحفاظ على صلاحية الخلية وتجنب التجميع الحر للخلايا الناجم عن الحمض النووي بسبب تحلل الخلايا. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول أيضا مرجعا قيما لتطوير بروتوكولات تفكك الخلايا من أمعاء أنواع أسماك الاستزراع المائي الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات خلال هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة هاينان (رقم البروتوكول: HNUAUCC-2022-00063; تاريخ الموافقة: 2022-03-03). يمكن العثور على قائمة بالمعدات واللوازم المستخدمة في هذه التجربة في جدول المواد. ويرد ملخص للبروتوكول الحالي في الشكل 1.

1. إعداد الأسماك

  1. احصل على البلطي النيلي البالغ من العمر 6 أشهر بمتوسط وزن 100 جرام من مصدر موثوق. اختر الأسماك الخالية من أي علامات للأمراض.
  2. توقف عن إطعام الأسماك لمدة 24 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: صيام السمك يقلل من حجم محتويات الأمعاء ويسهل تحضير شرائح الأمعاء.
  3. اشطف السمك في ماء معقم جيد التهوية لمدة 15 دقيقة لغسل البكتيريا المربوطة بشكل فضفاض على سطح الجسم.
  4. القتل الرحيم للأسماك باستخدام 300 مجم / لتر تريكايين ميثان سلفونات (MS-222) لمدة 10 دقائق حتى تتوقف كل الحركة.

2. إعداد الكاشف

  1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.08٪ من BSA-Dulbecco (BSA-DPBS ، لشطف الخلايا وتعليقها). قم بإذابة 0.08 جم من BSA (0.8٪ وزن / حجم) في 100 مل من 1x DPBS. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويبرد مسبقا على الثلج عند استخدامه.
    ملاحظة: إضافة BSA مفيد لتقليل تكتل الخلايا. يمكن زيادة نسبة BSA من 0.04٪ إلى 1٪ وفقا لظروف تكتل الخلية.
  2. تحضير كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية.
    1. خفف كولاجيناز / ديسباز مع 1x PBS إلى تركيز نهائي من 1 ملغ / مل (0.1 وحدة / مل كولاجيناز و 0.8 وحدة / مل ديسباز). تأكد من استخدام PBS وليس DPBS.
      ملاحظة: يوفر برنامج تلفزيوني أيونات الكالسيوم اللازمة للإنزيم ليعمل بشكل صحيح. لا ينبغي استخدام DPBS في هذه الخطوة لأنه خال من Ca2 + / Mg2+ . بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام الكولاجين من النوع الأول في البروتوكول الحالي.
    2. قم بتصفية التخفيف من خلال مرشح غشاء معقم 0.22 ميكرومتر.
    3. تحضير كاشف تفكك الخلايا الذي يتكون من حجم 95٪ من محلول كولاجيناز / ديسباز وحجم 5٪ من مصل الجنين البقري (FBS).
      ملاحظة: يجب أن يكون كاشف التفكك طازجا في كل مرة يتم استخدامه. يساعد استخدام 5٪ FBS في الحفاظ على بقاء الخلية أثناء الهضم.
  3. تحضير محلول تريبان الأزرق.
    1. خذ محلول التريبان الأزرق من الثلاجة 4 درجات مئوية ، واحتفظ به عند 15-20 درجة مئوية لبضع دقائق قبل الاستخدام لمنع هطول الأمطار.
    2. قم بتصفية المحلول من خلال غشاء معقم 0.22 ميكرومتر.

3. إعداد المعدات

  1. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي المبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
  2. احصل على أنابيب طرد مركزي معقمة خالية من RNase سعة 1.5 مل ، وأنابيب مخروطية سعة 50 مل ، وماصات ونصائح زجاجية عريضة التجويف ، ومرشحات غشائية ، ومصافي خلايا ، وجميع أنابيب ونصائح منخفضة الاحتفاظ.
  3. ماصات الأوتوكلاف الزجاجية وأدوات التشريح ، بما في ذلك الملقط والمقص والمشارط ، ومعالجتها مسبقا بمحلول إزالة RNase لمنع الآثار الضارة ل RNase لخلية واحدة RNA-seq.

4. تشريح الأنسجة وتفكك الخلايا

  1. ضع السمك الرحيم على الجليد لتشريحه. بشكل معقم ، اجمع 3-4 سم من الجزء الأوسط من الأمعاء ، واستأصل أكبر قدر ممكن من الدهون والمساريق. قم بإزالة الدهون المرفقة بسطح الأمعاء بعناية وطبقة الغشاء المخاطي الشفاف المرن والقابل للطرق بالملقط.
    ملاحظة: يتم ربط الدهون والمساريق بالسطح الخارجي للأمعاء.
  2. إزالة أكبر قدر ممكن من الدهون لمنع آثاره الضارة على بروتوكول التفكك. باستخدام حقنة ، شطف الشظايا بلطف مع برنامج تلفزيوني معقم بارد الجليد عدة مرات لغسل محتويات الأمعاء والمخاط. تجنب التعامل الخشن.
  3. تشريح جزء الأمعاء إلى قطع صغيرة ، ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل مملوء ب 1 مل من برنامج تلفزيوني بارد.
  4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية برفق ، واستبدلها ب 1 مل من الثلج البارد 0.08٪ BSA-DPBS. أعد تعليق شظايا الأنسجة عن طريق الشفط اللطيف باستخدام ماصة زجاجية. كرر هذه الخطوة مرتين.
  5. قم بإزالة المادة الطافية ، وهضم شظايا الأنسجة باستخدام 1 مل من كاشف التفكك الأنزيمي (950 ميكرولتر من محلول كولاجيناز / ديسباز و 50 ميكرولتر من FBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
    1. بالإضافة إلى ذلك ، أضف 5 ميكرولتر من مثبط RNase (40 وحدة / ميكرولتر في محلول المخزون) إلى كاشف التفكك إذا تم تحضير العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
      ملاحظة: التركيز النهائي لمزيج الكولاجيناز / ديسباز هو 1 مجم / مل ، بما في ذلك كولاجيناز عند 0.1 وحدة / مل و dispase عند 0.8 وحدة / مل.
  6. اقلب الأنبوب يدويا على فترات 5 دقائق خلال حمام مائي لمدة 30-60 دقيقة.
    ملاحظة: يختلف وقت الحضانة الدقيق وفقا للأنسجة المستخدمة. تحقق من تقدم التفكك تحت المجهر حتى لا يتم رؤية أي نسيج سائب. ضع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة زجاجية مع ماصة ، وافحصها تحت المجهر. زيادة وقت الهضم إذا لم يتم فصل الخلايا تماما.
  7. قم بتدوير الأنابيب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية برفق باستخدام أطراف عريضة التجويف. أضف 1 مل من الثلج البارد 0.08٪ BSA-DPBS ، وقم بامتصاص الخلايا برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة زجاجية عريضة التجويف لمدة دقيقة واحدة.
    1. كرر هذه الخطوة مرتين.
      ملاحظة: يجب إجراء السحب لأعلى ولأسفل بعناية باستخدام أطراف عريضة التجويف ومنخفضة الاحتفاظ لمنع تعطل الخلايا.
  8. بلل مصفاة خلية 40 ميكرومتر مسبقا بنسبة 0.08٪ BSA-DPBS ، وضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. مرر تعليق الخلية من خلال المصفاة. اضغط واشطفه باستخدام 200 ميكرولتر DPBS إضافية ، واجمع التعليق في الجزء السفلي من الأنبوب.
  9. انقل التعليق إلى أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 5 ميكرولتر من DNase I (1 وحدة / ميكرولتر) ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 15-20 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من DPBS المثلج (Ca2 + / Mg2+ مجانا). ماصة بلطف صعودا وهبوطا مع أطراف واسعة التجويف لخلط الخلايا. كرر هذه الخطوة مرتين.

5. تلطيخ والفحص المجهري

  1. للتلطيخ ، امزج تعليق الخلية مع محلول أزرق تريبان بنسبة 0.4٪ بنسبة 1: 1. احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. أضف 5-10 ميكرولتر من الخليط على مقياس الدم ، وافحصه تحت المجهر.
    ملاحظة: تحتوي الخلايا القابلة للحياة على سيتوبلازم غير ملوث ، بينما تحتوي الخلايا الميتة على سيتوبلازم أزرق (الشكل 2).
  3. عد الخلايا القابلة للحياة والميتة في ثلاثة حقول مختلفة تحت المجهر. احسب النسبة المئوية لصلاحية الخلية بقسمة عدد الخلايا القابلة للحياة على إجمالي عدد الخلايا في الحقل.
    ملاحظة: يجب أن تكون صلاحية الخلية أكثر من 85٪ ، ويجب ألا يقل تركيز الخلية عن 1 × 105-1 × 107 / مل. يجب أن تكون خلفية تعليق الخلية نظيفة ، بدون كتل أو شظايا أو شوائب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول تحضير معلق عالي الجودة أحادي الخلية لأمعاء البلطي النيلي لتسلسل الخلية الواحدة (الشكل 1). يظهر هذا البحث أن مزيج كولاجيناز / ديسباز له تأثير تفكك جيد وهو خفيف لأنسجة الأمعاء. يعد اختيار إنزيم الهضم الأمثل أمرا ضروريا لإعداد تعليق أحادي الخلية عالي الجودة. في العمل الأولي ، تمت مقارنة كفاءات التفكك للعديد من الإنزيمات شائعة الاستخدام ، والنتائج مدرجة في الجدول 1. تم التحقق من أن مزيج الكولاجيناز / ديسباز له تأثير تفكك أفضل بكثير من كولاجيناز أو ديسباز أو تربسين وحده والعديد من مخاليط الإنزيم الأخرى ، بما في ذلك ليبراز ، تريبسين / إيلاستاز ، كولاجيناز / إيلاستاز ، وكولاجيناز / تربسين. علاوة على ذلك ، أنتج كولاجيناز / ديسباز أيضا الخلايا الأكثر قابلية للحياة في نهاية التجربة.

خلال فترة الحضانة ، تم فحص تقدم التفكك تحت المجهر. بعد 30 دقيقة ، اختفت الأنسجة السائبة تقريبا ، وبشكل عام ، لم يتم رؤية أي نسيج سائب بعد 45 دقيقة. بعد الهضم ، يتم ترشيح تعليق الخلية من خلال المصفاة بسهولة. بعد هذا البروتوكول ، أظهر تلطيخ التريبان الأزرق والفحص المجهري أن الخلايا المعوية لديها قابلية عالية للخلايا (أكثر من 90 ٪ ؛ الشكل 2 ، وأن تركيز الخلية يمكن أن يصل إلى 1 × 107 / مل. تم تشتيت الخلايا كخلايا مفردة. كانت معظم الخلايا مشرقة وبيضاء (خلايا قابلة للحياة) ، في حين أن القليل منها فقط كان داكنا أو أزرق (خلايا ميتة). الخلايا الميتة ملطخة باللون الأزرق الداكن بسبب غشاء الخلية المتغلغل. استوفت صلاحية الخلية وتركيزها متطلبات تسلسل الخلية الواحدة.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تدفق موجز لتفكك أمعاء البلطي النيلي وبروتوكولات تحضير معلق الخلية الواحدة. يتم تحضير الكواشف (الأقسام 1-2) قبل استئصال الأمعاء. يتم فرم الأمعاء وغسلها بالطرد المركزي في برنامج تلفزيوني (الخطوات 4.1-4.4). يتم هضم شظايا الأنسجة باستخدام محلول كولاجيناز / ديسباز في حمام مائي 37 درجة مئوية لعزل الخلايا (الخطوات 4.5-4.6). يتم شطف معلق الخلية المهضومة بنسبة 0.08٪ BAS-DPBS وتصفيته من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر (الخطوات 4.7-4.8). بعد حضانة DNase I ، يتم إعادة تعليق حبيبات الخلية في DPBS (الخطوات 4.9-4.10). يحدد تلطيخ تريبان الأزرق تركيز الخلية وصلاحيتها (القسم 5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الفحص المجهري لمعلق وحيد الخلية محضر من أنسجة معوية من البلطي النيلي وملطخ بالتريبان الأزرق. الخلايا القابلة للحياة بيضاء ومشرقة ، في حين أن الخلايا الميتة داكنة وزرقاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

انزيم أفضل تركيز عمل (ملغم / مل) تأثير التفكك
كولاجيناز II 1 +++
ديسباس 0.25 ++
التربسين 2.5 ++
ليبراز 1 +++
* كولاجيناز / ديسباز 1 +++++
كولاجيناز II / الإيلاستاز 1/1 +++
التربسين / الإيلاستاز 2.5/0.5 +++
التربسين / كولاجيناز II 1/1 +++

الجدول 1: نتائج مقارنة آثار تفكك إنزيمات الهضم شائعة الاستخدام لأمعاء البلطي النيل. تمثل المزيد من الرموز "+" درجة أعلى من التفكك وقابلية أعلى للخلية. الإنزيم المسمى ب "*" هو منتج تجاري ، وأفضل حل عمل 1 مجم / مل يتضمن 0.1 وحدة / مل كولاجيناز I و 0.8 وحدة / مل ديسباز. تم خلط الخلائط الأخرى من الإنزيمات عندما استخدمها الباحثون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول تحضير معلق أحادي الخلية عالي الجودة لأمعاء البلطي النيلي. قبل التفكك ، من الضروري إزالة الدهون والمساريق من الأمعاء ، خاصة بالنسبة لأمعاء الأسماك آكلة اللحوم التي تحتوي على الكثير من الدهون. استخدام حقنة بدلا من الكشط الصلب لغسل محتويات الأمعاء يقلل من الأضرار الميكانيكية للخلايا. لضمان بقاء الخلية ، من الضروري أيضا الحفاظ على درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية أو أقل لتشريح الأنسجة وخطوات الشطف. يتم تبريد محاليل الغسيل على الجليد ، ويتم ضبط درجة حرارة جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية مقدما. الأهم من ذلك ، يجب اختيار إنزيمات تفكك الخلايا الخفيفة والفعالة للأنسجة المدروسة. بناء على دراسة سابقة ، فإن مزيج كولاجيناز / ديسباز هو الأمثل لأمعاء البلطي النيل. مزيج الإنزيم هذا أكثر اعتدالا وفعالية على أمعاء البلطي من التربسين أو الديسباز أو الكولاجيناز وحده. بالإضافة إلى ذلك ، تم تضمين 5٪ FBS في كاشف التفكك للحفاظ على صلاحية الخلية أثناء الهضم39. يختلف وقت الحضانة الدقيق وفقا للأنسجة المستخدمة. يجب زيادة وقت الهضم إذا لم يتم فصل الأنسجة تماما. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب كولاجيناز / ديسباز Ca2+ للعمل. لذلك ، يتم استخدام PBS لتخفيف الإنزيم بدلا من DPBS ، وهو خال من Ca2 + / Mg2+. بالنسبة لحلول الغسيل ، يتم استخدام DPBS في حالة تأثير هذه الأيونات على خطوات تسلسل المصب.

تعمل معظم إنزيمات التفكك ، بما في ذلك كولاجيناز / ديسباز ، بأقصى سرعة وكفاءة عند درجة الحرارة المثلى ، والتي عادة ما تكون 37 درجة مئوية. عند درجة الحرارة هذه ، يتم نسخ الجينات ، وتتغير مستويات تعبيرها استجابة للتعامل مع40,41. تم الإبلاغ عن هذه الظاهرة في العديد من الدراسات التي أجريت على الثدييات وسمك الزرد. في كلية الفأر ، يتم التعبير عن موت الخلايا المبرمج والجينات المرتبطة بالإجهاد بما في ذلك JUN-B و FOS و Hsp90 بشكل تفاضلي في ظل ظروف تفكك إنزيمية مختلفة40. يتم تغيير التعبير التفاضلي للجينات المبكرة الفورية وجينات HSP في خلايا زعانف الزرد في ظروف تفكك مختلفة41. لقد ثبت أن جينات الاستجابة المبكرة ، بما في ذلك أعضاء متعددون من عائلات FOS و JUN ، يتم تنظيمها بشكل كبير بعد بضع دقائق فقط من الانفصال عند 37 درجة مئوية في معلقات الخلايا المحضرة عن طريق التفكك الأنزيمي لأنسجة الثدييات6. لذلك ، ينبغي النظر بعناية في تغييرات التعبير في موت الخلايا المبرمج والجينات المرتبطة بالإجهاد لبيانات ScRNA-seq. يمكن التغلب على هذا العيب باستخدام الضوابط المناسبة لتجارب ScRNA-seq. يجب معالجة أحد عناصر التحكم في ظل نفس ظروف التفكك بحيث يمكن اكتشاف التغييرات في التعبير الجيني أو تجنبها.

في هذا البروتوكول ، تتم إضافة BSA إلى DPBS بشكل أساسي لتقليل خسائر الخلايا وتكتل الخلايا. يمكن استخدام نسب BSA من 0.04٪ إلى 1٪ لإعداد معلقات تسلسل أحادية الخلية دون آثار ضارة38. سيؤدي استخدام نسبة BSA الصحيحة إلى تقليل تجميع الخلايا. يجب تحسين النسبة المناسبة للأنسجة المختلفة وظروف تكتل الخلايا. في هذا البروتوكول ، منع 0.08٪ BSA ارتباط خلايا أمعاء البلطي النيل. ومع ذلك ، يجب ألا تحتوي إعادة تعليق الخلية النهائية على BSA لتجنب تأثير Ca 2+ / Mg2+ على تطبيقات المصب.

إجراء آخر لتقليل تراكم الخلايا هو إضافة DNase I. تطلق الخلايا الممزقة أو المحتضرة جزيئات الحمض النووي "اللزجة" ، والتي تعد من بين الأسباب الرئيسية لتكتل الخلايا. يؤدي DNase إلى تحلل الحمض النووي الحر ، وبالتالي يقلل من تكتل الخلايا. لذلك ، يتم استخدامه بشكل شائع في إعداد تعليق الخلية لتسلسل الخليةالواحدة 42,43. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد السحب اللطيف باستخدام ماصات أو أطراف زجاجية عريضة التجويف على تقليل تلف الخلايا. خاصة بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، يجب أن تكون الأدوات مثل المقص والأنابيب والماصات الزجاجية ومصافي الخلايا خالية من RNase.

قبل كل شيء ، يجب أن تتم العملية الكاملة لإعداد تعليق خلية واحدة عالي الجودة باستخدام إنزيم التفكك المناسب ، ويجب أن يتم إجراؤها بلطف وبسرعة عند درجة حرارة منخفضة ، ويجب أن تتضمن تدابير لمنع الخلايا من التجمع من أجل تحقيق قابلية عالية للبقاء والتركيز وسلامة الحمض النووي. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لإعداد معلقات الأمعاء أحادية الخلية لأنواع الأسماك الأخرى مع تعديلات طفيفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوفر هذا البروتوكول أيضا مرجعا قيما لتطوير بروتوكولات تفكك الخلايا لأنسجة الأسماك الأخرى لتسلسل الخلية الواحدة والدراسات على مستوى الخلية الواحدة ، مثل زراعة الخلايا وقياس التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هاينان في الصين (رقم 320QN211) وبرنامج صندوق الأبحاث التابع للمختبر الرئيسي لمقاطعة قوانغدونغ لمكافحة أمراض الحيوانات المائية والزراعة الصحية في الصين (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 192 ، البلطي النيلي ، الأمعاء ، تفكك الأنسجة ، تحضير معلق الخلية الواحدة
تحضير معلق أحادي الخلية من أمعاء البلطي النيلي لتسلسل الخلية الواحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, P., Zhou, Y., Wang, B.,… More

Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter