Summary
Aqui, demonstramos a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia para sequenciamento unicelular.
Abstract
A tilápia-do-nilo é uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em todo o mundo e é um modelo de pesquisa amplamente utilizado para estudos de peixes de aquicultura. A preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade é essencial para estudos em nível de célula única, como RNA de célula única ou sequenciamento genômico. No entanto, não existe um protocolo pronto para uso para espécies de peixes de aquicultura, particularmente para o intestino da tilápia. As enzimas de dissociação efetivas variam dependendo do tipo de tecido. Portanto, otimizar o protocolo de dissociação tecidual selecionando a enzima ou combinação enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. Este estudo ilustra um protocolo otimizado para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo com uma combinação enzimática de colagenase/dispase. Esta combinação é altamente eficaz para dissociação com a utilização de albumina de soro bovino e DNase para reduzir a agregação celular após a digestão. A produção celular satisfaz os requisitos para sequenciamento unicelular, com 90% de viabilidade celular e alta concentração celular. Este protocolo também pode ser modificado para preparar uma suspensão unicelular do intestino de outras espécies de peixes. Esta pesquisa fornece um protocolo de referência eficiente e reduz a necessidade de ensaios adicionais na preparação de suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.
Introduction
As células são as unidades fundamentais dos organismos. Comparados a estudos de tecidos volumosos, estudos em nível de célula única podem refletir a heterogeneidade celular e fornecer informações de maior resolução1. Nos últimos anos, pesquisadores têm aplicado tecnologias de sequenciamento unicelular para estudos genômicos, transcriptomas, epigenomas ou multi-ômicos em nível unicelular em mamíferos, peixes-zebra e outros organismos modelo e relatado grandes avanços 2,3,4,5,6,7 . Embora a maioria dos estudos tenha se concentrado em organismos-modelo, há poucos protocolos de referência ou kits comerciais de dissociação para sequenciamento unicelular em espécies econômicas de peixes, o que limita a aplicação do sequenciamento unicelular em pesquisas aquícolas. Portanto, o desenvolvimento de protocolos de dissociação tecidual que produzam suspensões unicelulares de alta qualidade com alta viabilidade celular e integridade de ácidos nucleicos é crucial.
A otimização do protocolo de dissociação tecidual com a combinação enzimática ou enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. A enzima mais eficaz para a dissociação tecidual varia de acordo com o tipo de tecido. Em mamíferos, várias enzimas têm sido utilizadas para preparar suspensões unicelulares para tecidos sólidos de mamíferos, incluindo colagenase, dispase, tripsina, papaína, elastase, hialuronidase, liberase, accutase e tripLE 8,9. A digestão de tripsina combinada com ruptura mecânica tem sido comumente utilizada para dissociar tecidos para cultura celular em peixes 10,11,12,13,14. A tripsina também tem sido usada ou adicionada ao coquetel de digestão para dissociação tecidual no intestino de ratos15 e tecido branquial de peixe-zebra16. No entanto, por várias razões, a tripsina não é a melhor opção para o sequenciamento unicelular. A tripsina isolada é geralmente ineficaz para a dissociação tecidual. Adicionalmente, a tripsina induz quebras de fitas de DNA 17,18 e degradação de RNA19.
A papaína degrada as proteínas que compõem as tight junctions entre as células. Em células nervosas e musculares lisas de mamíferos, a papaína é mais eficiente e menos destrutiva que outras proteases20,21. Entretanto, assim como a tripsina, a papaína resulta na agregação celular induzida pelo DNA livre devido à lise celular que ocorre durante a digestão enzimática9. A elastase decompõe a elastina, que é tipicamente encontrada na pele, pulmões, ligamentos, tendões e tecidos vasculares22. É frequentemente usado em combinação com colagenase, dispase ou tripsina para dissociar o tecido pulmonar8. A hialuronidase cliva as ligações glicosídicas do hialuronano, contribuindo para a digestão da matriz extracelular em vários tecidos conjuntivos e pele 9,23.
Em geral, colagenase e dispase são boas opções para a quebra da matriz extracelular. Eles têm sido utilizados na dissociação dos intestinos de humanos, camundongos e peixes-zebra24,25,26,27. A colagenase destrói a ligação peptídica no colágeno, promove a digestão da matriz extracelular e libera as células em suspensão, e, assim, a colagenase é frequentemente utilizada para dissociação de tecidos sólidos humanos e de camundongos, inclusive para o fígado 28,29, baço30, pâncreas31 e intestino 25. Dispase é uma protease que hidrolisa as ligações peptídicas N-terminais de resíduos de aminoácidos apolares e é mais suave que a colagenase. Cliva os componentes da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno tipo IV e, em menor grau, colágeno tipo I, sem afetar as junções célula-célula. Dispase é usado separadamente ou com outras enzimas para dissociação tecidual, como intestino25,32, cérebro33, fígado34, etc. Além disso, coquetéis de digestão comercialmente disponíveis, incluindo liberase, accutase e triple, também são boas alternativas para a dissociação de tecidos sólidos, especialmente para pele, fígado e rins 8,9.
A tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) pertence à família Cichlidae da ordem Perciformes. É uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em áreas tropicais e subtropicais, com uma produção anual de 4,5 milhões de toneladas em 202235. É uma das espécies de peixes de aquicultura mais bem estudadas com um genoma bem anotado. A tilápia-do-nilo é um modelo de pesquisa ideal para espécies de peixes aquícolas devido ao seu curto tempo de geração, facilidade de criação e adaptabilidade a uma ampla gama de ambientes de criação. O intestino é de grande interesse de pesquisa, pois é o órgão da digestão e absorção da nutrição, metabolismo e imunidade das mucosas. O intestino é o habitat das populações microbianas e é um tecido imune essencial36. É imunologicamente ativo devido à presença de numerosos tipos de células imunes, incluindo macrófagos, células B, granulócitos e células T.
No presente estudo, desenvolvemos um protocolo para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível unicelular em espécies de peixes de aquicultura. De acordo com as características dessas enzimas tecido-específicas e trabalhos preliminares, a colagenase/dispase é apropriada para dissociar o tecido intestinal da tilápia. O último tipo enzimático a ser considerado no preparo de suspensões unicelulares é a DNase-I, que impede a agregação celular degradando o DNA livre liberado pela lise de células mortas durante a digestão enzimática sem iniciar vias apoptóticas9 e aumenta o rendimento de células vivas36. Além disso, a albumina de soro bovino (BSA) é adicionada ao tampão de lavagem para reduzir a aglomeração celular e melhorar a viabilidade celular. Várias empresas de reagentes descrevem a BSA como um estabilizador enzimático. A adição de BSA 0,04%-1% ao PBS (phosphate-buffered saline) tem sido utilizada para desenvolver uma solução de lavagem para o preparo de suspensões de sequenciamento unicelular sem efeitos adversos38. A adição de uma baixa proporção de BSA poderia ajudar a manter a viabilidade celular e evitar a agregação livre induzida por DNA de células devido à lise celular. Este protocolo também pode fornecer uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular do intestino de outras espécies de peixes de aquicultura.
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Protocol
Todos os protocolos em animais durante este estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Hainan (número do protocolo: HNUAUCC-2022-00063; Data de aprovação: 03/03/2022). Uma lista dos equipamentos e insumos utilizados neste experimento pode ser encontrada na Tabela de Materiais. Um resumo do protocolo atual é ilustrado na Figura 1.
1. Preparo do peixe
- Obter tilápia do Nilo com 6 meses de idade com peso corporal médio de 100 g de fonte confiável. Selecione peixes que estejam livres de quaisquer sinais de doença.
- Pare de alimentar os peixes 24 h antes de prosseguir para a próxima etapa.
OBS: O jejum de peixes reduz o volume do conteúdo intestinal e facilita o preparo dos segmentos intestinais. - Enxágue o peixe em água estéril bem aerada por 15 minutos para lavar as bactérias soltas na superfície corporal.
- Eutanasiar os peixes com 300 mg/L de metanossulfonato de tricaína (MS-222) por cerca de 10 min até que todo o movimento pare.
2. Preparação dos reagentes
- Preparar solução salina tamponada com fosfato BSA-Dulbecco a 0,08% (BSA-DPBS, para lavagem e resussão celular). Dissolver 0,08 g de BSA (0,8% p/v) em 100 mL de 1x DPBS. Conservar a 4 °C e pré-arrefecer no gelo quando utilizado.
NOTA: A adição de BSA é benéfica para minimizar a aglomeração celular. A razão BSA pode ser aumentada de 0,04% para 1% de acordo com as condições de aglomeração celular. - Preparar o reagente de dissociação enzimática celular.
- Diluir a colagenase/dispase com 1x PBS até uma concentração final de 1 mg/mL (0,1 U/mL colagenase e 0,8 U/mL dispase). Certifique-se de que o PBS e não o DPBS sejam usados.
NOTA: PBS fornece os íons de cálcio necessários para que a enzima funcione corretamente. DPBS não deve ser usado nesta etapa porque é Ca 2+/Mg2+ livre. Além disso, a colagenase tipo I é utilizada no protocolo atual. - Filtrar a diluição através de um filtro de membrana estéril de 0,22 μm.
- Preparar um reagente de dissociação celular composto por um volume de 95% de solução de colagenase/dispase e um volume de 5% de soro fetal bovino (SFB).
NOTA: O reagente de dissociação deve ser renovado sempre que for utilizado. Usando 5% FBS ajuda a manter a viabilidade celular durante a digestão.
- Diluir a colagenase/dispase com 1x PBS até uma concentração final de 1 mg/mL (0,1 U/mL colagenase e 0,8 U/mL dispase). Certifique-se de que o PBS e não o DPBS sejam usados.
- Prepare a solução de azul de tripano.
- Tome a solução de azul de tripano do frigorífico a 4 °C e mantenha-a a 15-20 °C durante alguns minutos antes de utilizar para evitar precipitação.
- Filtrar a solução através de uma membrana estéril de 0,22 μm.
3. Preparação do equipamento
- Pré-resfriar a centrífuga refrigerada a 4 °C antes de usar.
- Obter tubos de centrífuga estéreis de 1,5 mL sem RNase, tubos cônicos de 50 mL, pipetas e pontas de vidro de furo largo, filtros de membrana, filtros de células e todos os tubos e pontas de baixa retenção.
- Pipetas de vidro de autoclave e ferramentas de dissecção, incluindo pinças, tesouras e bisturis, e pré-tratá-las com a solução de remoção de RNase para prevenir os efeitos adversos da RNase para RNA-seq de célula única.
4. Dissecção tecidual e dissociação celular
- Coloque o peixe eutanasiado no gelo para dissecção. Assepticamente, colete 3-4 cm da seção média do intestino e excise o máximo de gordura e mesentério possível. Remova cuidadosamente a gordura aderida à superfície intestinal e a camada de mucosa clara elástica e maleável com pinças.
NOTA: A gordura e o mesentério estão ligados à superfície externa do intestino. - Remova o máximo de gordura possível para evitar seus efeitos adversos no protocolo de dissociação. Usando uma seringa, lave suavemente os fragmentos com PBS gelado estéril várias vezes para lavar o conteúdo intestinal e o muco. Evite manuseio áspero.
- Disseque o segmento do intestino em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 1,5 mL preenchido com 1 mL de PBS gelado.
- Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante delicadamente e substitua por 1 mL de BSA-DPBS 0,08% gelado. Ressuspender os fragmentos de tecido por aspiração suave usando uma pipeta de vidro. Repita esta etapa duas vezes.
- Remover o sobrenadante e digerir os fragmentos de tecido usando 1 mL do reagente de dissociação enzimática (950 μL de solução de colagenase/dispase e 50 μL de SFB) em banho-maria a 37 °C por 30-60 min.
- Além disso, adicionar 5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL na solução reserva) ao reagente de dissociação se as amostras estiverem preparadas para o sequenciamento de RNA de célula única.
NOTA: A concentração final da mistura colagenase/dispase é de 1 mg/mL, incluindo colagenase a 0,1 U/mL e dispase a 0,8 U/mL.
- Além disso, adicionar 5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL na solução reserva) ao reagente de dissociação se as amostras estiverem preparadas para o sequenciamento de RNA de célula única.
- Inverta manualmente o tubo em intervalos de 5 min durante o banho de água de 30-60 min.
NOTA: O tempo exato de incubação varia de acordo com os tecidos utilizados. Verifique o progresso da dissociação sob um microscópio até que nenhum tecido volumoso seja visto. Coloque 10 μL da suspensão celular em uma lâmina de vidro com uma pipeta e examine-a ao microscópio. Aumente o tempo de digestão se as células não estiverem completamente dissociadas. - Gire os tubos a 300 × g por 5 min a 4 °C e remova suavemente o reagente de dissociação enzimática celular usando pontas largas. Adicione 1 mL de BSA-DPBS 0,08% gelado e pipete suavemente as células para cima e para baixo usando uma pipeta de vidro de furo largo por 1 min.
- Repita esta etapa duas vezes.
NOTA: A pipetagem para cima e para baixo deve ser realizada com cuidado usando pontas de furo largo e baixa retenção para evitar a ruptura celular.
- Repita esta etapa duas vezes.
- Pré-umedeça um filtro celular de 40 μm com BSA-DPBS a 0,08% e coloque-o em um tubo cônico de 50 mL. Passe a suspensão da célula através do filtro. Bata e enxágue com um DPBS adicional de 200 μL e recolha a suspensão no fundo do tubo.
- Transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 5 μL de DNase I (1 U/μL) e incubar durante 15 min a 15-20 °C. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células em 400 μL de DPBS gelado (Ca 2+/Mg2+ livre). Pipetar suavemente para cima e para baixo com pontas largas para misturar as células. Repita esta etapa duas vezes.
5. Coloração e exame microscópico
- Para a coloração, misturar a suspensão celular com solução de azul de tripano a 0,4% na proporção de 1:1. Incubar durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Adicione 5-10 μL da mistura em um hemocitômetro e examine ao microscópio.
NOTA: As células viáveis terão citoplasma não corado, enquanto as células mortas terão um citoplasma azul (Figura 2). - Conte as células viáveis e mortas em três campos diferentes sob o microscópio. Calcule a porcentagem de viabilidade celular dividindo o número de células viáveis pelo número total de células em um campo.
NOTA: A viabilidade celular deve ser superior a 85% e a concentração celular não deve ser inferior a 1 x 105-1 x 107/mL. O fundo da suspensão celular deve estar limpo, sem aglomerações, fragmentos ou impurezas.
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Representative Results
Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia-do-nilo para sequenciamento unicelular (Figura 1). Esta pesquisa mostra que a mistura colagenase/dispase tem um bom efeito de dissociação e é leve para o tecido intestinal. A seleção da enzima de digestão ideal é essencial para preparar uma suspensão de célula única de alta qualidade. No trabalho preliminar, as eficiências de dissociação de várias enzimas comumente usadas foram comparadas, e os resultados estão listados na Tabela 1. Verificou-se que a mistura colagenase/dispase tem um efeito de dissociação muito melhor do que colagenase, dispase ou tripsina isoladamente e várias outras misturas enzimáticas, incluindo liberase, tripsina/elastase, colagenase/elastase e colagenase/tripsina. Além disso, a colagenase/dispase também produziu as células mais viáveis ao final do experimento.
Durante o tempo de incubação, o progresso da dissociação foi verificado ao microscópio. Após 30 min, o tecido volumoso estava quase desaparecido e, em geral, nenhum tecido volumoso foi visto após 45 min. Após a digestão, a suspensão celular filtrou através do filtro facilmente. Seguindo este protocolo, a coloração com azul de tripano e o exame microscópico mostraram que as células intestinais tinham alta viabilidade celular (mais de 90%; Figura 2, e que a concentração celular poderia ser de até 1 x 107/mL. As células foram dispersas como células únicas. A maioria das células era brilhante e branca (células viáveis), enquanto apenas algumas eram escuras ou azuis (células mortas). As células mortas são coradas de azul escuro por causa da membrana celular permeabilizada. A viabilidade celular e a concentração celular satisfizeram os requisitos do sequenciamento unicelular.
Figura 1: Fluxograma resumido dos protocolos de dissociação intestinal da tilápia-do-nilo e preparo da suspensão unicelular. Os reagentes são preparados (seções 1-2) antes da excisão do intestino. Os intestinos são picados e centrifugamente lavados em PBS (passos 4.1-4.4). Os fragmentos de tecido são digeridos em solução de colagenase/dispase em banho-maria a 37 °C para isolar as células (passos 4.5-4.6). A suspensão de células digeridas é enxaguada com BAS-DPBS 0,08% e filtrada através de um filtro celular de 40 μm (passos 4.7-4.8). Após a incubação da DNase I, o pellet celular é ressuspendido em DPBS (passos 4.9-4.10). A coloração com azul de tripano determina a concentração e a viabilidade celular (secção 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exame microscópico de uma suspensão unicelular preparada a partir do tecido intestinal da tilápia do Nilo e corada com azul de tripano. As células viáveis são brancas e brilhantes, enquanto as células mortas são escuras e azuis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Enzima | Melhor concentração de trabalho (mg/mL) | Efeito de dissociação |
| Colagenase II | 1 | +++ |
| Dispase | 0.25 | ++ |
| Tripsina | 2.5 | ++ |
| Liberase | 1 | +++ |
| *Colagenase/dispase | 1 | +++++ |
| Colagenase II/elastase | 1/1 | +++ |
| Tripsina/elastase | 2.5/0.5 | +++ |
| Tripsina/colagenase II | 1/1 | +++ |
Tabela 1: Resultados comparativos dos efeitos de dissociação das enzimas de digestão comumente usadas para o intestino da tilápia do Nilo. Mais símbolos "+" representam maior grau de dissociação e maior viabilidade celular. A enzima marcada com "*" é um produto comercial, e a melhor solução de trabalho de 1 mg/mL inclui 0,1 U/mL de colagenase I e 0,8 U/mL de dispase. As demais misturas de enzimas foram misturadas quando utilizadas pelos pesquisadores.
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Discussion
Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo. Antes da dissociação, a remoção de gordura e mesentério do intestino é necessária, particularmente para intestinos de peixes carnívoros com muita gordura. Usar uma seringa em vez de raspagem dura para lavar o conteúdo intestinal reduz os danos mecânicos às células. Para garantir a viabilidade celular, também é essencial manter a temperatura em 20 °C ou abaixo para as etapas de dissecção e enxágue do tecido. As soluções de lavagem são resfriadas em gelo e a temperatura da centrífuga é ajustada para 4 °C com antecedência. Mais importante, enzimas de dissociação celular leves e eficientes para o tecido estudado devem ser selecionadas. Com base em um estudo anterior, a mistura colagenase/dispase é ideal para o intestino da tilápia do Nilo. Essa combinação enzimática é mais suave e eficaz no intestino da tilápia do que a tripsina, a dispase ou a colagenase isoladamente. Além disso, SFB a 5% foi incluída no reagente de dissociação para manter a viabilidade celular durante a digestão39. O tempo exato de incubação varia de acordo com os tecidos utilizados. O tempo de digestão precisa ser aumentado se o tecido não estiver completamente dissociado. Além disso, a colagenase/dispase requer Ca2+ para funcionar. Portanto, PBS é usado para diluir a enzima em vez de DPBS, que é livre de Ca 2+/Mg2+. Para as soluções de lavagem, o DPBS é usado caso esses íons influenciem as etapas de sequenciamento a jusante.
A maioria das enzimas de dissociação, incluindo a colagenase/dispase, trabalha com velocidade e eficiência máximas em sua temperatura ideal, que geralmente é de 37 °C. Nessa temperatura, os genes são transcritos e seus níveis de expressão mudam em resposta ao manuseio40,41. Este fenômeno tem sido relatado em vários estudos em mamíferos e peixes-zebra. No rim de camundongos, a apoptose e genes relacionados ao estresse, incluindo JUN-B, FOS e Hsp90, são diferencialmente expressos sob diferentes condições de dissociação enzimática40. A expressão diferencial de genes precoces imediatos e genes HSP está alterada em células da nadadeira do peixe-zebra em diferentes condições dedissociação41. Demonstrou-se que genes de resposta precoce, incluindo múltiplos membros das famílias FOS e JUN, são significativamente up-regulated após apenas alguns minutos de separação a 37 °C em suspensões celulares preparadas pela dissociação enzimática de tecidos de mamíferos6. Portanto, as alterações de expressão em genes relacionados à apoptose e estresse devem ser consideradas cuidadosamente para os dados de ScRNA-seq. Essa desvantagem pode ser superada com o uso de controles apropriados para os experimentos de ScRNA-seq. Um dos controles deve ser tratado sob as mesmas condições de dissociação para que as alterações artefatos, na expressão gênica, possam ser detectadas ou evitadas.
Neste protocolo, a BSA é adicionada à SDPD principalmente para minimizar as perdas celulares e a aglomeração celular. Proporções de SCQ de 0,04% a 1% podem ser usadas para preparar suspensões de sequenciamento unicelular sem efeitos adversos38. Usar a proporção correta de BSA reduziria a agregação celular. A proporção apropriada deve ser otimizada para diferentes tecidos e condições de aglomeração celular. Neste protocolo, a BSA a 0,08% impediu a fixação de células intestinais da tilápia-do-nilo. No entanto, a ressuspensão celular final não deve conter BSA para evitar a influência de Ca 2+/Mg2+ nas aplicações a jusante.
Outra medida para reduzir a agregação celular é a adição de DNase I. Células rompidas ou moribundas liberam moléculas de DNA "pegajosas", que estão entre as principais causas de aglomeração celular. A DNase degrada o DNA livre e, assim, minimiza a aglomeração celular. Portanto, é comumente utilizada no preparo de suspensão celular para sequenciamento unicelular42,43. Além disso, a pipetagem suave usando pipetas ou pontas de vidro de furo largo ajuda a reduzir os danos celulares. Especialmente para RNA-seq de célula única, ferramentas como tesouras, tubos, pipetas de vidro e filtros de células devem ser livres de RNase.
Acima de tudo, todo o processo de preparação de uma suspensão de célula única de alta qualidade deve ser feito com a enzima de dissociação apropriada, deve ser realizado suave e rapidamente a uma baixa temperatura e deve incluir medidas para evitar que as células se agreguem, a fim de alcançar alta viabilidade e concentração celular e integridade do ácido nucleico. Este protocolo também pode ser usado para a preparação de suspensões unicelulares intestinais para outras espécies de peixes com pequenas modificações. Além disso, este protocolo também pode fornecer uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular para outros tecidos de peixes para sequenciamento de célula única e estudos em nível de célula única, como cultura celular e citometria de fluxo.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer o apoio da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Hainan da China (NO. 320QN211) e do Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave da Província de Guangdong de Controle de Doenças de Animais Aquáticos e Cultura Saudável da China (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
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