Summary
Qui, dimostriamo la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia per il sequenziamento unicellulare.
Abstract
La tilapia del Nilo è una delle specie di pesci d'acqua dolce più comunemente coltivate in tutto il mondo ed è un modello di ricerca ampiamente utilizzato per gli studi sui pesci di acquacoltura. La preparazione di sospensioni monocellulari di alta qualità è essenziale per gli studi a livello di singola cellula come l'RNA a singola cellula o il sequenziamento del genoma. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all'uso per le specie ittiche di acquacoltura, in particolare per l'intestino della tilapia. Gli enzimi di dissociazione efficaci variano a seconda del tipo di tessuto. Pertanto, è essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale selezionando l'enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. Questo studio illustra un protocollo ottimizzato per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino di tilapia del Nilo con una combinazione enzimatica di collagenasi/dispasi. Questa combinazione è altamente efficace per la dissociazione con l'utilizzo di albumina sierica bovina e DNasi per ridurre l'aggregazione cellulare dopo la digestione. La produzione cellulare soddisfa i requisiti per il sequenziamento di singole cellule, con una vitalità cellulare del 90% e un'alta concentrazione cellulare. Questo protocollo può anche essere modificato per preparare una sospensione unicellulare dall'intestino di altre specie di pesci. Questa ricerca fornisce un protocollo di riferimento efficiente e riduce la necessità di ulteriori prove nella preparazione di sospensioni monocellulari per specie ittiche di acquacoltura.
Introduction
Le cellule sono le unità fondamentali degli organismi. Rispetto agli studi sui tessuti di massa, gli studi a livello di singola cellula possono riflettere l'eterogeneità cellulare e fornire informazioni a risoluzione più elevata1. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno applicato tecnologie di sequenziamento a singola cellula per studi su genoma, trascrittoma, epigenoma o multi-omici a livello di singola cellula in mammiferi, zebrafish e altri organismi modello e hanno riportato grandi scoperte 2,3,4,5,6,7 . Mentre la maggior parte degli studi si è concentrata su organismi modello, ci sono pochi protocolli di riferimento o kit di dissociazione commerciale per il sequenziamento a singola cellula nelle specie ittiche economiche, il che limita l'applicazione del sequenziamento a singola cellula nella ricerca sull'acquacoltura. Pertanto, lo sviluppo di protocolli di dissociazione tissutale che producano sospensioni monocellulari di alta qualità con elevata vitalità cellulare e integrità dell'acido nucleico è fondamentale.
È essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale con l'enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. L'enzima più efficace per la dissociazione tissutale varia a seconda del tipo di tessuto. Nei mammiferi, diversi enzimi sono stati utilizzati per preparare sospensioni unicellulari per i tessuti solidi dei mammiferi, tra cui collagenasi, dispasi, tripsina, papaina, elastasi, ialuronidasi, liberase, accutasi e trypLE 8,9. La digestione della tripsina combinata con la rottura meccanica è stata comunemente usata per dissociare i tessuti per la coltura cellulare nei pesci 10,11,12,13,14. La tripsina è stata anche utilizzata o aggiunta nel cocktail di digestione per la dissociazione dei tessuti nell'intestino di ratto15 e nel tessuto branchiale zebrafish16. Tuttavia, per diversi motivi, la tripsina non è l'opzione migliore per il sequenziamento a singola cellula. La tripsina da sola è di solito inefficace per la dissociazione tissutale. Inoltre, la tripsina induce rotture del filamento di DNA 17,18 e degradazione dell'RNA19.
La papaina degrada le proteine che compongono le giunzioni strette tra le cellule. Nelle cellule nervose e muscolari lisce dei mammiferi, la papaina è più efficiente e meno distruttiva di altre proteasi20,21. Tuttavia, come la tripsina, la papaina provoca l'aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare che si verifica durante la digestione enzimatica9. L'elastasi rompe l'elastina, che si trova tipicamente nella pelle, nei polmoni, nei legamenti, nei tendini e nei tessuti vascolari22. È spesso usato in combinazione con collagenasi, dispasi o tripsina per dissociare il tessuto polmonare8. La ialuronidasi fende i legami glicosidici dello ialuronano, contribuendo alla digestione della matrice extracellulare in vari tessuti connettivi e della pelle 9,23.
In generale, la collagenasi e la dispasi sono buone opzioni per la rottura della matrice extracellulare. Sono stati utilizzati nella dissociazione degli intestini umani, di topo e zebrafish24,25,26,27. La collagenasi distrugge il legame peptidico nel collagene, promuove la digestione della matrice extracellulare e rilascia le cellule in sospensione e, quindi, la collagenasi viene spesso utilizzata per la dissociazione dei tessuti solidi umani e di topo, incluso il fegato 28,29, la milza30, il pancreas31 e l'intestino 25. La dispasi è una proteasi che idrolizza i legami peptidici N-terminali dei residui di amminoacidi non polari ed è più mite della collagenasi. Fende i componenti della matrice extracellulare, come la fibronectina, il collagene di tipo IV e, in misura minore, il collagene di tipo I, senza influenzare le giunzioni cellula-cellula. Dispase è usato separatamente o con altri enzimi per la dissociazione dei tessuti, come per intestino25,32, cervello33, fegato34, ecc. Inoltre, i cocktail di digestione disponibili in commercio, tra cui liberase, accutase e trypLE, sono anche buone alternative per la dissociazione dei tessuti solidi, in particolare per la pelle, il fegato e i reni 8,9.
La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) appartiene alla famiglia Cichlidae dell'ordine Perciformes. È una delle specie ittiche d'acqua dolce più coltivate nelle aree tropicali e subtropicali, con una produzione annua di 4,5 milioni di tonnellate nel 202235. È una delle specie di pesci di acquacoltura meglio studiate con un genoma ben annotato. La tilapia del Nilo è un modello di ricerca ideale per le specie ittiche di acquacoltura grazie al suo breve tempo di generazione, alla facilità di allevamento e all'adattabilità a una vasta gamma di ambienti di allevamento. L'intestino è di grande interesse di ricerca in quanto è l'organo della digestione e dell'assorbimento della nutrizione, del metabolismo e dell'immunità delle mucose. L'intestino è l'habitat delle popolazioni microbiche ed è un tessuto immunitario essenziale36. È immunologicamente attivo a causa della presenza di numerosi tipi di cellule immunitarie, tra cui macrofagi, cellule B, granulociti e cellule T.
Nel presente studio, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino della tilapia del Nilo per facilitare gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura. Secondo le caratteristiche di questi enzimi tessuto-specifici e il lavoro preliminare, la collagenasi/dispasi è appropriata per dissociare il tessuto intestinale della tilapia. L'ultimo tipo di enzima da considerare nella preparazione di sospensioni monocellulari è la DNasi-I, che impedisce l'aggregazione cellulare degradando il DNA libero rilasciato attraverso la lisi delle cellule morte durante la digestione enzimatica senza iniziare le vie apoptotiche9 e aumenta la resa delle cellule vive36. Inoltre, l'albumina sierica bovina (BSA) viene aggiunta al tampone di lavaggio per ridurre l'aggregazione cellulare e migliorare la vitalità cellulare. Diverse aziende produttrici di reagenti descrivono BSA come uno stabilizzatore enzimatico. L'aggiunta di BSA allo 0,04%-1% di BSA al PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) è stata utilizzata per sviluppare una soluzione di lavaggio per la preparazione di sospensioni di sequenziamento monocellulare senza effetti avversi38. L'aggiunta di un basso rapporto di BSA potrebbe aiutare a mantenere la vitalità cellulare ed evitare l'aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare. Questo protocollo può anche fornire un valido riferimento per lo sviluppo di protocolli di dissociazione cellulare dall'intestino di altre specie di pesci di acquacoltura.
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Protocol
Tutti i protocolli sugli animali durante questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Hainan (numero di protocollo: HNUAUCC-2022-00063; Data di approvazione: 2022-03-03). Un elenco delle attrezzature e delle forniture utilizzate in questo esperimento può essere trovato nella tabella dei materiali. Un riepilogo del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.
1. Preparazione del pesce
- Ottenere tilapia del Nilo di 6 mesi con un peso corporeo medio di 100 g da una fonte affidabile. Seleziona pesci privi di segni di malattia.
- Smettere di nutrire il pesce 24 ore prima di procedere al passaggio successivo.
NOTA: Il digiuno del pesce riduce il volume del contenuto intestinale e facilita la preparazione dei segmenti intestinali. - Risciacquare il pesce in acqua sterile ben aerata per 15 minuti per lavare via i batteri legati liberamente sulla superficie del corpo.
- Eutanasia il pesce con 300 mg / L di tricaina metansolfonato (MS-222) per circa 10 minuti fino a quando tutti i movimenti si fermano.
2. Preparazione del reagente
- Preparare la soluzione salina tamponata fosfato di BSA-Dulbecco allo 0,08% (BSA-DPBS, per il risciacquo e la sospensione cellulare). Sciogliere 0,08 g di BSA (0,8% p/v) in 100 mL di 1x DPBS. Conservare a 4 °C e pre-raffreddare su ghiaccio quando utilizzato.
NOTA: L'aggiunta di BSA è utile per ridurre al minimo l'aggregazione cellulare. Il rapporto BSA può essere aumentato dallo 0,04% all'1% in base alle condizioni di aggregazione cellulare. - Preparare il reagente di dissociazione cellulare enzimatica.
- Diluire la collagenasi/dispasi con 1x PBS ad una concentrazione finale di 1 mg/mL (0,1 U/mL collagenasi e 0,8 U/mL dispasi). Assicurarsi che venga utilizzato PBS e non DPBS.
NOTA: PBS fornisce gli ioni calcio necessari per il corretto funzionamento dell'enzima. DPBS non deve essere utilizzato in questo passaggio perché è privo di Ca 2+/Mg2+. Inoltre, la collagenasi di tipo I viene utilizzata nel protocollo corrente. - Filtrare la diluizione attraverso un filtro sterile a membrana da 0,22 μm.
- Preparare un reagente di dissociazione cellulare composto da un volume del 95% di soluzione di collagenasi/dispasi e un volume del 5% di siero bovino fetale (FBS).
NOTA: Il reagente di dissociazione deve essere reso fresco ogni volta che viene utilizzato. L'uso di FBS al 5% aiuta a mantenere la vitalità cellulare durante la digestione.
- Diluire la collagenasi/dispasi con 1x PBS ad una concentrazione finale di 1 mg/mL (0,1 U/mL collagenasi e 0,8 U/mL dispasi). Assicurarsi che venga utilizzato PBS e non DPBS.
- Preparare la soluzione di tripano blu.
- Prelevare la soluzione di tripano blu dal frigorifero a 4 °C e tenerla a 15-20 °C per alcuni minuti prima dell'uso per evitare precipitazioni.
- Filtrare la soluzione attraverso una membrana sterile da 0,22 μm.
3. Preparazione dell'attrezzatura
- Preraffreddare la centrifuga refrigerata a 4 °C prima dell'uso.
- Ottenere provette da centrifuga sterili da 1,5 mL prive di RNasi, tubi conici da 50 ml, pipette e punte in vetro ad ampio alesaggio, filtri a membrana, filtri cellulari e tutti i tubi e le punte a bassa ritenzione.
- Pipette in vetro per autoclave e strumenti di dissezione, tra cui pinze, forbici e bisturi, e pretrattarli con la soluzione di rimozione della RNasi per prevenire gli effetti avversi della RNasi per l'RNA-seq unicellulare.
4. Dissezione tissutale e dissociazione cellulare
- Metti il pesce eutanasia sul ghiaccio per la dissezione. Asetticamente, raccogliere 3-4 cm della sezione centrale dell'intestino e asportare quanto più grasso e mesentere possibile. Rimuovere con attenzione il grasso attaccato alla superficie intestinale e lo strato di mucosa chiara elastica e malleabile con una pinza.
NOTA: Il grasso e il mesentere sono attaccati alla superficie esterna dell'intestino. - Rimuovere quanto più grasso possibile per prevenire i suoi effetti negativi sul protocollo di dissociazione. Utilizzando una siringa, sciacquare delicatamente i frammenti con PBS ghiacciato sterile più volte per lavare via il contenuto intestinale e il muco. Evitare la manipolazione ruvida.
- Sezionare il segmento di intestino in piccoli pezzi e trasferirli in un tubo da 1,5 ml riempito con 1 ml di PBS ghiacciato.
- Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C. Rimuovere delicatamente il surnatante e sostituirlo con 1 mL di BSA-DPBS ghiacciato allo 0,08%. Risospendere i frammenti di tessuto mediante delicata aspirazione utilizzando una pipetta di vetro. Ripetere questo passaggio due volte.
- Rimuovere il surnatante e digerire i frammenti di tessuto utilizzando 1 mL del reagente di dissociazione enzimatica (950 μL di soluzione di collagenasi/dispasi e 50 μL di FBS) a bagnomaria a 37 °C per 30-60 minuti.
- Inoltre, aggiungere 5 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL nella soluzione madre) al reagente di dissociazione se i campioni sono preparati per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
NOTA: La concentrazione finale della miscela collagenasi/dispasi è di 1 mg/ml, compresa la collagenasi a 0,1 U/mL e la dispasi a 0,8 U/mL.
- Inoltre, aggiungere 5 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL nella soluzione madre) al reagente di dissociazione se i campioni sono preparati per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
- Capovolgere manualmente il tubo a intervalli di 5 minuti durante il bagno d'acqua di 30-60 minuti.
NOTA: Il tempo esatto di incubazione varia a seconda dei tessuti utilizzati. Controllare l'andamento della dissociazione al microscopio fino a quando non si vede alcun tessuto bulk. Posizionare 10 μL della sospensione cellulare su un vetrino con una pipetta ed esaminarla al microscopio. Aumentare il tempo di digestione se le cellule non sono completamente dissociate. - Ruotare i tubi a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere delicatamente il reagente di dissociazione cellulare enzimatica utilizzando punte larghe. Aggiungere 1 mL di BSA-DPBS ghiacciato allo 0,08% e pipettare delicatamente le celle su e giù usando una pipetta di vetro ad ampio foro per 1 minuto.
- Ripetere questo passaggio due volte.
NOTA: il pipettaggio su e giù deve essere eseguito con cura utilizzando punte a foro largo e bassa ritenzione per prevenire la rottura delle cellule.
- Ripetere questo passaggio due volte.
- Pre-bagnare un filtro cellulare da 40 μm con BSA-DPBS allo 0,08% e posizionarlo in un tubo conico da 50 ml. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro. Picchiettare e risciacquare con un ulteriore DPBS da 200 μL e raccogliere la sospensione sul fondo del tubo.
- Trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 ml. Aggiungere 5 μL di DNasi I (1 U/μL) e incubare per 15 minuti a 15-20 °C. Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 400 μL di DPBS ghiacciato (Ca 2+/Mg2+ libero). Pipettare delicatamente su e giù con punte larghe per mescolare le cellule. Ripetere questo passaggio due volte.
5. Colorazione ed esame microscopico
- Per la colorazione, mescolare la sospensione cellulare con una soluzione di tripano blu allo 0,4% in rapporto 1: 1. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 5-10 μL della miscela su un emocitometro ed esaminare al microscopio.
NOTA: Le cellule vitali avranno un citoplasma non colorato, mentre le cellule morte avranno un citoplasma blu (Figura 2). - Conta le cellule vitali e morte in tre diversi campi al microscopio. Calcola la percentuale di vitalità cellulare dividendo il numero di cellule vitali per il numero totale di cellule in un campo.
NOTA: La vitalità cellulare deve essere superiore all'85% e la concentrazione cellulare non deve essere inferiore a 1 x 105-1 x 107/ml. Lo sfondo della sospensione cellulare deve essere pulito, senza grumi, frammenti o impurità.
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Representative Results
Questo protocollo descrive la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula (Figura 1). Questa ricerca mostra che il mix collagenasi/dispasi ha un buon effetto di dissociazione ed è delicato per il tessuto intestinale. La selezione dell'enzima di digestione ottimale è essenziale per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità. Nel lavoro preliminare, sono state confrontate le efficienze di dissociazione di diversi enzimi comunemente usati e i risultati sono elencati nella Tabella 1. È stato verificato che la miscela collagenasi/dispasi ha un effetto di dissociazione molto migliore rispetto alla collagenasi, alla dispasi o alla tripsina da sola e a diverse altre miscele enzimatiche, tra cui liberasi, tripsina/elastasi, collagenasi/elastasi e collagenasi/tripsina. Inoltre, la collagenasi/dispasi ha anche prodotto le cellule più vitali alla fine dell'esperimento.
Durante il periodo di incubazione, il progresso della dissociazione è stato controllato al microscopio. Dopo 30 minuti, il tessuto sfuso era quasi scomparso e, in generale, nessun tessuto sfuso è stato visto dopo 45 minuti. Dopo la digestione, la sospensione cellulare filtrava facilmente attraverso il colino. Seguendo questo protocollo, la colorazione blu tripano e l'esame microscopico hanno mostrato che le cellule intestinali avevano un'elevata vitalità cellulare (oltre il 90%; Figura 2, e che la concentrazione cellulare potrebbe essere fino a 1 x 107/mL. Le cellule sono state disperse come singole cellule. La maggior parte delle cellule erano luminose e bianche (cellule vitali), mentre solo poche erano scure o blu (cellule morte). Le cellule morte sono colorate di blu scuro a causa della membrana cellulare permeabilizzata. La vitalità cellulare e la concentrazione cellulare hanno soddisfatto i requisiti del sequenziamento a singola cellula.
Figura 1: Diagramma di flusso riassuntivo dei protocolli di dissociazione intestinale della tilapia del Nilo e di preparazione della sospensione unicellulare. I reagenti vengono preparati (sezioni 1-2) prima dell'escissione dell'intestino. Gli intestini vengono tritati e lavati centrifugamente in PBS (fasi 4.1-4.4). I frammenti di tessuto vengono digeriti utilizzando una soluzione di collagenasi/dispasi in un bagno d'acqua a 37 °C per isolare le cellule (fasi 4.5-4.6). La sospensione cellulare digerita viene risciacquata con BAS-DPBS allo 0,08% e filtrata attraverso un filtro cellulare da 40 μm (fasi 4,7-4,8). Dopo l'incubazione della DNasi I, il pellet cellulare viene risospeso in DPBS (fasi 4.9-4.10). La colorazione blu di Trypan determina la concentrazione e la vitalità delle cellule (sezione 5). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Esame microscopico di una sospensione unicellulare preparata dal tessuto intestinale della tilapia del Nilo e colorata con blu tripano. Le cellule vitali sono bianche e luminose, mentre le cellule morte sono scure e blu. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Enzima | Migliore concentrazione di lavoro (mg/ml) | Effetto di dissociazione |
| Collagenasi II | 1 | +++ |
| Dispase | 0.25 | ++ |
| Tripsina | 2.5 | ++ |
| Liberate | 1 | +++ |
| *Collagenasi/dispasi | 1 | +++++ |
| Collagenasi II/elastasi | 1/1 | +++ |
| Tripsina/elastasi | 2.5/0.5 | +++ |
| Tripsina/collagenasi II | 1/1 | +++ |
Tabella 1: Risultati di confronto degli effetti di dissociazione degli enzimi di digestione comunemente usati per l'intestino di tilapia del Nilo. Più simboli "+" rappresentano un più alto grado di dissociazione e una maggiore vitalità cellulare. L'enzima marcato con "*" è un prodotto commerciale e la migliore soluzione di lavoro da 1 mg/mL include 0,1 U/mL di collagenasi I e 0,8 U/mL di dispasi. Le altre miscele di enzimi sono state mescolate quando sono state utilizzate dai ricercatori.
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Discussion
Questo protocollo descrive la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia del Nilo. Prima della dissociazione, è necessaria la rimozione del grasso e del mesentere dall'intestino, in particolare per gli intestini di pesci carnivori con molto grasso. L'uso di una siringa invece di raschiare duramente per lavare via il contenuto intestinale riduce il danno meccanico alle cellule. Per garantire la vitalità cellulare, è anche essenziale mantenere la temperatura a 20 °C o inferiore per le fasi di dissezione e risciacquo dei tessuti. Le soluzioni di lavaggio vengono raffreddate su ghiaccio e la temperatura della centrifuga viene regolata a 4 °C in anticipo. Ancora più importante, dovrebbero essere selezionati enzimi di dissociazione cellulare lievi ed efficienti per il tessuto studiato. Sulla base di uno studio precedente, il mix collagenasi/dispasi è ottimale per l'intestino della tilapia del Nilo. Questa combinazione enzimatica è più mite e più efficace sull'intestino di tilapia rispetto alla tripsina, alla dispasi o alla collagenasi da sola. Inoltre, il 5% di FBS è stato incluso nel reagente di dissociazione per mantenere la vitalità cellulare durante la digestione39. Il tempo esatto di incubazione varia a seconda dei tessuti utilizzati. Il tempo di digestione deve essere aumentato se il tessuto non è completamente dissociato. Inoltre, la collagenasi/dispasi richiede Ca2+ per funzionare. Pertanto, PBS viene utilizzato per diluire l'enzima piuttosto che DPBS, che è privo di Ca 2 + / Mg2 +. Per le soluzioni di lavaggio, DPBS viene utilizzato nel caso in cui questi ioni influenzino le fasi di sequenziamento a valle.
La maggior parte degli enzimi di dissociazione, compresa la collagenasi/dispasi, lavorano con la massima velocità ed efficienza alla loro temperatura ottimale, che è comunemente di 37 °C. A questa temperatura, i geni vengono trascritti e i loro livelli di espressione cambiano in risposta alla manipolazionedi 40,41. Questo fenomeno è stato riportato in diversi studi su mammiferi e zebrafish. Nel rene di topo, l'apoptosi e i geni correlati allo stress, inclusi JUN-B, FOS e Hsp90, sono espressi in modo differenziale in diverse condizioni di dissociazione enzimatica40. L'espressione differenziale dei geni precoci immediati e dei geni HSP è alterata nelle cellule delle pinne zebrafish in diverse condizioni di dissociazione41. È stato dimostrato che i geni di risposta precoce, inclusi più membri delle famiglie FOS e JUN, sono significativamente up-regolati dopo solo pochi minuti di separazione a 37 °C in sospensioni cellulari preparate dalla dissociazione enzimatica dei tessuti di mammifero6. Pertanto, i cambiamenti di espressione nell'apoptosi e nei geni correlati allo stress devono essere considerati attentamente per i dati di ScRNA-seq. Questo svantaggio può essere superato utilizzando controlli appropriati per gli esperimenti ScRNA-seq. Uno dei controlli deve essere trattato nelle stesse condizioni di dissociazione in modo che i cambiamenti dell'artefatto nell'espressione genica possano essere rilevati o evitati.
In questo protocollo, BSA viene aggiunto a DPBS principalmente per ridurre al minimo le perdite cellulari e l'aggregazione cellulare. Rapporti di BSA dallo 0,04% all'1% possono essere utilizzati per preparare sospensioni di sequenziamento a singola cellula senza effetti avversi38. L'uso della corretta proporzione di BSA ridurrebbe l'aggregazione cellulare. Il rapporto appropriato deve essere ottimizzato per i diversi tessuti e le condizioni di aggregazione cellulare. In questo protocollo, lo 0,08% di BSA ha impedito l'attaccamento delle cellule intestinali della tilapia del Nilo. Tuttavia, la risospensione cellulare finale non deve contenere BSA per evitare l'influenza di Ca 2+/Mg2+ sulle applicazioni a valle.
Un'altra misura per ridurre l'aggregazione cellulare è l'aggiunta di DNasi I. Le cellule rotte o morenti rilasciano molecole di DNA "appiccicose", che sono tra le principali cause di aggregazione cellulare. La DNasi degrada il DNA libero e, quindi, riduce al minimo l'aggregazione cellulare. Pertanto, è comunemente usato nella preparazione della sospensione cellulare per il sequenziamento a singola cellula42,43. Inoltre, il pipettaggio delicato con pipette o punte in vetro ad ampio foro aiuta a ridurre il danno cellulare. Soprattutto per l'RNA-seq a singola cellula, strumenti come forbici, tubi, pipette di vetro e filtri cellulari devono essere privi di RNasi.
Soprattutto, l'intero processo di preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dovrebbe essere fatto con l'enzima di dissociazione appropriato, dovrebbe essere eseguito delicatamente e rapidamente a bassa temperatura e dovrebbe includere misure per impedire alle cellule di aggregarsi al fine di ottenere un'elevata vitalità e concentrazione cellulare e integrità dell'acido nucleico. Questo protocollo può essere utilizzato anche per la preparazione di sospensioni monocellulari intestinali per altre specie ittiche con piccole modifiche. Inoltre, questo protocollo può anche fornire un valido riferimento per lo sviluppo di protocolli di dissociazione cellulare per altri tessuti di pesce per il sequenziamento di singole cellule e studi a livello di singola cellula, come la coltura cellulare e la citometria a flusso.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) e del Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
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