Summary
본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.
Abstract
영장류 만능 줄기 세포와 그 유도체를 연구하는 종 간 접근법은 질병, 발달 및 진화의 분자 및 세포 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 영장류 유도만능줄기세포(iPSC)에 보다 쉽게 접근할 수 있도록 하기 위해 본 논문에서는 소변 유래 세포에서 인간 및 비인간 영장류 iPSC를 생성하는 비침습적 방법과 피더 프리 배양 방법을 사용한 유지 관리를 제시합니다.
소변은 비멸균 환경(예: 동물의 케이지)에서 샘플링하고 1차 세포 배양 중에 광범위한 항생제 칵테일로 처리하여 오염을 효율적으로 줄일 수 있습니다. 소변 유래 세포의 증식 후, iPSC는 상업적으로 이용 가능한 센다이 바이러스 벡터 시스템의 변형된 형질도입 방법에 의해 생성됩니다. 첫 번째 iPSC 콜로니는 이미 5일 후에 볼 수 있으며 빠르면 10일 후에 채취할 수 있습니다. 효소가 없는 해리 완충액을 사용한 일상적인 덩어리 계대배양은 50개 이상의 계대에 대해 생성된 iPSC의 다능성을 지원합니다.
Introduction
인간과 비인간 영장류(NHP)의 게놈 비교는 우리의 진화 역사와 인간 특이적 형질의 진화를 이해하는 데 중요합니다1. 추가적으로, 이러한 비교는 보존된 DNA 서열2을 식별함으로써, 예를 들어, 질병 관련 변이체3의 우선순위를 정함으로써 기능의 추론을 가능하게한다. 유전자 발현 수준과 같은 분자 표현형의 비교는 게놈 비교를 더 잘 해석하고 예를 들어 세포 표현형 차이를 발견하는 데 중요합니다. 또한, DNA 수준에서의 비교와 유사하게 기능적 관련성을 추론할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 따라서 인간 내에서 의학적으로 관련된 변이를 더 잘 해석할 수 있다4. 이러한 비교 연구에 포괄적인 분자 표현형 데이터를 통합하려면 적절한 생물학적 자원(즉, 종 전반에 걸친 상동 세포)이 필요합니다. 그러나 윤리적이고 실용적인 이유로 인해 특히 개발 중에 이러한 유사한 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)는 시험관 내에서 접근하기 어려운 세포 유형의 생성을 가능하게 하고5,6, 실험적으로 접근가능하며, 영장류 비교에 사용되어 왔다6,7,8,9,10,11,12,13,14.
iPSC를 생성하려면 다시 프로그래밍할 1차 셀을 획득해야 합니다. 소변에서 분리된 세포는 영장류로부터 비침습적으로 샘플링할 수 있고, 줄기세포와 유사한 분자 프로파일로 인해 쉽게 재프로그래밍할 수 있다는 장점이 있다15. 영장류 iPSC를 유지하기 위한 배양 조건은 재프로그래밍만큼 중요합니다. 일반적으로 인간 만능 줄기 세포의 배양에는 필수 영양소와 배아 줄기 세포(ESC)를 위한 스캐폴드를 제공하는 정의되지 않은 혈청 기반 배지와 마우스 배아 섬유아세포(소위 영양세포)의 공동 배양이 필요했습니다16. 화학적으로 정의되고 피더가 없는 배양 시스템(17,18)의 개발 이후, 현재 상업적으로 이용 가능한 iPSC 배양 배지 및 매트릭스의 다양한 옵션이 있습니다. 그러나 이러한 배양 조건의 대부분은 인간 ESC 및 iPSC에 최적화되어 있으므로 NHP iPSC 배양에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 소변 세포 배양에서 파생된 인간 및 NHP iPSC를 생성하고 유지하기 위한 지침을 제공합니다.
2006년 섬유아세포에서 정의된 인자의 강제 발현에 의한 iPSC 생성이 처음 보고된 이후, 이 방법은 다양한 기원의 다양한 세포 유형에 적용되었습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. 그 중에서도 소변 유래 세포만 완전히 비침습적으로 얻을 수 있습니다. 앞서 기술한 Zhou et al.33의 프로토콜에 따르면, 광범위한 항생제를 보충함으로써 비멸균 샘플에서도 영장류의 소변에서 세포를 분리하고 확장할 수 있다15. 특히, 이 프로토콜에 의해 샘플링된 소변 유래 세포는 섬유아세포의 기존 재프로그래밍(20-30일, 우리의 경험에서)보다 더 짧은 기간(콜로니가 5-15일 후에 볼 수 있음) 내에 iPSC를 생성할 수 있는 높은 잠재력을 나타내며 충분히 높은 성공률로 나타납니다. 이러한 소변 유래 세포는 중간엽 줄기세포 유사 세포와 방광 상피 세포의 혼합 집단으로 분류되어 높은 재프로그래밍 효율을 일으켰다(15).
1차 셀의 변화 외에도 iPSC를 생성하는 재프로그래밍 방법도 사용 목적에 따라 다릅니다. 인간 체세포에 대한 종래의 재프로그래밍 절차는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용한 재프로그래밍 인자의 과발현에 의해 수행되었으며, 이는 게놈 5,34,35에서 외인성 DNA의 통합을 허용하였다. 생성된 iPSC를 게놈적으로 온전하게 유지하기 위해 연구자들은 절제 가능한 PiggyBac 벡터 36,37, 에피솜 벡터38,39, 센다이 바이러스 40 및 아데노바이러스 41과 같은 비통합 바이러스 벡터, mRNA 형질감염 42, 단백질 형질감염 43,44 및 화학 화합물 처리 45. 효율성과 취급 용이성으로 인해 센다이 바이러스 기반 재프로그래밍 벡터가 이 프로토콜에 사용됩니다. 일차 세포의 감염은 플레이팅 전에 5의 감염 다중도(MOI)에서 세포 및 바이러스의 1시간 현탁 배양에서 수행됩니다. 이 변형된 단계는 바이러스가 부착된 세포 배양물에 직접 첨가되는 종래의 방법에 비해 세포 표면과 바이러스 사이의 접촉 가능성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 더 많은 iPSC 콜로니를 생성할 수 있다15.
인간 및 NHP 만능 줄기 세포의 계대는 덩어리 계대증 및 단세포 계대증에 의해 수행될 수 있습니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 칼슘과 마그네슘 이온을 결합하여 카데린과 인테그린의 부착 활성을 방지하는 비용 효율적인 킬레이트제입니다. EDTA는 또한 미분화 세포가 다른 접착 분자로 인해 분화 된 세포보다 먼저 분리되기 때문에 온화하고 선택적인 해리 시약으로 사용됩니다. 완전한 해리는 단백질 키나아제(Rho/Rock) 매개 미오신 과활성화를 포함하는 Rho/Rho 관련 코일 코일을 통해 영장류 iPSC의 대규모 세포 사멸을 유도합니다. 따라서 배양 배지에 Rho/Rock 억제제를 보충하는 것은 현탁액46,47의 단일 세포가 필요한 실험에 필수적입니다. 이 프로토콜에서는 일상적인 패시징 방법으로 덩어리 패시징을 권장하고 정의된 셀 번호의 시딩이 필요한 경우 또는 하위 클로닝 중에 필요한 경우에만 단일 셀 패시징을 권장합니다.
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Protocol
이 실험 절차는 인간 실험에 대한 책임 윤리 위원회(20-122, Ethikkommission LMU München)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
참고: 인간 및 NHP 샘플을 다루는 실험을 시작하기 전에 적절한 윤리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 모든 실험 절차는 관련 지침 및 규정에 따라 수행되어야 합니다. 다음 각 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 모든 완충액 및 배지 조성은 보충표 S1에서 찾을 수 있다. 셀에 첨가하기 전에 모든 배지를 실온(22°C)으로 예열해야 합니다. 각 원심분리 단계는 달리 언급되지 않는 한 실온에서 수행되어야 한다.
1. 소변 샘플에서 세포 분리
주의: 인간 기증자가 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV) 및 C형 간염 바이러스(HCV)가 없는지 확인하십시오. NHP의 경우 가능한 기증자/세포에 특정 병원체인 B 바이러스(BV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 유인원 베타레트로바이러스(SRV) 및 유인원 T 세포 림프친화성 바이러스(STLV)가 없는지 확인하십시오.
- 웰 당 0.2% 젤라틴 500μL를 첨가하여 젤라틴이 코팅된 12웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 움직여 액체를 분배한다. 필요하기 전에 최소 37°C에서 30분 동안 두십시오.
- 50mL 원뿔형 튜브에 사람의 소변 샘플을 수집합니다. 영장류의 경우 주사기로 동물 시설 바닥에서 소변을 채취하십시오.
참고: 5mL의 소변은 시도의 42%에서 적어도 하나의 콜로니를 분리하기에 충분한 것으로 입증되었습니다. 그러나 집락을 분리할 가능성을 높이려면 더 많은 양의 ~50mL의 소변을 사용하는 것이 좋습니다. NHP 소변은 가능한 한 신선하게, 가급적이면 배뇨 직후에 채취해야 합니다. 소변 샘플의 보관은 4°C에서 4시간 동안 프로토콜의 성공률에 부정적인 영향을 미치지 않았지만 더 긴 저장 시간은 테스트되지 않았습니다. - 소변 함유 튜브를 400 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 1mL를 남깁니다.
- 펠릿을 잔류 액체 1mL에 재현탁합니다. 여러 개의 소변 튜브가 수집 된 경우 하나의 튜브에 현탁액을 모으십시오.
- 2.5μg/mL 암포테리신이 포함된 10mL의 소변 세척 완충액( 보충 표 S1 참조)을 튜브에 추가하여 세포를 세척하고 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 조심스럽게 혼합합니다.
- 튜브를 200 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 <0.2 mL를 남깁니다.
- 초기에 처리된 소변 50mL당 0.5μg/mL 암포테리신을 함유한 1차 소변 배지 1mL( 보충 표 S1 참조)에 세포 펠릿을 재현탁합니다(50mL 미만의 소변이 처리된 경우에도 1mL로 재현탁).
- 웰로부터 젤라틴을 흡인하고(단계 1.1에서 제조됨), 단계 1.7로부터의 현탁액 1 mL를 12-웰 플레이트의 하나의 웰에 플레이트한다. 원하는만큼 우물에 대해 또는 사용 가능한만큼의 현탁액에 대해 반복하십시오.
선택 사항: 비위생적인 시료 채취로 인한 오염을 방지하려면 여기서부터 첫 번째 계대까지 100μg/mL 항균 시약을 세포에 추가합니다. - 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 넣는다.
- 기존 배지를 제거하지 않고 5일까지 매일 웰당 1mL의 1차 소변 배지를 추가합니다.
- 5일째에 플레이트에서 4mL의 배지를 흡인하고 약 1mL의 배지를 남깁니다. 웰당 1mL의 REMC 배지(보충 표 S1 참조)를 추가하여 새 배양 배지와 1:1 혼합물을 얻습니다.
- 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 매일 배지의 절반을 REMC 배지로 교체하십시오(그림 1A, B). 따라서 1mL의 오래된 배지를 제거하고 웰당 1mL의 신선한 REMC 배지를 추가합니다.
2. 비뇨기 세포의 확장
참고: 배양이 90% 밀도에 도달하기 전에 요로 세포 계대배양을 수행해야 합니다.
- 단계 1.1에 명시된 바와 같이 원하는 양의 젤라틴 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다.
- 기존 배지를 흡인하고 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS) 1mL를 첨가하여 세포를 세척합니다.
- DPBS를 흡인하고 DPBS로 희석된 0.5x 해리 효소 300μL를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
- 700 μL의 REMC 배지를 첨가하여 효소 반응을 중지시킨다. 세포가 단일 세포로 해리될 때까지 P1000 피펫을 사용하여 현탁액을 부드럽게 피펫팅합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 튜브를 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 REMC 배지 1mL에 재현탁합니다.
- 세포 계수기(혈구계 또는 자동 세포 계수기)를 사용하여 세포 수를 세십시오.
- 비뇨기 세포의 확장을 위해, 1mL의 REMC 배지에 1.5 × 10 내지 3 내지 104 세포를 0.2% 젤라틴으로 코팅된 하나의12-웰 플레이트에 넣× 플레이트.
- 배양이 80%-90% 밀도에 도달할 때까지 격일로 후속 배지 교체를 수행합니다. 따라서 기존 배지를 흡인하고 신선한 REMC 배지 1mL를 추가합니다.
3. 센다이 바이러스 벡터 감염에 의한 iPSC의 생성
알림: 재프로그래밍 절차의 워크플로는 그림 2A를 참조하십시오. 재 프로그래밍에 사용되는 비뇨기 세포는 가능한 한 젊어야하지만 4 번 통과 전에는 재 프로그래밍 효율의 현저한 손실이 관찰되지 않습니다. 센다이 바이러스 재프로그래밍 키트는 BL-2 시설에서 사용해야 합니다. 층류가 있는 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 바이러스를 처리하고 점막 노출을 방지하기 위해 항상 적절한 안전 장비를 사용하십시오.
- 웰 당 500 μL의 기저막 매트릭스를 첨가하여 기저막 매트릭스가 코팅된 12-웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 이동시켜 액체를 분배하였다. 플레이트를 37°C에서 최소 1시간 동안 인큐베이션하고, 기저막 매트릭스를 900μL의 REMC 배지로 교체한다. 사용할 때까지 플레이트를 37°C에서 보관하십시오.
- Sendai Reprogramming Kit의 구성 요소를 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다. 센다이 바이러스(polycistronic KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC 및 KLF4)를 MOI 5와 혼합하고 REMC 배지를 최대 100μL까지 추가합니다. 방정식 (1)을 사용하십시오.
참고: 바이러스 역가는 로트마다 다르므로 항상 제조업체에서 제공한 분석 인증서에서 역가를 확인하십시오.
선택 사항: 녹색 형광 단백질(GFP) 센다이 바이러스를 형질도입 효율에 대한 양성 대조군으로 추가로 사용합니다. 이를 위해 3.3 단계에서 별도의 튜브에 3.5 ×10 4 셀을 추가로 준비합니다. - 비뇨기 세포의 해리를 위해서는 2.2-2.4 단계를 따르십시오. 세포 계수기를 사용하여 세포를 세고 7 ×10 4 개의 소변 세포를 1.5mL 튜브에 옮깁니다.
- 튜브를 200× g 에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 3.2단계에서 제조된 SeV 혼합물 100μL에 펠렛을 재현탁합니다. 현탁액 감염을 위해 37°C에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다.
- 현탁액을 기저막 매트릭스로 코팅된 12-웰 플레이트 상에 플레이트하여 단계 3.1에서 제조하였다. 일상적으로, 플레이트 1 × 10 4 및 2.5 × 104 셀을 웰 당 이중으로 한다.
- 세포를 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다. 형질도입 후 24시간 및 3일째에 배지를 1mL의 신선한 REMC 배지로 교체합니다.
- 형질도입 후 5일째에 배지를 PSC 생성 배지로 변경하고(보충표 S1 참조), 이후 배지를 격일로 교체합니다. 따라서 기존 배지를 제거하고 웰당 1mL의 PSC 생성 배지를 추가합니다.
참고: 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 최대 15일이 소요될 수 있습니다. - 콜로니의 크기가 1mm를 초과할 때 개별 iPSC 콜로니를 선택합니다. 이렇게하려면 현미경으로 p10 피펫으로 단일 식민지를 긁어 내고 조심스럽게 수집하십시오. 콜로니를 750 μL의 PSC 배양 배지를 함유하는 기저막 매트릭스로 코팅된 12-웰 플레이트의 새로운 웰로 옮깁니다.
선택 사항: 채취 전에 플레이트를 DPBS로 헹구고 0.5mM EDTA로 1분 동안 처리하면 추가 단계의 강력한 배양을 지원할 수 있습니다. 세포가 나중에 출현하는 콜로니를 기다리기 위해 더 오래 배양되어야 하는 경우, 이 EDTA 처리 단계를 수행하지 마십시오. - 37°C 및 5%CO2 에서 세포를 성장시키고, 프로토콜의 섹션 4에 명시된 바와 같이, 격일로 후속 배지를 교체한다. 선택된 콜로니가 직경 2mm에 도달하면 프로토콜의 섹션 5에 설명된 대로 일상적인 iPSC 통과를 계속합니다.
4. 중간 변화
참고: 배양 배지는 콜로니가 계대배양을 할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 격일로 교체해야 합니다.
- 기존 배지를 흡인하고 12웰 플레이트당 750μL의 새로운 배지를 추가합니다. 다른 유형의 배지로 전환하려면 통과 후 최소 1일 후에 배지를 교체하십시오.
5. 패시징
참고: iPSC 콜로니가 충분히 커지거나(직경 > 2mm) 콜로니가 서로 접촉하려고 할 때 세포를 계대해야 합니다. 일반적으로 iPSC는 약 5일마다 분할할 수 있습니다. 일상적인 유지 관리에는 덩어리 계대 (5.1 단계)를 사용하고 정의 된 수의 세포가 필요한 실험에는 단일 세포 계대 (5.2 단계)를 사용합니다. iPSC가 많이 분화되는 경우 콜로니 피킹(5.3단계)이 배양의 순도를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 덩어리 패시징
- 웰 당 500 μL의 기저막 매트릭스를 첨가하여 기저막 매트릭스가 코팅된 12-웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 이동시켜 액체를 분배하였다. 플레이트를 37°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 기저막 매트릭스를 500 μL의 PSC 배양 배지로 교체하고 사용할 때까지 플레이트를 37°C에서 보관합니다.
- 배양된 세포로부터 배지를 흡인하고, 500 μL의 DPBS를 조심스럽게 첨가하여 세포를 세척한다. DPBS를 제거하고 500 μL의 0.5 mM EDTA를 웰에 첨가한다.
- 콜로니가 분리되기 시작할 때까지 RT에서 2-5분 동안 플레이트를 배양합니다. 현미경으로 세포를주의 깊게 관찰하십시오.
- 콜로니의 가장자리가 벗겨지기 시작하고 세포 사이의 틈이 보이기 시작하면(그림 3A) EDTA를 제거하고 DPBS 500μL를 조심스럽게 추가합니다.
알림: 플레이트에서 셀이 분리되지 않도록 항상 웰의 측벽에 피펫을 대고 셀에 직접 대지 마십시오. - DPBS를 흡인하고 p1000 피펫을 사용하여 500μL의 PSC 배양 배지로 웰을 플러시합니다. 콜로니를 적절한 크기의 덩어리로 분산시키기 위해 1x-5x 위아래로 피펫팅합니다(그림 3A). 피펫을 너무 많이 사용하지 마십시오.
알림: iPSC가 실수로 너무 많이 피펫팅된 경우 10μM의 Rock 억제제 Y-27632를 배지에 추가합니다. 이것은 iPSC가 단일 세포로 생존할 수 없기 때문에 생존을 향상시킬 수 있습니다. - 세포 덩어리 현탁액의 1/10-1/50을 새로운 웰로 옮깁니다. 비율은 분할 전 웰의 밀도, 시딩된 세포의 원하는 밀도 및 iPSC 클론 선호도에 따라 달라집니다.
- 접시를 앞뒤로 여러 번 부드럽게 움직여 덩어리를 우물에 고르게 분배하십시오. 덩어리가 부착되도록 37°C에서 최소 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 많은 부유 죽은 세포가 관찰되는 경우 배지를 750μL의 PSC 배양 배지로 교체하십시오. 그렇지 않으면 250 μL의 PSC 배양 배지를 추가합니다. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
참고: 30분 후 배지 교체는 특히 불안정한 세포주(예: NHP)의 경우 매우 중요합니다. - 식민지가 통과하기에 충분히 커질 때까지 2-3 일마다 배지를 교체하십시오. 중간 변경의 경우 프로토콜의 4단계를 수행합니다.
- 단일 셀 패시징
- PSC 배양 배지에 10 μM Y-27632를 첨가하여, 단계 5.1.1에 명시된 바와 같이 기저막 매트릭스-코팅된 배양 플레이트를 준비한다.
선택 사항: 민감한 세포주의 생존을 향상시키기 위해 계대시간 1-3시간 전에 세포에 10μM Y-27632를 추가합니다. - 배지를 흡인하고 500 μL의 DPBS를 첨가하여 세포를 세척한다. DPBS를 제거하고 300μL의 분리 용액을 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 37°C에서 5-10분 동안 인큐베이션합니다. 현미경으로 세포의 충분한 박리가 관찰되면 700μL의 PSC 배양 배지 또는 DPBS를 추가합니다.
- 세포가 단일 세포로 해리될 때까지 p1000 피펫을 사용하여 5-10배 위아래로 피펫팅합니다. 세포 손상을 방지하기 위해 피펫을 너무 많이 사용하지 마십시오.
- 세포 현탁액을 최소 2mL의 DPBS가 들어 있는 15mL 튜브로 옮겨 분리 용액을 희석합니다.
- 튜브를 200× g 에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 용액을 완전히 흡인합니다.
- 10μM Y-27632가 보충된 PSC 배양 배지 500μL에 펠렛을 재현탁합니다.
- 세포 및 시드 5,000-7,000 세포를 단계 5.2.1에서 제조된 기저막 매트릭스-코팅된 12-웰 플레이트 당 계수한다.
알림: 다른 셀 번호가 필요한 경우 그에 따라 더 크거나 작은 우물로 변경하십시오. - 플레이트를 37°C 및 5%CO2 에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하여 세포가 부착되게 한다.
- 많은 죽은 세포가 관찰되는 경우 배지를 750 μL의 PSC 배양 배지 + 10 μM Y-27632로 교체하십시오. 그렇지 않으면 250 μL + 10 μM Y-27632를 추가합니다.
참고: 이 단계는 특히 불안정한 세포주(예: NHP)의 경우 매우 중요합니다. - 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
- 배지를 Y-27632 없이 배양한 후 1 내지 2일 후에 PSC 배양 배지로 변경하여, 세포가 고전적인 콜로니 형태를 다시 나타낼 수 있도록 하였다(도 3B).
- 식민지가 충분히 커질 때까지 2 일마다 배지를 교체하십시오. 중간 변경의 경우 프로토콜의 섹션 4를 따르십시오.
- PSC 배양 배지에 10 μM Y-27632를 첨가하여, 단계 5.1.1에 명시된 바와 같이 기저막 매트릭스-코팅된 배양 플레이트를 준비한다.
- 콜로니 피킹에 의한 iPSC의 통과
- 5.1.1 단계에 명시된 대로 기저막 매트릭스 코팅된 12-웰을 준비합니다.
- 배지를 흡인하고 500 μL의 DPBS를 조심스럽게 첨가하여 세포를 세척한다. DPBS를 제거하고 500 μL의 0.5 mM EDTA를 웰에 첨가한다.
- RT에서 플레이트를 1-3 분 동안 배양하고 콜로니의 분리가 경계에서 보일 때까지 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
- EDTA를 제거하고 500 μL의 DPBS를 조심스럽게 첨가한다. 세포를 분리하지 않고 500μL의 PSC 배양 배지를 웰에 천천히 추가하기 전에 액체를 흡인합니다.
- p200 피펫을 사용하여 분화된 세포를 수집하지 않고 현미경으로 원하는 콜로니를 선택합니다. 이렇게하려면 세포가 들어있는 배지를 차지하면서 식민지를 부드럽게 긁습니다.
- 각각의 선택된 콜로니를 단계 5.3.1에서 제조된 바와 같이 하나의 기저막 매트릭스-코팅된 웰로 옮긴다. p1000 피펫을 사용하여 세포를 2-5배 피펫팅하여 세포를 작은 덩어리로 분리합니다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 30분 동안 인큐베이션하여 덩어리가 부착되도록 합니다.
- 많은 부유 죽은 세포가 관찰되는 경우 배지를 750μL의 PSC 배양 배지로 교체하십시오. 그렇지 않으면 250 μL의 PSC 배양 배지를 추가합니다.
참고: 30분 후 배지 교체는 특히 불안정한 세포주(예: NHP)의 경우 매우 중요합니다. - 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
- 식민지가 통과하기에 충분히 커질 때까지 2-3 일마다 배지를 교체하십시오. 이렇게 하려면 프로토콜의 섹션 4를 따릅니다.
6. 장기 보관을 위한 비뇨기 세포 및 iPSC의 동결
참고: 일반적으로 iPSC는 계수 없이 세포 동결 배지에서 덩어리로 동결됩니다. 단일 세포로의 해리를 피하기 위해 피펫팅을 최소화해야 합니다. 비뇨기 세포의 경우, 관당 1.5 ×10 4 내지 3 × 104 개의 세포가 동결되어, 사용자가 다른 계수 단계 없이 12웰 플레이트의 한 웰에서 직접 하나의 튜브를 해동할 수 있습니다.
- 15mL 튜브에 5mL의 DPBS를 준비합니다.
- 비뇨기 세포의 동결을 위해서는 프로토콜의 2.2-2.4 단계를 따르십시오. iPSC를 동결하려면 덩어리 통과 프로토콜의 5.1.2-5.1.5단계를 따르십시오.
- 현탁액을 단계 6.1에서 제조된 15 mL 튜브로 옮긴다. 비뇨기 세포의 동결을 위해, hemocytometer를 사용하여 세포 현탁액의 10 μL를 세십시오. 세포를 200 × g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 완전히 흡인합니다.
- 튜브당 400μL의 세포 동결 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 원하는 양의 cryotube에 세포를 분배합니다.
- cryotube를 즉시 -80 °C로 옮깁니다. 장기간 보관을 위해 -80°C에서 냉동한 후 1일 후에 냉동된 튜브를 -150°C 냉동고 또는 액체 질소로 옮깁니다.
7. 비뇨기 세포 및 iPSC의 해동
- 비뇨기 세포의 해동을 위해, 프로토콜의 1.1 단계에 명시된 바와 같이, 원하는 양의 젤라틴-코팅된 12-웰을 준비한다. iPSC의 경우, 5.1.1 단계에 명시된 바와 같이 기저막 매트릭스 코팅된 12웰 플레이트를 준비한다. 두 경우 모두 매트릭스를 매체와 교환하지 마십시오.
- 4 mL의 DPBS가 들어있는 15 mL 튜브를 준비하고, 37 °C에서 보관한다.
- 떠 다니는 얼음 조각이 보일 때까지 해동을 위해 냉동 된 세포 바이알을 37 °C 수조에 빠르게 놓습니다.
알림: 오염을 방지하기 위해 수조에서 배양하기 전후에 에탄올로 cryotube를 닦으십시오. - 얼음 함유 현탁액에 비뇨기 세포용 REMC 배지 500μL 또는 iPSC용 PSC 배양 배지 500μL를 추가하고 즉시 현탁액을 단계 7.2에서 제조된 예열된 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 튜브를 200 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 완전히 버립니다.
- 비뇨기 세포의 경우 펠릿을 1mL의 REMC 배지에 재현탁합니다. iPSC의 경우 펠렛을 750μL의 PSC 배양 배지에 조심스럽게 재현탁합니다. 덩어리를 온전하게 유지하기 위해 피펫팅을 너무 많이 하지 마십시오.
선택 사항: 배지에 10μM Y-27632를 보충하면 해동 후 iPSC의 생존을 지원할 수 있습니다. - 단계 7.1에서 제조된 12-웰 플레이트로부터 매트릭스를 흡인하고, 세포 현탁액을 웰로 조심스럽게 옮긴다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 놓는다.
- 다음날 배지를 PSC 배양 배지로 교체하고 iPSC의 경우 Y-27632가 없고 비뇨기 세포의 경우 REMC로 교체합니다.
- 세포를 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2 에서 성장시킨다.
- 세포가 계대 배양을 위해 충분히 커질 때까지 2-3 일마다 배지를 교체하십시오. 중간 변경의 경우 프로토콜의 섹션 4를 따르십시오.
8. 면역세포화학
참고: NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 및 EpCAM과 같은 만능 관련 마커를 표적으로 하는 항체를 사용한 면역염색은 새로 생성된 iPSC에서 가장 널리 사용되는 검증 중 하나입니다. 항체 및 희석액에 대한 추가 정보는 물질 표에서 찾을 수 있습니다.
- 적절한 수의 12웰 플레이트에 사용하기 1-3일 전에 iPSC를 플레이트합니다. 배지를 흡인하고, 500 μL의 DPBS를 첨가하여 세포를 세척하고, DPBS를 제거한다. 웰당 400μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가하고 RT에서 15분 동안 세포를 고정합니다.
- 4% PFA를 제거하고, 세포를 DPBS로 3배 세척한다. 웰 당 400 μL의 블로킹 완충액을 첨가하고, 플레이트를 RT에서 30 분 동안 인큐베이션한다.
- 차단 완충액을 흡인하고 400μL의 항체 희석 완충액(ADB)에 희석된 항체를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 1차 항체를 함유하는 ADB를 제거하고, 세포를 DPBS로 3배 세척한다.
- DPBS를 흡인하고 웰당 ADB에 희석된 400μL의 2차 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
- ADB를 제거하고 DPBS로 세포를 3배 세척합니다. 웰당 DPBS에 희석된 1μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 추가하고 RT에서 3분 동안 배양합니다.
- DAPI 용액을 흡인하고 DPBS로 세포를 3배 세척합니다. 이미징을 위해 500μL의 DPBS를 추가합니다.
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Representative Results
인간 및 NHP 소변에서 세포를 분리할 때 분리 직후 다양한 유형의 세포를 식별할 수 있습니다. 편평 세포와 다양한 작은 원형 세포가 소변과 함께 배설됩니다. 여성의 소변은 남성의 소변보다 훨씬 더 많은 편평 세포를 함유하고 있습니다(그림 1B - 0일; 보충 그림 S1). 1차 소변 배지에서 5일 동안 배양한 후 첫 번째 부착성 증식 세포를 볼 수 있습니다(그림 1A, B - 5일). 이 시점에서, 배지의 절반은 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 매일 REMC 증식 배지로 대체된다. 대략 13일째에, 부착 세포는 계대배양될 수 있는 큰 콜로니로 성장한다(도 1B - 13일째). 이러한 콜로니는 형태학적으로 구별되는 두 가지 세포 유형으로 형성될 수 있는데, 하나는 세포가 밀접하게 부착되어 성장하는 상피와 유사한 표현형을 가지며, 다른 하나는 길쭉한 모양과 더 높은 이동 능력을 가진 더 중간엽과 유사한 형태를 나타냅니다(그림 1C). 첫 번째 계대 후, 비뇨기 세포는 단층으로 성장하고, 배양이 80 % 밀도에 도달하면 계대 될 수 있습니다 (그림 1B - 17 일).
그림 1: 비뇨기 세포의 분리 및 배양 . (A) 인간 및 비인간 영장류 샘플에서 비뇨기 세포를 확립하기 위한 워크플로우. (B) 첫 번째 계대(p1)까지 비뇨기 세포의 성장 및 집락 형성을 보여주는 위상차 이미지. (C) 소변 샘플로부터 분리된 두 가지 상이한 세포 유형은 배양 2주 후에 구별될 수 있다. 스케일 바 = 250 μm (B,C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비뇨기 세포에서 iPSC를 생성하기 위해 Yamanaka 인자 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 도입하는 센다이 바이러스로 형질도입이 사용됩니다. 형질도입 효율을 높이기 위해 비뇨기 세포를 현탁액에서 1시간 동안 바이러스와 함께 배양한 후 기저막 매트릭스 코팅 웰에 파종합니다(그림 2A). 일부 부착 세포는 형질 도입 후 1 일 후에 웰에서 볼 수 있습니다 (그림 2B - 1 일). 5-10 일 후,이 세포들은 콜로니를 형성하기 시작하고, 세포의 재 프로그래밍을 나타내는 초기 형태 학적 변화가 관찰 될 수 있습니다 (그림 2B - 14 일). 이러한 콜로니의 대부분은 점진적으로 ESC와 유사한 형태를 나타내며 직경이 1mm를 초과할 때 PSC 배양 배지에서 채취할 수 있습니다. 채취 후, 세포는 약 4일 이내에 전형적인 ESC 형태를 나타내는 콜로니를 형성합니다(그림 2B - 21일 및 24일). iPSC 콜로니가 충분히 커지면 덩어리 계대 프로토콜(프로토콜 단계 5.1)을 사용하여 처음으로 세포를 계대할 수 있습니다.
이 재프로그래밍 접근법은 인간, 고릴라 고릴라(고릴라) 및 퐁고 아벨리(오랑우탄)15에서 iPSC를 생성하는 데 사용되었습니다. 비뇨기 세포를 얻을 확률은 매우 다양하고 침팬지가 인간보다 적어도 2-3배 낮지만15, 얻은 비뇨기 세포의 재프로그래밍은 우리의 경험에서 대부분 성공적이었다. 일반적으로, 감염된 요로 세포의 0.19%는 배아줄기세포와 유사한 형태를 가진 콜로니를 생성하며, 그 결과 재프로그래밍 시도의 87%에서 적어도 하나의 콜로니가 발생한다15. 생성된 모든 iPSC는 동일한 특성을 공유하며 가장자리가 명확하게 정의된 촘촘하게 채워진 세포를 특징으로 하는 전형적인 ESC 유사 콜로니 형태를 보여줍니다(그림 2C). 또한, 모든 iPSC는 정상적인 핵형을 나타내며, SeV 재프로그래밍 벡터의 부재는 SeV 재프로그래밍 키트 제조업체(데이터는 표시되지 않음)15에서 권장하는 대로 최소 5회 계대 후 PCR에 의해 확인되었습니다. 면역세포화학은 NANOG, OCT3/4 및 SOX2와 같은 핵에서 만능 관련 단백질의 발현을 테스트하는 데 사용됩니다. TRA-1-60, EpCAM 및 SSEA4와 같은 표면 마커도 사용할 수 있습니다(그림 2D). 그러나, SSEA4는 또한 요로 세포에서도 발현된다15. 또한, 유세포 분석은 iPSCs의 다능성 상태에 대한 정량적 정보를 제공하기 위해 이러한 표면 마커를 사용하여 수행될 수 있다(Ohnuki et al.48에 의해 기술된 방법). 이 접근법은 분석된 오랑우탄 iPSC의 95.3%가 TRA-1-60에 양성임을 보여주기 위해 사용됩니다(그림 2E). 또한, NHP iPSC의 분화 능력은 시험관 내 배아체(EB) 분화를 통해 입증될 수 있습니다(Geuder et al.15에 의해 기술된 방법). 그림 2F에서 볼 수 있듯이 고릴라 iPSC는 내배엽(ɑ-태아단백), 중배엽(ɑ-평활근 액틴) 및 외배엽(β-III 튜불린) 계통으로 분화할 수 있습니다.
그림 2: 소변 유래 iPSC의 생성 및 특성화. (A) 소변 유래 세포의 재프로그래밍 워크플로. (B) iPSC 콜로니가 형성될 때까지 재프로그래밍하는 동안 고릴라 비뇨기 세포의 형태학적 변화를 보여주는 위상차 이미지. 스케일 바 = 500 μm. (C) 인간, 고릴라 및 오랑우탄 세포 배양에서 확립된 iPSC 콜로니의 형태. 스케일 바 = 500 μm. (D) 통과 8에서 만능 관련 마커가 있는 고릴라 iPSC의 면역형광 염색: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM 및 TRA-1-60. 스케일 바 = 100 μm. (E) 항-TRA-1-60-PE로 염색된 오랑우탄 iPSC의 유세포 분석 염색되지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. (F) 고릴라 iPSC의 배아체 분화 후 내배엽(AFP), 중배엽(ɑ-SMA) 및 외배엽(β-III TUB)의 면역형광 분석. 핵은 DAPI로 대조염색되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: iPSCs = 유도만능줄기세포; PE = 피코에리트린; AFP = α태아단백; ɑ-SMA = 알파 평활근 액틴; β-III TUB = 베타 III 튜불린; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
iPSC 콜로니가 직경이 약 2mm에 도달하거나 서로 닿으려고 하면 세포가 분할되어야 합니다. 일상적인 유지 관리를 위해 덩어리 통과 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서, 0.5 mM EDTA는 콜로니 크기에 따라 3-5분 동안 세포를 분리하기 위해 사용된다. EDTA 배양 중에 콜로니의 경계가 벗겨지기 시작하고 세포 사이에 눈에 보이는 간격이 나타납니다(그림 3A). EDTA는 현미경으로 적절한 박리가 관찰될 때 제거되어야 합니다. EDTA로 장기간 배양하면 생존 할 수없는 단일 세포의 비율이 높아집니다. 다음으로, 세포는 그림 3A와 같이 유사한 크기의 덩어리로 해리되어야 합니다. 세포는 생존을 감소시키고 더 많은 분화 세포로 이어질 수 있으므로 작은 덩어리로 해리되어서는 안됩니다.
실험에서 정의된 수의 세포를 시딩해야 하는 경우 단일 세포 계대 프로토콜을 사용해야 합니다. 이 프로토콜에는 단일 세포가 생존할 수 있도록 하는 Rock 억제제로 배지를 보충하는 것이 포함됩니다. 부착된 단일 세포는 덩어리 파종 후 콜로니에서 성장하는 세포와 비교하여 다른 형태를 보일 것으로 예상됩니다(그림 3B - 0일). 배양 1-2일 후, Rock 억제제를 배지에 첨가하면 단일 세포가 다시 콜로니로 성장하기 시작하며, 형태와 느슨한 세포-세포 접촉을 보존합니다(그림 3B - 2일차). 이러한 작은 콜로니가 관찰되면 Rock 억제제를 배지에서 제거하여 세포가 전형적인 ESC 유사 형태를 다시 나타낼 수 있도록 해야 합니다(그림 3B - 4일차).
iPSC 콜로니의 품질이 높은지 판단하려면 몇 가지 측면을 고려해야 합니다. 첫째, 건강한 식민지가 자발적인 분화를 전혀 또는 소량 보이는 것은 정상입니다. 그러나 분화된 세포의 수가 증가하면(>10%) iPSC 품질이 좋지 않음을 나타냅니다. 낮은 iPSC 품질의 또 다른 특징은 경계 무결성 및 균일성의 손실(그림 3C: 오른쪽)과 셀 사이에 눈에 띄는 간격이 있는 느슨한 세포 패키징(그림 3D: 오른쪽)입니다. 대조적으로, 고품질 iPSC는 정의된 경계, 촘촘한 세포 패키징 및 두드러진 핵소체가 특징입니다(그림 3C, D: 왼쪽 이미지).
그림 3: 영장류 iPSC 배양. (A) 덩어리 계대 프로토콜에 따른 EDTA 배양 중 iPSC 콜로니의 분리와 해리 후 최적의 덩어리 크기를 보여주는 위상차 이미지. 스케일 바 = 250 μm. (B) 단일 세포 계대 후 iPSC 회복 타임라인. 락 억제제 Y-27632는 2일째부터 제거되었습니다. 스케일 바 = 250 μm. (C) 왼쪽: 정의된 경계가 있는 고품질 인간 iPSC 콜로니의 예. 오른쪽: 경계 무결성이 낮고 세포가 분화되지 않은 품질이 낮은 군체의 예. 스케일 바 = 500 μm. (D) 느슨하게 채워진 세포가 있는 저품질 콜로니(오른쪽)와 비교한 고품질 인간 iPSC 콜로니(왼쪽)의 예 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 약어: iPSCs = 유도만능줄기세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 인간 소변에서 발견되는 세포 유형의 개요. (A) 여성의 소변에서 분리된 세포. (B) 남성 소변에서 분리된 세포. 스케일 바 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충표 S1: 본 연구에 사용된 완충액 및 배지 조성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
iPSC는 시험관 내에서 접근할 수 없는 세포 유형을 생성할 수 있기 때문에 가치 있는 세포 유형입니다. 재프로그래밍을 위한 출발 물질로서, 예를 들어, 섬유아세포는 모든 영장류 종에서 쉽게 구할 수 있는 것은 아니지만, 이 논문은 소변 유래 세포에서 iPSC를 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 세포는 배양 배지에 광범위한 항생제를 보충하여 비멸균 영장류 소변 샘플에서도 비침습적 방식으로 얻을 수 있습니다.
프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 추가 논의가 필요합니다. 첫째, 비멸균 소변에서 세포를 분리할 때 오염 위험을 줄이기 위해 광범위한 항균 시약으로 배지를 보충하는 것이 중요합니다. 항생제 사용에도 불구하고 미생물 오염의 증가가 명백 해지면 전체 배양 물을 버리고 해당 지역을 소독하는 것이 좋습니다. 또한, 우리의 경험에 따르면, 지속적인 배양은 건강하게 성장하는 요 세포를 생성하지 않습니다. 둘째, 세포 재프로그래밍을 시작할 때 과잉 밀도로 인한 모든 세포의 분리 위험을 피하고 iPSC 획득 확률을 높이기 위해 SeV 형질도입 세포 수가 다른 여러 접시를 준비하는 것이 좋습니다. 일반적으로 더 높은 밀도의 SeV-형질도입된 세포를 도금하면 더 많은 재프로그래밍된 iPSC 콜로니가 생성될 것으로 예상되는 반면, ~20일 동안 재프로그래밍된 세포를 배양하면 종종 과잉 밀도가 발생하고 전체 웰이 분리됩니다. 셋째, iPSC의 해리가 필요한 각 단계에서 심각한 세포 사멸을 초래하는 광범위한 피펫팅을 피하는 것이 중요합니다. 특히 덩어리 패시징을 수행할 때 덩어리를 적절한 크기로 유지하는 것이 중요합니다(그림 3A). 너무 큰 덩어리는 빠른 분화로 이어질 수 있고, 너무 작은 덩어리는 생존을 감소시킬 수 있습니다.
우리는 요로 세포를 얻을 확률이 샘플과 부분 표본 사이에서 매우 다양하다는 것을 관찰했지만, 더 작은 부피가 콜로니를 얻는 데 더 낮은 성공률을 갖는다는 증거는 발견하지 못했습니다. 일반적으로 우리는 100mL의 인간 소변에서 평균 7.6개의 콜로니를 분리했습니다. 이 평균 비율과 푸아송 분포를 가정하면 적어도 하나의 콜로니를 얻는 것은 50mL의 경우 ~98%, 5mL의 출발 물질에 대해 ~30%의 확률을 갖습니다. 우리의 경우, 시도15의 42 %에서 5 mL의 인간 소변에서 적어도 하나의 식민지를 분리하는 것이 가능했습니다. 이를 바탕으로, 소량의 소변 만 사용할 수 있더라도 식민지의 격리는 여전히 시도해 볼 가치가 있습니다. 비뇨기 세포의 재프로그래밍이 실패하고 iPSC 콜로니가 관찰되지 않는 경우, 다른 수의 형질주입된 세포를 도금하면 소변 유래 세포가 재프로그래밍될 수 있습니다. 신흥 iPSC 콜로니는 표면 마커(예: TRA-1-60 또는 알칼리성 포스파타제[AP]; 데이터는 표시되지 않음)를 사용하여 살아있는 염색에 의해 iPSC로 식별될 수도 있습니다. AP 활성은 만능 줄기 세포에서 상향 조절되는 것으로 알려져 있으며, 배양 과정에서 줄기 세포를 일시적으로 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 또 다른 가능한 함정은 NHP iPSC의 최적 배양입니다. 이 프로토콜을 사용하여 인간 및 NHP iPSC가 상업적으로 이용 가능한 배지를 사용하여 50개 이상의 계대 동안 만능 상태를 유지함을 확인했습니다. 그러나 인간 iPSC와 비교할 때 NHP iPSC는 NHP 배양이 아닌 인간에 최적화된 배양 조건으로 인해 잠재적으로 우리의 경험에서 자발적으로 차별화되는 경향이 있습니다. 또한, iPSC 클론 간에는 도금 후 생존율, 성장 속도 및 분화 경향에 큰 차이가 있습니다. 따라서 각 클론에 대해 개별적으로 최적의 분할 비율, 통과 타이밍 및 덩어리 크기를 결정해야 하는 경우가 많습니다.
우리는 5mL의 부피로도 NHP로부터 요로 세포를 분리하기에 충분할 수 있음을 입증했습니다15. 그러나 인간, 고릴라, 오랑우탄에서 분리된 요로 세포의 수에는 큰 차이가 없었지만 침팬지는 총 87mL에서 요 세포를 분리할 수 없었기 때문에 비율이 더 낮았습니다. 따라서 일부 종의 경우 다른 종보다 훨씬 더 많은 소변을 수집해야 할 수도 있습니다. 작은 영장류에서 많은 양을 수집하는 것은 특히 어려울 수 있지만 요로 세포의 분리는 상당히 비용 효율적이므로 특정 종과 사용 가능한 양의 소변에 대해 시도하는 것이 실용적입니다. 불행히도 소변 샘플은 동결될 수 없으므로 샘플을 수집할 수 있는 반경이 제한됩니다. 그러나 4°C에서 4시간의 보관 시간은 분리된15개의 콜로니 수에 영향을 미치지 않으며 더 긴 보관 시간이나 보관 조건 개선이 가능할 수 있음을 보여주었습니다. 검증을 위해 여러 유형의 품질 관리 테스트를 도입했습니다. 그러나, iPSC 계통이 이러한 기준을 만족하더라도, 클론 이질성은 여전히 상당하며, 이는 유전적 배경(49) 및 후성유전학적 상태(50,51,52,53,54)에 의해 설명되었다. 영장류 iPSC를 향후 비교 분석에 적용하려면 이질성을 고려하고 클론 변이를 평균화하기에 충분한 클론을 사용하여 결과의 오해를 피해야 합니다.
그럼에도 불구하고, 일차 세포의 공급원으로서 소변의 사용은 완전히 비침습적으로 수득될 수 있기 때문에, 예를 들어, 재프로그래밍을 위한 섬유아세포를 사용하는 종래의 방법에 비해 주요한 이점을 갖는다. 또한, 이 프로토콜은 기존의 재프로그래밍보다 짧은 기간으로 소변 유래 세포에서 iPSC를 생성할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 식민지가 5-15 일 이내에 보이는 반면, 영장류 섬유 아세포 (붉은털, 개코 원숭이)의 식민지는 20-30 일 후에 나타나는 경향이 있음을 발견했습니다. 또한, 이 현탁 감염 방법을 사용하여 0.19%의 바이러스 형질도입 세포가 만능 세포 유사 형태를 가진 콜로니를 생성했습니다. 그 결과 시도15 중 87 %에서 적어도 하나의 식민지가 발생했습니다. 이에 비해 부착된 세포를 사용한 SeV의 기존 형질도입 방법과 에피솜 플라스미드를 사용한 리포펙션은 각각 0.09% 및 0.009%의 세포가 만능 콜로니를 형성하여 상당히 낮은 재프로그래밍 효율을 갖는 것으로 나타났습니다15.
요약하면, 이 방법을 사용하면 비침습적으로 비뇨기 세포를 분리하고 거의 모든 인간 기증자와 많은 NHP로부터 피더가 없는 iPSC를 생성할 수 있습니다. 이는 이러한 iPSC와 구별할 수 있는 귀중한 세포 유형에 대한 접근성을 높입니다. 또한, 이 방법은 질병 모델링 또는 미래의 세포 기반 치료에 사용될 수 있는 환자 특이적 iPSC를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, iPSC는 소량의 소변에서만 생성될 수 있기 때문에 이 방법은 더 많은 다른 영장류 또는 포유류 종에 적용할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 인간 특이적 형질의 진화를 더 잘 이해할 수 있는 종 간 비교를 위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 DFG EN 1093/5-1(프로젝트 번호 458247426)의 지원을 받았습니다. M.O.는 JSPS Overseas Research Fellowship의 지원을 받았습니다. 모든 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 유세포 분석은 뮌헨 생물 의학 센터의 핵심 시설 유세포 분석의 도움으로 수행되었습니다. 비디오 촬영을 지원해 주신 교토 대학 ASHBi의 Makoto Shida와 Tomoyo Muto에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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