Summary
Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.
Abstract
Primat pluripotent kök hücreleri ve türevlerini inceleyen türler arası yaklaşımlar, hastalık, gelişim ve evrimin moleküler ve hücresel mekanizmalarını daha iyi anlamak için çok önemlidir. Primatların neden olduğu pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) daha erişilebilir hale getirmek için, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden insan ve insan olmayan primat iPSC'leri üretmek için invaziv olmayan bir yöntem ve bunların besleyicisiz bir kültürleme yöntemi kullanılarak sürdürülmesini sunmaktadır.
İdrar, steril olmayan bir ortamdan (örneğin, hayvanın kafesi) örneklenebilir ve kontaminasyonu etkili bir şekilde azaltmak için birincil hücre kültürü sırasında geniş spektrumlu bir antibiyotik kokteyli ile muamele edilebilir. İdrar kaynaklı hücrelerin çoğaltılmasından sonra, iPSC'ler ticari olarak temin edilebilen bir Sendai virüs vektör sisteminin modifiye edilmiş bir transdüksiyon yöntemi ile üretilir. İlk iPSC kolonileri 5 gün sonra zaten görülebilir ve en erken 10 gün sonra toplanabilir. Enzimsiz ayrışma tamponu ile rutin kümelenme geçişi, 50'den fazla pasaj için üretilen iPSC'lerin pluripotensini destekler.
Introduction
İnsan ve insan olmayan primatların (NHP'ler) genomik karşılaştırmaları, evrimsel tarihimizi ve insana özgü özelliklerin evrimini anlamak için çok önemlidir1. Ek olarak, bu karşılaştırmalar, korunmuş DNA dizileri2'yi tanımlayarak, örneğin hastalıkla ilişkili varyantları önceliklendirmek için fonksiyonun çıkarılmasına izin verir3. Gen ekspresyon seviyeleri gibi moleküler fenotiplerin karşılaştırılması, genomik karşılaştırmaları daha iyi yorumlamak ve örneğin hücresel fenotipik farklılıkları keşfetmek için çok önemlidir. Dahası, DNA seviyesindeki karşılaştırmalara benzer şekilde, işlevsel alaka düzeyini çıkarma ve dolayısıyla insanlarda tıbbi olarak ilgili varyasyonları daha iyi yorumlama potansiyeline sahiptirler4. Kapsamlı moleküler fenotipik verilerin bu karşılaştırmalı çalışmalara dahil edilmesi, uygun biyolojik kaynakları (yani, türler arasında ortolog hücreler) gerektirir. Bununla birlikte, etik ve pratik nedenler, özellikle gelişim sırasında, bu tür karşılaştırılabilir hücrelere erişmeyi zorlaştırır veya imkansız kılar. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), in vitro 5,6'da erişilemeyen hücre tiplerinin üretilmesine izin verir, deneysel olarak erişilebilirdir ve primat karşılaştırmaları için kullanılmıştır6,7,8,9,10,11,12,13,14.
iPSC'ler oluşturmak için, yeniden programlanacak birincil hücrelerin edinilmesi gerekir. İdrardan izole edilen hücreler, primatlardan invaziv olmayan bir şekilde örneklenebilmeleri ve muhtemelen kök hücre benzeri moleküler profilleri nedeniyle kolayca yeniden programlanabilmeleri avantajına sahiptir15. Primat iPSC'lerini korumak için kültür koşulları, yeniden programlama kadar önemlidir; Klasik olarak, insan pluripotent kök hücrelerinin kültürü, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) için gerekli besinleri ve bir iskele sağlayan, tanımlanmamış, serum bazlı bir ortam ve fare embriyonik fibroblastlarının (besleyici hücreler olarak adlandırılır) ortak kültürünü gerektiriyordu16. Kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen kültür sistemlerinin geliştirilmesinden bu yana17,18, artık ticari olarak temin edilebilen iPSC kültür ortamları ve matrisleri için çeşitli seçenekler bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu kültür koşullarının çoğu insan ESC'leri ve iPSC'leri için optimize edilmiştir ve bu nedenle NHP iPSC kültüründe daha az iyi çalışabilir. Bu video protokolünde, idrar hücre kültüründen türetilen insan ve NHP iPSC'lerinin üretilmesi ve sürdürülmesi için talimatlar sunuyoruz.
2006 yılında fibroblastlarda tanımlanmış faktörlerin zorla ekspresyonu ile iPSC üretiminin ilk raporundan bu yana, bu yöntem çeşitli kökenlerden birçok farklı hücre tipine uygulanmıştır 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Bunlar arasında, sadece idrar kaynaklı hücreler tamamen invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilir. Zhou ve ark.33 tarafından daha önce tarif edilen protokole dayanarak, geniş spektrumlu antibiyotikleri15 destekleyerek, steril olmayan örneklerden bile primat idrarından hücreleri izole edebilir ve genişletebilir. Özellikle, bu protokol tarafından örneklenen idrar türevi hücreler, fibroblastların geleneksel yeniden programlanmasından (deneyimlerimize göre 20-30 gün) daha kısa bir süre içinde (koloniler 5-15 gün içinde görünür hale gelir) ve yeterince yüksek bir başarı oranıyla iPSC'ler üretmek için yüksek bir potansiyel sergiler. Bu idrar kaynaklı hücreler, mezenkimal kök hücre benzeri hücrelerin ve mesane epitel hücrelerinin karışık popülasyonu olarak sınıflandırıldı ve yüksek yeniden programlama verimliliğine neden oldu15.
Birincil hücrelerdeki varyasyona ek olarak, iPSC'leri oluşturmak için yeniden programlama yöntemleri de kullanım amacına göre değişir. İnsan somatik hücreleri için geleneksel yeniden programlama prosedürleri, eksojen DNA'nıngenom 5,34,35'e entegrasyonuna izin veren retrovirüs veya lentivirüs vektörleri ile yeniden programlama faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile gerçekleştirildi. Üretilen iPSC'leri genomik olarak sağlam tutmak için, araştırmacılar çok çeşitli entegrasyon dışı sistemler geliştirdiler - uyarılabilir PiggyBac vektörü36,37, epizomal vektör38,39, Sendai virüsü 40 ve adenovirüs41 gibi entegre olmayan virüs vektörleri, mRNA transfeksiyonu 42, protein transfeksiyonu 43,44 ve kimyasal bileşik tedavisi 45. Kullanımdaki verimlilik ve kolaylık nedeniyle, Sendai virüsü tabanlı yeniden programlama vektörleri bu protokolde kullanılır. Primer hücrelerin enfeksiyonu, kaplamadan önce 5'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücrelerin ve virüslerin 1 saatlik süspansiyon kültüründe gerçekleştirilir. Bu modifiye adım, virüslerin doğrudan yapışkan hücre kültürüne eklendiği geleneksel yönteme kıyasla hücre yüzeyleri ve virüsler arasındaki temas olasılığını artırabilir ve böylece daha fazla iPSC kolonisi15 verebilir.
İnsan ve NHP pluripotent kök hücrelerin geçişi, kümelenme geçişi ve tek hücreli geçiş ile yapılabilir. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), kalsiyum ve magnezyum iyonlarını bağlayan ve böylece kadherin ve integrinin yapışkan aktivitesini önleyen uygun maliyetli bir şelatlama ajanıdır. EDTA ayrıca hafif, seçici bir ayrışma reaktifi olarak da kullanılır, çünkü farklılaşmamış hücreler farklı yapışma molekülleri nedeniyle farklılaşmış hücrelerden önce ayrılırlar. Tam ayrışma, primat iPSC'lerinin Rho / Rho ile ilişkili sarmal bobin içeren protein kinaz (Rho / Rock) aracılı miyozin hiperaktivasyonu yoluyla masif hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, kültür ortamının bir Rho / Rock inhibitörü ile desteklenmesi,süspansiyon 46,47'de tek hücre gerektiren deneyler için gereklidir. Bu protokolde, rutin geçiş yöntemi olarak küme geçişini öneriyoruz ve tek hücreli geçişi yalnızca gerekli olduğunda, örneğin tanımlanmış hücre numaralarının tohumlanması gerektiğinde veya alt klonlama sırasında öneriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneysel prosedür, insan deneyleri sorumlu etik komitesi (20-122, Ethikkommission LMU München) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler ilgili kılavuz ilkelere ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: İnsan ve NHP örnekleri ile ilgili deneylere başlamadan önce uygun etik kuruldan onay alınmalıdır. Tüm deneysel prosedürler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Aşağıdaki adımların her biri, biyolojik bir güvenlik kabininde steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm tampon ve ortam bileşimleri Ek Tablo S1'de bulunabilir. Hücrelere eklenmeden önce tüm ortamların oda sıcaklığına (22 °C) ısıtıldığından emin olun. Her santrifüjleme adımı, aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir.
1. İdrar örneklerinden hücrelerin izolasyonu
DİKKAT: İnsan donörlerinin insan immün yetmezlik virüsü (HIV), hepatit B virüsü (HBV) ve hepatit C virüsü (HCV) içermediğinden emin olun. NHP'ler için, olası donörlerin / hücrelerin spesifik patojenler-B Virüsü (BV), Simian İmmün Yetmezlik Virüsü (SIV), Simian Betaretrovirüs (SRV) ve Simian T Hücresi Lenfotropik Virüsü (STLV) içermediğinden emin olun.
- Kuyucuk başına 500 μL% 0.2 jelatin ekleyerek jelatin kaplı 12 delikli bir plaka hazırlayın ve plakayı hareket ettirerek sıvıyı dağıtın. İhtiyaç duyulmadan önce en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de bekletin.
- İnsan idrar örneklerini 50 mL konik tüplerde toplayın. Primatlar için, hayvan tesisinin tabanından bir şırınga ile idrar toplayın.
NOT: Girişimlerin% 42'sinde en az bir koloninin izole edilmesi için 5 mL'lik bir idrar hacminin yeterli olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, kolonileri izole etme şansını artırmak için daha yüksek miktarda ~ 50 mL idrar kullanılması önerilir. NHP idrarı mümkün olduğunca taze, tercihen idrara çıktıktan hemen sonra örneklenmelidir. İdrar örneklerinin 4 saat boyunca 4 ° C'de saklanmasının protokolün başarı oranı üzerinde olumsuz bir etkisi olmamıştır, ancak daha uzun depolama süreleri test edilmemiştir. - İdrar içeren tüpü 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj edin ve tüpte yaklaşık 1 mL bırakarak süpernatanı dikkatlice aspire edin.
- Pelet artık 1 mL sıvı içinde tekrar askıya alın. Birden fazla idrar tüpü toplanmışsa, süspansiyonları bir tüpte toplayın.
- Tüpe 2,5 μg/mL amfoterisin içeren 10 mL idrar yıkama tamponu ( Ek Tablo S1'e bakınız) ekleyerek hücreleri yıkayın ve süspansiyonu serolojik bir pipet kullanarak dikkatlice karıştırın.
- Tüpü 10 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı dikkatlice aspire ederek tüpte yaklaşık <0.2 mL bırakın.
- Başlangıçta işlenmiş idrarın 50 mL'si başına 0.5 μg / mL amfoterisin içeren 1 mL birincil idrar ortamında (Ek Tablo S1'e bakınız) hücre peletini yeniden askıya alın (50 mL'den az idrar işlenmiş olsa bile 1 mL'de yeniden askıya alın).
- Kuyucuklardan jelatin aspire edin (adım 1.1'de hazırlanır) ve süspansiyonun 1 mL'sini adım 1.7'den 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna taplayın. İstediğiniz kadar kuyu için veya mevcut olduğu kadar mililitre süspansiyon için tekrarlayın.
İsteğe bağlı: Sağlıksız numune toplamadan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için, buradan ilk geçişe kadar hücrelere 100 μg/mL antimikrobiyal reaktif ekleyin. - Plakayı 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
- Mevcut ortamı çıkarmadan, 5. güne kadar günde 1 mL birincil idrar ortamı ekleyin.
- 5. günde, plakadan 4 mL ortam aspire edin ve yaklaşık 1 mL orta bırakın. Yeni kültür ortamıyla 1:1 karışım elde etmek için kuyucuk başına 1 mL REMC ortamı ekleyin (Ek Tablo S1'e bakınız).
- İlk koloniler ortaya çıkana kadar ortamın yarısını her gün REMC ortamı ile değiştirin (Şekil 1A, B). Bu nedenle, 1 mL eski ortamı çıkarın ve kuyu başına 1 mL taze REMC ortamı ekleyin.
2. İdrar hücrelerinin genişlemesi
NOT: Üriner hücre geçişi, kültür %90 akıcılığa ulaşmadan önce yapılmalıdır.
- Adım 1.1'de belirtildiği gibi istenen miktarda jelatin kaplı 12 delikli plakaları hazırlayın.
- Eski ortamı aspire edin ve 1 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ekleyerek hücreleri yıkayın.
- DPBS'yi aspire edin ve DPBS ile seyreltilmiş 300 μL 0.5x ayrışma enzimi ekleyin. Plakayı 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 700 μL REMC ortamı ekleyin. Hücreler tek hücrelere ayrılana kadar bir P1000 pipet kullanarak süspansiyonu nazikçe pipetinleyin.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpü 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin.
- Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve peleti 1 mL REMC ortamında yeniden askıya alın.
- Bir hücre sayacı (hemositometre veya otomatik hücre sayacı) kullanarak hücreleri sayın.
- İdrar hücrelerinin genişlemesi için, 1 mL REMC ortamındaki 1.5 ×10 4 ila 3 × 104 hücreyi% 0.2 jelatin ile kaplanmış 12 delikli bir plakaya yerleştirin.
- Kültür% 80 -% 90 akıcılığa ulaşana kadar her gün sonraki ortam değişikliklerini gerçekleştirin. Bu nedenle, eski ortamı aspire edin ve 1 mL taze REMC ortamı ekleyin.
3. Sendai virüsü vektör enfeksiyonu ile iPSC'lerin oluşturulması
NOT: Yeniden programlama yordamının iş akışı için bkz: Şekil 2A. Yeniden programlama için kullanılan üriner hücreler mümkün olduğunca genç olmalıdır, ancak 4. pasajdan önce yeniden programlama verimliliğinde kayda değer bir kayıp gözlenmemiştir. Sendai Virüs Yeniden Programlama Kiti bir BL-2 tesisinde kullanılmalıdır. Virüsleri laminer akışlı bir biyolojik güvenlik kabini altında tutun ve mukozal maruziyeti önlemek için daima uygun güvenlik ekipmanlarını kullanın.
- Kuyu başına 500 μL bazal membran matrisi ekleyerek bazal membran matrisi kaplı 12 delikli bir plaka hazırlayın ve plakayı hareket ettirerek sıvıyı dağıtın. Plakayı 37 ° C'de en az 1 saat boyunca inkübe edin ve bazal membran matrisini 900 μL REMC ortamı ile değiştirin. Plakayı kullanıma kadar 37 °C'de saklayın.
- Sendai Yeniden Programlama Kitinin bileşenlerini 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözün. Sendai virüslerini (polisistronik KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC ve KLF4) 5'lik bir MOI ile karıştırın ve 100 μL'ye kadar REMC ortamı ekleyin. Denklemi kullanın (1):
NOT: Virüs titreleri partiler arasında farklılık gösterdiğinden, titreyi her zaman üretici tarafından sağlanan analiz sertifikasında kontrol edin.
İsteğe bağlı: Transdüksiyon verimliliği için pozitif bir kontrol olarak yeşil floresan protein (GFP) Sendai virüsünü kullanın. Bunun için, adım 3.3 sırasında ayrı bir tüpte ek bir 3.5 × 104 hücre hazırlayın. - İdrar hücrelerinin ayrışması için, 2.2-2.4 adımlarını izleyin. Hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve 7 × 104 idrar hücresini 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüpü 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Pelet, adım 3.2'de hazırlanan SeV karışımının 100 μL'sinde tekrar askıya alın. Süspansiyon enfeksiyonu için tüpü 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Süspansiyonu, adım 3.1'de hazırlanan bodrum membran matris kaplı 12 delikli plakalar üzerine plakalayın. Rutin olarak, kopyalar halinde kuyu başına 1 × 104 ve 2.5 × 104 hücre plakası.
- Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ortamı, transdüksiyondan 24 saat sonra ve 3. günde 1 mL taze REMC ortamı ile değiştirin.
- Transdüksiyondan sonraki 5. günde, ortamı PSC nesil ortamına değiştirin (bkz. Ek Tablo S1), sonraki ortam her geçen gün değişir. Bu nedenle, eski ortamı çıkarın ve kuyu başına 1 mL PSC üretim ortamı ekleyin.
NOT: İlk kolonilerin ortaya çıkması 15 gün kadar sürebilir. - Koloninin büyüklüğü 1 mm'yi aştığında bireysel iPSC kolonilerini seçin. Bunu yapmak için, mikroskop altında p10 pipetli tek bir koloni kazıyın ve dikkatlice toplayın. Koloniyi, 750 μL PSC kültür ortamı içeren bir bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli bir plakanın yeni bir kuyusuna aktarın.
İsteğe bağlı: Plakanın DPBS ile durulanması ve toplamadan önce 0,5 mM EDTA ile 1 dakika boyunca muamele edilmesi, sonraki adımların sağlam kültürünü destekleyebilir. Hücreler daha sonra ortaya çıkan kolonileri beklemek için daha uzun süre kültürlenecekse, bu EDTA tedavi adımını uygulamayın. - Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de , protokolün 4. bölümünde belirtildiği gibi, her geçen gün daha sonraki ortam değişiklikleriyle büyütün. Seçilen koloni 2 mm'lik bir çapa ulaştığında, protokolün 5. bölümünde açıklandığı gibi rutin iPSC geçişine devam edin.
4. Orta değişim
NOT: Koloniler geçiş için yeterince büyüyene kadar kültür ortamı her geçen gün değiştirilmelidir.
- Eski ortamı aspire edin ve 12 delikli plaka başına 750 μL taze ortam ekleyin. Farklı bir ortam türüne geçmek için, ortamı geçtikten en az 1 gün sonra değiştirin.
5. Geçiş
NOT: Hücreler, iPSC kolonileri yeterince büyüdüğünde (çap > 2 mm) veya koloniler birbirine temas etmek üzere olduğunda geçirilmelidir. Rutin olarak, iPSC'ler yaklaşık olarak her 5 günde bir bölünebilir. Rutin bakım için küme geçişi (adım 5.1) ve tanımlanmış sayıda hücrenin gerekli olduğu deneyler için tek hücreli geçişi (adım 5.2) kullanın. İPSC'lerin çok fazla farklılaşması durumunda, koloni toplama (adım 5.3) kültürlerin saflığını artırmaya yardımcı olabilir.
- Kümelenme geçişi
- Kuyu başına 500 μL bazal membran matrisi ekleyerek bazal membran matrisi kaplı 12 delikli bir plaka hazırlayın ve plakayı hareket ettirerek sıvıyı dağıtın. Plakayı 37 ° C'de en az 1 saat inkübe edin. Bazal membran matrisini 500 μL PSC kültür ortamı ile değiştirin ve plakayı kullanıma kadar 37 °C'de saklayın.
- Ortamı kültürlenmiş hücrelerden aspire edin ve 500 μL DPBS'yi dikkatlice ekleyerek hücreleri yıkayın. DPBS'yi çıkarın ve kuyuya 500 μL 0,5 mM EDTA ekleyin.
- Koloniler ayrılmaya başlayana kadar plakayı RT'de 2-5 dakika inkübe edin. Hücreleri mikroskop altında dikkatlice gözlemleyin.
- Kolonilerin kenarları soyulmaya başladığında ve hücreler arasındaki boşluklar görünür hale geldiğinde (Şekil 3A), EDTA'yı çıkarın ve dikkatlice 500 μL DPBS ekleyin.
NOT: Hücreleri plakadan ayırmamak için daima kuyunun yan duvarına pipet uygulayın ve asla doğrudan hücrelerin üzerine koymayın. - DPBS'yi aspire edin ve p1000 pipet kullanarak kuyuyu 500 μL PSC kültür ortamıyla yıkayın. Kolonileri uygun büyüklükte kümeler halinde dağıtmak için pipeti 1x-5x yukarı ve aşağı doğru çekin (Şekil 3A). Çok fazla pipet yapmayın.
NOT: iPSC'ler yanlışlıkla çok fazla pipetlenirse, ortama 10 μM Kaya inhibitörü Y-27632 ekleyin. Bu, iPSC'ler tek hücreler olarak hayatta kalamayacağı için hayatta kalmayı artırabilir. - Hücre küme süspansiyonunun 1/10-1/50'sini yeni kuyucuklara aktarın. Oran, ayrılmadan önce kuyunun akıcılığına, tohumlanan hücrelerin istenen yoğunluğuna ve iPSC klonal tercihine bağlıdır.
- Plakayı birkaç kez ileri geri hafifçe hareket ettirerek kümeleri kuyuya eşit olarak dağıtın. Kümelerin yapışmasını sağlamak için plakayı 37 ° C'de en az 30 dakika inkübe edin.
- Çok sayıda yüzen ölü hücre gözlenirse, ortamı 750 μL PSC kültür ortamı ile değiştirin; aksi takdirde, 250 μL PSC kültür ortamı ekleyin. Plakayı bir inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'ye yerleştirin.
NOT: 30 dakika sonra orta replasman, özellikle kararsız hücre hatları (örneğin, NHP'ler) için kritik öneme sahiptir. - Koloniler geçiş için yeterince büyüyene kadar ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Orta düzeyde değişiklik için, protokolün 4. adımını izleyin.
- Tek hücreli geçiş
- Adım 5.1.1'de belirtildiği gibi, PSC kültür ortamına 10 μM Y-27632 ilavesiyle bazal membran matris kaplı kültür plakasını hazırlayın.
İsteğe bağlı: Hassas hücre hatlarının hayatta kalmasını artırmak için geçmeden 1-3 saat önce hücrelere 10 μM Y-27632 ekleyin. - Ortamı aspire edin ve 500 μL DPBS ekleyerek hücreleri yıkayın. DPBS'yi çıkarın ve kuyucuklara 300 μL ayırma çözeltisi ekleyin.
- Plakayı 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca inkübe edin. Mikroskop altında hücrelerin yeterli şekilde ayrılması gözlendiğinde, 700 μL PSC kültür ortamı veya DPBS ekleyin.
- Hücreler tek hücrelere ayrılana kadar p1000 pipet kullanarak 5-10 kat yukarı ve aşağı pipet yapın. Hücre hasarını önlemek için çok fazla pipet yapmayın.
- Ayrılma çözeltisini seyreltmek için hücre süspansiyonunu en az 2 mL DPBS içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüpü 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan çözeltiyi tamamen aspire edin.
- Pelet, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 500 μL PSC kültür ortamında yeniden askıya alın.
- Hücreleri sayın ve adım 5.2.1'de hazırlanan bazal membran matris kaplı 12 delikli plaka başına 5.000-7.000 hücreyi tohumlayın.
NOT: Farklı bir hücre numarası gerekiyorsa, buna göre daha büyük veya daha küçük bir kuyucuğa geçin. - Hücrelerin yapışmasına izin vermek için plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de en az 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Çok sayıda ölü hücre gözlenirse, ortamı 750 μL PSC kültür ortamı + 10 μM Y-27632 ile değiştirin; aksi takdirde, 250 μL + 10 μM Y-27632 ekleyin.
NOT: Bu adım, özellikle kararsız hücre hatları (örneğin, NHP'ler) için kritiktir. - Plakayı bir inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'ye yerleştirin.
- Hücrelerin klasik koloni morfolojisini tekrar görüntülemesine izin vermek için bölmeden 1 ila 2 gün sonra ortamı Y-27632 olmadan PSC kültür ortamına değiştirin (Şekil 3B).
- Koloniler yeterince büyüyene kadar ortamı her 2 günde bir değiştirin. Orta değişiklik için, protokolün 4. bölümünü izleyin.
- Adım 5.1.1'de belirtildiği gibi, PSC kültür ortamına 10 μM Y-27632 ilavesiyle bazal membran matris kaplı kültür plakasını hazırlayın.
- Koloni toplama ile iPSC'lerin geçişi
- Adım 5.1.1'de belirtildiği gibi bazal membran matris kaplı 12 kuyucuklu taslaklar hazırlayın.
- Ortamı aspire edin ve 500 μL DPBS'yi dikkatlice ekleyerek hücreleri yıkayın. DPBS'yi çıkarın ve kuyuya 500 μL 0,5 mM EDTA ekleyin.
- Plakayı RT'de 1-3 dakika boyunca inkübe edin ve koloninin ayrılması sınırlarda görünene kadar hücreleri mikroskop altında gözlemleyin.
- EDTA'yı çıkarın ve dikkatlice 500 μL DPBS ekleyin. Hücreleri ayırmadan kuyuya yavaşça 500 μL PSC kültür ortamı eklemeden önce sıvıyı aspire edin.
- Farklılaşmış hücreleri toplamadan mikroskop altında istenen koloni seçmek için bir p200 pipet kullanın. Bunu yapmak için, ortam içeren hücreleri alırken koloninin üzerine yavaşça çizin.
- Toplanan her koloniyi, adım 5.3.1'de hazırlandığı gibi, bir bazal membran matris kaplı kuyuya aktarın. Hücreleri 2-5x pipetleyerek bir p1000 pipet kullanarak hücreleri küçük kümeler halinde ayırın.
- Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 30 dakika boyunca inkübe edin, böylece kümelerin yapışmasına izin verin.
- Çok sayıda yüzen ölü hücre gözlenirse, ortamı 750 μL PSC kültür ortamı ile değiştirin; aksi takdirde, 250 μL PSC kültür ortamı ekleyin.
NOT: 30 dakika sonra orta replasman, özellikle kararsız hücre hatları (örneğin, NHP'ler) için kritik öneme sahiptir. - Plakayı bir inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'ye yerleştirin.
- Koloniler geçiş için yeterince büyüyene kadar ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Bunu yapmak için, protokolün 4. bölümünü izleyin.
6. Uzun süreli depolama için idrar hücrelerinin ve iPSC'lerin dondurulması
NOT: Rutin olarak, iPSC'ler hücre dondurma ortamında sayılmadan kümeler halinde dondurulur. Tek hücrelere ayrışmayı önlemek için pipetleme minimum düzeyde olmalıdır. İdrar hücreleri için, rutin olarak, tüp başına 1,5 × 10 4 ila 3 ×ila 104 hücre dondurulur, bu da kullanıcının bir tüpü başka bir sayma adımına ihtiyaç duymadan doğrudan 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda çözmesine izin verir.
- 15 mL'lik bir tüpte 5 mL DPBS hazırlayın.
- İdrar hücrelerinin dondurulması için, protokolün 2.2-2.4 adımlarını izleyin. iPSC'lerin dondurulması için, küme geçiş protokolünden 5.1.2-5.1.5 adımlarını izleyin.
- Süspansiyonu adım 6.1'de hazırlanan 15 mL'lik tüpe aktarın. İdrar hücrelerinin dondurulması için, bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunun 10 μL'sini sayın. Hücreleri 200 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı tamamen aspire edin.
- Hücre peletini tüp başına 400 μL hücre dondurma ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri istenen miktarda kriyotüpe dağıtın.
- Kriyotüpleri hemen -80 ° C'ye aktarın. Dondurulmuş tüpleri uzun süreli depolama için -80 °C'de dondurulduktan 1 gün sonra -150 °C dondurucuya veya sıvı azota aktarın.
7. İdrar hücrelerinin ve iPSC'lerin çözülmesi
- İdrar hücrelerinin çözülmesi için, protokolün 1.1 adımında belirtildiği gibi, istenen miktarda jelatin kaplı 12 kuyucuklu hazırlayın. iPSC'ler için, adım 5.1.1'de belirtildiği gibi bazal membran matris kaplı 12 delikli plakaları hazırlayın. Her iki durumda da, matrisi ortamla değiştirmeyin.
- 4 mL DPBS içeren 15 mL'lik bir tüp hazırlayın ve 37 ° C'de saklayın.
- Donmuş bir hücre şişesini, bir parça yüzen buz görünene kadar çözülmesi için 37 ° C'lik bir su banyosuna hızlı bir şekilde yerleştirin.
NOT: Kirlenmeleri önlemek için kriyotüpü su banyosunda inkübasyondan önce ve sonra etanol ile silin. - İdrar hücreleri için 500 μL REMC ortamı veya iPSC'ler için 500 μL PSC kültür ortamını buz içeren süspansiyona ekleyin ve süspansiyonu derhal adım 7.2'de hazırlanan önceden ısıtılmış 15 mL tüpe aktarın.
- Tüpü 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin ve süpernatantı tamamen atın.
- İdrar hücreleri için, peleti 1 mL REMC ortamında yeniden askıya alın. iPSC'ler için, peletleri 750 μL PSC kültür ortamında dikkatlice askıya alın. Kümeleri sağlam tutmak için çok fazla pipetleme yapmaktan kaçının.
İsteğe bağlı: Ortamın 10 μM Y-27632 ile desteklenmesi, çözüldükten sonra iPSC'lerin hayatta kalmasını destekleyebilir. - Matrisi adım 7.1'de hazırlanan 12 delikli plakalardan aspire edin ve hücre süspansiyonunu dikkatlice kuyuya aktarın.
- Plakayı bir inkübatörde gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de yerleştirin.
- Ertesi gün, ortamı PSC kültür ortamıyla, iPSC'ler için Y-27632 olmadan ve idrar hücreleri için REMC ile değiştirin.
- Hücreleri bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de büyütün.
- Hücreler geçiş için yeterince büyüyene kadar ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Orta değişiklik için, protokolün 4. bölümünü izleyin.
8. İmmünositokimya
NOT: NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 ve EpCAM gibi pluripotensi ile ilişkili belirteçleri hedef alan antikorlarla immün boyama, yeni oluşturulan iPSC'lerin en yaygın kullanılan validasyonlarından biridir. Antikorlar ve seyreltmeler hakkında daha fazla bilgi Malzeme Tablosunda bulunabilir.
- Plaka iPSC'leri kullanımdan 1-3 gün önce uygun sayıda 12 delikli plakalarda kullanılır. Ortamı aspire edin, 500 μL DPBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve DPBS'yi çıkarın. Kuyucuk başına 400 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve hücreleri RT'de 15 dakika sabitleyin.
- % 4 PFA'yı çıkarın ve hücreleri DPBS ile 3 kat yıkayın. Kuyucuk başına 400 μL bloke tamponu ekleyin ve plakayı RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Bloke edici tamponu aspire edin ve her bir kuyucuğa 400 μL antikor seyreltme tamponunda (ADB) seyreltilmiş antikorları ekleyin. Plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Birincil antikorları içeren ADB'yi çıkarın ve hücreleri DPBS ile 3 kat yıkayın.
- DPBS'yi aspire edin ve kuyucuk başına ADB'de seyreltilmiş 400 μL ikincil antikor ekleyin. Plakayı karanlıkta RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- ADB'yi çıkarın ve hücreleri DPBS ile 3 kez yıkayın. Kuyu başına DPBS'de seyreltilmiş 1 μg / mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve RT'de 3 dakika inkübe edin.
- DAPI çözeltisini aspire edin ve hücreyi DPBS ile 3 kat yıkayın. Görüntüleme için 500 μL DPBS ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücreleri insan ve NHP idrarından izole ederken, izolasyondan hemen sonra farklı hücre tipleri tanımlanabilir. Skuamöz hücrelerin yanı sıra çeşitli küçük yuvarlak hücreler idrarla atılır; Kadın idrarı, erkek idrarından çok daha fazla skuamöz hücre içerir (Şekil 1B - Gün 0; Ek Şekil S1). Primer idrar ortamında 5 günlük kültürden sonra ilk yapışık proliferasyon yapan hücreler görülebilir (Şekil 1A,B - Gün 5). Bu noktada, ortamın yarısı, ilk koloniler ortaya çıkana kadar her gün REMC proliferasyon ortamı ile değiştirilir. Yaklaşık 13. günde, yapışkan hücreler geçilebilen büyük kolonilere dönüşür (Şekil 1B - Gün 13). Bu koloniler, morfolojik olarak birbirinden farklı iki hücre tipinden oluşabilir - biri yakından bağlı büyüyen hücrelerle daha epitel benzeri bir fenotipe sahipken, diğeri uzamış şekle ve daha yüksek göç kabiliyetine sahip daha mezenkimal benzeri bir morfoloji gösterir (Şekil 1C). İlk geçişten sonra, idrar hücreleri tek katmanlı olarak büyür ve kültür% 80 akıcılığa ulaştığında geçebilir (Şekil 1B - Gün 17).
Şekil 1: İdrar hücrelerinin izolasyonu ve yetiştirilmesi . (A) İnsan ve insan olmayan primat örneklerinden idrar hücreleri oluşturmak için iş akışı. (B) İlk geçişe kadar üriner hücrelerin büyümesini ve koloni oluşumunu gösteren faz-kontrast görüntüleri (p1). (C) İdrar örneklerinden izole edilen iki farklı hücre tipi, 2 haftalık kültürden sonra ayırt edilebilir. Ölçek çubukları = 250 μm (B,C). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
İdrar hücrelerinden iPSC'ler üretmek için, Yamanaka faktörleri OCT3/4, SOX2, KLF4 ve c-MYC'yi tanıtan Sendai virüsleri ile bir transdüksiyon kullanılır. Transdüksiyon verimliliğini arttırmak için, idrar hücreleri, bazal membran matris kaplı kuyucuklara tohumlanmadan önce, süspansiyonda 1 saat boyunca virüs ile inkübe edilir (Şekil 2A). Transdüksiyondan 1 gün sonra kuyucuklarda bazı yapışkan hücreler görülebilir (Şekil 2B - Gün 1). 5-10 gün sonra, bu hücreler koloniler oluşturmaya başlar ve hücrelerin yeniden programlandığını gösteren erken morfolojik değişiklikler gözlenebilir (Şekil 2B - Gün 14). Bu kolonilerin birçoğu aşamalı olarak ESC benzeri bir morfoloji gösterir ve çap 1 mm'yi aştığında PSC kültür ortamında toplanabilir. Toplandıktan sonra, hücreler yaklaşık 4 gün içinde tipik ESC morfolojisini gösteren koloniler oluştururlar (Şekil 2B - Gün 21 ve 24). iPSC kolonileri yeterince büyüdüğünde, hücreler küme geçiş protokolü kullanılarak ilk kez geçirilebilir (protokol adım 5.1).
Bu yeniden programlama yaklaşımı, insanlardan, Goril gorillerden (goril ) ve Pongo abelii'den (orangutan)15 iPSC'ler üretmek için kullanılmıştır. İdrar hücreleri elde etme olasılığı oldukça değişken ve şempanzeler için insanlardan en az iki ila üç kat daha düşük olsada15, elde edilen idrar hücrelerinin yeniden programlanması deneyimlerimize göre çoğunlukla başarılı olmuştur. Genel olarak, enfekte üriner hücrelerin% 0.19'u ESC benzeri morfolojiye sahip kolonilere yol açar ve yeniden programlama girişimlerinin% 87'sinde en az bir koloni ile sonuçlanır15. Oluşturulan tüm iPSC'ler aynı özellikleri paylaşır ve açıkça tanımlanmış kenarları olan sıkıca paketlenmiş hücrelerle karakterize edilen tipik ESC benzeri koloni morfolojisini gösterir (Şekil 2C). Ek olarak, tüm iPSC'ler normal bir karyotip gösterir ve SeV yeniden programlama kiti üreticisi tarafından önerildiği gibi en az beş geçişten sonra SeV yeniden programlama vektörlerinin yokluğu PCR tarafından doğrulanmıştır (veriler gösterilmemiştir)15. İmmünositokimya, çekirdekte NANOG, OCT3/4 ve SOX2 gibi pluripotens ile ilişkili proteinlerin ekspresyonunu test etmek için kullanılır. TRA-1-60, EpCAM ve SSEA4 gibi yüzey belirteçleri de kullanılabilir (Şekil 2D); Bununla birlikte, SSEA4 üriner hücrelerde de eksprese edilir15. Ayrıca, iPSC'lerin pluripotens durumu hakkında nicel bilgi sağlamak için bu yüzey belirteçleri kullanılarak akış sitometri analizi yapılabilir (Ohnuki ve ark.48 tarafından açıklanan yöntem). Bu yaklaşım, analiz edilen orangutan iPSC'lerinin% 95.3'ünün TRA-1-60 için pozitif olduğunu göstermek için kullanılır (Şekil 2E). Ayrıca, NHP iPSC'lerin farklılaşma kapasitesi, in vitro embriyoid cisim (EB) farklılaşması (Geuder ve ark.15 tarafından tanımlanan yöntem) ile kanıtlanabilir. Şekil 2F'de gösterildiği gibi, goril iPSC'leri endoderm (ɑ-fetoprotein), mezoderm (ɑ-düz kas aktin) ve ektoderm (β-III tübülin) soylarına farklılaşabilir.
Şekil 2: İdrar kaynaklı iPSC'lerin üretimi ve karakterizasyonu . (A) İdrar kaynaklı hücrelerin iş akışını yeniden programlama. (B) Goril üriner hücrelerinin iPSC kolonilerinin kurulmasına kadar yeniden programlama sırasında morfolojik değişikliklerini gösteren faz-kontrast görüntüleri. Ölçek çubukları = 500 μm. (C) İnsan, goril ve orangutan hücre kültürlerinden kurulan iPSC kolonilerinin morfolojisi. Ölçek çubukları = 500 μm. (D) Goril iPSC'lerinin 8. pasajda pluripotens ile ilişkili belirteçlerle immünofloresan boyanması: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM ve TRA-1-60. Ölçek çubukları = 100 μm. (E) Anti-TRA-1-60-PE ile boyanmış orangutan iPSC'lerin akış sitometri analizi. Kontrol olarak lekelenmemiş hücreler kullanıldı. (F) Goril iPSC'lerinin embriyoid cisim farklılaşmasından sonra endoderm (AFP), mezoderm (ɑ-SMA) ve ektodermin (β-III TUB) immünofloresan analizi. Çekirdekler DAPI ile boyandı. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; PE = fikoeritrin; AFP = α-fetoprotein; ɑ-SMA = alfa düz kas aktin; β-III TUB = beta III Tubulin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
İPSC kolonileri kabaca 2 mm'lik bir çapa ulaştığında veya birbirine dokunmak üzereyken, hücreler bölünmelidir. Rutin bakım için küme geçiş protokolünü kullanmanızı öneririz. Bu protokolde, koloni büyüklüğüne bağlı olarak hücreleri 3-5 dakika ayırmak için 0.5 mM EDTA kullanılır. EDTA inkübasyonu sırasında, kolonilerin sınırları soyulmaya başlar ve hücreler arasında görünür boşluklar ortaya çıkar (Şekil 3A). EDTA, mikroskop altında uygun bir ayrılma gözlendiğinde çıkarılmalıdır. EDTA ile uzun süreli inkübasyon, hayatta kalamayan tek hücrelerin daha yüksek bir fraksiyonuna yol açar. Daha sonra, hücreler Şekil 3A'da gösterildiği gibi benzer büyüklükteki kümelere ayrıştırılmalıdır. Hücreler küçük kümelere ayrılmamalıdır, çünkü bu hayatta kalmayı azaltır ve daha farklılaşan hücrelere yol açabilir.
Bir deney tanımlanmış sayıda hücrenin tohumlanmasını gerektirdiğinde, tek hücreli geçiş protokolü kullanılmalıdır. Bu protokol, ortamın, tek hücrelerin hayatta kalmasını sağlayan bir Kaya inhibitörü ile desteklenmesini içerir. Ekli tek hücrelerin, küme tohumlamasından sonra bir kolonide büyüyen hücrelere kıyasla farklı bir morfoloji göstermesi beklenmektedir (Şekil 3B - Gün 0). 1-2 günlük kültürden sonra, tek hücreler, ortama bir Kaya inhibitörü eklenirse, morfolojilerini ve gevşek hücre-hücre temaslarını koruyarak tekrar koloniler halinde büyümeye başlar (Şekil 3B - Gün 2). Bu küçük koloniler gözlendiğinde, Kaya inhibitörü ortamdan çıkarılmalı ve hücrelerin tipik ESC benzeri morfolojiyi tekrar göstermesine izin verilmelidir (Şekil 3B - Gün 4).
Bir iPSC kolonisinin yüksek kalitede olup olmadığına karar vermek için, birkaç yönün dikkate alınması gerekir. İlk olarak, sağlıklı kolonilerin hiç veya az miktarda spontan farklılaşma göstermesi normaldir; Bununla birlikte, farklılaşmış hücre sayısının artması (%>10) düşük iPSC kalitesinin göstergesidir. Düşük iPSC kalitesinin ek özellikleri, sınır bütünlüğü ve homojenlik kaybının (Şekil 3C: sağda) yanı sıra hücreler arasında görünür boşluklara sahip gevşek hücresel ambalajlardır (Şekil 3D: sağda). Buna karşılık, yüksek kaliteli iPSC'ler tanımlanmış sınırlar, sıkı hücresel ambalajlar ve belirgin nükleoller ile karakterize edilir (Şekil 3C, D: sol görüntüler).
Resim 3: Primat iPSC kültürü. (A) Küme geçiş protokolünü takiben EDTA inkübasyonu sırasında iPSC kolonilerinin ayrılmasını ve ayrışma sonrası optimal küme boyutunu gösteren faz kontrastlı görüntüler. Ölçek çubukları = 250 μm. (B) Tek hücreli geçişten sonra iPSC kurtarma zaman çizelgesi. Kaya inhibitörü Y-27632, 2. günden itibaren çıkarıldı. Ölçek çubukları = 250 μm. (C) Sol: tanımlanmış sınırları olan yüksek kaliteli bir insan iPSC kolonisi örneği. Sağ: Daha az sınır bütünlüğü ve farklılaşmış hücreler gösteren düşük kaliteli bir koloni örneği. Ölçek çubukları = 500 μm. (D) Yüksek kaliteli bir insan iPSC kolonisi (solda) için gevşek paketlenmiş hücrelere sahip düşük kaliteli bir koloniye (sağda) kıyasla örnek görüntüler. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: İnsan idrarında bulunan hücre tiplerine genel bakış. (A) Kadın idrarından izole edilen hücreler. (B) Erkek idrarından izole edilen hücreler. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: Bu çalışmada kullanılan tampon ve ortam bileşimleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSC'ler, in vitro olarak erişilemeyen hücre tiplerinin üretilmesine izin verdikleri için değerli hücre tipleridir. Yeniden programlamanın başlangıç materyalleri olarak, örneğin, fibroblastlar tüm primat türlerinden kolayca elde edilemediğinden, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden iPSC'lerin üretilmesi için bir protokol sunmaktadır. Bu hücreler, kültür ortamını geniş spektrumlu antibiyotiklerle destekleyerek, steril olmayan primat idrar örneklerinden bile invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilir.
Protokoldeki birkaç kritik adım bazı ek tartışmalara değer. İlk olarak, hücreleri steril olmayan idrardan izole ederken, kontaminasyon riskini azaltmak için ortamı geniş spektrumlu bir antimikrobiyal reaktif ile desteklemek önemlidir. Antibiyotik kullanımına rağmen mikrobiyolojik kontaminasyonun büyümesi belirginleşirse, tüm kültürün atılması ve alanın dezenfekte edilmesi önerilir; Ek olarak, deneyimlerimize göre, devam eden kültürleme, sağlıklı büyüyen idrar hücreleri üretmez. İkincisi, hücreleri yeniden programlamaya başlarken, tüm hücrelerin aşırı akıcılık ile ayrılma riskini önlemek ve iPSC edinme olasılığını artırmak için farklı sayıda SeV transdübe edilmiş hücreye sahip birkaç yemek hazırlamak şiddetle tavsiye edilir. Genel olarak, daha yüksek yoğunlukta SeV-dönüştürülmüş hücrelerin kaplanmasının daha fazla yeniden programlanmış iPSC kolonisi üretmesi beklenirken, yeniden programlama hücrelerinin ~ 20 günlük bir süre boyunca kültürlenmesi genellikle aşırı akıcılık ve ardından tüm kuyunun ayrılması ile sonuçlanır. Üçüncüsü, iPSC'lerin ayrışmasını gerektiren her adımda, önemli hücre ölümüne yol açan kapsamlı pipetlemeden kaçınmak çok önemlidir. Özellikle kümelenme geçişi yapılırken kümelenmelerin uygun boyutta tutulması önemlidir (Şekil 3A). Çok büyük kümeler hızlı farklılaşmaya neden olabilirken, çok küçük olan kümeler hayatta kalmayı azaltabilir.
İdrar hücrelerinin elde edilme olasılığının örnekler ve alikotlar arasında oldukça değişken olduğunu gözlemledik, ancak daha küçük hacimlerin koloni elde etmede daha düşük bir başarı oranına sahip olduğuna dair bir kanıt bulamadık. Genel olarak, 100 mL insan idrarından ortalama 7.6 koloni izole ettik. Bu ortalama oran ve Poisson dağılımı varsayıldığında, en az bir koloni elde edilmesi, 50 mL başlangıç materyali için ~% 98 ve 5 mL başlangıç materyali için ~% 30 olasıdır. Bizim durumumuzda, girişimlerin% 42'sinde 5 mL insan idrarından en az bir koloni izole etmek mümkündü15. Buna dayanarak, kolonilerin izolasyonu, sadece küçük miktarlarda idrar mevcut olsa bile, denemeye değer olabilir. İdrar hücrelerinin yeniden programlanmasının başarısız olması ve hiçbir iPSC kolonisinin gözlenememesi durumunda, farklı sayıda transfekte hücrenin kaplanması idrardan türetilmiş hücrelerin yeniden programlanmasına neden olabilir. Ortaya çıkan iPSC kolonileri, yüzey belirteçleri kullanılarak canlı boyama yoluyla iPSC'ler olarak da tanımlanabilir (örneğin, TRA-1-60 veya alkalen fosfataz [AP]; veriler gösterilmemiştir). AP aktivitesinin pluripotent kök hücrelerde yukarı regüle edildiği bilinmektedir ve kültür işlemi sırasında kök hücreleri geçici olarak boyamak için kullanılabilir. Protokolün bir diğer olası tuzağı, NHP iPSC'lerin optimal kültürüdür. Bu protokolü kullanarak, insan ve NHP iPSC'lerinin ticari olarak temin edilebilen bir ortam kullanarak 50'den fazla pasaj için pluripotent durumlarını koruduklarını doğruladık. Bununla birlikte, insan iPSC'lerine kıyasla, NHP iPSC'leri, potansiyel olarak NHP kültürleri için değil, insan için optimize edilmiş kültür koşulları nedeniyle, deneyimlerimizde kendiliğinden farklılaşmaya daha yatkındır. Ek olarak, iPSC klonları arasında kaplama sonrası hayatta kalma oranlarında, büyüme hızında ve farklılaşma eğiliminde büyük değişkenlik vardır. Bu nedenle, genellikle her klon için ayrı ayrı en uygun bölme oranını, geçiş zamanlamasını ve küme boyutunu belirlemek gerekir.
Üriner hücreleri NHP'lerden izole etmek için 5 mL'lik bir hacmin bile yeterli olabileceğini gösterdik15. Bununla birlikte, insanlarda, gorillerde ve orangutanlarda izole edilmiş idrar hücrelerinin sayısında anlamlı bir fark bulamasak da, şempanzeler idrar hücrelerini toplam 87 mL'den izole edemediğimiz için daha düşük bir orana sahipti. Bu nedenle, bazı türler için, diğerlerinden çok daha fazla idrar toplamak gerekebilir. Küçük primatlardan büyük hacimlerin toplanması özellikle zor olabilir, ancak idrar hücrelerinin izolasyonu oldukça uygun maliyetli olduğundan, sadece belirli türler ve mevcut idrar hacimleri için denemek pratiktir. Ne yazık ki, idrar örnekleri dondurulamaz, bu da örneklerin toplanabileceği yarıçapı sınırlar. Bununla birlikte, 4 ° C'de 4 saatlik bir depolama süresinin, izole edilen kolonilerin sayısı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterdik15 ve daha uzun bir depolama süresi veya depolama koşullarının iyileştirilmesi mümkün olabilir. Doğrulama için çeşitli kalite kontrol testleri başlattık. Bununla birlikte, bir iPSC hattı bu kriterleri karşılasa bile, klonal heterojenite hala önemlidir, bu da genetik arka plan49 ve epigenetik durum50,51,52,53,54 ile açıklanmıştır. Primat iPSC'leri gelecekteki karşılaştırmalı analizlere uygulamak için, heterojenliği göz önünde bulundurmalı ve klonal varyasyonun ortalamasını almak için yeterli klon kullanılmalı, böylece sonucun yanlış yorumlanmasından kaçınılmalıdır.
Bununla birlikte, idrarın birincil hücreler için bir kaynak olarak kullanılması, örneğin yeniden programlama için fibroblastların kullanıldığı geleneksel yöntemlere göre büyük bir avantaja sahiptir, çünkü bunlar tamamen invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilir. Ek olarak, bu protokol, geleneksel yeniden programlamadan daha kısa bir süre ile idrar kaynaklı hücrelerden iPSC'lerin üretilmesine izin verir. Bu yöntemle, koloniler 5-15 gün içinde görünür hale gelirken, primat fibroblastlarından (rhesus, babun) kolonilerin 20-30 gün sonra daha sonra ortaya çıkma eğiliminde olduğunu bulduk. Ek olarak, bu süspansiyon enfeksiyonu yönteminin kullanılmasıyla, virüs transdüe edilen hücrelerin% 0.19'u pluripotent hücre benzeri morfolojiye sahip kolonilere yol açmıştır. Bu, girişimlerin% 87'sinde en az bir koloni ile sonuçlandı15. Buna karşılık, SeV'nin bağlı hücrelerle konvansiyonel transdüksiyon yönteminin ve epizomal plazmidlerle lipofeksiyonun, sırasıyla pluripotent bir koloni oluşturan hücrelerin% 0.09 ve% 0.009'u ile anlamlı derecede daha düşük bir yeniden programlama etkinliğine sahip olduğu gösterilmiştir15.
Özetle, bu yöntem üriner hücrelerin invaziv olmayan izolasyonuna ve hemen hemen her insan donöründen ve birçok NHP'den besleyicisiz iPSC'lerin üretilmesine izin verir. Bu, bu iPSC'lerden ayırt edilebilen değerli hücre tiplerine erişilebilirliği artırır. Ayrıca, bu yöntem, hastalık modellemesi veya gelecekteki hücre bazlı tedaviler için kullanılabilecek hastaya özgü iPSC'ler üretmek için kullanılabilir. Son olarak, iPSC'ler sadece küçük miktarlarda idrardan üretilebildiğinden, bu yöntem daha birçok farklı primat ve hatta memeli türüne uygulanabilir. Bu nedenle, bu yöntem, insana özgü özelliklerin evriminin daha iyi anlaşılmasını sağlayabilecek türler arası karşılaştırma için güçlü bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma DFG EN 1093/5-1 (proje numarası 458247426) tarafından desteklenmiştir. M.O. JSPS Overseas Research Fellowship tarafından desteklenmiştir. Tüm figürler BioRender.com ile oluşturuldu. Akım sitometrisi, Münih Biyomedikal Merkezi'ndeki Core Facility Flow Cytometry yardımıyla gerçekleştirildi. Kyoto Üniversitesi ASHBi'den Makoto Shida ve Tomoyo Muto'ya videografiye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
