Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Expansion und Reprogrammierung von humanen und nicht-humanen Zellen aus dem Urin von Primaten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sowie Anweisungen zur feederfreien Aufrechterhaltung der neu erzeugten iPS-Zellen.
Abstract
Speziesübergreifende Ansätze zur Untersuchung pluripotenter Stammzellen von Primaten und ihrer Derivate sind von entscheidender Bedeutung, um die molekularen und zellulären Mechanismen von Krankheit, Entwicklung und Evolution besser zu verstehen. Um den Zugang zu Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu erleichtern, wird in dieser Arbeit eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung von humanen und nicht-humanen Primaten-iPS-Zellen aus aus aus dem Urin gewonnenen Zellen und deren Erhaltung mit einer feederfreien Kultivierungsmethode vorgestellt.
Der Urin kann aus einer unsterilen Umgebung (z. B. dem Käfig des Tieres) entnommen und während der primären Zellkultur mit einem Breitband-Antibiotika-Cocktail behandelt werden, um die Kontamination effizient zu reduzieren. Nach der Vermehrung der aus dem Urin gewonnenen Zellen werden iPS-Zellen durch eine modifizierte Transduktionsmethode eines kommerziell erhältlichen Sendai-Virus-Vektorsystems erzeugt. Erste iPSC-Kolonien können bereits nach 5 Tagen sichtbar sein und frühestens nach 10 Tagen gepflückt werden. Die routinemäßige Klumpenpassage mit enzymfreiem Dissoziationspuffer unterstützt die Pluripotenz der erzeugten iPSCs für mehr als 50 Passagen.
Introduction
Genomische Vergleiche von menschlichen und nicht-menschlichen Primaten (NHPs) sind entscheidend, um unsere Evolutionsgeschichte und die Evolution menschenspezifischer Merkmale zu verstehen1. Darüber hinaus ermöglichen diese Vergleiche den Rückschluss auf die Funktion durch die Identifizierung konservierter DNA-Sequenzen2, z. B. um krankheitsassoziierte Varianten3 zu priorisieren. Vergleiche von molekularen Phänotypen, wie z.B. Genexpressionsniveaus, sind entscheidend, um genomische Vergleiche besser interpretieren zu können und z.B. zelluläre phänotypische Unterschiede zu entdecken. Darüber hinaus haben sie - ähnlich wie Vergleiche auf DNA-Ebene - das Potenzial, auf funktionelle Relevanz zu schließen und damit medizinisch relevante Variationen innerhalb des Menschen besser zu interpretieren4. Die Einbeziehung umfassender molekularphänotypischer Daten in diese Vergleichsstudien erfordert geeignete biologische Ressourcen (d.h. orthologe Zellen über Spezies hinweg). Ethische und praktische Gründe erschweren oder verunmöglichen jedoch den Zugang zu solchen vergleichbaren Zellen, insbesondere während der Entwicklung. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Generierung solcher unzugänglichen Zelltypen in vitro5,6, sind experimentell zugänglich und wurden für Primatenvergleicheverwendet 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Um iPS-Zellen zu erzeugen, muss man die Primärzellen erfassen, die neu programmiert werden sollen. Aus Urin isolierte Zellen haben den Vorteil, dass sie nicht-invasiv von Primaten entnommen werden können und dass sie leicht umprogrammiert werden können, wahrscheinlich aufgrund ihrer stammzellähnlichen molekularen Profile15. Die Kulturbedingungen für die Erhaltung von Primaten-iPS-Zellen sind ebenso wichtig wie die Reprogrammierung. Klassischerweise erforderte die Kultivierung menschlicher pluripotenter Stammzellen ein nicht definiertes, serumbasiertes Medium und eine Kokultur von embryonalen Fibroblasten der Maus - sogenannten Feederzellen -, die essentielle Nährstoffe und ein Gerüst für embryonale Stammzellen (ESCs) liefern16. Seit der Entwicklung chemisch definierter und feederfreier Kultursysteme17,18 gibt es heute verschiedene Optionen für kommerziell erhältliche iPSC-Nährmedien und -Matrices. Die meisten dieser Kulturbedingungen wurden jedoch für humane ES-Zellen und iPS-Zellen optimiert und funktionieren daher möglicherweise weniger gut in der NHP-iPSC-Kultur. In diesem Videoprotokoll geben wir Anweisungen zur Erzeugung und Pflege von humanen und NHP-iPS-Zellen, die aus Zellkulturen im Urin gewonnen werden.
Seit dem ersten Bericht über die Erzeugung von iPS-Zellen durch die erzwungene Expression definierter Faktoren in Fibroblasten im Jahr 2006 wurde diese Methode auf viele verschiedene Zelltypen unterschiedlicher Herkunft angewendet 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Von ihnen können nur aus Urin gewonnene Zellen auf völlig nicht-invasive Weise gewonnen werden. Basierend auf dem zuvor beschriebenen Protokoll von Zhou et al.33 kann man Zellen aus Primatenurin auch aus unsterilen Proben isolieren und expandieren, indem man Breitbandantibiotika ergänzt15. Bemerkenswert ist, dass Urinzellen, die mit diesem Protokoll beprobt wurden, ein hohes Potenzial zur Produktion von iPS-Zellen aufweisen, und zwar innerhalb eines kürzeren Zeitraums (Kolonien werden in 5-15 Tagen sichtbar) als die herkömmliche Reprogrammierung von Fibroblasten (20-30 Tage, unserer Erfahrung nach) und mit einer ausreichend hohen Erfolgsrate. Diese aus dem Urin gewonnenen Zellen wurden als gemischte Population von mesenchymalen Stammzell-ähnlichen Zellen und Blasenepithelzellen klassifiziert, was die hohe Reprogrammierungseffizienz verursacht15.
Neben der Variation in den Primärzellen variieren auch die Reprogrammierungsmethoden zur Erzeugung von iPS-Zellen je nach Verwendungszweck. Konventionelle Reprogrammierungsverfahren für menschliche somatische Zellen wurden durch die Überexpression von Reprogrammierungsfaktoren mit Retrovirus- oder Lentivirus-Vektoren durchgeführt, was die Integration exogener DNA in das Genom ermöglichte 5,34,35. Um die erzeugten iPS-Zellen genomisch intakt zu halten, haben die Forscher eine Vielzahl von Nicht-Integrationssystemen entwickelt - den exzisierbaren PiggyBac-Vektor 36,37, den episomalen Vektor38,39, nicht-integrierende Virusvektoren wie das Sendai-Virus 40 und das Adenovirus 41, die mRNA-Transfektion 42, die Proteintransfektion 43,44 und die Behandlung mit chemischen Verbindungen 45. Aufgrund der Effizienz und einfachen Handhabung werden in diesem Protokoll die auf dem Sendai-Virus basierenden Reprogrammierungsvektoren verwendet. Die Infektion der Primärzellen erfolgt in einer 1-stündigen Suspensionskultur von Zellen und Viren bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 vor der Plattierung. Dieser modifizierte Schritt könnte die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts zwischen Zelloberflächen und Viren im Vergleich zu der herkömmlichen Methode, bei der die Viren direkt in die adhärente Zellkultur gegeben werden, erhöhen und so mehr iPSC-Kolonien ergeben15.
Die Passage von humanen und NHP-pluripotenten Stammzellen kann durch Klumpen- und Einzelzellpassage erfolgen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist ein kostengünstiger Chelatbildner, der Calcium- und Magnesiumionen bindet und so die Adhärentaktivität von Cadherin und Integrin verhindert. EDTA wird auch als mildes, selektives Dissoziationsreagenz verwendet, da sich undifferenzierte Zellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Adhäsionsmoleküle vor differenzierten Zellen ablösen. Die vollständige Dissoziation induziert einen massiven Zelltod von Primaten-iPS-Zellen über die Rho/Rho-assoziierte Coiled-Coil-haltige Proteinkinase (Rho/Rock)-vermittelte Myosin-Hyperaktivierung. Daher ist die Ergänzung des Nährmediums mit einem Rho/Rock-Inhibitor für Experimente, die Einzelzellen in Suspension erfordern, unerlässlich46,47. In diesem Protokoll empfehlen wir die Klumpenpassage als routinemäßige Passaging-Methode und empfehlen die Einzelzell-Passage nur, wenn dies erforderlich ist, z. B. wenn das Seeding definierter Zellzahlen erforderlich ist, oder während der Subklonen.
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Protocol
Dieses experimentelle Verfahren wurde von der zuständigen Ethikkommission für Menschenversuche (20-122, Ethikkommission LMU München) genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
HINWEIS: Vor Beginn von Experimenten, die sich mit menschlichen und NHP-Proben befassen, muss die Genehmigung der zuständigen Ethikkommission eingeholt werden. Alle experimentellen Verfahren müssen in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden. Jeder der folgenden Schritte sollte steril in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Alle Puffer- und Medienzusammensetzungen finden Sie in der Ergänzungstabelle S1. Stellen Sie sicher, dass alle Medien auf Raumtemperatur (22 °C) erwärmt sind, bevor Sie sie in die Zellen geben. Jeder Zentrifugationsschritt sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
1. Isolierung von Zellen aus Urinproben
VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass menschliche Spender frei von humanen Immundefizienzviren (HIV), Hepatitis-B-Viren (HBV) und Hepatitis-C-Viren (HCV) sind. Stellen Sie bei NHPs sicher, dass die möglichen Spender/Zellen frei von spezifischen Krankheitserregern sind - dem B-Virus (BV), dem Affen-Immundefizienz-Virus (SIV), dem Affen-Betaretrovirus (SRV) und dem Affen-T-Zell-Lymphotropen Virus (STLV).
- Bereiten Sie eine mit Gelatine beschichtete 12-Well-Platte vor, indem Sie 500 μl 0,2%ige Gelatine pro Well hinzufügen, und verteilen Sie die Flüssigkeit durch Bewegen der Platte. Vor der Einnahme bei 37 °C mindestens 30 Minuten einwirken lassen.
- Sammeln Sie menschliche Urinproben in konischen 50-ml-Röhrchen. Bei Primaten wird der Urin mit einer Spritze vom Boden der Tieranlage gesammelt.
HINWEIS: Ein Volumen von 5 ml Urin erwies sich in 42 % der Versuche als ausreichend, um mindestens eine Kolonie zu isolieren. Es wird jedoch empfohlen, ein höheres Volumen von ~50 ml Urin zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, Kolonien zu isolieren. NHP-Urin sollte so frisch wie möglich entnommen werden, vorzugsweise unmittelbar nach dem Wasserlassen. Die Lagerung von Urinproben bei 4 °C für 4 h hatte keinen negativen Einfluss auf die Erfolgsrate des Protokolls, längere Lagerzeiten wurden jedoch nicht getestet. - Zentrifugieren Sie das urinhaltige Röhrchen bei 400 × g für 10 Minuten und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, wobei ca. 1 ml im Röhrchen verbleibt.
- Resuspendieren Sie das Pellet in den verbleibenden 1 ml Flüssigkeit. Fassen Sie die Suspensionen in einem Röhrchen zusammen, wenn mehrere Röhrchen Urin gesammelt wurden.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 ml Urinwaschpuffer (siehe Ergänzungstabelle S1) mit 2,5 μg/ml Amphotericin in das Röhrchen geben und die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette mischen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 200 × g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, so dass etwa <0,2 ml im Röhrchen verbleiben.
- Das Zellpellet wird in 1 ml primärem Urinmedium (siehe Ergänzungstabelle S1) mit 0,5 μg/ml Amphotericin pro 50 ml ursprünglich verarbeitetem Urin resuspendiert (Resuspendierung in 1 ml, auch wenn weniger als 50 ml Urin verarbeitet wurden).
- Abgesaugte Gelatine aus den Vertiefungen (hergestellt in Schritt 1.1) und 1 ml der Suspension aus Schritt 1.7 in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte schichten. Wiederholen Sie dies für so viele Vertiefungen wie gewünscht oder für so viele Milliliter Suspension, die verfügbar sind.
Optional: Um eine Kontamination durch unhygienische Probenentnahme zu vermeiden, fügen Sie den Zellen von nun an bis zum ersten Durchgang 100 μg/ml antimikrobielles Reagenz hinzu. - Legen Sie die Platte in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 .
- Fügen Sie täglich bis zum 5. Tag 1 ml primäres Urinmedium pro Vertiefung hinzu, ohne das vorhandene Medium zu entfernen.
- Saugen Sie am 5. Tag 4 ml Medium von der Platte ab, so dass etwa 1 ml Medium übrig bleibt. Fügen Sie 1 ml REMC-Medium (siehe Ergänzungstabelle S1) pro Well hinzu, um eine 1:1-Mischung mit dem neuen Nährmedium zu erhalten.
- Ersetzen Sie jeden Tag die Hälfte des Mediums durch REMC-Medium, bis die ersten Kolonien erscheinen (Abbildung 1A, B). Entfernen Sie daher 1 ml des alten Mediums und fügen Sie 1 ml frisches REMC-Medium pro Vertiefung hinzu.
2. Ausdehnung der Harnzellen
HINWEIS: Die Urinzellpassage sollte durchgeführt werden, bevor die Kultur eine Konfluenz von 90 % erreicht.
- Bereiten Sie die gewünschte Menge an gelatinebeschichteten 12-Well-Platten vor, wie in Schritt 1.1 angegeben.
- Saugen Sie das alte Medium ab und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) hinzufügen.
- Saugen Sie das DPBS ab und fügen Sie 300 μl 0,5-faches Dissoziationsenzym hinzu, das mit DPBS verdünnt ist. Die Platte bei 37 °C 5 min inkubieren.
- Fügen Sie 700 μl REMC-Medium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig mit einer P1000-Pipette, bis die Zellen in einzelne Zellen dissoziiert sind.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 200 × g .
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml REMC-Medium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler (einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler).
- Zur Expansion der Harnzellen werden 1,5 × 10 4 bis 3 × 104 Zellen in 1 ml REMC-Medium in eine mit 0,2 % Gelatine beschichtete 12-Well-Platte zerlegt.
- Führen Sie alle zwei Tage nachfolgende Medienwechsel durch, bis die Kultur eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht hat. Saugen Sie daher das alte Medium ab und fügen Sie 1 ml frisches REMC-Medium hinzu.
3. Generierung von iPS-Zellen durch Sendai-Virus-Vektorinfektion
HINWEIS: Den Arbeitsablauf des Neuprogrammierungsverfahrens finden Sie in Abbildung 2A. Harnzellen, die für die Reprogrammierung verwendet werden, sollten so jung wie möglich sein, aber ein bemerkenswerter Verlust der Reprogrammierungseffizienz wird vor Passage 4 nicht beobachtet. Das Sendai Virus Reprogramming Kit muss in einer BL-2-Anlage verwendet werden. Behandeln Sie Viren unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit laminarer Strömung und verwenden Sie immer geeignete Sicherheitsausrüstung, um eine Exposition gegenüber Schleimhäuten zu verhindern.
- Bereiten Sie eine mit Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte vor, indem Sie 500 μl Basalmembranmatrix pro Well hinzufügen, und verteilen Sie die Flüssigkeit durch Bewegen der Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für mindestens 1 h und ersetzen Sie die Basalmembranmatrix durch 900 μl REMC-Medium. Lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei 37 °C.
- Tauen Sie die Komponenten des Sendai Reprogramming Kits schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Mischen Sie die Sendai-Viren (polycistronische KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC und KLF4) mit einem MOI von 5 und fügen Sie REMC-Medium bis zu 100 μl hinzu. Verwenden Sie Gleichung (1):
HINWEIS: Da sich die Virustiter von Charge zu Charge unterscheiden, überprüfen Sie den Titer immer im Analysezertifikat, das vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird.
Optional: Verwenden Sie zusätzlich grün fluoreszierendes Protein (GFP) Sendai-Virus als Positivkontrolle für die Transduktionseffizienz. Bereiten Sie dazu in Schritt 3.3 weitere 3,5 × 104 Zellen in einem separaten Röhrchen vor. - Um die Harnzellen zu dissoziieren, befolgen Sie die Schritte 2.2-2.4. Zählen Sie die Zellen mit dem Zellzähler und übertragen Sie 7 × 104 Harnzellen in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für 5 Minuten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu zerstören. Das Pellet wird in 100 μl der in Schritt 3.2 hergestellten SeV-Mischung resuspendiert. Inkubieren Sie das Röhrchen 1 h lang bei 37 °C für eine Suspensionsinfektion.
- Die Suspension wird auf die mit der Basalmembranmatrix beschichteten 12-Well-Platten aufgetragen, die in Schritt 3.1 hergestellt wurden. Routinemäßig werden Platte 1 × 104 und 2,5 × 104 Zellen pro Well in Duplikaten behandelt.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Medium 24 Stunden nach der Transduktion und an Tag 3 durch 1 ml frisches REMC-Medium.
- Am 5. Tag nach der Transduktion wird das Medium auf PSC-Erzeugungsmedium umgestellt (siehe Ergänzungstabelle S1), wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird. Entfernen Sie daher das alte Medium und fügen Sie 1 ml PSC-Erzeugungsmedium pro Well hinzu.
HINWEIS: Es kann bis zu 15 Tage dauern, bis die ersten Völker erscheinen. - Wählen Sie einzelne iPSC-Kolonien aus, wenn die Größe der Kolonie 1 mm überschreitet. Kratzen Sie dazu eine einzelne Kolonie ab und sammeln Sie sie vorsichtig mit einer p10-Pipette unter dem Mikroskop. Die Kolonie wird in eine neue Vertiefung einer 12-Well-Platte überführt, die mit einer Basalmembranmatrix beschichtet ist, die 750 μl PSC-Nährmedium enthält.
Optional: Das Spülen der Platte mit DPBS und das Behandeln für 1 min mit 0,5 mM EDTA vor der Kommissionierung könnte die robuste Kultur der weiteren Schritte unterstützen. Wenn die Zellen länger kultiviert werden sollen, um auf später schlüpfende Kolonien zu warten, führen Sie diesen EDTA-Behandlungsschritt nicht durch. - Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird, wie in Abschnitt 4 des Protokolls angegeben. Wenn die gepflückte Kolonie einen Durchmesser von 2 mm erreicht hat, fahren Sie mit der routinemäßigen iPSC-Durchleitung fort, wie in Abschnitt 5 des Protokolls erläutert.
4. Mittlerer Wechsel
HINWEIS: Das Nährmedium sollte jeden zweiten Tag gewechselt werden, bis die Kolonien groß genug für die Durchreise sind.
- Saugen Sie das alte Medium ab und fügen Sie 750 μl des frischen Mediums pro 12-Well-Platte hinzu. Um zu einem anderen Medientyp zu wechseln, tauschen Sie das Medium mindestens 1 Tag nach dem Passieren aus.
5. Verabschiedung
HINWEIS: Die Zellen sollten durchquert werden, wenn die iPSC-Kolonien groß genug sind (Durchmesser > 2 mm) oder die Kolonien kurz davor sind, sich zu berühren. Routinemäßig können iPS-Zellen etwa alle 5 Tage geteilt werden. Verwenden Sie die Klumpenpassage (Schritt 5.1) für die routinemäßige Wartung und die Einzelzell-Passaging (Schritt 5.2) für Experimente, bei denen eine definierte Anzahl von Zellen benötigt wird. Falls sich die iPS-Zellen stark differenzieren, kann der Colony Picking (Schritt 5.3) dazu beitragen, die Reinheit der Kulturen zu verbessern.
- Klumpen-Passage
- Bereiten Sie eine mit Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte vor, indem Sie 500 μl Basalmembranmatrix pro Well hinzufügen, und verteilen Sie die Flüssigkeit durch Bewegen der Platte. Die Platte bei 37 °C mindestens 1 h inkubieren. Ersetzen Sie die Basalmembranmatrix durch 500 μl PSC-Nährmedium und lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei 37 °C.
- Saugen Sie das Medium aus den kultivierten Zellen ab und waschen Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzufügen. Entfernen Sie das DPBS und geben Sie 500 μl 0,5 mM EDTA in die Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platte bei RT für 2-5 Minuten, bis sich die Kolonien zu lösen beginnen. Beobachten Sie die Zellen sorgfältig unter dem Mikroskop.
- Wenn sich die Ränder der Kolonien abzulösen beginnen und Lücken zwischen den Zellen sichtbar werden (Abbildung 3A), entfernen Sie das EDTA und fügen Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzu.
Anmerkungen: Pipettieren Sie immer gegen die Seitenwand der Vertiefung und niemals direkt auf die Zellen, um die Zellen nicht von der Platte zu lösen. - Saugen Sie das DPBS ab und spülen Sie die Vertiefung mit 500 μl PSC-Nährmedium mit einer p1000-Pipette. Pipettieren Sie 1x-5x auf und ab, um die Kolonien in Klumpen geeigneter Größe zu verteilen (Abbildung 3A). Pipettieren Sie nicht zu viel.
Anmerkungen: Wenn die iPS-Zellen versehentlich zu stark pipettiert werden, geben Sie 10 μM Rock-Inhibitor Y-27632 in das Medium. Dies kann das Überleben verbessern, da iPS-Zellen nicht in der Lage sind, als Einzelzellen zu überleben. - Übertragen Sie 1/10-1/50 der Zellklumpensuspension in die neuen Vertiefungen. Das Verhältnis hängt von der Konfluenz der Vertiefung vor der Spaltung, der gewünschten Dichte der ausgesäten Zellen und der klonalen Präferenz des iPSC ab.
- Verteilen Sie die Klumpen gleichmäßig in der Vertiefung, indem Sie die Platte mehrmals vorsichtig hin und her bewegen. Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Klumpen festsetzen können.
- Ersetzen Sie das Medium durch 750 μl PSC-Nährmedium, wenn viele schwimmende tote Zellen beobachtet werden. Andernfalls fügen Sie 250 μl PSC-Nährmedium hinzu. Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
HINWEIS: Ein Mediumersatz nach 30 Minuten ist kritisch, insbesondere bei instabilen Zelllinien (z. B. NHPs). - Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis die Kolonien groß genug sind, um durchzugehen. Befolgen Sie für mittlere Änderungen Schritt 4 des Protokolls.
- Einzelzell-Passaging
- Die mit der Basalmembranmatrix beschichtete Kulturplatte wird wie in Schritt 5.1.1 beschrieben unter Zugabe von 10 μM Y-27632 zum PSC-Nährmedium vorbereitet.
Optional: 10 μM Y-27632 1-3 h vor der Passage in die Zellen geben, um das Überleben empfindlicher Zelllinien zu verbessern. - Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 500 μl DPBS. Entfernen Sie das DPBS und geben Sie 300 μl Ablöselösung in die Vertiefungen.
- Die Platte bei 37 °C 5-10 min inkubieren. Wenn eine ausreichende Ablösung der Zellen unter dem Mikroskop beobachtet wird, fügen Sie 700 μl PSC-Nährmedium oder DPBS hinzu.
- Pipettieren Sie mit einer p1000-Pipette 5-10x auf und ab, bis die Zellen in einzelne Zellen zerfallen sind. Pipettieren Sie nicht zu viel, um Zellschäden zu vermeiden.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen, das mindestens 2 ml DPBS enthält, um die Ablöselösung zu verdünnen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für 5 Minuten und saugen Sie die Lösung vollständig an, ohne das Zellpellet zu zerstören.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl PSC-Nährmedium, ergänzt mit 10 μM Y-27632.
- Zählen Sie die Zellen und säen Sie 5.000-7.000 Zellen pro mit Basalmembranmatrix beschichteter 12-Well-Platte, die in Schritt 5.2.1 vorbereitet wurde.
HINWEIS: Wenn eine andere Zellennummer benötigt wird, wechseln Sie entsprechend zu einer größeren oder kleineren Well. - Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 , damit sich die Zellen anlagern können.
- Ersetzen Sie das Medium durch 750 μl PSC-Nährmedium + 10 μM Y-27632, wenn viele tote Zellen beobachtet werden. Andernfalls fügen Sie 250 μL + 10 μM Y-27632 hinzu.
HINWEIS: Dieser Schritt ist besonders für instabile Zelllinien (z. B. NHPs) von entscheidender Bedeutung. - Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
- Wechseln Sie das Medium 1 bis 2 Tage nach der Teilung auf PSC-Nährmedium ohne Y-27632, damit die Zellen wieder die klassische Koloniemorphologie aufweisen können (Abbildung 3B).
- Wechsle das Medium alle 2 Tage, bis die Kolonien groß genug sind. Befolgen Sie für mittlere Änderungen Abschnitt 4 des Protokolls.
- Die mit der Basalmembranmatrix beschichtete Kulturplatte wird wie in Schritt 5.1.1 beschrieben unter Zugabe von 10 μM Y-27632 zum PSC-Nährmedium vorbereitet.
- Passage von iPS-Zellen durch Colony Picking
- Bereiten Sie die mit der Basalmembranmatrix beschichteten 12-Wells vor, wie in Schritt 5.1.1 beschrieben.
- Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzufügen. Entfernen Sie das DPBS und geben Sie 500 μl 0,5 mM EDTA in die Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platte bei RT für 1-3 min und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis die Ablösung der Kolonie an den Rändern sichtbar ist.
- Entfernen Sie das EDTA und fügen Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzu. Saugen Sie die Flüssigkeit ab, bevor Sie langsam 500 μl PSC-Nährmedium in die Vertiefung geben, ohne die Zellen abzulösen.
- Verwenden Sie eine p200-Pipette, um die gewünschte Kolonie unter dem Mikroskop auszuwählen, ohne die differenzierten Zellen zu sammeln. Kratzen Sie dazu vorsichtig über die Kolonie, während Sie das Medium mit den Zellen aufnehmen.
- Jede gepflückte Kolonie wird in eine mit Basalmembranmatrix beschichtete Vertiefung überführt, wie in Schritt 5.3.1 vorbereitet. Dissoziieren Sie die Zellen mit einer p1000-Pipette in kleine Klumpen, indem Sie die Zellen 2-5x pipettieren.
- Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2, damit sich die Klumpen anlagern können.
- Ersetzen Sie das Medium durch 750 μl PSC-Nährmedium, wenn viele schwimmende tote Zellen beobachtet werden. Andernfalls fügen Sie 250 μl PSC-Nährmedium hinzu.
HINWEIS: Der Mediumersatz nach 30 Minuten ist kritisch, insbesondere für die instabilen Zelllinien (z. B. NHPs). - Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
- Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis die Kolonien groß genug sind, um durchzugehen. Befolgen Sie dazu Abschnitt 4 des Protokolls.
6. Einfrieren von Harnzellen und iPS-Zellen zur Langzeitlagerung
HINWEIS: Routinemäßig werden iPS-Zellen als Klumpen in Zellgefriermedium eingefroren, ohne zu zählen. Das Pipettieren sollte minimal sein, um eine Dissoziation in einzelne Zellen zu vermeiden. Für Harnzellen werden routinemäßig 1,5 × 10 4 bis 3 × 104 Zellen pro Röhrchen eingefroren, so dass der Benutzer ein Röhrchen direkt in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte auftauen kann, ohne dass ein weiterer Zählschritt erforderlich ist.
- Bereiten Sie 5 ml DPBS in einem 15-ml-Röhrchen vor.
- Befolgen Sie für das Einfrieren von Urinzellen die Schritte 2.2-2.4 des Protokolls. Befolgen Sie zum Einfrieren von iPS-Zellen die Schritte 5.1.2-5.1.5 aus dem Clump-Passaging-Protokoll.
- Übertragen Sie die Suspension in das in Schritt 6.1 vorbereitete 15-ml-Röhrchen. Für das Einfrieren von Harnzellen werden 10 μl der Zellsuspension mit einem Hämozytometer gezählt. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 200 × g und saugen Sie den Überstand vollständig ab.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 μl Zellgefriermedium pro Röhrchen und verteilen Sie die Zellen auf die gewünschte Menge an Kryoröhrchen.
- Übertragen Sie die Kryoröhrchen sofort auf -80 °C. Übertragen Sie die gefrorenen Röhrchen 1 Tag nach dem Einfrieren bei -80 °C zur Langzeitlagerung in einen -150 °C Gefrierschrank oder flüssigen Stickstoff.
7. Auftauen von Harnzellen und iPS-Zellen
- Für das Auftauen von Harnzellen wird die gewünschte Menge an gelatinebeschichteten 12-Wells vorbereitet, wie in Schritt 1.1 des Protokolls angegeben. Für iPS-Zellen sind die mit der Basalmembranmatrix beschichteten 12-Well-Platten wie in Schritt 5.1.1 beschrieben vorzubereiten. Tauschen Sie in beiden Fällen die Matrix nicht gegen Medium aus.
- Bereiten Sie ein 15-ml-Röhrchen mit 4 ml DPBS vor und lagern Sie es bei 37 °C.
- Ein gefrorenes Fläschchen mit Zellen zum Auftauen schnell in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen, bis ein Stück schwimmendes Eis sichtbar wird.
Anmerkungen: Wischen Sie das Kryoröhrchen vor und nach der Inkubation im Wasserbad mit Ethanol ab, um Verunreinigungen zu vermeiden. - 500 μl REMC-Medium für Harnzellen oder 500 μl PSC-Nährmedium für iPS-Zellen in die eishaltige Suspension geben und die Suspension sofort in das in Schritt 7.2 vorbereitete vorgewärmte 15-ml-Röhrchen überführen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für 5 Minuten und entsorgen Sie den Überstand vollständig.
- Bei Harnzellen wird das Pellet in 1 ml REMC-Medium resuspendiert. Bei iPS-Zellen wird das Pellet vorsichtig in 750 μl PSC-Nährmedium resuspendiert. Vermeiden Sie es, zu viel zu pipettieren, um die Klumpen intakt zu halten.
Optional: Die Ergänzung des Mediums mit 10 μM Y-27632 kann das Überleben von iPS-Zellen nach dem Auftauen unterstützen. - Saugen Sie die Matrix von den in Schritt 7.1 hergestellten 12-Well-Platten ab und übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig in die Well.
- Stellen Sie die Platte über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
- Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch PSC-Nährmedium, ohne Y-27632 für iPS-Zellen und durch REMC für Harnzellen.
- Züchten Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem Inkubator.
- Wechsle das Medium alle 2-3 Tage, bis die Zellen groß genug sind, um durchzugehen. Befolgen Sie für mittlere Änderungen Abschnitt 4 des Protokolls.
8. Immunzytochemie
HINWEIS: Die Immunfärbung mit Antikörpern, die auf pluripotenzbezogene Marker wie NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 und EpCAM abzielen, ist eine der am weitesten verbreiteten Validierungen neu generierter iPS-Zellen. Weitere Informationen zu den Antikörpern und Verdünnungen finden Sie in der Materialtabelle.
- Platte iPS-Zellen 1-3 Tage vor der Anwendung in einer geeigneten Anzahl von 12-Well-Platten. Saugen Sie das Medium an, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 500 μl DPBS und entfernen Sie das DPBS. Fügen Sie 400 μl 4%iges Paraformaldehyd (PFA) pro Vertiefung hinzu und fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei RT.
- Entfernen Sie das 4%ige PFA und waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS. Fügen Sie 400 μl Blockierungspuffer pro Well hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei RT.
- Saugen Sie den Blockierungspuffer an und geben Sie die Antikörper, die in 400 μl Antikörperverdünnungspuffer (ADB) verdünnt sind, in jede Vertiefung. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Entfernen Sie das ADB mit den primären Antikörpern und waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS.
- Saugen Sie das DPBS ab und fügen Sie 400 μl Sekundärantikörper, die in ADB verdünnt sind, pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei RT im Dunkeln.
- Entfernen Sie die ADB und waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS. Fügen Sie 1 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) verdünnt in DPBS pro Well hinzu und inkubieren Sie es 3 Minuten lang bei RT.
- Saugen Sie die DAPI-Lösung an und waschen Sie die Zelle 3x mit DPBS. Fügen Sie 500 μl DPBS für die Bildgebung hinzu.
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Representative Results
Bei der Isolierung von Zellen aus menschlichem und NHP-Urin können verschiedene Zelltypen direkt nach der Isolierung identifiziert werden. Plattenepithelzellen sowie verschiedene kleinere runde Zellen werden mit dem Urin ausgeschieden; Der weibliche Urin enthält weitaus mehr Plattenepithelzellen als der männliche Urin (Abbildung 1B - Tag 0; Ergänzende Abbildung S1). Nach 5-tägiger Kultivierung im primären Urinmedium sind die ersten adhärenten proliferierenden Zellen zu sehen (Abbildung 1A,B - Tag 5). Zu diesem Zeitpunkt wird jeden Tag die Hälfte des Mediums durch REMC-Proliferationsmedium ersetzt, bis die ersten Kolonien erscheinen. Etwa am 13. Tag wachsen die adhärenten Zellen zu großen Kolonien heran, die durchquert werden können (Abbildung 1B - Tag 13). Diese Kolonien können aus zwei morphologisch unterschiedlichen Zelltypen gebildet werden - einer mit einem eher epithelialen Phänotyp mit eng aneinander wachsenden Zellen und der andere mit einer eher mesenchymalen Morphologie mit länglicher Form und höherer Migrationsfähigkeit (Abbildung 1C). Nach der ersten Passage wachsen die Urinzellen als Monoschicht und können durchgelassen werden, wenn die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreicht hat (Abbildung 1B - Tag 17).
Abbildung 1: Isolierung und Kultivierung von Harnzellen. (A) Arbeitsablauf zur Etablierung von Harnzellen aus menschlichen und nicht-menschlichen Primatenproben. (B) Phasenkontrastbilder, die das Wachstum und die Koloniebildung von Harnzellen bis zur ersten Passage zeigen (p1). (C) Zwei verschiedene Zelltypen, die aus Urinproben isoliert wurden, können nach 2 Wochen Kultur unterschieden werden. Maßstabsbalken = 250 μm (B,C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um iPS-Zellen aus Harnzellen zu erzeugen, wird eine Transduktion mit Sendai-Viren verwendet, die die Yamanaka-Faktoren OCT3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC einführen. Um die Transduktionseffizienz zu erhöhen, werden die Urinzellen mit dem Virus 1 h lang in Suspension inkubiert, bevor sie sich auf mit Basalmembranmatrix beschichtete Vertiefungen aussäen (Abbildung 2A). Einige adhärente Zellen sind 1 Tag nach der Transduktion in den Vertiefungen zu sehen (Abbildung 2B - Tag 1). Nach 5-10 Tagen beginnen diese Zellen, Kolonien zu bilden, und es können frühe morphologische Veränderungen beobachtet werden, die auf eine Reprogrammierung der Zellen hinweisen (Abbildung 2B - Tag 14). Viele dieser Kolonien zeigen nach und nach eine ESC-ähnliche Morphologie und können in PSC-Nährmedium gepflückt werden, wenn der Durchmesser 1 mm überschreitet. Nach der Ernte bilden die Zellen innerhalb von ca. 4 Tagen Kolonien, die die typische ESC-Morphologie aufweisen (Abbildung 2B - Tage 21 &; 24). Wenn die iPSC-Kolonien groß genug sind, können die Zellen zum ersten Mal mit Hilfe des Clump-Passaging-Protokolls (Protokollschritt 5.1) durchquert werden.
Dieser Reprogrammierungsansatz wurde verwendet, um iPS-Zellen von Menschen, Gorilla-Gorillas (Gorilla ) und Pongo abelii (Orang-Utan) zu generieren15. Während die Wahrscheinlichkeit, Harnzellen zu erhalten, recht variabel ist und bei Schimpansen mindestens zwei- bis dreimal geringer ist als beim Menschen15, war die Reprogrammierung der gewonnenen Harnzellen unserer Erfahrung nach meist erfolgreich. Im Allgemeinen führen 0,19 % der infizierten Harnzellen zu Kolonien mit ESC-ähnlicher Morphologie, was bei 87 % der Reprogrammierungsversuche zu mindestens einer Kolonie führt15. Alle generierten iPS-Zellen weisen die gleichen Eigenschaften auf und zeigen die typische ESC-ähnliche Koloniemorphologie, die durch dicht gepackte Zellen mit klar definierten Rändern gekennzeichnet ist (Abbildung 2C). Darüber hinaus weisen alle iPS-Zellen einen normalen Karyotyp auf, und das Fehlen von SeV-Reprogrammierungsvektoren wurde nach mindestens fünf Passagen mittels PCR verifiziert, wie vom Hersteller des SeV-Reprogrammierungskits empfohlen (Daten nicht gezeigt)15. Die Immunzytochemie wird verwendet, um die Expression von Pluripotenz-assoziierten Proteinen im Zellkern wie NANOG, OCT3/4 und SOX2 zu testen. Oberflächenmarker wie TRA-1-60, EpCAM und SSEA4 können ebenfalls verwendet werden (Abbildung 2D); SSEA4 wird jedoch auch in den Harnzellen exprimiert15. Darüber hinaus kann eine durchflusszytometrische Analyse mit diesen Oberflächenmarkern durchgeführt werden, um quantitative Informationen über den Pluripotenzstatus der iPS-Zellen zu erhalten (Methode, beschrieben von Ohnuki et al.48). Dieser Ansatz wird verwendet, um zu zeigen, dass 95,3% der analysierten Orang-Utan-iPS-Zellen positiv für TRA-1-60 sind (Abbildung 2E). Darüber hinaus kann die Differenzierungsfähigkeit von NHP-iPS-Zellen durch in vitro Embryoid Body (EB)-Differenzierung nachgewiesen werden (Methode beschrieben von Geuder et al.15). Wie in Abbildung 2F gezeigt, sind Gorilla-iPS-Zellen in der Lage, sich in Endoderm- (ɑ-Fetoprotein), Mesoderm- (ɑ-Aktin) und Ektodermlinien (β-III-Tubulin) zu differenzieren.
Abbildung 2: Generierung und Charakterisierung von aus Urin gewonnenen iPS-Zellen. (A) Reprogrammierung von aus Urin gewonnenen Zellen. (B) Phasenkontrastbilder, die die morphologischen Veränderungen der Gorilla-Harnzellen während der Reprogrammierung bis zur Etablierung von iPSC-Kolonien zeigen. Maßstabsbalken = 500 μm. (C) Morphologie etablierter iPSC-Kolonien aus humanen, Gorilla- und Orang-Utan-Zellkulturen. Maßstabsbalken = 500 μm. (D) Immunfluoreszenzfärbung von Gorilla-iPS-Zellen mit Pluripotenz-assoziierten Markern an Passage 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM und TRA-1-60. Maßstabsbalken = 100 μm. (E) Durchflusszytometrische Analyse von Orang-Utan-iPS-Zellen, die mit Anti-TRA-1-60-PE gefärbt wurden. Als Kontrolle wurden ungefärbte Zellen verwendet. (F) Immunfluoreszenzanalyse von Endoderm (AFP), Mesoderm (ɑ-SMA) und Ektoderm (β-III TUB) nach Embryoidkörperdifferenzierung von Gorilla-iPS-Zellen. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: iPSCs = induzierte pluripotente Stammzellen; PE = Phycoerythrin; AFP = α-Fetoprotein; ɑ-SMA = Alpha-Aktin der glatten Muskulatur; β-III-TUB = Beta-III-Tubulin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Wenn die iPSC-Kolonien einen Durchmesser von etwa 2 mm erreichen oder kurz davor stehen, sich zu berühren, sollten die Zellen geteilt werden. Wir empfehlen die Verwendung des Clump-Passaging-Protokolls für die routinemäßige Wartung. In diesem Protokoll werden je nach Koloniegröße 0,5 mM EDTA verwendet, um die Zellen für 3-5 Minuten abzulösen. Während der EDTA-Inkubation beginnen sich die Ränder der Kolonien abzulösen, und es entstehen sichtbare Lücken zwischen den Zellen (Abbildung 3A). Das EDTA ist zu entfernen, wenn eine entsprechende Ablösung unter dem Mikroskop beobachtet wird. Eine längere Inkubation mit EDTA führt zu einem höheren Anteil an Einzelzellen, die nicht überlebensfähig sind. Als nächstes sollten die Zellen zu Klumpen ähnlicher Größe dissoziiert werden, wie in Abbildung 3A gezeigt. Die Zellen sollten nicht in kleine Klumpen zerlegt werden, da dies das Überleben verringert und zu differenzierenderen Zellen führen kann.
Wenn ein Experiment das Seeding einer definierten Anzahl von Zellen erfordert, sollte das Einzelzell-Passaging-Protokoll verwendet werden. Dieses Protokoll beinhaltet die Ergänzung des Mediums mit einem Rock-Inhibitor, der den einzelnen Zellen das Überleben ermöglicht. Es wird erwartet, dass angehängte Einzelzellen eine andere Morphologie aufweisen als Zellen, die in einer Kolonie nach der Klumpenaussaat wachsen (Abbildung 3B - Tag 0). Nach 1-2 Tagen Kultur beginnen die einzelnen Zellen wieder zu Kolonien zu wachsen, wobei ihre Morphologie sowie ihr lockerer Zell-Zell-Kontakt erhalten bleiben, wenn dem Medium ein Rock-Inhibitor zugesetzt wird (Abbildung 3B - Tag 2). Wenn diese kleinen Kolonien beobachtet werden, sollte der Rock-Inhibitor aus dem Medium entfernt werden, damit die Zellen wieder die typische ESC-ähnliche Morphologie aufweisen können (Abbildung 3B - Tag 4).
Um beurteilen zu können, ob eine iPSC-Kolonie von hoher Qualität ist, müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Erstens ist es normal, dass gesunde Kolonien keine oder nur ein geringes Maß an spontaner Differenzierung zeigen; Eine erhöhte Anzahl differenzierter Zellen (>10%) deutet jedoch auf eine schlechte iPSC-Qualität hin. Weitere Merkmale einer niedrigen iPSC-Qualität sind ein Verlust der Randintegrität und Homogenität (Abbildung 3C: rechts) sowie eine lose zelluläre Verpackung mit sichtbaren Lücken zwischen den Zellen (Abbildung 3D: rechts). Im Gegensatz dazu zeichnen sich hochwertige iPS-Zellen durch definierte Grenzen, enge zelluläre Verpackung und prominente Nukleolen aus (Abbildung 3C, D: linke Bilder).
Abbildung 3: iPSC-Kultur von Primaten . (A) Phasenkontrastbilder, die die Ablösung von iPSC-Kolonien während der EDTA-Inkubation nach dem Klumpenpassaging-Protokoll und die optimale Klumpengröße nach Dissoziation zeigen. Maßstabsbalken = 250 μm. (B) Zeitleiste der iPSC-Erholung nach Einzelzell-Passaging. Der Rock-Inhibitor Y-27632 wurde ab Tag 2 entfernt. Maßstabsbalken = 250 μm. (C) Links: Beispiel einer hochwertigen humanen iPSC-Kolonie mit definierten Grenzen. Rechts: Beispiel einer minderwertigen Kolonie mit weniger Randintegrität und differenzierten Zellen. Maßstabsbalken = 500 μm. (D) Beispielbilder für eine qualitativ hochwertige humane iPSC-Kolonie (links) im Vergleich zu einer minderwertigen Kolonie mit lose gepackten Zellen (rechts). Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzung: iPSCs = induzierte pluripotente Stammzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Übersicht über Zelltypen, die im menschlichen Urin gefunden wurden. (A) Zellen, die aus weiblichem Urin isoliert wurden. (B) Zellen, die aus männlichem Urin isoliert wurden. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S1: Puffer- und Medienzusammensetzungen, die in dieser Studie verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
iPS-Zellen sind wertvolle Zelltypen, da sie die Erzeugung von sonst unzugänglichen Zelltypen in vitro ermöglichen. Da die Ausgangsmaterialien für die Reprogrammierung, z.B. Fibroblasten, nicht von allen Primatenarten leicht verfügbar sind, wird in dieser Arbeit ein Protokoll für die Generierung von iPS-Zellen aus Urinzellen vorgestellt. Diese Zellen können nicht-invasiv gewonnen werden, auch aus unsterilen Urinproben von Primaten, indem das Nährmedium mit Breitbandantibiotika ergänzt wird.
Einige kritische Schritte im Protokoll sind eine zusätzliche Diskussion wert. Erstens ist es bei der Isolierung von Zellen aus unsterilem Urin wichtig, das Medium mit einem antimikrobiellen Breitbandreagenz zu ergänzen, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Wenn sich trotz des Einsatzes von Antibiotika eine mikrobiologische Kontamination abzeichnet, wird empfohlen, die gesamte Kultur zu verwerfen und den Bereich zu desinfizieren. Hinzu kommt, dass nach unserer Erfahrung eine fortgesetzte Kultivierung keine gesund wachsenden Harnzellen hervorbringt. Zweitens wird dringend empfohlen, wenn mit der Reprogrammierung von Zellen begonnen wird, mehrere Schalen mit unterschiedlicher Anzahl von SeV-transduzierten Zellen zuzubereiten, um das Risiko einer Ablösung aller Zellen durch Überkonfluenz zu vermeiden und die Wahrscheinlichkeit des iPSC-Erwerbs zu erhöhen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass eine höhere Dichte von SeV-transduzierten Zellen zu mehr reprogrammierten iPSC-Kolonien führt, während die Kultivierung der reprogrammierenden Zellen über einen Zeitraum von ~20 Tagen oft zu einer Überkonfluenz führt, gefolgt von einer Ablösung des gesamten Wells. Drittens ist es bei jedem Schritt, der eine Dissoziation von iPS-Zellen erfordert, von entscheidender Bedeutung, umfangreiches Pipettieren zu vermeiden, das zu einem signifikanten Zelltod führt. Insbesondere wenn die Klumpenpassage durchgeführt wird, ist es wichtig, die Klumpen in einer geeigneten Größe zu halten (Abbildung 3A). Zu große Klumpen können zu einer schnellen Differenzierung führen, während zu kleine Klumpen das Überleben verringern können.
Wir beobachteten, dass die Wahrscheinlichkeit, Urinzellen zu erhalten, zwischen Proben und Aliquoten sehr unterschiedlich ist, fanden aber keine Hinweise darauf, dass kleinere Volumina eine geringere Erfolgsrate bei der Gewinnung von Kolonien haben. Im Allgemeinen isolierten wir durchschnittlich 7,6 Kolonien aus 100 ml menschlichem Urin. Unter der Annahme dieser durchschnittlichen Rate und einer Poisson-Verteilung hat der Erhalt von mindestens einer Kolonie eine Wahrscheinlichkeit von ~98% für 50 ml und ~30% für 5 ml Ausgangsmaterial. In unserem Fall war es in 42% der Versuche möglich, mindestens eine Kolonie aus 5 ml menschlichem Urin zu isolieren15. Auf dieser Grundlage kann die Isolierung von Kolonien immer noch einen Versuch wert sein, auch wenn nur geringe Mengen Urin zur Verfügung stehen. Falls die Reprogrammierung von Harnzellen fehlschlägt und keine iPSC-Kolonien beobachtet werden können, kann die Beschichtung unterschiedlich vieler transfizierter Zellen zu einer Reprogrammierung der aus dem Urin gewonnenen Zellen führen. Die entstehenden iPSC-Kolonien können auch durch Lebendfärbung mit Oberflächenmarkern (z. B. TRA-1-60 oder alkalische Phosphatase [AP]; Daten nicht gezeigt) als iPS-Zellen identifiziert werden. Es ist bekannt, dass die AP-Aktivität in pluripotenten Stammzellen hochreguliert ist, und es kann verwendet werden, um Stammzellen während des Kulturprozesses vorübergehend zu färben. Ein weiterer möglicher Fallstrick des Protokolls ist die optimale Kultivierung von NHP-iPS-Zellen. Mit Hilfe dieses Protokolls konnten wir bestätigen, dass humane und NHP-iPS-Zellen ihren pluripotenten Zustand für mehr als 50 Passagen mit einem kommerziell erhältlichen Medium beibehalten. Im Vergleich zu humanen iPS-Zellen neigen NHP-iPS-Zellen unserer Erfahrung nach jedoch eher zur spontanen Differenzierung, möglicherweise aufgrund der Kulturbedingungen, die für menschliche und nicht für NHP-Kulturen optimiert wurden. Darüber hinaus gibt es eine große Variabilität zwischen den iPSC-Klonen in Bezug auf die Überlebensraten nach der Beschichtung, die Wachstumsgeschwindigkeit und die Tendenz zur Differenzierung. Daher muss man oft das optimale Spaltungsverhältnis, den optimalen Durchgangszeitpunkt und die Klumpengröße für jeden Klon einzeln bestimmen.
Wir haben gezeigt, dass bereits ein Volumen von 5 ml ausreichen kann, um Harnzellen aus NHPs zu isolieren15. Während wir jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der isolierten Harnzellen bei Menschen, Gorillas und Orang-Utans fanden, wiesen Schimpansen ein geringeres Verhältnis auf, da wir keine Urinzellen aus insgesamt 87 ml isolieren konnten. Daher kann es bei einigen Arten notwendig sein, viel mehr Urin zu sammeln als bei anderen. Das Sammeln großer Mengen von kleinen Primaten kann eine besondere Herausforderung sein, aber da die Isolierung von Urinzellen ziemlich kostengünstig ist, ist es praktisch, sie einfach für bestimmte Arten und verfügbare Urinmengen auszuprobieren. Leider können die Urinproben nicht eingefroren werden, was den Radius einschränkt, über den Proben entnommen werden können. Wir konnten jedoch zeigen, dass eine Lagerzeit von 4 h bei 4 °C keinen Einfluss auf die Anzahl der isolierten Völker15 hat, und dass eine längere Lagerzeit oder eine Verbesserung der Lagerbedingungen durchaus möglich sein könnte. Wir haben verschiedene Arten von Qualitätskontrolltests zur Validierung eingeführt. Doch selbst wenn eine iPSC-Linie diese Kriterien erfüllt, ist die klonale Heterogenität immer noch erheblich, was durch den genetischen Hintergrund49 und den epigenetischen Status 50,51,52,53,54 erklärt werden konnte. Um Primaten-iPS-Zellen auf zukünftige vergleichende Analysen anzuwenden, sollte man die Heterogenität berücksichtigen und genügend Klone verwenden, um die klonale Variation zu mitteln, um Fehlinterpretationen des Ergebnisses zu vermeiden.
Dennoch hat die Verwendung von Urin als Quelle für Primärzellen einen großen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden, bei denen beispielsweise Fibroblasten zur Reprogrammierung verwendet werden, da diese völlig nicht-invasiv gewonnen werden können. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Erzeugung von iPS-Zellen aus Urinzellen mit einer kürzeren Zeitspanne als bei der herkömmlichen Reprogrammierung. Mit dieser Methode werden Kolonien innerhalb von 5-15 Tagen sichtbar, während wir festgestellt haben, dass Kolonien von Primatenfibroblasten (Rhesus, Pavian) dazu neigen, später, nach 20-30 Tagen, zu erscheinen. Darüber hinaus führten 0,19 % der virustransduzierten Zellen mit dieser Suspensionsinfektionsmethode zu Kolonien mit pluripotenter zellähnlicher Morphologie. Dies führte dazu, dass in 87 % der Versuche mindestens eine Kolonie gefunden wurde15. Im Vergleich dazu zeigte sich, dass die konventionelle Transduktionsmethode von SeV mit angehängten Zellen und die Liofektion mit episomalen Plasmiden eine signifikant geringere Reprogrammierungseffizienz aufwiesen, wobei 0,09 % bzw. 0,009 % der Zellen eine pluripotente Kolonie bildeten15.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode die nicht-invasive Isolierung von Harnzellen und die Erzeugung von feederfreien iPS-Zellen von nahezu jedem menschlichen Spender und vielen NHPs ermöglicht. Dies erhöht die Zugänglichkeit zu wertvollen Zelltypen, die von diesen iPS-Zellen unterschieden werden können. Darüber hinaus können mit dieser Methode patientenspezifische iPS-Zellen hergestellt werden, die für die Modellierung von Krankheiten oder zukünftige zellbasierte Therapien verwendet werden können. Da iPS-Zellen nur aus kleinen Urinmengen erzeugt werden können, kann diese Methode auf viele weitere verschiedene Primaten- oder sogar Säugetierarten angewendet werden. Daher kann diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug für den Vergleich zwischen den Arten sein, das ein besseres Verständnis der Evolution von menschenspezifischen Merkmalen ermöglichen könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der DFG EN 1093/5-1 (Projektnummer 458247426) gefördert. M.O. wurde durch das JSPS Overseas Research Fellowship unterstützt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Durchflusszytometrie wurde mit Hilfe der Core Facility Durchflusszytometrie am Biomedizinischen Zentrum München durchgeführt. Wir bedanken uns bei Makoto Shida und Tomoyo Muto von der ASHBi, Kyoto University, für die Unterstützung der Videografie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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