Summary
Her demonstrerer vi forberedelsen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af tilapiattarm til enkeltcellesekventering.
Abstract
Nilen tilapia er en af de mest almindeligt dyrkede ferskvandsfiskearter på verdensplan og er en udbredt forskningsmodel til akvakulturfiskstudier. Fremstillingen af enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet er afgørende for undersøgelser på enkeltcelleniveau såsom enkeltcelle-RNA eller genomsekventering. Der findes imidlertid ingen brugsklar protokol for akvakulturfiskearter, især for tarmen i tilapia. De effektive dissociationsenzymer varierer afhængigt af vævstypen. Derfor er det vigtigt at optimere vævsdissociationsprotokollen ved at vælge den passende enzym- eller enzymkombination for at opnå nok levedygtige celler med minimal skade. Denne undersøgelse illustrerer en optimeret protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra Nile tilapia tarm med en enzymkombination af collagenase/dispase. Denne kombination er yderst effektiv til dissociation med udnyttelsen af bovin serumalbumin og DNase for at reducere celleaggregering efter fordøjelse. Celleudgangen opfylder kravene til enkeltcellesekventering med 90% cellelevedygtighed og en høj cellekoncentration. Denne protokol kan også modificeres til fremstilling af en enkeltcellesuspension fra tarmene fra andre fiskearter. Denne forskning giver en effektiv referenceprotokol og reducerer behovet for yderligere forsøg med fremstilling af encellede suspensioner til akvakulturfiskearter.
Introduction
Celler er de grundlæggende enheder af organismer. Sammenlignet med bulkvævsundersøgelser kan undersøgelser på enkeltcelleniveau afspejle celleheterogenitet og give oplysninger med højere opløsning1. I de senere år har forskere anvendt enkeltcellesekventeringsteknologier til genom-, transkriptom-, epigenom- eller multi-omiske undersøgelser på enkeltcelleniveau hos pattedyr, zebrafisk og andre modelorganismer og rapporteret store gennembrud 2,3,4,5,6,7 . Mens de fleste undersøgelser har fokuseret på modelorganismer, er der få referenceprotokoller eller kommercielle dissociationssæt til enkeltcellesekventering i økonomiske fiskearter, hvilket begrænser anvendelsen af enkeltcellesekventering i akvakulturforskning. Derfor er det afgørende at udvikle vævsdissociationsprotokoller, der producerer enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet med høj cellelevedygtighed og nukleinsyreintegritet.
Det er vigtigt at optimere vævsdissociationsprotokollen med den passende enzym- eller enzymkombination for at opnå nok levedygtige celler med minimal skade. Det mest effektive enzym til vævsdissociation varierer afhængigt af vævstypen. Hos pattedyr er flere enzymer blevet anvendt til fremstilling af enkeltcellesuspensioner til pattedyrs faste væv, herunder collagenase, dispase, trypsin, papain, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase og trypLE 8,9. Trypsin fordøjelse kombineret med mekanisk forstyrrelse har almindeligvis været anvendt til at dissociere væv til cellekultur i fisk 10,11,12,13,14. Trypsin er også blevet brugt eller tilsat i fordøjelsescocktailen til vævsdissociation i rottetarmen15 og zebrafiskens gællevæv16. Af flere grunde er trypsin imidlertid ikke den bedste mulighed for enkeltcellesekventering. Trypsin alene er normalt ineffektivt til vævsdissociation. Derudover inducerer trypsin DNA-strengbrud 17,18 og RNA-nedbrydning19.
Papain nedbryder proteinerne, der udgør de tætte kryds mellem celler. I pattedyrs nerve- og glatte muskelceller er papain mere effektiv og mindre destruktiv end andre proteaser20,21. Men ligesom trypsin resulterer papain i den frie DNA-inducerede aggregering af celler på grund af cellelyse, der opstår under enzymatisk fordøjelse9. Elastase nedbryder elastin, som typisk findes i hud, lunger, ledbånd, sener og vaskulært væv22. Det bruges ofte i kombination med collagenase, dispase eller trypsin til dissociering af lungevæv8. Hyaluronidase spalter hyaluronans glycosidbindinger, hvilket bidrager til fordøjelsen af den ekstracellulære matrix i forskellige bindevæv og hud 9,23.
Generelt er collagenase og dispase gode muligheder for ekstracellulær matrixnedbrydning. De er blevet brugt til dissociation af tarme fra mennesker, mus og zebrafisk 24,25,26,27. Collagenase ødelægger peptidbindingen i kollagen, fremmer fordøjelsen af den ekstracellulære matrix og frigiver cellerne i suspension, og således anvendes collagenase ofte til human og mus fast vævsdissociation, herunder til leveren 28,29, milt30, bugspytkirtlen31 og tarmen 25. Dispase er en protease, der hydrolyserer de N-terminale peptidbindinger af ikke-polære aminosyrerester og er mildere end collagenase. Det spalter de ekstracellulære matrixkomponenter, såsom fibronectin, type IV kollagen og i mindre grad type I kollagen, uden at påvirke celle-celle krydsninger. Dispase anvendes separat eller sammen med andre enzymer til vævsdissociation, såsom tarm25,32, hjerne33, lever 34 osv. Derudover er kommercielt tilgængelige fordøjelsescocktails, herunder liberase, accutase og trypLE, også gode alternativer til dissociation af fast væv, især for hud, lever og nyre 8,9.
Nile tilapia (Oreochromis niloticus) tilhører familien Cichlidae af ordren Perciformes. Det er en af de mest dyrkede ferskvandsfiskearter i tropiske og subtropiske områder med en årlig produktion på 4,5 millioner tons i 202235. Det er en af de bedst undersøgte akvakulturfiskearter med et godt kommenteret genom. Nilen tilapia er en ideel forskningsmodel for akvakulturfiskearter på grund af dens korte generationstid, lette opdræt og tilpasningsevne til en bred vifte af opdrætsmiljøer. Tarmen er af stor forskningsinteresse, da det er organet for ernæring, fordøjelse og absorption, stofskifte og slimhindeimmunitet. Tarmen er levested for mikrobielle populationer og er et essentielt immunvæv36. Det er immunologisk aktivt på grund af tilstedeværelsen af adskillige immuncelletyper, herunder makrofager, B-celler, granulocytter og T-celler.
I den aktuelle undersøgelse udviklede vi en protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra Nilens tilapiatarm for at lette enkeltcelleniveauundersøgelser i akvakulturfiskearter. Ifølge egenskaberne ved disse vævsspecifikke enzymer og indledende arbejde er collagenase/dispase egnet til dissociering af tilapia tarmvæv. Den sidste enzymtype, der skal overvejes ved fremstilling af enkeltcellesuspensioner, er DNase-I, som forhindrer celleaggregering ved at nedbryde frit DNA frigivet gennem død cellelyse under enzymatisk fordøjelse uden at initiere apoptotiske veje9 og øger det levende celleudbytte36. Derudover tilsættes bovint serumalbumin (BSA) til vaskebufferen for at reducere celleklumpning og forbedre cellelevedygtigheden. Flere reagensfirmaer beskriver BSA som en enzymstabilisator. Tilsætningen af 0,04%-1% BSA til PBS (fosfatbufret saltvand) er blevet anvendt til at udvikle en vaskeopløsning til fremstilling af enkeltcellesekventeringssuspensioner uden skadelige virkninger38. Tilføjelsen af et lavt forhold mellem BSA kan hjælpe med at opretholde cellelevedygtighed og undgå den frie DNA-inducerede aggregering af celler på grund af cellelyse. Denne protokol kan også udgøre en værdifuld reference for udvikling af celledissociationsprotokoller fra tarmene hos andre akvakulturfiskearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller under denne undersøgelse blev godkendt af Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protokolnummer: HNUAUCC-2022-00063; Godkendelsesdato: 2022-03-03). En liste over udstyr og forsyninger, der anvendes i dette eksperiment, findes i materialefortegnelsen. Et resumé af den nuværende protokol er illustreret i figur 1.
1. Tilberedning af fisk
- Få 6 måneder gammel Nile tilapia med en gennemsnitlig kropsvægt på 100 g fra en pålidelig kilde. Vælg fisk, der er fri for tegn på sygdom.
- Stop med at fodre fisken 24 timer, før du fortsætter til næste trin.
BEMÆRK: Fiskefaste reducerer mængden af tarmindhold og letter forberedelsen af tarmsegmenter. - Skyl fisken i godt luftet sterilt vand i 15 minutter for at vaske løst bundne bakterier på kropsoverfladen.
- Afliv fisken med 300 mg/l tricainmethansulfonat (MS-222) i ca. 10 minutter, indtil al bevægelse stopper.
2. Fremstilling af reagens
- Forbered 0,08% BSA-Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (BSA-DPBS, til celleskylning og resuspension). 0,08 g BSA (0,8 % w/v) opløses i 100 ml 1x DPBS. Opbevares ved 4 °C og forkøles på is, når det bruges.
BEMÆRK: Tilsætningen af BSA er gavnlig for at minimere celleklumpning. BSA-forholdet kan øges fra 0,04% til 1% i henhold til celleklumpningsbetingelserne. - Forbered det enzymatiske celledissociationsreagens.
- Fortynd collagenasen/dispasen med 1x PBS til en slutkoncentration på 1 mg/ml (0,1 E/ml collagenase og 0,8 E/ml dispase). Sørg for, at PBS og ikke DPBS bruges.
BEMÆRK: PBS tilvejebringer de calciumioner, der er nødvendige for, at enzymet fungerer korrekt. DPBS bør ikke bruges i dette trin, fordi det er Ca 2+/Mg2+ frit. Derudover anvendes collagenase type I i den nuværende protokol. - Fortyndingen filtreres gennem et sterilt 0,22 μm membranfilter.
- Forbered et celledissociationsreagens, der består af et 95% volumen collagenase / dispaseopløsning og et 5% volumen føtalt bovint serum (FBS).
BEMÆRK: Dissociationsreagenset skal gøres frisk, hver gang det anvendes. Brug af 5% FBS hjælper med at opretholde cellens levedygtighed under fordøjelsen.
- Fortynd collagenasen/dispasen med 1x PBS til en slutkoncentration på 1 mg/ml (0,1 E/ml collagenase og 0,8 E/ml dispase). Sørg for, at PBS og ikke DPBS bruges.
- Forbered trypanblå opløsning.
- Tag trypanblå opløsning fra køleskabet på 4 °C, og opbevar den ved 15-20 °C i et par minutter før brug for at forhindre nedbør.
- Opløsningen filtreres gennem en steril 0,22 μm membran.
3. Forberedelse af udstyr
- Forafkøl den nedkølede centrifuge til 4 °C før brug.
- Få sterile RNase-frie 1,5 ml centrifugerør, 50 ml koniske rør, bredborede glaspipetter og spidser, membranfiltre, cellesier og alle rør og spidser med lav retention.
- Autoklave glaspipetter og dissektionsværktøjer, herunder pincet, saks og skalpeller, og forbehandle dem med RNase-fjernelsesopløsningen for at forhindre de negative virkninger af RNase for enkeltcelle RNA-seq.
4. Vævsdissektion og celledissociation
- Sæt den aflivede fisk på is til dissektion. Aseptisk samles 3-4 cm af tarmens midtersektion og punktafgifter så meget fedt og mesenteri som muligt. Fjern forsigtigt fedtet, der er fastgjort til tarmoverfladen og laget af elastisk og formbar klar slimhinde med tang.
BEMÆRK: Fedt og mesenteri er fastgjort til tarmens ydre overflade. - Fjern så meget fedt som muligt for at forhindre dets negative virkninger på dissociationsprotokollen. Brug en sprøjte til forsigtigt at skylle fragmenterne med steril iskold PBS flere gange for at vaske tarmindholdet og slimet af. Undgå hårdhændet håndtering.
- Disseker tarmsegmentet i små stykker, og overfør dem til et 1,5 ml rør fyldt med 1 ml iskold PBS.
- Der centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes forsigtigt, og erstattes med 1 ml iskold 0,08% BSA-DPBS. Resuspender vævsfragmenterne ved forsigtig aspiration ved hjælp af en glaspipette. Gentag dette trin to gange.
- Supernatanten fjernes, og vævsfragmenterne fordøjes med 1 ml enzymatisk dissociationsreagens (950 μl collagenase/dispaseopløsning og 50 μl FBS) i et 37 °C vandbad i 30-60 min.
- Derudover tilsættes 5 μL RNase-hæmmer (40 E/μL i stamopløsningen) til dissociationsreagenset, hvis prøverne fremstilles til enkeltcelle-RNA-sekventering.
BEMÆRK: Den endelige koncentration af collagenase/dispase-blandingen er 1 mg/ml, inklusive kollagenase ved 0,1 E/ml og dispase ved 0,8 E/ml.
- Derudover tilsættes 5 μL RNase-hæmmer (40 E/μL i stamopløsningen) til dissociationsreagenset, hvis prøverne fremstilles til enkeltcelle-RNA-sekventering.
- Vend røret manuelt med 5 minutters mellemrum i løbet af 30-60 minutters vandbad.
BEMÆRK: Den nøjagtige inkubationstid varierer afhængigt af det anvendte væv. Kontroller udviklingen af dissociation under et mikroskop, indtil der ikke ses noget bulkvæv. 10 μL af cellesuspensionen anbringes på et glasglas med en pipette, og det undersøges under mikroskop. Forøg fordøjelsestiden, hvis cellerne ikke er helt dissocierede. - Drej glassene ned ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C, og fjern forsigtigt det enzymatiske celledissociationsreagens ved hjælp af spidser med bred boring. Tilsæt 1 ml iskold 0,08% BSA-DPBS, og pipette forsigtigt cellerne op og ned ved hjælp af en glaspipette med bred boring i 1 min.
- Gentag dette trin to gange.
BEMÆRK: Pipettering op og ned skal udføres med forsigtighed ved hjælp af spidser med bred boring og lav retentionsspids for at forhindre celleforstyrrelser.
- Gentag dette trin to gange.
- Forvåd en 40 μm cellesi med 0,08% BSA-DPBS, og læg den i et 50 ml konisk rør. Før cellesuspensionen gennem silen. Bank og skyl med yderligere 200 μL DPBS, og opsaml suspensionen i bunden af røret.
- Overfør suspensionen til et 1,5 ml rør. Der tilsættes 5 μL DNase I (1 E/μL), og der inkuberes i 15 minutter ved 15-20 °C. Der centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og cellepelletsen resuspenderes i 400 μL iskold DPBS (Ca 2+/Mg2+ fri). Pipetter forsigtigt op og ned med spidser med bred boring for at blande cellerne. Gentag dette trin to gange.
5. Farvning og mikroskopisk undersøgelse
- Til farvning blandes cellesuspensionen med 0,4% trypanblå opløsning i forholdet 1: 1. Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 5-10 μL af blandingen på et hæmocytometer, og undersøg under mikroskopet.
BEMÆRK: Levedygtige celler vil have ufarvet cytoplasma, mens døde celler vil have en blå cytoplasma (figur 2). - Tæl de levedygtige og døde celler i tre forskellige felter under mikroskopet. Beregn cellelevedygtighedsprocenten ved at dividere antallet af levedygtige celler med det samlede antal celler i et felt.
BEMÆRK: Cellelevedygtigheden skal være mere end 85%, og cellekoncentrationen bør ikke være mindre end 1 x 105-1 x 107/ml. Cellesuspensionsbaggrunden skal være ren uden klumper, fragmenter eller urenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver fremstillingen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af Nile tilapiatarm til enkeltcellesekventering (figur 1). Denne forskning viser, at collagenase/dispase-blandingen har en god dissociationseffekt og er mild for tarmvæv. Valget af det optimale fordøjelsesenzym er afgørende for at fremstille en højkvalitets enkeltcellesuspension. I det indledende arbejde blev dissociationseffektiviteten af flere almindeligt anvendte enzymer sammenlignet, og resultaterne er anført i tabel 1. Collagenase/dispase-blandingen blev verificeret til at have en meget bedre dissociationseffekt end collagenase, dispase eller trypsin alene og flere andre enzymblandinger, herunder liberase, trypsin / elastase, collagenase / elastase og collagenase / trypsin. Desuden gav collagenase/dispase også de mest levedygtige celler i slutningen af eksperimentet.
Under inkubationstiden blev dissociationens fremskridt kontrolleret under et mikroskop. Efter 30 minutter var bulkvævet næsten væk, og generelt blev der ikke set noget bulkvæv efter 45 minutter. Efter fordøjelsen filtreres cellesuspensionen let gennem silen. Efter denne protokol viste trypanblå farvning og mikroskopisk undersøgelse, at tarmcellerne havde høj cellelevedygtighed (mere end 90%; Figur 2, og at cellekoncentrationen kunne være op til 1 x 107/ml. Cellerne blev spredt som enkeltceller. De fleste celler var lyse og hvide (levedygtige celler), mens kun få var mørke eller blå (døde celler). Døde celler farves mørkeblå på grund af den permeabiliserede cellemembran. Cellelevedygtigheden og cellekoncentrationen opfyldte kravene til enkeltcellesekventering.
Figur 1: Sammenfattende flowdiagram over Nilen tilapia tarmdissociation og enkeltcelle suspension forberedelse protokoller. Reagenserne fremstilles (afsnit 1-2) før tarmens udskæring. Tarmene hakkes og centrifugeres i PBS (trin 4.1-4.4). Vævsfragmenterne fordøjes ved hjælp af collagenase/dispaseopløsning i et 37 °C vandbad for at isolere cellerne (trin 4.5-4.6). Den fordøjede cellesuspension skylles med 0,08% BAS-DPBS og filtreres gennem en 40 μm cellesil (trin 4.7-4.8). Efter DNase I-inkubation resuspenderes cellepelleten i DPBS (trin 4.9-4.10). Trypanblå farvning bestemmer cellekoncentrationen og levedygtigheden (afsnit 5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikroskopisk undersøgelse af en enkeltcellesuspension fremstillet af Nilens tilapia tarmvæv og farvet med trypanblåt. Levedygtige celler er hvide og lyse, mens døde celler er mørke og blå. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Enzym | Bedste arbejdskoncentration (mg/ml) | Dissociation effekt |
| Collagenase II | 1 | +++ |
| Dispase | 0.25 | ++ |
| Trypsin | 2.5 | ++ |
| Liberase | 1 | +++ |
| *Collagenase/dispase | 1 | +++++ |
| Collagenase II/elastase | 1/1 | +++ |
| Trypsin/elastase | 2.5/0.5 | +++ |
| Trypsin/collagenase II | 1/1 | +++ |
Tabel 1: Sammenligningsresultater af dissociationseffekterne af almindeligt anvendte fordøjelsesenzymer til Nile tilapia tarm. Flere "+" symboler repræsenterer en højere grad af dissociation og højere cellelevedygtighed. Enzymet mærket med "*" er et kommercielt produkt, og 1 mg / ml bedste arbejdsløsning inkluderer 0,1 U / ml collagenase I og 0,8 U / ml dispase. De øvrige blandinger af enzymer blev blandet, når de blev brugt af forskerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver fremstillingen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af Nile tilapia tarm. Før dissociation er fjernelse af fedt og mesenteri fra tarmen nødvendig, især for kødædende fisketarme med meget fedt. Brug af en sprøjte i stedet for hård skrabning for at vaske tarmindholdet reducerer den mekaniske skade på cellerne. For at sikre cellernes levedygtighed er det også vigtigt at holde temperaturen på 20 °C eller derunder i vævsdissektions- og skylletrinnene. Vaskeopløsningerne afkøles på is, og centrifugetemperaturen justeres til 4 °C på forhånd. Vigtigst er det, at milde og effektive celledissociationsenzymer til det undersøgte væv bør vælges. Baseret på en tidligere undersøgelse er collagenase/dispase-blandingen optimal for Nilens tilapiatarm. Denne enzymkombination er mildere og mere effektiv på tilapia tarm end trypsin, dispase, eller kollagenase alene. Derudover blev 5% FBS inkluderet i dissociationsreagenset for at opretholde cellens levedygtighed under fordøjelsen39. Den nøjagtige inkubationstid varierer alt efter det anvendte væv. Fordøjelsestiden skal øges, hvis vævet ikke er helt dissocieret. Derudover kræver collagenase/dispase Ca2+ for at fungere. PBS anvendes derfor til at fortynde enzymet i stedet for DPBS, som er fri for Ca 2+/Mg2+. Til vaskeopløsningerne anvendes DPBS, hvis disse ioner påvirker nedstrøms sekventeringstrinnene.
De fleste dissociationsenzymer, herunder collagenase/dispase, arbejder med maksimal hastighed og effektivitet ved deres optimale temperatur, som almindeligvis er 37 °C. Ved denne temperatur transskriberes gener, og deres ekspressionsniveauer ændres som reaktion på håndteringaf 40,41. Dette fænomen er blevet rapporteret i flere undersøgelser hos pattedyr og zebrafisk. I musenyren udtrykkes apoptose og stressrelaterede gener, herunder JUN-B, FOS og Hsp90, forskelligt under forskellige enzymatiske dissociationsbetingelser40. Differentialekspressionen af umiddelbare tidlige gener og HSP-gener ændres i zebrafiskfineceller ved forskellige dissociationsbetingelser41. Det har vist sig, at tidlige responsgener, herunder flere medlemmer af FOS- og JUN-familierne, opreguleres signifikant efter kun få minutters adskillelse ved 37 °C i cellesuspensioner fremstillet ved enzymatisk dissociation af pattedyrvæv6. Derfor bør ekspressionsændringerne i apoptose og stressrelaterede gener overvejes nøje for ScRNA-seq-dataene. Denne ulempe kan overvindes ved at anvende passende kontroller til ScRNA-seq-eksperimenterne. En af kontrollerne skal behandles under de samme dissociationsbetingelser, så artefaktændringer i genekspression kan detekteres eller undgås.
I denne protokol tilføjes BSA primært til DPBS for at minimere celletab og celleklumpning. Forholdet mellem BSA fra 0,04% til 1% kan anvendes til fremstilling af enkeltcellesekventeringssuspensioner uden bivirkninger38. Brug af den korrekte BSA-andel ville reducere celleaggregering. Det passende forhold bør optimeres til forskellige vævs- og celleklumpningsforhold. I denne protokol forhindrede 0,08% BSA vedhæftning af Nile tilapia tarmceller. Den endelige celleresuspension bør dog ikke indeholde BSA for at undgå påvirkning af Ca 2+/Mg2+ på downstream-applikationerne.
En anden foranstaltning til at reducere celleaggregering er tilføjelsen af DNase I. Sprængte eller døende celler frigiver "klæbrige" DNA-molekyler, som er blandt hovedårsagerne til celleklumpning. DNase nedbryder frit DNA og minimerer dermed celleklumpning. Derfor anvendes det almindeligvis i cellesuspensionspræparat til enkeltcellesekventering42,43. Derudover hjælper skånsom pipettering ved hjælp af glaspipetter eller spidser med bred boring med at reducere celleskader. Især for enkeltcelle RNA-seq skal værktøjer som saks, rør, glaspipetter og cellesier være RNase-fri.
Frem for alt bør hele processen med fremstilling af en enkeltcellesuspension af høj kvalitet udføres med det passende dissociationsenzym, skal udføres forsigtigt og hurtigt ved lav temperatur og bør omfatte foranstaltninger til at forhindre celler i at aggregere for at opnå høj cellelevedygtighed og koncentration og nukleinsyreintegritet. Denne protokol kan også anvendes til fremstilling af tarm enkeltcellesuspensioner til andre fiskearter med mindre ændringer. Derudover kan denne protokol også give en værdifuld reference til udvikling af celledissociationsprotokoller for andet fiskevæv til enkeltcellesekventering og enkeltcelleniveauundersøgelser, såsom cellekultur og flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) og Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
References
- Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
- He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
- Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
- Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
- Xu, S. H., Cooke, I. M.
- Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
- Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
- Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
- Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
- Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
- Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
- Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
- Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
- Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
- Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
- FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
- Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
- Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
- Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
- Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
