Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera, expandera och omprogrammera humana och icke-mänskliga urinceller från primater till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), samt instruktioner för matarfritt underhåll av de nyligen genererade iPSC.
Abstract
Artöverskridande tillvägagångssätt som studerar primatpluripotenta stamceller och deras derivat är avgörande för att bättre förstå de molekylära och cellulära mekanismerna för sjukdom, utveckling och evolution. För att göra primatinducerade pluripotenta stamceller (iPSC) mer tillgängliga presenterar denna artikel en icke-invasiv metod för att generera humana och icke-mänskliga primat-iPSC från urinhärledda celler och deras underhåll med hjälp av en matarfri odlingsmetod.
Urinen kan provtas från en icke-steril miljö (t.ex. djurets bur) och behandlas med en bredspektrum antibiotikacocktail under primär cellodling för att effektivt minska kontaminering. Efter förökning av de urinhärledda cellerna genereras iPSC genom en modifierad transduktionsmetod av ett kommersiellt tillgängligt Sendai-virusvektorsystem. De första iPSC-kolonierna kan vara synliga efter 5 dagar och kan plockas tidigast efter 10 dagar. Rutinmässig klumppassaging med enzymfri dissociationsbuffert stöder pluripotens hos de genererade iPSC: erna i mer än 50 passager.
Introduction
Genomiska jämförelser av mänskliga och icke-mänskliga primater (NHP) är avgörande för att förstå vår evolutionära historia och utvecklingen av människospecifika egenskaper1. Dessutom möjliggör dessa jämförelser inferens av funktion genom att identifiera bevarade DNA-sekvenser2, t.ex. för att prioritera sjukdomsassocierade varianter3. Jämförelser av molekylära fenotyper såsom genuttrycksnivåer är avgörande för att bättre tolka genomiska jämförelser och för att upptäcka till exempel cellulära fenotypiska skillnader. Dessutom har de - i likhet med jämförelser på DNA-nivå - potential att härleda funktionell relevans och därmed bättre tolka medicinskt relevant variation inom människor4. Införlivandet av omfattande molekylära fenotypiska data i dessa jämförande studier kräver lämpliga biologiska resurser (dvs. ortologa celler över arter). Etiska och praktiska skäl gör det dock svårt eller omöjligt att få tillgång till sådana jämförbara celler, särskilt under utvecklingen. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) möjliggör generering av sådana otillgängliga celltyper in vitro5,6, är experimentellt tillgängliga och har använts för primatjämförelser 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
För att generera iPSC måste man förvärva de primära cellerna som ska omprogrammeras. Celler isolerade från urin har fördelen att de kan provtas icke-invasivt från primater och att de lätt kan omprogrammeras, troligen på grund av deras stamcellsliknande molekylära profiler15. Odlingsförhållandena för att upprätthålla primat-iPSC är lika viktiga som omprogrammering; Klassiskt krävde odling av humana pluripotenta stamceller ett odefinierat, serumbaserat medium och samodling av musembryonala fibroblaster – så kallade matarceller – som tillhandahåller viktiga näringsämnen och en byggnadsställning för embryonala stamceller (ESC)16. Sedan utvecklingen av kemiskt definierade och matarfria odlingssystem17,18 finns det nu olika alternativ för kommersiellt tillgängliga iPSC-odlingsmedier och matriser. De flesta av dessa odlingsförhållanden har dock optimerats för humana ESC och iPSC, och kan därför fungera mindre bra i NHP iPSC-kulturen. I detta videoprotokoll tillhandahåller vi instruktioner för att generera och underhålla humana och NHP iPSC härledda från urincellsodling.
Sedan den första rapporten om iPSC-generering genom tvångsuttryck av definierade faktorer i fibroblaster 2006 har denna metod tillämpats på många olika celltyper av olika ursprung 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Bland dem kan endast urin-härledda celler erhållas på ett helt icke-invasivt sätt. Baserat på det tidigare beskrivna protokollet av Zhou et al.33 kan man isolera och expandera celler från primaturin även från icke-sterila prover, genom att komplettera bredspektrumantibiotika15. I synnerhet uppvisar urin-härledda celler som provtas av detta protokoll en hög potential att producera iPSCs, inom en kortare tidsperiod (kolonier blir synliga inom 5-15 dagar) än den konventionella omprogrammeringen av fibroblaster (20-30 dagar, enligt vår erfarenhet), och med en tillräckligt hög framgångsgrad. Dessa urin-härledda celler klassificerades som den blandade populationen av mesenkymala stamcellsliknande celler och blåsepitelceller, vilket orsakade den höga omprogrammeringseffektiviteten15.
Förutom variationen i primära celler varierar omprogrammeringsmetoderna för att generera iPSC också beroende på användningsändamålet. Konventionella omprogrammeringsprocedurer för humana somatiska celler utfördes genom överuttryck av omprogrammeringsfaktorer med retrovirus- eller lentivirusvektorer, vilket möjliggjorde integrationen av exogent DNA i genomet 5,34,35. För att hålla de genererade iPSC: erna genomiskt intakta har forskare utvecklat ett brett utbud av icke-integrationssystem - punktskattepliktig PiggyBac-vektor 36,37, episomal vektor38,39, icke-integrerande virusvektorer såsom Sendai-virus 40 och adenovirus 41, mRNA-transfektion 42, proteintransfektion 43,44 och kemisk föreningsbehandling 45. På grund av effektiviteten och enkel hantering används Sendai-virusbaserade omprogrammeringsvektorer i detta protokoll. Infektion av primära celler utförs i en 1 h suspensionskultur av celler och virus vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 5 före plätering. Detta modifierade steg kan öka sannolikheten för kontakt mellan cellytor och virus, jämfört med den konventionella metoden där virusen tillsätts direkt till den vidhäftande cellkulturen, och därmed ge fler iPSC-kolonier15.
Passaging av humana och NHP pluripotenta stamceller kan göras genom klumppassaging och single-cell passaging. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) är ett kostnadseffektivt kelatbildare som binder kalcium- och magnesiumjoner och därmed förhindrar vidhäftande aktivitet av kadherin och integrin. EDTA används också som ett mildt, selektivt dissociationsreagens, eftersom odifferentierade celler lossnar före differentierade celler på grund av deras olika vidhäftningsmolekyler. Fullständig dissociation inducerar massiv celldöd hos primat-iPSC via Rho/Rho-associerad spole innehållande proteinkinas (Rho/Rock)-medierad myosinhyperaktivering. Därför är det viktigt att komplettera odlingsmediet med en Rho / Rock-hämmare för experiment som kräver enstaka celler i suspension46,47. I detta protokoll rekommenderar vi klumppassaging som rutinpasseringsmetod och rekommenderar encellspassaging endast när det är nödvändigt, t.ex. när seeding av definierade cellnummer krävs, eller under subkloning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta experimentella förfarande godkändes av den ansvariga etiska kommittén för mänskliga experiment (20-122, Ethikkommission LMU München). Alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter.
OBS: Godkännande måste erhållas från lämplig etisk kommitté innan försök som behandlar human- och NHP-prover påbörjas. Alla försöksförsök ska utföras i enlighet med gällande riktlinjer och föreskrifter. Var och en av följande steg bör utföras med steril teknik i ett biologiskt säkerhetsskåp. Alla buffert- och mediekompositioner finns i tilläggstabell S1. Se till att alla medier värms upp till rumstemperatur (22 °C) innan de tillsätts cellerna. Varje centrifugeringssteg bör utföras vid rumstemperatur, om inte annat anges.
1. Isolering av celler från urinprover
VARNING: Se till att mänskliga givare är fria från humant immunbristvirus (HIV), hepatit B-virus (HBV) och hepatit C-virus (HCV). För NHP, se till att de möjliga givarna / cellerna är fria från specifika patogener-B-virus (BV), Simian Immunodeficiency Virus (SIV), Simian Betaretrovirus (SRV) och Simian T Cell Lymphotropic Virus (STLV).
- Förbered en gelatinbelagd platta med 12 brunnar genom att tillsätta 500 μL 0,2% gelatin per brunn och fördela vätskan genom att flytta plattan. Placera vid 37 °C i minst 30 minuter innan det behövs.
- Samla humana urinprover i 50 ml koniska rör. För primater, samla urin från golvet i djuranläggningen med en spruta.
OBS: En volym på 5 ml urin visade sig vara tillräcklig för att isolera minst en koloni i 42% av försöken. Emellertid, med hjälp av en högre volym av ~ 50 ml urin rekommenderas för att öka risken för att isolera kolonier. NHP urin bör provtas så färskt som möjligt, helst omedelbart efter urinering. Förvaring av urinprover vid 4 °C i 4 timmar hade ingen negativ effekt på protokollets framgångsgrad, men längre lagringstider testades inte. - Centrifugera det urininnehållande röret vid 400 × g i 10 minuter och aspirera försiktigt supernatanten och lämna cirka 1 ml i röret.
- Återsuspendera pelleten i resterande 1 ml vätska. Slå samman suspensionerna i ett rör om flera urinrör samlades in.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 10 ml urintvättsbuffert (se kompletterande tabell S1) innehållande 2,5 μg/ml amfotericin till tuben och blanda försiktigt suspensionen med en serologisk pipett.
- Centrifugera röret vid 200 × g i 10 minuter och aspirera försiktigt supernatanten och lämna cirka <0,2 ml i röret.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml primärt urinmedium (se kompletterande tabell S1) innehållande 0,5 μg/ml amfotericin per 50 ml initialt bearbetad urin (resuspendera i 1 ml, även om mindre än 50 ml urin bearbetades).
- Aspirera gelatin från brunnarna (beredd i steg 1.1) och platta 1 ml av suspensionen från steg 1.7 i en brunn på en 12-brunnsplatta. Upprepa för så många brunnar som önskas, eller för så många mililiter suspension som finns tillgänglig.
Valfritt: För att undvika kontaminering som härrör från ohälsosam provinsamling, tillsätt 100 μg / ml antimikrobiellt reagens till cellerna härifrån tills den första passagen. - Placera plattan i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Tillsätt 1 ml primärt urinmedium per brunn dagligen fram till dag 5, utan att ta bort det befintliga mediet.
- På dag 5, aspirera 4 ml medium från plattan och lämna cirka 1 ml medium. Tillsätt 1 ml REMC-medium (se kompletterande tabell S1) per brunn för att få en 1:1-blandning med det nya odlingsmediet.
- Byt ut hälften av mediet mot REMC-mediet varje dag tills de första kolonierna visas (figur 1A, B). Ta därför bort 1 ml gammalt medium och tillsätt 1 ml färskt REMC-medium per brunn.
2. Expansion av urinceller
OBS: Urincellspassaging bör utföras innan kulturen når 90% sammanflöde.
- Bered önskad mängd gelatinbelagda 12-brunnsplattor, enligt vad som anges i steg 1.1.
- Aspirera det gamla mediet och tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
- Aspirera DPBS och tillsätt 300 μL 0,5x dissociationsenzym utspätt med DPBS. Inkubera plattan vid 37 °C i 5 minuter.
- Tillsätt 700 μl REMC-medium för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Pipettera försiktigt suspensionen med en P1000-pipett tills cellerna dissocieras i enskilda celler.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och centrifugera röret vid 200 × g i 5 minuter.
- Aspirera försiktigt supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml REMC-medium.
- Räkna cellerna med hjälp av en cellräknare (en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare).
- För expansion av urincellerna, platta 1,5 × 10 4 till 3 × 104 celler i 1 ml REMC-medium till en 12-brunnsplatta belagd med 0,2% gelatin.
- Utför efterföljande medieförändringar varannan dag tills kulturen når 80% -90% sammanflöde. Aspirera därför det gamla mediet och tillsätt 1 ml färskt REMC-medium.
3. Generering av iPSC med Sendai-virusvektorinfektion
OBS: För arbetsflödet för omprogrammeringsproceduren, se figur 2A. Urinceller som används för omprogrammering bör vara så unga som möjligt, men en anmärkningsvärd förlust av omprogrammeringseffektivitet observeras inte före passage 4. Sendai Virus Reprogramming Kit måste användas i en BL-2 anläggning. Hantera virus under ett biologiskt säkerhetsskåp med laminärt flöde och använd alltid lämplig säkerhetsutrustning för att förhindra slemhinneexponering.
- Förbered en matrisbelagd platta med 12 brunnar genom att tillsätta 500 μL basalmembranmatris per brunn och fördela vätskan genom att flytta plattan. Inkubera plattan vid 37 °C i minst 1 timme och ersätt basalmembranmatrisen med 900 μl REMC-medium. Förvara plattan vid 37 °C tills den används.
- Tina snabbt komponenterna i Sendai Reprogramming Kit i ett 37 °C vattenbad. Blanda Sendai-virusen (polycistroniska KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC och KLF4) med en MOI på 5 och tillsätt REMC-medium upp till 100 μl. Använd ekvation (1):
OBS: Eftersom virustitrar skiljer sig åt mellan partier, kontrollera alltid titern i analyscertifikatet som tillhandahålls av tillverkaren.
Valfritt: Använd grönt fluorescerande protein (GFP) Sendai-virus dessutom som en positiv kontroll för transduktionseffektiviteten. För detta, förbered ytterligare 3,5 × 104 celler i ett separat rör under steg 3.3. - För dissociation av urincellerna, följ steg 2.2-2.4. Räkna cellerna med cellräknaren och överför 7 × 104 urinceller till ett 1,5 ml rör.
- Centrifugera röret vid 200 × g i 5 minuter och avlägsna försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten. Återsuspendera pelleten i 100 μl av den SeV-blandning som beretts i steg 3.2. Inkubera röret i 1 timme vid 37 °C för suspensionsinfektion.
- Platta suspensionen på de matrisbelagda 12-brunnsplattorna med basalmembran som bereddes i steg 3.1. Rutinmässigt × platta 1 × 10 4 och 2,5 104 celler per brunn i duplikat.
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 %CO2. Byt ut mediet mot 1 ml färskt REMC-medium 24 timmar efter transduktion och dag 3.
- På dag 5 efter transduktion, byt medium till PSC-genereringsmedium (se kompletterande tabell S1), med efterföljande mediebyten varannan dag. Ta därför bort det gamla mediet och tillsätt 1 ml PSC-genereringsmedium per brunn.
OBS: Det kan ta upp till 15 dagar tills de första kolonierna dyker upp. - Välj enskilda iPSC-kolonier när kolonins storlek överstiger 1 mm. För att göra detta, skrapa och försiktigt samla en enda koloni med en p10-pipett under ett mikroskop. Överför kolonin till en ny brunn på en platta med 12 brunnar belagd med en basalmembranmatris innehållande 750 μL PSC-odlingsmedium.
Valfritt: Att skölja plattan med DPBS och behandla i 1 minut med 0,5 mM EDTA före plockning kan stödja den robusta kulturen med ytterligare steg. Om cellerna ska odlas längre för att vänta på senare framväxande kolonier, utför inte detta EDTA-behandlingssteg. - Odla cellerna vid 37 °C och 5 %CO2 med efterföljande mediebyten varannan dag, enligt vad som anges i avsnitt 4 i protokollet. När den plockade kolonin når en diameter på 2 mm, fortsätt med den rutinmässiga iPSC-passagingen, som förklaras i avsnitt 5 i protokollet.
4. Medium förändring
OBS: Odlingsmediet bör bytas varannan dag tills kolonierna växer tillräckligt stora för att passera.
- Aspirera det gamla mediet och tillsätt 750 μL av det färska mediet per 12-brunnsplatta. För att byta till en annan typ av medium, byt ut mediet minst 1 dag efter passaging.
5. Passering
OBS: Cellerna ska passeras när iPSC-kolonierna växer tillräckligt stora (diameter > 2 mm), eller kolonierna är på väg att röra varandra. Rutinmässigt kan iPSC delas ungefär var 5: e dag. Använd klumppassaging (steg 5.1) för rutinunderhåll och single-cell passaging (steg 5.2) för experiment där ett definierat antal celler behövs. Om iPSC skiljer sig mycket kan koloniplockning (steg 5.3) bidra till att förbättra kulturernas renhet.
- Klump-passaging
- Förbered en matrisbelagd platta med 12 brunnar genom att tillsätta 500 μL basalmembranmatris per brunn och fördela vätskan genom att flytta plattan. Inkubera plattan vid 37 °C i minst 1 timme. Byt ut basalmembranmatrisen mot 500 μl PSC-odlingsmedium och förvara plattan vid 37 °C tills den används.
- Aspirera mediet från de odlade cellerna och tvätta cellerna genom att försiktigt tillsätta 500 μL DPBS. Ta bort DPBS och tillsätt 500 μL 0,5 mM EDTA till brunnen.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur i 2-5 minuter tills kolonierna börjar lossna. Observera noggrant cellerna under mikroskopet.
- När koloniernas kanter börjar lossna och mellanrum mellan cellerna blir synliga (figur 3A), ta bort EDTA och tillsätt försiktigt 500 μL DPBS.
OBS: Pipettera alltid mot brunnens sidovägg och aldrig direkt på cellerna, för att inte lossa cellerna från plattan. - Aspirera DPBS och spola brunnen med 500 μL PSC-odlingsmedium med en p1000-pipett. Pipettera upp och ner 1x-5x för att sprida kolonierna i klumpar av lämplig storlek (figur 3A). Pipettera inte för mycket.
OBS: Om iPSCs av misstag pipetteras för mycket, tillsätt 10 μM Rock-hämmare Y-27632 till mediet. Detta kan förbättra överlevnaden, eftersom iPSC inte kan överleva som enskilda celler. - Överför 1/10-1/50 av cellklumpsuspensionen till de nya brunnarna. Förhållandet beror på brunnens sammanflöde före delning, den önskade densiteten hos de sådda cellerna och iPSC-klonpreferens.
- Fördela klumparna jämnt i brunnen genom att försiktigt flytta plattan fram och tillbaka flera gånger. Inkubera plattan i minst 30 minuter vid 37 °C så att klumparna fäster.
- Ersätt mediet med 750 μl PSC-odlingsmedium om många flytande döda celler observeras. Tillsätt annars 250 μl PSC-odlingsmedium. Placera plattan vid 37 °C och 5%CO2 i en inkubator.
OBS: Medium ersättning efter 30 min är kritisk, särskilt för instabila cellinjer (t.ex. NHP). - Byt medium var 2-3: e dag tills kolonierna blir tillräckligt stora för passaging. För medelstor ändring följer du steg 4 i protokollet.
- Encellspassaging
- Bered den matrisbelagda odlingsplattan av basalmembranet enligt steg 5.1.1 med tillsats av 10 μM Y-27632 till PSC-odlingsmediet.
Valfritt: Tillsätt 10 μM Y-27632 till cellerna 1-3 timmar före passage för att förbättra överlevnaden av känsliga cellinjer. - Aspirera mediet och tvätta cellerna genom att tillsätta 500 μL DPBS. Ta bort DPBS och tillsätt 300 μL avskiljningslösning till brunnarna.
- Inkubera plattan vid 37 °C i 5-10 minuter. När tillräcklig frigöring av cellerna observeras under mikroskopet, tillsätt 700 μL PSC-odlingsmedium eller DPBS.
- Pipettera upp och ner 5-10x med en p1000-pipett tills cellerna dissocieras i enskilda celler. Pipettera inte för mycket, för att förhindra cellskador.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör innehållande minst 2 ml DPBS för att späda ut avskiljningslösningen.
- Centrifugera röret vid 200 × g i 5 minuter och aspirera lösningen helt, utan att störa cellpelleten.
- Återsuspendera pelleten i 500 μL PSC-odlingsmedium kompletterat med 10 μM Y-27632.
- Räkna cellerna och fröet 5 000-7 000 celler per basalmembranmatrisbelagd 12-brunnsplatta, beredd i steg 5.2.1.
OBS: Om ett annat cellnummer behövs, byt till en större eller mindre brunn i enlighet därmed. - Inkubera plattan i minst 30 minuter vid 37 °C och 5 %CO2 så att cellerna fäster.
- Ersätt mediet med 750 μL PSC-odlingsmedium + 10 μM Y-27632 om många döda celler observeras. annars tillsätt 250 μL + 10 μM Y-27632.
OBS: Detta steg är kritiskt, särskilt för de instabila cellinjerna (t.ex. NHP). - Placera plattan vid 37 °C och 5%CO2 i en inkubator.
- Byt medium till PSC-odlingsmedium utan Y-27632 1 till 2 dagar efter delning, så att cellerna kan visa den klassiska kolonimorfologin igen (figur 3B).
- Byt medium var 2: e dag tills kolonierna blir tillräckligt stora. För medeländring, följ avsnitt 4 i protokollet.
- Bered den matrisbelagda odlingsplattan av basalmembranet enligt steg 5.1.1 med tillsats av 10 μM Y-27632 till PSC-odlingsmediet.
- Passering av iPSC genom koloniplockning
- Förbered matrisbelagda 12-brunnar med basalmembran enligt steg 5.1.1.
- Aspirera mediet och tvätta cellerna genom att försiktigt tillsätta 500 μL DPBS. Ta bort DPBS och tillsätt 500 μL 0,5 mM EDTA till brunnen.
- Inkubera plattan vid RT i 1-3 minuter och observera cellerna under mikroskopet tills kolonins frigöring är synlig på gränserna.
- Ta bort EDTA och tillsätt försiktigt 500 μL DPBS. Aspirera vätskan innan du långsamt tillsätter 500 μL PSC-odlingsmedium till brunnen, utan att cellerna lossnar.
- Använd en p200-pipett för att välja önskad koloni under mikroskopet, utan att samla de differentierade cellerna. För att göra detta, skrapa försiktigt över kolonin medan du tar upp mediet som innehåller celler.
- Överför varje plockad koloni till en matrisbelagd brunn med basalmembran, enligt beredningen i steg 5.3.1. Dissociera cellerna i små klumpar med hjälp av en p1000-pipett genom att pipettera cellerna 2-5x.
- Inkubera plattan i 30 minuter vid 37 °C och 5 %CO2 så att klumparna fäster.
- Ersätt mediet med 750 μl PSC-odlingsmedium om många flytande döda celler observeras. Tillsätt annars 250 μl PSC-odlingsmedium.
OBS: Medium ersättning efter 30 min är kritisk, särskilt för de instabila cellinjerna (t.ex. NHP). - Placera plattan vid 37 °C och 5%CO2 i en inkubator.
- Byt medium var 2-3: e dag tills kolonierna blir tillräckligt stora för passaging. För att göra detta, följ avsnitt 4 i protokollet.
6. Frysning av urinceller och iPSC för långvarig lagring
OBS: Rutinmässigt fryses iPSC som klumpar i cellfrysningsmedium utan att räkna. Pipettering bör vara minimal för att undvika dissociation i enskilda celler. För urinceller fryses rutinmässigt 1,5 × 10 4 till 3 × 104 celler per rör, vilket gör att användaren kan tina ett rör direkt i en brunn på en 12-brunnsplatta utan behov av ett annat räknesteg.
- Förbered 5 ml DPBS i ett 15 ml rör.
- För frysning av urinceller, följ steg 2.2-2.4 i protokollet. För frysning av iPSC, följ steg 5.1.2-5.1.5 från klumppasseringsprotokollet.
- Överför suspensionen till 15 ml röret som beretts i steg 6.1. För frysning av urinceller, räkna 10 μL av cellsuspensionen med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 × g och aspirera supernatanten helt.
- Resuspendera cellpelleten i 400 μL cellfrysningsmedium per rör och fördela cellerna till önskad mängd kryorör.
- Överför kryorören omedelbart till -80 °C. Överför de frysta rören till en frys på -150 °C eller flytande kväve 1 dag efter frysning vid -80 °C för långtidsförvaring.
7. Upptining av urinceller och iPSC
- För upptining av urinceller, bereda önskad mängd gelatinbelagda 12-brunnar, som anges i steg 1.1 i protokollet. För iPSC, förbered de matrisbelagda plattorna med 12 brunnar i basalmembranet enligt steg 5.1.1. I båda fallen, byt inte matrisen med medium.
- Förbered ett 15 ml rör som innehåller 4 ml DPBS och förvara det vid 37 °C.
- Placera snabbt en frusen injektionsflaska med celler i ett 37 °C vattenbad för upptining tills en bit flytande is blir synlig.
OBS: Torka av kryoröret med etanol före och efter inkubation i vattenbadet för att undvika föroreningar. - Tillsätt 500 μl REMC-medium för urinceller eller 500 μl PSC-odlingsmedium för iPSC till den isinnehållande suspensionen och överför omedelbart suspensionen till det förvärmda 15 ml-röret som beretts i steg 7.2.
- Centrifugera röret vid 200 × g i 5 minuter och kassera supernatanten helt.
- För urinceller, resuspendera pelleten i 1 ml REMC-medium. För iPSC, suspendera försiktigt pelleten i 750 μl PSC-odlingsmedium. Undvik pipettering för mycket, för att hålla klumparna intakta.
Valfritt: Komplettering av mediet med 10 μM Y-27632 kan stödja iPSCs överlevnad efter upptining. - Aspirera matrisen från de 12-brunnsplattor som beretts i steg 7.1 och överför försiktigt cellsuspensionen till brunnen.
- Placera plattan över natten vid 37 °C och 5%CO2 i en inkubator.
- Nästa dag, ersätt mediet med PSC-odlingsmedium, utan Y-27632 för iPSC och med REMC för urinceller.
- Odla cellerna vid 37 °C och 5%CO2 i en inkubator.
- Byt medium var 2-3: e dag tills cellerna blir tillräckligt stora för att passera. För medeländring, följ avsnitt 4 i protokollet.
8. Immunocytokemi
OBS: Immunfärgning med antikroppar riktade mot pluripotensrelaterade markörer såsom NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 och EpCAM är en av de mest använda valideringarna av nygenererade iPSC. Mer information om antikroppar och spädningar finns i materialförteckningen.
- Platta iPSC 1-3 dagar före användning i ett lämpligt antal 12-brunnsplattor. Aspirera mediet, tvätta cellerna genom att tillsätta 500 μL DPBS och ta bort DPBS. Tillsätt 400 μL 4% paraformaldehyd (PFA) per brunn och fixera cellerna i 15 minuter vid RT.
- Ta bort 4% PFA och tvätta cellerna 3x med DPBS. Tillsätt 400 μL blockerande buffert per brunn och inkubera plattan i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera den blockerande bufferten och tillsätt antikropparna utspädda i 400 μL antikroppsutspädningsbuffert (ADB) till varje brunn. Inkubera plattan vid 4 °C över natten.
- Ta bort ADB som innehåller de primära antikropparna och tvätta cellerna 3x med DPBS.
- Aspirera DPBS och tillsätt 400 μL sekundära antikroppar utspädda i ADB per brunn. Inkubera plattan i 1 h vid rumstemperatur i mörker.
- Ta bort ADB och tvätta cellerna 3x med DPBS. Tillsätt 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) utspätt i DPBS per brunn och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera DAPI-lösningen och tvätta cellen 3x med DPBS. Tillsätt 500 μL DPBS för avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid isolering av celler från human och NHP-urin kan olika typer av celler identifieras direkt efter isolering. Skivepitelceller, liksom olika mindre runda celler, utsöndras med urinen; kvinnlig urin innehåller mycket mer skivepitelceller än manlig urin (Figur 1B - Dag 0; Kompletterande figur S1). Efter 5 dagars odling i primärt urinmedium kan de första vidhäftande prolifererande cellerna ses (Figur 1A, B - Dag 5). Vid denna tidpunkt ersätts hälften av mediet med REMC-proliferationsmedium varje dag tills de första kolonierna dyker upp. På ungefär dag 13 växer de vidhäftande cellerna till stora kolonier som kan passeras (Figur 1B - Dag 13). Dessa kolonier kan bildas av två morfologiskt distinkta celltyper - en med en mer epitelliknande fenotyp med celler som växer nära fästa, och den andra visar en mer mesenkymalliknande morfologi med långsträckt form och högre migrationsförmåga (figur 1C). Efter den första passagen växer urinceller som ett monolager och kan passeras när kulturen når 80% sammanflöde (Figur 1B - Dag 17).
Figur 1: Isolering och odling av urinceller. a) Arbetsflöde för framställning av urinceller från humana och icke-mänskliga primatprover. (B) Faskontrastbilder som visar tillväxt och kolonibildning av urinceller fram till första passagen (p1). (C) Två olika celltyper isolerade från urinprover kan särskiljas efter 2 veckors odling. Skalstänger = 250 μm (B,C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att generera iPSC från urinceller används en transduktion med Sendai-virus som introducerar Yamanaka-faktorerna OCT3/4, SOX2, KLF4 och c-MYC. För att öka transduktionseffektiviteten inkuberas urinceller med viruset i 1 timme i suspension innan de sås på matrisbelagda brunnar med basalmembran (figur 2A). Vissa vidhäftande celler kan ses i brunnarna 1 dag efter transduktion (Figur 2B - Dag 1). Efter 5-10 dagar börjar dessa celler bilda kolonier, och tidiga morfologiska förändringar kan observeras, vilket indikerar omprogrammering av cellerna (Figur 2B - Dag 14). Många av dessa kolonier uppvisar gradvis en ESC-liknande morfologi och kan plockas i PSC-odlingsmedium när diametern överstiger 1 mm. Efter plockning bildar cellerna kolonier som visar den typiska ESC-morfologin inom cirka 4 dagar (figur 2B - Dag 21 &; 24). När iPSC-kolonierna växer sig tillräckligt stora kan cellerna passeras för första gången med hjälp av klumppasseringsprotokollet (protokollsteg 5.1).
Denna omprogrammeringsmetod har använts för att generera iPSC från människor, Gorillagorilla (gorilla ) och Pongo abelii (orangutang)15. Medan sannolikheten för att få urinceller är ganska variabel och minst två till tre gånger lägre för schimpanser än för människor15, var omprogrammering av de erhållna urincellerna mestadels framgångsrik enligt vår erfarenhet. I allmänhet ger 0,19% av de infekterade urincellerna upphov till kolonier med ESC-liknande morfologi, vilket resulterar i minst en koloni i 87% av omprogrammeringsförsöken15. Alla genererade iPSC delar samma egenskaper och visar den typiska ESC-liknande kolonimorfologin, kännetecknad av tätt packade celler med tydligt definierade kanter (figur 2C). Dessutom uppvisar alla iPSC en normal karyotyp, och frånvaron av SeV-omprogrammeringsvektorer verifierades med PCR efter minst fem passager, vilket rekommenderades av tillverkaren av SeV-omprogrammeringssatsen (data visas inte)15. Immunocytokemi används för att testa uttrycket av pluripotensassocierade proteiner i kärnan, såsom NANOG, OCT3/4 och SOX2. Ytmarkörer som TRA-1-60, EpCAM och SSEA4 kan också användas (figur 2D); SSEA4 uttrycks emellertid också i urincellerna15. Dessutom kan flödescytometrianalys utföras med hjälp av dessa ytmarkörer för att ge kvantitativ information om pluripotensstatus för iPSC (metod som beskrivs av Ohnuki et al.48). Detta tillvägagångssätt används för att visa att 95,3% av de analyserade orangutang-iPSC är positiva för TRA-1-60 (figur 2E). Dessutom kan differentieringskapaciteten hos NHP iPSC bevisas via in vitro embryoid body (EB) differentiering (metod som beskrivs av Geuder et al.15). Som visas i figur 2F kan gorilla iPSC differentiera till endoderm (ɑ-fetoprotein), mesoderm (ɑ-glatt muskelaktin) och ektoderm (β-III tubulin) linjer.
Figur 2: Generering och karakterisering av urinhärledda iPSC . (A) Omprogrammering av arbetsflöde för urin-härledda celler. (B) Faskontrastbilder som visar morfologiska förändringar av gorillaurinceller under omprogrammering fram till upprättandet av iPSC-kolonier. Skalstaplar = 500 μm. (C) Morfologi hos etablerade iPSC-kolonier från humana, gorilla- och orangutangcellkulturer. Skalstänger = 500 μm. (D) Immunofluorescensfärgning av gorilla iPSC med pluripotensassocierade markörer vid passage 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM och TRA-1-60. Skalstänger = 100 μm. (E) Flödescytometrianalys av orangutang-iPSC färgade med anti-TRA-1-60-PE. Ofärgade celler användes som kontroll. (F) Immunofluorescensanalys av endoderm (AFP), mesoderm (ɑ-SMA) och ektoderm (β-III TUB) efter embryoid kroppsdifferentiering av gorilla iPSCs. Kärnor motfärgades med DAPI. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; PE = fykoerytrin; AFP = α-fetoprotein; ɑ-SMA = alfa glatt muskelaktin; β-III TUB = beta III tubulin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
När iPSC-kolonierna når en diameter på ungefär 2 mm, eller är på väg att röra vid varandra, ska cellerna delas. Vi föreslår att du använder klumppasseringsprotokollet för rutinunderhåll. I detta protokoll används 0,5 mM EDTA för att lossa cellerna i 3-5 minuter, beroende på kolonins storlek. Under EDTA-inkubation börjar koloniernas gränser att avskalas och synliga luckor uppträder mellan cellerna (figur 3A). EDTA ska avlägsnas när en lämplig lossning observeras under mikroskopet. Långvarig inkubation med EDTA leder till en högre andel enskilda celler som inte kan överleva. Därefter bör cellerna dissocieras till klumpar av liknande storlek, som visas i figur 3A. Cellerna bör inte dissocieras i små klumpar, eftersom detta minskar överlevnaden och kan leda till mer differentierande celler.
När ett experiment kräver sådd av ett definierat antal celler bör encellspasseringsprotokollet användas. Detta protokoll inkluderar att komplettera mediet med en Rock-hämmare, vilket gör det möjligt för de enskilda cellerna att överleva. Det förväntas att bifogade enskilda celler visar en annan morfologi jämfört med celler som växer i en koloni efter klumpsådd (Figur 3B - Dag 0). Efter 1-2 dagars odling börjar de enskilda cellerna växa till kolonier igen, samtidigt som deras morfologi såväl som deras lösa cell-cellkontakt bevaras, om en Rock-hämmare läggs till mediet (Figur 3B - Dag 2). När dessa små kolonier observeras bör berghämmaren avlägsnas från mediet, så att cellerna kan visa den typiska ESC-liknande morfologin igen (figur 3B - dag 4).
För att bedöma om en iPSC-koloni är av hög kvalitet måste flera aspekter beaktas. För det första är det normalt att friska kolonier visar ingen eller en liten mängd spontan differentiering; Ett ökat antal differentierade celler (>10%) indikerar dock dålig iPSC-kvalitet. Ytterligare egenskaper hos låg iPSC-kvalitet är en förlust av gränsintegritet och enhetlighet (figur 3C: höger), samt lös cellulär förpackning med synliga luckor mellan cellerna (figur 3D: höger). Däremot kännetecknas högkvalitativa iPSC av definierade gränser, tät cellulär förpackning och framträdande nukleoler (figur 3C, D: vänstra bilder).
Figur 3: Primat-iPSC-kultur . (A) Faskontrastbilder som visar hur iPSC-kolonier lossnar under EDTA-inkubation enligt klumppasseringsprotokollet och den optimala klumpstorleken efter dissociation. Skalstaplar = 250 μm. (B) Tidslinje för iPSC-återhämtning efter encellspassaging. Rockhämmaren Y-27632 avlägsnades från dag 2 och framåt. Skalstaplar = 250 μm. (C) Vänster: exempel på en högkvalitativ mänsklig iPSC-koloni med definierade gränser. Höger: exempel på en koloni av dålig kvalitet som visar mindre gränsintegritet och differentierade celler. Skalstreck = 500 μm. (D) Exempelbilder för en högkvalitativ human iPSC-koloni (vänster) jämfört med en lågkvalitativ koloni med löst packade celler (höger). Skalstänger = 100 μm. Förkortning: iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Översikt över celltyper som finns i human urin. (A) Celler isolerade från honurin. b) Celler isolerade från manlig urin. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Buffert- och mediekompositioner som använts i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSC är värdefulla celltyper eftersom de möjliggör generering av annars otillgängliga celltyper in vitro. Eftersom utgångsmaterialen för omprogrammering, till exempel, fibroblaster inte är lätt tillgängliga från alla primatarter, presenterar detta dokument ett protokoll för generering av iPSC från urin-härledda celler. Dessa celler kan erhållas på ett icke-invasivt sätt, även från icke-sterila primaturinprover, genom att komplettera odlingsmediet med bredspektrum antibiotika.
Flera kritiska steg i protokollet är värda ytterligare diskussion. För det första, när man isolerar celler från icke-steril urin, är det viktigt att komplettera mediet med ett bredspektrum antimikrobiellt reagens för att minska risken för kontaminering. Om tillväxten av mikrobiologisk kontaminering blir uppenbar trots användning av antibiotika, rekommenderas att kassera hela kulturen och desinficera området. Dessutom, enligt vår erfarenhet, producerar fortsatt odling inte friska växande urinceller. För det andra, när man börjar omprogrammera celler, rekommenderas starkt att förbereda flera rätter med olika antal SeV-transducerade celler för att undvika risken för att alla celler lossnar genom översammanflöde och för att öka sannolikheten för iPSC-förvärv. I allmänhet förväntas plätering av en högre densitet av SeV-transducerade celler ge mer omprogrammerade iPSC-kolonier, medan odling av omprogrammeringscellerna under en period av ~ 20 dagar ofta resulterar i översammanflöde, följt av frigöring av hela brunnen. För det tredje, vid varje steg som kräver dissociation av iPSCs är det viktigt att undvika omfattande pipettering, vilket leder till signifikant celldöd. Speciellt när klumppassagen utförs är det viktigt att hålla klumparna i lämplig storlek (figur 3A). Klumpar som är för stora kan leda till snabb differentiering, medan klumpar som är för små kan minska överlevnaden.
Vi observerade att sannolikheten för att erhålla urinceller är ganska varierande mellan prover och alikvoter, men fann inga bevis för att mindre volymer har en lägre framgångsgrad för att erhålla kolonier. I allmänhet isolerade vi i genomsnitt 7,6 kolonier från 100 ml mänsklig urin. Om man antar denna genomsnittliga hastighet och en Poisson-fördelning har minst en koloni en sannolikhet på ~ 98% för 50 ml och ~ 30% för 5 ml utgångsmaterial. I vårt fall var det möjligt att isolera minst en koloni från 5 ml human urin i 42% av försöken15. Baserat på detta kan isoleringen av kolonier fortfarande vara värt att försöka, även om endast små volymer urin är tillgängliga. Om omprogrammeringen av urinceller misslyckas, och inga iPSC-kolonier kan observeras, kan plätering av olika antal transfekterade celler resultera i omprogrammering av de urinhärledda cellerna. De framväxande iPSC-kolonierna kan också identifieras som iPSC genom levande färgning med hjälp av ytmarkörer (t.ex. TRA-1-60 eller alkaliskt fosfatas [AP]; data visas inte). Det är känt att AP-aktiviteten är uppreglerad i pluripotenta stamceller, och den kan användas för att tillfälligt färga stamceller under odlingsprocessen. En annan möjlig fallgrop i protokollet är den optimala kulturen för NHP iPSCs. Med hjälp av detta protokoll bekräftade vi att humana och NHP iPSC bibehåller sitt pluripotenta tillstånd i mer än 50 passager med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt medium. Men i jämförelse med humana iPSC är NHP iPSC mer benägna att spontant differentiera i vår erfarenhet, potentiellt på grund av de kulturförhållanden som optimerades för mänskliga och inte för NHP-kulturer. Dessutom finns det stor variation bland iPSC-kloner i överlevnadshastigheter efter plätering, tillväxthastighet och tendens till differentiering. Därför behöver man ofta bestämma det optimala delningsförhållandet, passagetiden och klumpstorleken för varje klon individuellt.
Vi har visat att även en volym på 5 ml kan vara tillräcklig för att isolera urinceller från NHP15. Men medan vi inte hittade några signifikanta skillnader i antalet isolerade urinceller hos människor, gorillor och orangutanger, hade schimpanser ett lägre förhållande, eftersom vi inte kunde isolera urinceller från totalt 87 ml. Därför kan det för vissa arter vara nödvändigt att samla mycket mer urin än för andra. Att samla stora volymer från små primater kan vara särskilt utmanande, men eftersom isoleringen av urinceller är ganska kostnadseffektiv är det praktiskt att bara prova det för vissa arter och tillgängliga volymer urin. Tyvärr kan urinproverna inte frysas, vilket begränsar radien över vilken prover kan samlas in. Vi visade dock att en lagringstid på 4 timmar vid 4 °C inte hade någon inverkan på antalet isoleradekolonier 15, och en längre lagringstid eller förbättrade lagringsförhållanden kan mycket väl vara möjlig. Vi har infört flera typer av kvalitetskontrolltester för validering. Men även om en iPSC-linje uppfyller dessa kriterier är klonal heterogenitet fortfarande betydande, vilket har förklarats av genetisk bakgrund49 och epigenetisk status 50,51,52,53,54. För att tillämpa primat-iPSC på framtida jämförande analys bör man överväga heterogeniteten och använda tillräckligt med kloner för att medelvärdet av den klonala variationen och därmed undvika feltolkning av resultatet.
Ändå har användningen av urin som källa för primära celler en stor fördel jämfört med konventionella metoder som till exempel använder fibroblaster för omprogrammering, eftersom de kan erhållas helt icke-invasivt. Dessutom möjliggör detta protokoll generering av iPSC från urinhärledda celler med en kortare period än konventionell omprogrammering. Med denna metod blir kolonier synliga inom 5-15 dagar, medan vi har funnit att kolonier från primatfibroblaster (rhesus, babian) tenderar att dyka upp senare, efter 20-30 dagar. Dessutom, med användning av denna suspensionsinfektionsmetod, gav 0,19% av virustransducerade celler upphov till kolonier med pluripotent cellliknande morfologi. Detta resulterade i minst en koloni i 87% av försöken15. I jämförelse visade sig den konventionella transduktionsmetoden för SeV med bifogade celler och lipofektion med episomala plasmider ha en signifikant lägre omprogrammeringseffektivitet, med 0,09% respektive 0,009% av cellerna som bildar en pluripotent koloni, respektive15.
Sammanfattningsvis möjliggör denna metod isolering av urinceller icke-invasivt och generering av matarfria iPSC från nästan alla mänskliga givare och många NHP. Detta ökar tillgängligheten till värdefulla celltyper som kan särskiljas från dessa iPSC. Dessutom kan denna metod användas för att producera patientspecifika iPSC som kan användas för sjukdomsmodellering eller framtida cellbaserade terapier. Slutligen, eftersom iPSC kan genereras från endast små volymer urin, kan denna metod tillämpas på många fler olika primater eller till och med däggdjursarter. Således kan denna metod vara ett kraftfullt verktyg för jämförelse mellan arter, vilket kan möjliggöra bättre förståelse av utvecklingen av mänskliga specifika egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av DFG EN 1093/5-1 (projektnummer 458247426). M.O. stöddes av JSPS Overseas Research Fellowship. Alla siffror skapades med BioRender.com. Flödescytometri utfördes med hjälp av Core Facility Flow Cytometry vid Biomedical Center München. Vi vill tacka Makoto Shida och Tomoyo Muto från ASHBi, Kyoto University, för stöd till videografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
