Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Enkeltcelle suspensjonsforberedelse fra Nilen tilapia tarm for enkeltcellesekvensering

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64688
Automatic Translation
*1, *1,3, 2, 4, 1,3, 1,3, 1,3
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University
* These authors contributed equally

Summary

Her demonstrerer vi utarbeidelsen av en høyverdig enkeltcellesuspensjon av tilapia-tarmen for enkeltcellesekvensering.

Abstract

Niltilapia er en av de mest kultiverte ferskvannsfiskeartene over hele verden og er en mye brukt forskningsmodell for akvakulturfiskestudier. Fremstillingen av høykvalitets enkeltcellesuspensjoner er avgjørende for enkeltcellenivåstudier som enkeltcelle-RNA eller genomsekvensering. Det finnes imidlertid ingen bruksklar protokoll for akvakulturfiskearter, spesielt for tarmen til tilapia. De effektive dissosiasjonsenzymene varierer avhengig av vevstype. Derfor er det viktig å optimalisere vevsdissosiasjonsprotokollen ved å velge riktig enzym- eller enzymkombinasjon for å oppnå nok levedyktige celler med minimal skade. Denne studien illustrerer en optimalisert protokoll for å forberede en høyverdig enkeltcellesuspensjon fra Nilen tilapia tarm med en enzymkombinasjon av kollagenase / dispase. Denne kombinasjonen er svært effektiv for dissosiasjon med bruk av bovint serumalbumin og DNase for å redusere celleaggregering etter fordøyelse. Celleutgangen tilfredsstiller kravene til enkeltcellesekvensering, med 90% cellelevedyktighet og høy cellekonsentrasjon. Denne protokollen kan også modifiseres for å fremstille en encellesuspensjon fra tarmene til andre fiskearter. Denne forskningen gir en effektiv referanseprotokoll og reduserer behovet for ytterligere forsøk i utarbeidelse av encellede suspensjoner for akvakulturfiskearter.

Introduction

Celler er de grunnleggende enhetene av organismer. Sammenlignet med bulkvevsstudier kan enkeltcellenivåstudier gjenspeile celleheterogenitet og gi informasjon med høyere oppløsning1. I de senere år har forskere brukt enkeltcellesekvenseringsteknologier for genom-, transkriptom-, epigenom- eller multi-omiske studier på enkeltcellenivå hos pattedyr, sebrafisk og andre modellorganismer og rapportert store gjennombrudd 2,3,4,5,6,7 . Mens de fleste studier har fokusert på modellorganismer, er det få referanseprotokoller eller kommersielle dissosiasjonssett for enkeltcellesekvensering i økonomiske fiskearter, noe som begrenser anvendelsen av enkeltcellesekvensering i akvakulturforskning. Derfor er det avgjørende å utvikle vevsdissosiasjonsprotokoller som produserer enkeltcellesuspensjoner av høy kvalitet med høy cellelevedyktighet og nukleinsyreintegritet.

Det er viktig å optimalisere vevsdissosiasjonsprotokollen med riktig enzym eller enzymkombinasjon for å oppnå nok levedyktige celler med minimal skade. Det mest effektive enzymet for vevsdissosiasjon varierer avhengig av vevstype. Hos pattedyr har flere enzymer blitt brukt til å fremstille encellede suspensjoner for pattedyrs faste vev, inkludert kollagenase, dispase, trypsin, papain, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase og trypLE 8,9. Trypsinfordøyelse kombinert med mekanisk forstyrrelse har ofte blitt brukt til å dissosiere vev for cellekultur i fisk 10,11,12,13,14. Trypsin har også blitt brukt eller tilsatt i fordøyelsescocktailen for vevsdissosiasjon i rottetarm15 og sebrafiskgjellevev16. Av flere grunner er trypsin imidlertid ikke det beste alternativet for enkeltcellesekvensering. Trypsin alene er vanligvis ineffektivt for vevsdissosiasjon. I tillegg induserer trypsin DNA-strengbrudd 17,18 og RNA-nedbrytning19.

Papain nedbryter proteinene som utgjør de stramme kryssene mellom cellene. I pattedyrs nerve- og glatte muskelceller er papain mer effektiv og mindre ødeleggende enn andre proteaser20,21. Imidlertid, som trypsin, resulterer papain i fri DNA-indusert aggregering av celler på grunn av cellelysen som oppstår under enzymatisk fordøyelse9. Elastase bryter ned elastin, som vanligvis finnes i hud, lunger, leddbånd, sener og vaskulært vev22. Det brukes ofte i kombinasjon med kollagenase, dispase eller trypsin for dissosiering av lungevev8. Hyaluronidase spalter de glykosidiske bindingene av hyaluronan, noe som bidrar til fordøyelsen av den ekstracellulære matriksen i forskjellige bindevev og hud 9,23.

Generelt er kollagenase og dispase gode alternativer for ekstracellulær matriksbrudd. De har blitt brukt i dissosiasjon av tarmene til mennesker, mus og sebrafisk 24,25,26,27. Kollagenase ødelegger peptidbindingen i kollagen, fremmer fordøyelsen av den ekstracellulære matrisen, og frigjør cellene i suspensjon, og dermed brukes kollagenase ofte til dissosiasjon av humant og musfast vev, inkludert for leveren 28,29, milt30, bukspyttkjertel31 og tarm 25. Dispase er en protease som hydrolyserer de N-terminale peptidbindingene av ikke-polære aminosyrerester og er mildere enn kollagenase. Det spalter de ekstracellulære matrikskomponentene, slik som fibronektin, type IV kollagen, og i mindre grad type I kollagen, uten å påvirke celle-cellekryss. Dispase brukes separat eller sammen med andre enzymer for vevsdissosiasjon, for eksempel for tarm25,32, hjerne33, lever34, etc. I tillegg er kommersielt tilgjengelige fordøyelsescocktailer, inkludert liberase, accutase og trypLE, også gode alternativer for dissosiasjon av fast vev, spesielt for hud, lever og nyre 8,9.

Niltilapia (Oreochromis niloticus) tilhører familien Cichlidae i ordenen Perciformes. Det er en av de mest kultiverte ferskvannsfiskeartene i tropiske og subtropiske områder, med en årlig produksjon på 4,5 millioner tonn i 202235. Det er en av de best studerte akvakulturfiskeartene med et godt annotert genom. Nile tilapia er en ideell forskningsmodell for akvakulturfiskearter på grunn av sin korte generasjonstid, enkle oppdrett og tilpasningsevne til et bredt spekter av oppdrettsmiljøer. Tarmen er av stor forskningsinteresse som det er organet for ernæring fordøyelse og absorpsjon, metabolisme og slimhinneimmunitet. Tarmen er habitat for mikrobielle populasjoner og er et essensielt immunvev36. Det er immunologisk aktivt på grunn av tilstedeværelsen av mange immuncelletyper, inkludert makrofager, B-celler, granulocytter og T-celler.

I den nåværende studien utviklet vi en protokoll for å forberede en høyverdig enkeltcellesuspensjon fra Nilens tilapia-tarm for å lette studier på enkeltcellenivå i akvakulturfiskearter. I henhold til egenskapene til disse vevsspesifikke enzymene og forarbeidet, er kollagenase / dispase egnet for dissosiering av tilapia tarmvev. Den endelige enzymtypen som skal vurderes ved fremstilling av enkeltcellesuspensjoner er DNase-I, som forhindrer celleaggregering ved å nedbryte fritt DNA frigjort gjennom død cellelyse under enzymatisk fordøyelse uten å initiere apoptotiske veier9 og øker levendecelleutbyttet36. I tillegg tilsettes bovint serumalbumin (BSA) til vaskebufferen for å redusere celleklumping og forbedre cellens levedyktighet. Flere reagensselskaper beskriver BSA som en enzymstabilisator. Tilsetningen av 0,04%-1% BSA til PBS (fosfatbufret saltvann) har blitt brukt til å utvikle en vaskeløsning for fremstilling av enkeltcellesekvenseringssuspensjoner uten bivirkninger38. Tilsetningen av et lavt forhold mellom BSA kan bidra til å opprettholde cellenes levedyktighet og unngå fri DNA-indusert aggregering av celler på grunn av cellelyse. Denne protokollen kan også gi en verdifull referanse for å utvikle celledissosiasjonsprotokoller fra tarmen til andre akvakulturfiskearter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller under denne studien ble godkjent av Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnummer: HNUAUCC-2022-00063; Godkjenningsdato: 2022-03-03). En liste over utstyr og forsyninger som brukes i dette eksperimentet, finner du i materialfortegnelsen. En oppsummering av gjeldende protokoll er illustrert i figur 1.

1. Tilberedning av fisk

  1. Oppnå 6 måneder gammel niltilapia med en gjennomsnittlig kroppsvekt på 100 g fra en pålitelig kilde. Velg fisk som er fri for tegn på sykdom.
  2. Stopp fôring av fisken 24 timer før du går videre til neste trinn.
    MERK: Fiskefaste reduserer volumet av tarminnhold og letter forberedelsen av tarmsegmenter.
  3. Skyll fisken i godt luftet sterilt vann i 15 min for å vaske av løst bundne bakterier på kroppsoverflaten.
  4. Avlive fisken med 300 mg/l trikainmetansulfonat (MS-222) i ca. 10 min til all bevegelse opphører.

2. Reagens forberedelse

  1. Forbered 0,08% BSA-Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (BSA-DPBS, for celleskylling og resuspensjon). Løs opp 0,08 g BSA (0,8 % w/v) i 100 ml 1x DPBS. Oppbevares ved 4 °C, og forkjøles på is ved bruk.
    MERK: Tilsetningen av BSA er gunstig for å minimere celleklumping. BSA-forholdet kan økes fra 0,04 % til 1 % i henhold til celleklumpebetingelsene.
  2. Forbered det enzymatiske celledissosiasjonsreagenset.
    1. Fortynn kollagenasen/dispasen med 1x PBS til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml (0,1 E/ml kollagenase og 0,8 E/ml dispase). Forsikre deg om at PBS og ikke DPBS brukes.
      MERK: PBS gir kalsiumioner som trengs for at enzymet skal fungere skikkelig. DPBS bør ikke brukes i dette trinnet fordi det er Ca 2 + / Mg2 + gratis. I tillegg brukes kollagenase type I i den nåværende protokollen.
    2. Filtrer fortynningen gjennom et sterilt 0,22 μm membranfilter.
    3. Forbered et celledissosiasjonsreagens som består av et 95% volum kollagenase / dispaseoppløsning og et 5% volum av føtal bovint serum (FBS).
      MERK: Dissosiasjonsreagenset skal gjøres friskt hver gang det brukes. Ved å bruke 5% FBS bidrar til å opprettholde cellens levedyktighet under fordøyelsen.
  3. Forbered trypan blå løsning.
    1. Ta den trypanblå oppløsningen fra kjøleskap på 4 °C, og oppbevar den ved 15-20 °C i noen minutter før bruk for å unngå nedbør.
    2. Filtrer løsningen gjennom en steril 0,22 μm membran.

3. Forberedelse av utstyr

  1. Forkjøl den nedkjølte sentrifugen til 4 °C før bruk.
  2. Få sterile RNase-frie 1,5 ml sentrifugerør, 50 ml koniske rør, brede glasspipetter og spisser, membranfiltre, cellesiler og alle rør og spisser med lav retensjon.
  3. Autoklavglasspipetter og disseksjonsverktøy, inkludert tang, saks og skalpeller, og forbehandle dem med RNase-fjerningsløsningen for å forhindre bivirkninger av RNase for encellet RNA-seq.

4. Vevsdisseksjon og celledissosiasjon

  1. Legg den avlivede fisken på is for disseksjon. Aseptisk, samle 3-4 cm av tarmens midtseksjon, og excise så mye fett og mesenteri som mulig. Fjern forsiktig fettet festet til tarmoverflaten og laget av elastisk og formbar klar slimhinne med tang.
    MERK: Fettet og mesenteriet er festet til tarmens ytre overflate.
  2. Fjern så mye fett som mulig for å forhindre negative effekter på dissosiasjonsprotokollen. Bruk en sprøyte, skyll forsiktig fragmentene med steril iskald PBS flere ganger for å vaske av tarminnholdet og slimet. Unngå røff håndtering.
  3. Dissekere tarmsegmentet i små biter, og overfør dem til et 1,5 ml rør fylt med 1 ml iskald PBS.
  4. Sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten forsiktig, og erstatt med 1 ml iskald 0,08% BSA-DPBS. Resuspender vevfragmentene ved forsiktig aspirasjon ved hjelp av en glasspipette. Gjenta dette trinnet to ganger.
  5. Fjern supernatanten og fordøy vevsfragmentene ved hjelp av 1 ml av det enzymatiske dissosiasjonsreagenset (950 μL kollagenase/dispaseoppløsning og 50 μL FBS) i et vannbad på 37 °C i 30-60 minutter.
    1. I tillegg tilsettes 5 μL RNase-hemmer (40 U/μL i stamløsningen) til dissosiasjonsreagenset dersom prøvene fremstilles for encellet RNA-sekvensering.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av kollagenase/dispaseblandingen er 1 mg/ml, inkludert kollagenase ved 0,1 E/ml og dispase ved 0,8 E/ml.
  6. Snu røret manuelt med 5 minutters mellomrom i løpet av 30-60 min vannbad.
    MERK: Den nøyaktige inkubasjonstiden varierer i henhold til vevene som brukes. Kontroller fremdriften av dissosiasjon under et mikroskop til ingen bulkvev er sett. Plasser 10 μL av cellesuspensjonen på et lysbilde med pipette, og undersøk det under mikroskopet. Øk fordøyelsestiden hvis cellene ikke er helt dissociert.
  7. Spinn ned rørene ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C, og fjern forsiktig det enzymatiske celledissosiasjonsreagenset ved hjelp av brede spisser. Tilsett 1 ml iskald 0,08 % BSA-DPBS, og pipetter cellene forsiktig opp og ned med en glasspipette med bred boring i 1 min.
    1. Gjenta dette trinnet to ganger.
      MERK: Pipettering opp og ned bør utføres med forsiktighet ved bruk av brede hull og spisser med lav retensjon for å forhindre celleforstyrrelser.
  8. Forvåt en 40 μm cellesil med 0,08% BSA-DPBS, og legg den i et 50 ml konisk rør. Før cellesuspensjonen gjennom silen. Tapp og skyll med ytterligere 200 μL DPBS, og samle suspensjonen i bunnen av røret.
  9. Overfør suspensjonen til et 1,5 ml rør. Tilsett 5 μL DNase I (1 U/μL), og inkuber i 15 minutter ved 15-20 °C. Sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  10. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 400 μL iskald DPBS (Ca 2+/Mg2+ gratis). Pipetter forsiktig opp og ned med brede spisser for å blande cellene. Gjenta dette trinnet to ganger.

5. Farging og mikroskopisk undersøkelse

  1. For farging, bland cellesuspensjonen med 0,4% trypanblå løsning i forholdet 1: 1. Inkuber i 3 minutter ved romtemperatur.
  2. Tilsett 5-10 μL av blandingen på et hemocytometer, og undersøk under mikroskopet.
    MERK: Levedyktige celler vil ha ufarget cytoplasma, mens døde celler vil ha en blå cytoplasma (figur 2).
  3. Telle levedyktige og døde celler i tre forskjellige felt under mikroskopet. Beregn cellens levedyktighetsprosent ved å dele antall levedyktige celler med det totale antall celler i et felt.
    MERK: Cellens levedyktighet bør være mer enn 85%, og cellekonsentrasjonen bør ikke være mindre enn 1 x 105-1 x 107 / ml. Celleopphengsbakgrunnen skal være ren, uten klumper, fragmenter eller urenheter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver fremstilling av høyverdig encellesuspensjon av Nilens tilapiatarm for enkeltcellesekvensering (figur 1). Denne undersøkelsen viser at kollagenase/dispaseblandingen har en god dissosiasjonseffekt og er mild for tarmvevet. Valget av det optimale fordøyelsesenzymet er avgjørende for å tilberede en høyverdig enkeltcellesuspensjon. I forarbeidet ble dissosiasjonseffekten av flere vanlig brukte enzymer sammenlignet, og resultatene er listet opp i tabell 1. Kollagenase/dispaseblandingen ble verifisert å ha en mye bedre dissosiasjonseffekt enn kollagenase, dispase eller trypsin alene og flere andre enzymblandinger, inkludert liberase, trypsin/elastase, kollagenase/elastase og kollagenase/trypsin. Videre ga kollagenasen / dispasen også de mest levedyktige cellene på slutten av forsøket.

Under inkubasjonstiden ble fremdriften av dissosiasjon kontrollert under et mikroskop. Etter 30 min var bulkvevet nesten borte, og generelt ble det ikke sett bulkvev etter 45 min. Etter fordøyelsen filtrerte cellesuspensjonen lett gjennom silen. Etter denne protokollen viste trypanblåfarging og mikroskopisk undersøkelse at tarmcellene hadde høy cellelevedyktighet (mer enn 90%; figur 2, og at cellekonsentrasjonen kunne være opptil 1 x 107/ml. Cellene ble spredt som enkeltceller. De fleste cellene var lyse og hvite (levedyktige celler), mens bare noen få var mørke eller blå (døde celler). Døde celler er farget mørkeblå på grunn av den permeabiliserte cellemembranen. Cellens levedyktighet og cellekonsentrasjon tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering.

Figure 1
Figur 1: Sammendrag av flytdiagram over Nilen tilapia tarmdissosiasjon og enkeltcelle suspensjonspreparatprotokoller. Reagensene fremstilles (§ 1-2) før eksisjon av tarmen. Tarmene hakkes og sentrifugalvaskes i PBS (trinn 4.1-4.4). Vevsfragmentene fordøyes ved hjelp av kollagenase/dispaseoppløsning i et vannbad på 37 °C for å isolere cellene (trinn 4,5-4,6). Den fordøyde cellesuspensjonen skylles med 0,08% BAS-DPBS og filtreres gjennom en 40 μm cellesil (trinn 4,7-4,8). Etter DNase I-inkubasjon resuspenderes cellepelleten i DPBS (trinn 4.9-4.10). Trypanblå farging bestemmer cellekonsentrasjon og levedyktighet (avsnitt 5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Mikroskopisk undersøkelse av encellesuspensjon fremstilt fra Niltilapia tarmvev og farget med trypanblått. Levedyktige celler er hvite og lyse, mens døde celler er mørke og blå. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Enzym Beste arbeidskonsentrasjon (mg/ml) Dissosiasjonseffekt
Kollagenase II 1 +++
Dispase 0.25 ++
Trypsin 2.5 ++
Liberase 1 +++
*Kollagenase/dispase 1 +++++
Kollagenase II/elastase 1/1 +++
Trypsin/elastase 2.5/0.5 +++
Trypsin/kollagenase II 1/1 +++

Tabell 1: Sammenligningsresultater av dissosiasjonseffekter av vanlig brukte fordøyelsesenzymer for tarm med niltilapia. Flere "+" symboler representerer en høyere grad av dissosiasjon og høyere celle levedyktighet. Enzymet merket med "*" er et kommersielt produkt, og den beste arbeidsløsningen på 1 mg/ml inkluderer 0,1 U/ml kollagenase I og 0,8 U/ml dispase. De andre blandingene av enzymer ble blandet da de ble brukt av forskerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver fremstillingen av en høyverdig enkeltcellesuspensjon av Nile tilapia tarm. Før dissosiasjon er fjerning av fett og mesenteri fra tarmen nødvendig, spesielt for kjøttetende fisketarmer med mye fett. Ved å bruke en sprøyte i stedet for hard skraping for å vaske av tarminnholdet, reduseres den mekaniske skaden på cellene. For å sikre cellens levedyktighet er det også viktig å opprettholde temperaturen på 20 °C eller lavere for vevsdisseksjon og skylletrinn. Vaskeløsningene avkjøles på is, og sentrifugetemperaturen justeres til 4 °C på forhånd. Viktigst av alt, milde og effektive celledissosiasjonsenzymer for det studerte vevet bør velges. Basert på en tidligere studie er kollagenase/dispaseblandingen optimal for tarmen med niltilapia. Denne enzymkombinasjonen er mildere og mer effektiv på tilapia-tarmen enn trypsin, dispase eller kollagenase alene. I tillegg ble 5% FBS inkludert i dissosiasjonsreagenset for å opprettholde cellens levedyktighet under fordøyelsen39. Den nøyaktige inkubasjonstiden varierer i henhold til vevene som brukes. Fordøyelsestiden må økes hvis vevet ikke er helt dissosiert. I tillegg krever kollagenase/dispase Ca2+ for å fungere. Derfor brukes PBS til å fortynne enzymet i stedet for DPBS, som er fri for Ca 2+/Mg2+. For vaskeløsninger brukes DPBS i tilfelle disse ionene påvirker sekvenseringstrinnene nedstrøms.

De fleste dissosiasjonsenzymer, inkludert kollagenase/dispase, arbeider med maksimal hastighet og effektivitet ved optimal temperatur, som vanligvis er 37 °C. Ved denne temperaturen transkriberes gener, og deres uttrykksnivåer endres som respons på håndteringav 40,41. Dette fenomenet er rapportert i flere studier på pattedyr og sebrafisk. I musenyren uttrykkes apoptose og stressrelaterte gener inkludert JUN-B, FOS og Hsp90 differensielt under forskjellige enzymatiske dissosiasjonsbetingelser40. Differensialuttrykket av umiddelbare tidlige gener og HSP-gener endres i sebrafiskfinneceller ved forskjellige dissosiasjonsbetingelser41. Det har vist seg at tidlige responsgener, inkludert flere medlemmer av FOS- og JUN-familiene, er betydelig oppregulert etter bare noen få minutters separasjon ved 37 ° C i cellesuspensjoner fremstilt ved enzymatisk dissosiasjon av pattedyrvev6. Derfor bør ekspresjonsendringene i apoptose og stressrelaterte gener vurderes nøye for ScRNA-seq-dataene. Denne ulempen kan overvinnes ved å bruke passende kontroller for ScRNA-seq-eksperimentene. En av kontrollene bør behandles under de samme dissosiasjonsbetingelsene, slik at artefaktendringene i genuttrykk kan oppdages eller unngås.

I denne protokollen legges BSA til DPBS primært for å minimere celletap og celleklumping. Forhold mellom BSA fra 0,04% til 1% kan brukes til å forberede enkeltcellesekvenseringssuspensjoner uten bivirkninger38. Bruk av riktig BSA-andel vil redusere celleaggregering. Det riktige forholdet bør optimaliseres for forskjellige vev og celleklumpingsforhold. I denne protokollen forhindret 0,08% BSA Nile tilapia tarmcellefeste. Den endelige celleresuspensjonen bør imidlertid ikke inneholde BSA for å unngå påvirkning av Ca 2+/Mg2+ på nedstrømsapplikasjonene.

Et annet tiltak for å redusere celleaggregering er tilsetningen av DNase I. Ruptured eller døende celler frigjør "klebrig" DNA-molekyler, som er blant de viktigste årsakene til celleklumping. DNase nedbryter fritt DNA og minimerer dermed celleklumping. Derfor brukes det ofte i cellesuspensjonsforberedelse for enkeltcellesekvensering42,43. I tillegg bidrar skånsom pipettering med brede glasspipetter eller spisser til å redusere celleskader. Spesielt for encelle RNA-seq må verktøy som saks, rør, glasspipetter og cellesiler være RNase-frie.

Fremfor alt bør hele prosessen med fremstilling av en høyverdig enkeltcellesuspensjon gjøres med det aktuelle dissosiasjonsenzymet, utføres forsiktig og raskt ved lav temperatur, og bør omfatte tiltak for å forhindre at celler aggregerer for å oppnå høy celle levedyktighet og konsentrasjon og nukleinsyreintegritet. Denne protokollen kan også brukes til fremstilling av tarmens encellede suspensjoner for andre fiskearter med mindre modifikasjoner. I tillegg kan denne protokollen også gi en verdifull referanse for å utvikle celledissosiasjonsprotokoller for andre fiskevev for enkeltcellesekvensering og enkeltcellenivåstudier, for eksempel cellekultur og flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) og Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 192 Nilen tilapia tarm vev dissosiasjon single-cell suspensjon forberedelse
Enkeltcelle suspensjonsforberedelse fra Nilen tilapia tarm for enkeltcellesekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, P., Zhou, Y., Wang, B.,… More

Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter