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Biology

मूत्र से प्राप्त प्राइमेट प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन और रखरखाव

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/64922
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल मानव और गैर-मानव प्राइमेट मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) के लिए अलग करने, विस्तार ति करने और पुन: प्रोग्राम करने की एक विधि का वर्णन करता है, साथ ही साथ नए उत्पन्न आईपीएससी के फीडर-मुक्त रखरखाव के लिए निर्देश भी देता है।

Abstract

प्राइमेट प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं और उनके डेरिवेटिव का अध्ययन करने वाले क्रॉस-प्रजाति दृष्टिकोण रोग, विकास और विकास के आणविक और सेलुलर तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्राइमेट प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को अधिक सुलभ बनाने के लिए, यह पेपर मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं से मानव और गैर-मानव प्राइमेट आईपीएससी उत्पन्न करने और फीडर-मुक्त संवर्धन विधि का उपयोग करके उनके रखरखाव के लिए एक गैर-इनवेसिव विधि प्रस्तुत करता है।

मूत्र को एक गैर-बाँझ वातावरण (जैसे, जानवर के पिंजरे) से नमूना लिया जा सकता है और संदूषण को कुशलतापूर्वक कम करने के लिए प्राथमिक सेल कल्चर के दौरान एक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक कॉकटेल के साथ इलाज किया जा सकता है। मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रसार के बाद, आईपीएससी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेंडाई वायरस वेक्टर सिस्टम की एक संशोधित पारगमन विधि द्वारा उत्पन्न होते हैं। पहली आईपीएससी कॉलोनियां 5 दिनों के बाद पहले से ही दिखाई दे सकती हैं, और जल्द से जल्द 10 दिनों के बाद उठाई जा सकती हैं। एंजाइम-मुक्त पृथक्करण बफर के साथ नियमित क्लंप पासिंग 50 से अधिक मार्गों के लिए उत्पन्न आईपीएससी की प्लुरिपोटेंसी का समर्थन करता है।

Introduction

मानव और गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) की जीनोमिक तुलना हमारे विकासवादी इतिहास और मानव-विशिष्ट लक्षणों के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्णहै। इसके अतिरिक्त, ये तुलनासंरक्षित डीएनए अनुक्रम2 की पहचान करके फ़ंक्शन के अनुमान की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, रोग से जुड़े वेरिएंट3 को प्राथमिकता देने के लिए। जीन अभिव्यक्ति स्तर जैसे आणविक फेनोटाइप की तुलना जीनोमिक तुलना की बेहतर व्याख्या करने और उदाहरण के लिए, सेलुलर फेनोटाइपिक मतभेदों की खोज करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, उनके पास - डीएनए स्तर पर तुलना के समान - कार्यात्मक प्रासंगिकता का अनुमान लगाने की क्षमता है, और इसलिए मनुष्यों के भीतर चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक भिन्नता की बेहतर व्याख्या करने की क्षमताहै। इन तुलनात्मक अध्ययनों में व्यापक आणविक फेनोटाइपिक डेटा को शामिल करने के लिए उपयुक्त जैविक संसाधनों (यानी, प्रजातियों में ऑर्थोलॉगस कोशिकाओं) की आवश्यकता होती है। हालांकि, नैतिक और व्यावहारिक कारण ऐसी तुलनीय कोशिकाओं तक पहुंचना मुश्किल या असंभव बनाते हैं, खासकर विकास के दौरान। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) विट्रो5,6 में ऐसे दुर्गम सेल प्रकारों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं, प्रयोगात्मक रूप से सुलभ हैं, और प्राइमेट तुलना6,7,8,9,10,11,12,13,14 के लिए उपयोग किया गया है।

आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए, किसी को पुन: प्रोग्राम किए जाने के लिए प्राथमिक कोशिकाओं का अधिग्रहण करने की आवश्यकता होती है। मूत्र से अलग कोशिकाओं का लाभ यह है कि उन्हें प्राइमेट्स से गैर-आक्रामक रूप से नमूना लिया जा सकता है, और उन्हें आसानी से पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है, शायद उनके स्टेम सेल जैसे आणविक प्रोफाइल15 के कारण। प्राइमेट आईपीएससी को बनाए रखने के लिए संस्कृति की स्थिति रीप्रोग्रामिंग के रूप में महत्वपूर्ण है; शास्त्रीय रूप से, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति के लिए माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट - तथाकथित फीडर कोशिकाओं के एक गैर-परिभाषित, सीरम-आधारित माध्यम और सह-संस्कृति की आवश्यकता होती है - जो भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) 16 के लिए आवश्यक पोषक तत्व और एक मचान प्रदान करते हैं। रासायनिक रूप से परिभाषित और फीडर-मुक्त संस्कृति प्रणालियों17,18 के विकास के बाद से, अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईपीएससी संस्कृति मीडिया और मैट्रिक्स के विभिन्न विकल्प हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश संस्कृति स्थितियों को मानव ईएससी और आईपीएससी के लिए अनुकूलित किया गया है, और इसलिए एनएचपी आईपीएससी संस्कृति में कम अच्छी तरह से काम कर सकता है। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम मूत्र कोशिका संस्कृति से प्राप्त मानव और एनएचपी आईपीएससी उत्पन्न करने और बनाए रखने के निर्देश प्रदान करते हैं।

2006 में फाइब्रोब्लास्ट में परिभाषित कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा आईपीएससी पीढ़ी की पहली रिपोर्ट के बाद से, इस विधि को विभिन्न मूलके कई अलग-अलग सेल प्रकारों 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 पर लागू किया गया है।, 32. उनमें से, केवल मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को पूरी तरह से गैर-आक्रामक तरीके से प्राप्त किया जा सकता है। झोउ एट अल .33 द्वारा पहले वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर, व्यापक स्पेक्ट्रमएंटीबायोटिक दवाओं के पूरक द्वारा गैर-बाँझ नमूनों से भी प्राइमेट मूत्र से कोशिकाओं को अलग और विस्तारित किया जा सकता है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल द्वारा नमूना किए गए मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट (हमारे अनुभव में 20-30 दिनों) की पारंपरिक रीप्रोग्रामिंग की तुलना में कम समय के भीतर आईपीएससी का उत्पादन करने की उच्च क्षमता प्रदर्शित करती हैं (कॉलोनियां 5-15 दिनों में दिखाई देती हैं), और पर्याप्त रूप से उच्च सफलता दर के साथ। इन मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को मेसेनकाइमल स्टेम सेल जैसी कोशिकाओं और मूत्राशय उपकला कोशिकाओं की मिश्रित आबादी के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जिससे उच्च रीप्रोग्रामिंग दक्षता15 हो गई।

प्राथमिक कोशिकाओं में भिन्नता के अलावा, आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए रीप्रोग्रामिंग विधियां भी उपयोग के उद्देश्य के अनुसार भिन्न होती हैं। मानव दैहिक कोशिकाओं के लिए पारंपरिक रीप्रोग्रामिंग प्रक्रियाओं को रेट्रोवायरस या लेंटिवायरस वैक्टर के साथ रीप्रोग्रामिंग कारकों के ओवरएक्प्रेशन द्वारा किया गया था, जिसने जीनोम 5,34,35 में बहिर्जात डीएनए के एकीकरण की अनुमति दी थी। उत्पन्न आईपीएससी को जीनोमिक रूप से बरकरार रखने के लिए, शोधकर्ताओं ने विभिन्न प्रकार की गैर-एकीकरण प्रणालियों को विकसित किया है - एक्सिसेबल पिग्गीबैक वेक्टर 36,37, एपिसोमल वेक्टर38,39, गैर-एकीकृत वायरस वैक्टर जैसे सेंडाई वायरस 40 और एडेनोवायरस 41, एमआरएनए अभिकर्मक 42, प्रोटीन अभिकर्मक 43,44, और रासायनिक यौगिक उपचार 45।. हैंडलिंग में दक्षता और आसानी के कारण, इस प्रोटोकॉल में सेंडाई वायरस-आधारित रीप्रोग्रामिंग वैक्टर का उपयोग किया जाता है। प्राथमिक कोशिकाओं का संक्रमण चढ़ाना से पहले 5 की संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर कोशिकाओं और वायरस की 1 घंटे की निलंबन संस्कृति में किया जाता है। यह संशोधित कदम सेल सतहों और वायरस के बीच संपर्क की संभावना को बढ़ा सकता है, पारंपरिक विधि की तुलना में जिसमें वायरस को सीधे अनुयायी सेल संस्कृति में जोड़ा जाता है, और इस प्रकार अधिक आईपीएससी कॉलोनियां15 उत्पन्न होती हैं।

मानव और एनएचपी प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की पासिंग क्लंप पासिंग और सिंगल-सेल पासिंग द्वारा की जा सकती है। एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) एक लागत कुशल चेलटिंग एजेंट है जो कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों को बांधता है, और इस प्रकार कैडरिन और इंटीग्रिन की अनुयायी गतिविधि को रोकता है। ईडीटीए का उपयोग हल्के, चयनात्मक पृथक्करण अभिकर्मक के रूप में भी किया जाता है, क्योंकि उदासीन कोशिकाएं अपने अलग-अलग आसंजन अणुओं के कारण विभेदित कोशिकाओं से पहले अलग हो जाती हैं। पूर्ण पृथक्करण प्रोटीन काइनेज (Rho/Rock)-मध्यस्थता मायोसिन हाइपरएक्टिवेशन युक्त Rho/Rho-संबद्ध कॉइल्ड-कॉइल के माध्यम से प्राइमेट आईपीएससी की बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है। इसलिए, एक Rho / Rock अवरोधक के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करना उन प्रयोगों के लिए आवश्यक है जिनके लिए निलंबन46,47 में एकल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, हम नियमित पासिंग विधि के रूप में क्लंप पासिंग की सलाह देते हैं और एकल-सेल पासिंग की सलाह केवल तभी देते हैं जब यह आवश्यक हो, उदाहरण के लिए, जब परिभाषित सेल नंबरों की सीडिंग की आवश्यकता होती है, या उप-क्लोनिंग के दौरान।

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Protocol

इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया को मानव प्रयोग पर जिम्मेदार नैतिक समिति (20-122, एथिकोममिशन एलएमयू म्यूनचेन) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी प्रयोग प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किए गए थे।
नोट: मानव और एनएचपी नमूनों से निपटने वाले प्रयोगों को शुरू करने से पहले उचित नैतिक समिति से अनुमोदन प्राप्त किया जाना चाहिए। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किया जाना चाहिए। निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तकनीक का उपयोग करके किया जाना चाहिए। सभी बफर और मीडिया रचनाएं पूरक तालिका एस 1 में पाई जा सकती हैं। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं में जोड़े जाने से पहले सभी मीडिया को कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) तक गर्म किया जाता है। प्रत्येक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए, जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो।

1. मूत्र के नमूनों से कोशिकाओं का अलगाव

सावधानी: सुनिश्चित करें कि मानव दाता मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी), हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), और हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) से मुक्त हैं। एनएचपी के लिए, सुनिश्चित करें कि संभावित दाता / कोशिकाएं विशिष्ट रोगजनकों-बी वायरस (बीवी), सिमियन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एसआईवी), सिमियन बीटारेट्रोवायरस (एसआरवी), और सिमियन टी सेल लिम्फोट्रोपिक वायरस (एसटीएलवी) से मुक्त हैं।

  1. प्रति अच्छी तरह से 0.2% जिलेटिन के 500 μL जोड़कर जिलेटिन-लेपित 12-वेल प्लेट तैयार करें, और प्लेट को स्थानांतरित करके तरल वितरित करें। आवश्यकता से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में मानव मूत्र के नमूने एकत्र करें। प्राइमेट्स के लिए, एक सिरिंज के साथ पशु सुविधा के फर्श से मूत्र एकत्र करें।
    नोट: 42% प्रयासों में कम से कम एक कॉलोनी को अलग करने के लिए मूत्र की 5 एमएल की मात्रा पर्याप्त साबित हुई थी। हालांकि, कॉलोनियों को अलग करने की संभावना को बढ़ाने के लिए ~ 50 एमएल मूत्र की उच्च मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। एनएचपी मूत्र को यथासंभव ताजा नमूना लिया जाना चाहिए, अधिमानतः पेशाब के तुरंत बाद। 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मूत्र के नमूनों के भंडारण का प्रोटोकॉल की सफलता दर पर कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं पड़ा, लेकिन लंबे समय तक भंडारण समय का परीक्षण नहीं किया गया था।
  3. 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर मूत्र युक्त ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, और ट्यूब में लगभग 1 एमएल छोड़ते हुए सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
  4. अवशिष्ट 1 एमएल तरल में गोली को फिर से निलंबित करें। यदि मूत्र की कई नलियां एकत्र की गई थीं, तो निलंबन को एक ट्यूब में पूल करें।
  5. ट्यूब में 2.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन युक्त 10 मिलीलीटर मूत्र धोने वाले बफर ( पूरक तालिका S1 देखें) जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, और सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके निलंबन को सावधानीपूर्वक मिलाएं।
  6. ट्यूब को 10 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और ट्यूब में लगभग <0.2 एमएल छोड़ते हुए सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
  7. प्राथमिक मूत्र माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें ( पूरक तालिका एस 1 देखें) जिसमें शुरू में संसाधित मूत्र के प्रति 50 एमएल में 0.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन होता है (1 एमएल में पुन: निलंबित, भले ही 50 एमएल से कम मूत्र संसाधित किया गया हो)।
  8. कुओं से एस्पिरेट जिलेटिन (चरण 1.1 में तैयार), और चरण 1.7 से निलंबन की प्लेट 1 एमएल को 12-वेल प्लेट के एक कुएं में डालें। जितना चाहें उतने कुओं के लिए दोहराएं, या जितने मिलियन लीटर निलंबन उपलब्ध हैं।
    वैकल्पिक: अस्वच्छ नमूना संग्रह से उत्पन्न संदूषण से बचने के लिए, यहां से कोशिकाओं में 100 μg / mL रोगाणुरोधी अभिकर्मक जोड़ें, जब तक कि पहला मार्ग न हो जाए।
  9. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  10. मौजूदा माध्यम को हटाए बिना, 5 वें दिन तक प्रतिदिन प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर प्राथमिक मूत्र माध्यम जोड़ें।
  11. 5 वें दिन, प्लेट से 4 मिलीलीटर मध्यम को एस्पिरेट करें, जिससे लगभग 1 मिलीलीटर मध्यम बच जाए। नए कल्चर माध्यम के साथ 1: 1 मिश्रण प्राप्त करने के लिए प्रति कुएं आरईएमसी माध्यम (पूरक तालिका एस 1 देखें) के 1 एमएल जोड़ें।
  12. पहली कॉलोनियां दिखाई देने तक हर दिन आरईएमसी माध्यम के साथ माध्यम के आधे हिस्से को बदलें (चित्रा 1 ए, बी)। इसलिए, पुराने माध्यम के 1 एमएल को हटा दें, और प्रति अच्छी तरह से ताजा आरईएमसी माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।

2. मूत्र कोशिकाओं का विस्तार

नोट: संस्कृति 90% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने से पहले मूत्र कोशिका पासिंग आयोजित की जानी चाहिए।

  1. जिलेटिन-लेपित 12-वेल प्लेटों की वांछित मात्रा तैयार करें, जैसा कि चरण 1.1 में बताया गया है।
  2. पुराने माध्यम को एस्पिरेट करें, और डलबेकको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 1 एमएल को जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  3. डीपीबीएस को एस्पिरेट करें, और डीपीबीएस के साथ पतला 0.5 x पृथक्करण एंजाइम के 300 μL जोड़ें। प्लेट को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए आरईएमसी माध्यम के 700 μL जोड़ें। पी 1000 पिपेट का उपयोग करके निलंबन को धीरे से पिपेट करें जब तक कि कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग नहीं किया जाता है।
  5. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और ट्यूब को 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. सतह पर तैरने वाले को ध्यान से घुमाएं और आरईएमसी माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. सेल काउंटर (एक हेमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर) का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  8. मूत्र कोशिकाओं के विस्तार के लिए, प्लेट 1.5 × 10 4 से 3 × 104 कोशिकाओं को आरईएमसी माध्यम के 1 एमएल में 0.2% जिलेटिन के साथ लेपित एक 12-वेल प्लेट में विभाजित किया जाता है।
  9. हर दूसरे दिन बाद के माध्यम परिवर्तन करें जब तक कि संस्कृति 80% -90% सामंजस्य तक न पहुंच जाए। इसलिए, पुराने माध्यम को एस्पिरेट करें और ताजा आरईएमसी माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।

3. सेंडाई वायरस वेक्टर संक्रमण द्वारा आईपीएससी का उत्पादन।

नोट: रीप्रोग्रामिंग प्रक्रिया के वर्कफ़्लो के लिए, चित्र 2A देखें। रीप्रोग्रामिंग के लिए उपयोग की जाने वाली मूत्र कोशिकाएं यथासंभव युवा होनी चाहिए, लेकिन मार्ग 4 से पहले रीप्रोग्रामिंग दक्षता का उल्लेखनीय नुकसान नहीं देखा जाता है। सेंडाई वायरस रीप्रोग्रामिंग किट का उपयोग बीएल -2 सुविधा में किया जाना चाहिए। लैमिनर प्रवाह के साथ जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत वायरस को संभालें, और म्यूकोसल एक्सपोजर को रोकने के लिए हमेशा उचित सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।

  1. प्रति कुएं 500 μL बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स जोड़कर एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-वेल प्लेट तैयार करें, और प्लेट को स्थानांतरित करके तरल वितरित करें। प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को 900 μL REMC माध्यम से बदलें। उपयोग तक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेंडाई रीप्रोग्रामिंग किट के घटकों को जल्दी से पिघलाएं। सेंडाई वायरस (पॉलीसिस्ट्रोनिक KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC, और KLF4) को 5 के MOI के साथ मिलाएं, और REMC माध्यम को 100 μL तक जोड़ें। समीकरण (1) का उपयोग करें:
    Equation 1
    नोट: चूंकि वायरस टिटर्स लॉट के बीच भिन्न होते हैं, इसलिए हमेशा निर्माता द्वारा प्रदान किए गए विश्लेषण के प्रमाण पत्र में टिटर की जांच करें।
    वैकल्पिक: पारगमन दक्षता के लिए सकारात्मक नियंत्रण के अलावा हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) सेंडाई वायरस का उपयोग करें। इसके लिए, चरण 3.3 के दौरान एक अलग ट्यूब में अतिरिक्त 3.5 × 104 कोशिकाएं तैयार करें।
  3. मूत्र कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए, चरण 2.2-2.4 का पालन करें। सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और 7 × 104 मूत्र कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, और सेल गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें। चरण 3.2 में तैयार एसईवी मिश्रण के 100 μL में गोली को पुन: निलंबित करें। निलंबन संक्रमण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  5. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-वेल प्लेटों पर निलंबन को प्लेट करें जो चरण 3.1 में तैयार किए गए थे। नियमित रूप से, प्लेट 1 × 10 4 और 2.5 × 104 कोशिकाएं प्रति कुएं डुप्लिकेट में।
  6. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। माध्यम को 1 एमएल ताजा आरईएमसी माध्यम के साथ 24 घंटे पोस्ट-ट्रांसडक्शन और दिन 3 पर बदलें।
  7. पारगमन के बाद दिन 5 पर, माध्यम को पीएससी पीढ़ी माध्यम में बदलें (पूरक तालिका एस 1 देखें), हर दूसरे दिन बाद के माध्यम में परिवर्तन के साथ। इसलिए, पुराने माध्यम को हटा दें और प्रति कुएं पीएससी उत्पादन माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: पहली कॉलोनी दिखाई देने तक 15 दिन तक का समय लग सकता है।
  8. अलग-अलग आईपीएससी कॉलोनियों को चुनें जब कॉलोनी का आकार 1 मिमी से अधिक हो। ऐसा करने के लिए, माइक्रोस्कोप के नीचे पी 10 पिपेट के साथ एक एकल कॉलोनी को खुरचें और ध्यान से इकट्ठा करें। कॉलोनी को 12-वेल प्लेट के एक नए कुएं में स्थानांतरित करें, जिसमें एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित किया गया है जिसमें पीएससी कल्चर माध्यम के 750 μL हैं।
    वैकल्पिक: प्लेट को डीपीबीएस के साथ धोना और चुनने से पहले 0.5 एमएम ईडीटीए के साथ 1 मिनट के लिए इलाज करना आगे के कदमों की मजबूत संस्कृति का समर्थन कर सकता है। यदि कोशिकाओं को बाद में उभरती कॉलोनियों की प्रतीक्षा करने के लिए लंबे समय तक सुसंस्कृत किया जाना है, तो इस ईडीटीए उपचार चरण को न करें।
  9. प्रोटोकॉल के खंड 4 में बताए गए अनुसार हर दूसरे दिन बाद के मध्यम परिवर्तनों के साथ कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर विकसित करें। जब चुनी गई कॉलोनी 2 मिमी के व्यास तक पहुंच जाती है, तो नियमित आईपीएससी पासिंग के साथ जारी रखें, जैसा कि प्रोटोकॉल के अनुभाग 5 में बताया गया है।

4. मध्यम परिवर्तन

नोट: संस्कृति माध्यम को हर दूसरे दिन बदला जाना चाहिए जब तक कि कॉलोनियां पासिंग के लिए पर्याप्त बड़ी न हो जाएं।

  1. पुराने माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रति 12-वेल प्लेट में 750 μL ताजा माध्यम जोड़ें। एक अलग प्रकार के माध्यम पर स्विच करने के लिए, पासिंग के कम से कम 1 दिन बाद माध्यम को बदलें।

5. पासिंग

नोट: कोशिकाओं को तब पारित किया जाना चाहिए जब आईपीएससी कॉलोनियां काफी बड़ी हो जाती हैं (व्यास 2 मिमी >), या कॉलोनियां एक-दूसरे को छूने वाली होती हैं। नियमित रूप से, आईपीएससी को लगभग हर 5 दिनों में विभाजित किया जा सकता है। नियमित रखरखाव के लिए क्लंप-पासिंग (चरण 5.1) का उपयोग करें, और प्रयोगों के लिए एकल-सेल पासिंग (चरण 5.2) का उपयोग करें जहां कोशिकाओं की एक परिभाषित संख्या की आवश्यकता होती है। यदि आईपीएससी बहुत अंतर करते हैं, तो कॉलोनी चुनना (चरण 5.3) संस्कृतियों की शुद्धता में सुधार करने में मदद कर सकता है।

  1. क्लंप-पासिंग
    1. प्रति कुएं 500 μL बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स जोड़कर एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-वेल प्लेट तैयार करें, और प्लेट को स्थानांतरित करके तरल वितरित करें। प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को पीएससी कल्चर माध्यम के 500 μL के साथ बदलें और उपयोग तक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. सुसंस्कृत कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें, और डीपीबीएस के 500 μL को सावधानीपूर्वक जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। DPBS को निकालें और कुएं में 0.5 mM EDTA के 500 μL जोड़ें।
    3. प्लेट को 2-5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, जब तक कि कॉलोनियां अलग न होने लगें। माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें।
    4. जब कॉलोनियों के किनारे छीलने लगते हैं और कोशिकाओं के बीच अंतराल दिखाई देने लगते हैं (चित्रा 3 ए), तो ईडीटीए को हटा दें और ध्यान से डीपीबीएस के 500 μL जोड़ें।
      नोट: हमेशा कुएं की साइड दीवार के खिलाफ पिपेट करें और कभी भी सीधे कोशिकाओं पर न डालें, ताकि प्लेट से कोशिकाओं को अलग न किया जा सके।
    5. डीपीबीएस को एस्पिरेट करें और पी 1000 पिपेट का उपयोग करके पीएससी कल्चर माध्यम के 500 μL के साथ कुएं को फ्लश करें। उपनिवेशों को उपयुक्त आकार के झुरमुट में फैलाने के लिए 1x-5x ऊपर और नीचे पिपेट करें (चित्र 3A)। बहुत अधिक पिपेट न करें।
      नोट: यदि आईपीएससी गलती से बहुत अधिक पाइप किए गए हैं, तो माध्यम में रॉक इनहिबिटर वाई -27632 के 10 μM जोड़ें। यह अस्तित्व को बढ़ा सकता है, क्योंकि आईपीएससी एकल कोशिकाओं के रूप में जीवित रहने में सक्षम नहीं हैं।
    6. सेल क्लंप सस्पेंशन के 1/10-1/50 को नए कुओं में स्थानांतरित करें। अनुपात विभाजन से पहले कुएं के सामंजस्य, बीज कोशिकाओं के वांछित घनत्व और आईपीएससी क्लोनल वरीयता पर निर्भर करता है।
    7. प्लेट को कई बार धीरे-धीरे आगे और पीछे ले जाकर कुएं में समान रूप से झुरमुट वितरित करें। क्लंप को संलग्न करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    8. यदि कई तैरती हुई मृत कोशिकाएं देखी जाती हैं तो माध्यम को पीएससी संस्कृति माध्यम के 750 μL के साथ प्रतिस्थापित करें; अन्यथा, पीएससी संस्कृति माध्यम के 250 μL जोड़ें। एक इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।
      नोट: 30 मिनट के बाद मध्यम प्रतिस्थापन महत्वपूर्ण है, खासकर अस्थिर सेल लाइनों (जैसे, एनएचपी) के लिए।
    9. हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें जब तक कि कॉलोनियां पासिंग के लिए पर्याप्त बड़ी न हो जाएं। मध्यम परिवर्तन के लिए, प्रोटोकॉल के चरण 4 का पालन करें।
  2. एकल-कोशिका पासिंग
    1. पीएससी संस्कृति माध्यम में 10 μM Y-27632 को जोड़ने के साथ, चरण 5.1.1 में बताए गए अनुसार तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित कल्चर प्लेट तैयार करें।
      वैकल्पिक: संवेदनशील सेल लाइनों के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए पासिंग से 1-3 घंटे पहले कोशिकाओं में 10 μM Y-27632 जोड़ें।
    2. माध्यम को एस्पिरेट करें और डीपीबीएस के 500 μL जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। DPBS को निकालें और कुओं में 300 μL डिटेचमेंट समाधान जोड़ें।
    3. प्लेट को 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जब माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की पर्याप्त टुकड़ी देखी जाती है, तो पीएससी कल्चर माध्यम या डीपीबीएस के 700 μL जोड़ें।
    4. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके 5-10 x ऊपर और नीचे पिपेट करें जब तक कि कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग नहीं किया जाता है। सेल क्षति को रोकने के लिए, बहुत अधिक पिपेट न करें।
    5. डिटेचमेंट समाधान को पतला करने के लिए सेल सस्पेंशन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें कम से कम 2 एमएल डीपीबीएस हो।
    6. 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और सेल गोली को बाधित किए बिना घोल को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
    7. 10 μM Y-27632 के साथ पूरक पीएससी कल्चर माध्यम के 500 μL में गोली को पुन: निलंबित करें।
    8. कोशिकाओं की गणना करें और चरण 5.2.1 में तैयार किए गए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-वेल प्लेट में 5,000-7,000 कोशिकाओं को बीज दें।
      नोट: यदि एक अलग सेल नंबर की आवश्यकता है, तो तदनुसार बड़े या छोटे कुएं में बदलें।
    9. कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    10. यदि कई मृत कोशिकाएं देखी जाती हैं तो माध्यम को पीएससी कल्चर माध्यम + 10 μM Y-27632 के 750 μL के साथ प्रतिस्थापित करें; अन्यथा, 250 μL + 10 μM Y-27632 जोड़ें।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है, खासकर अस्थिर सेल लाइनों (जैसे, एनएचपी) के लिए।
    11. एक इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।
    12. विभाजन के 1 से 2 दिन बाद वाई -27632 के बिना माध्यम को पीएससी संस्कृति माध्यम में बदलें, ताकि कोशिकाओं को क्लासिक कॉलोनी आकृति विज्ञान को फिर से प्रदर्शित करने की अनुमति मिल सके (चित्रा 3 बी)।
    13. हर 2 दिनों में माध्यम बदलें जब तक कि कॉलोनियां काफी बड़ी न हो जाएं। मध्यम परिवर्तन के लिए, प्रोटोकॉल के अनुभाग 4 का पालन करें।
  3. कॉलोनी चयन द्वारा आईपीएससी की पासिंग
    1. चरण 5.1.1 में बताए गए अनुसार तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-कुएं तैयार करें।
    2. माध्यम को एस्पिरेट करें और डीपीबीएस के 500 μL को सावधानीपूर्वक जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। DPBS को निकालें और कुएं में 0.5 mM EDTA के 500 μL जोड़ें।
    3. 1-3 मिनट के लिए आरटी पर प्लेट को इनक्यूबेट करें और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें, जब तक कि कॉलोनी की टुकड़ी सीमाओं पर दिखाई न दे।
    4. ईडीटीए को हटा दें और ध्यान से डीपीबीएस के 500 μL जोड़ें। कोशिकाओं को अलग किए बिना, कुएं में धीरे-धीरे 500 μL पीएससी कल्चर माध्यम जोड़ने से पहले तरल को एस्पिरेट करें।
    5. विभेदित कोशिकाओं को इकट्ठा किए बिना, माइक्रोस्कोप के तहत वांछित कॉलोनी चुनने के लिए पी 200 पिपेट का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, कोशिकाओं वाले माध्यम को लेते समय कॉलोनी पर धीरे से खरोंच करें।
    6. प्रत्येक चुनी गई कॉलोनी को एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित कुएं में स्थानांतरित करें, जैसा कि चरण 5.3.1 में तैयार किया गया है। कोशिकाओं को 2-5x पाइप करके, p1000 पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को छोटे झुरमुट में अलग करें।
    7. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, जिससे क्लंप संलग्न हो सकें।
    8. यदि कई तैरती हुई मृत कोशिकाएं देखी जाती हैं तो माध्यम को पीएससी संस्कृति माध्यम के 750 μL के साथ प्रतिस्थापित करें; अन्यथा, पीएससी संस्कृति माध्यम के 250 μL जोड़ें।
      नोट: 30 मिनट के बाद मध्यम प्रतिस्थापन महत्वपूर्ण है, खासकर अस्थिर सेल लाइनों (जैसे, एनएचपी) के लिए।
    9. एक इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।
    10. हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें जब तक कि कॉलोनियां पासिंग के लिए पर्याप्त बड़ी न हो जाएं। ऐसा करने के लिए, प्रोटोकॉल के अनुभाग 4 का पालन करें।

6. लंबे समय तक भंडारण के लिए मूत्र कोशिकाओं और आईपीएससी की फ्रीजिंग

नोट: नियमित रूप से, आईपीएससी को गिनती के बिना सेल फ्रीजिंग माध्यम में झुरमुट के रूप में जमे हुए हैं। एकल कोशिकाओं में पृथक्करण से बचने के लिए पिपेटिंग न्यूनतम होनी चाहिए। मूत्र कोशिकाओं के लिए, नियमित रूप से, 1.5 × 10 4 से 3 × 104 कोशिकाएं प्रति ट्यूब जमी होती हैं, जिससे उपयोगकर्ता को एक और गिनती चरण की आवश्यकता के बिना 12-वेल प्लेट के एक कुएं में सीधे एक ट्यूब को पिघलाने की अनुमति मिलती है।

  1. 15 एमएल ट्यूब में 5 एमएल डीपीबीएस तैयार करें।
  2. मूत्र कोशिकाओं के ठंड के लिए, प्रोटोकॉल के चरण 2.2-2.4 का पालन करें। आईपीएससी की फ्रीजिंग के लिए, क्लंप पासिंग प्रोटोकॉल से चरण 5.1.2-5.1.5 का पालन करें।
  3. निलंबन को चरण 6.1 में तैयार 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। मूत्र कोशिकाओं के ठंड के लिए, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल निलंबन के 10 μL की गणना करें। 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
  4. प्रति ट्यूब सेल फ्रीजिंग माध्यम के 400 μL में सेल गोली को पुन: निलंबित करें, और कोशिकाओं को क्रायोट्यूब की वांछित मात्रा में वितरित करें।
  5. क्रायोट्यूब को तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड के 1 दिन बाद जमे हुए ट्यूबों को -150 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

7. मूत्र कोशिकाओं और आईपीएससी का पिघलना

  1. मूत्र कोशिकाओं के पिघलने के लिए, जिलेटिन-लेपित 12-कुओं की वांछित मात्रा तैयार करें, जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 1.1 में कहा गया है। आईपीएससी के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-वेल प्लेटें तैयार करें, जैसा कि चरण 5.1.1 में बताया गया है। दोनों मामलों में, माध्यम के साथ मैट्रिक्स का आदान-प्रदान न करें।
  2. 4 एमएल डीपीबीएस युक्त 15 एमएल ट्यूब तैयार करें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पिघलने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं की एक जमी हुई शीशी को जल्दी से रखें, जब तक कि तैरती हुई बर्फ का एक टुकड़ा दिखाई न दे।
    नोट: संदूषण से बचने के लिए पानी के स्नान में इनक्यूबेशन बाद में इथेनॉल के साथ क्रायोट्यूब को पोंछें।
  4. मूत्र कोशिकाओं के लिए आरईएमसी माध्यम के 500 μL, या आईपीएससी के लिए 500 μL पीएससी कल्चर माध्यम को बर्फ युक्त निलंबन में जोड़ें, और निलंबन को चरण 7.2 में तैयार पूर्व-गर्म 15 एमएल ट्यूब में तुरंत स्थानांतरित करें।
  5. ट्यूब को 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से छोड़ दें।
  6. मूत्र कोशिकाओं के लिए, आरईएमसी माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। आईपीएससी के लिए, पीएससी कल्चर माध्यम के 750 μL में गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें। झुरमुट को बरकरार रखने के लिए, बहुत अधिक पाइपिंग से बचें।
    वैकल्पिक: 10 μM Y-27632 के साथ माध्यम को पूरक करने से पिघलने के बाद आईपीएससी के अस्तित्व का समर्थन किया जा सकता है।
  7. चरण 7.1 में तैयार 12-वेल प्लेटों से मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें, और सेल निलंबन को सावधानी पूर्वक कुएं में स्थानांतरित करें।
  8. प्लेट को एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रात भर रखें।
  9. अगले दिन, माध्यम को पीएससी कल्चर माध्यम से बदलें, आईपीएससी के लिए वाई -27632 के बिना और मूत्र कोशिकाओं के लिए आरईएमसी के साथ।
  10. एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर विकसित करें।
  11. हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें जब तक कि कोशिकाएं पासिंग के लिए पर्याप्त बड़ी न हो जाएं। मध्यम परिवर्तन के लिए, प्रोटोकॉल के अनुभाग 4 का पालन करें।

8. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

नोट: प्लुरिपोटेंसी से संबंधित मार्करों जैसे कि नैनोजी, ओसीटी 3/4, एसओएक्स 2, टीआरए -1-60 और ईपीकैम को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग नए उत्पन्न आईपीएससी के सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सत्यापनों में से एक है। एंटीबॉडी और कमजोर पड़ने के बारे में अधिक जानकारी सामग्री की तालिका में पाई जा सकती है।

  1. 12-वेल प्लेटों की उचित संख्या में उपयोग करने से 1-3 दिन पहले प्लेट आईपीएससी। माध्यम को एस्पिरेट करें, डीपीबीएस के 500 μL जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, और DPBS को हटा दें। प्रति कुएं 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 400 μL जोड़ें, और आरटी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
  2. 4% पीएफए को हटा दें, और डीपीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें। प्रति अच्छी तरह से ब्लॉकिंग बफर के 400 μL जोड़ें, और आरटी पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  3. ब्लॉकिंग बफर को एस्पिरेट करें, और प्रत्येक कुएं में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर (एडीबी) के 400 μL में पतला एंटीबॉडी जोड़ें। प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त एडीबी को हटा दें, और डीपीबीएस के साथ 3 x कोशिकाओं को धो लें।
  5. डीपीबीएस को एस्पिरेट करें, और एडीबी में 400 μL द्वितीयक एंटीबॉडी को अच्छी तरह से जोड़ें। अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. एडीबी को हटा दें, और डीपीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें। प्रति कुएं डीपीबीएस में पतला 1 μg /mL 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिललिंडोल (DAPI) जोड़ें, और RT पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. DAPI घोल को एस्पिरेट करें, और DPBS के साथ सेल 3x धो लें। इमेजिंग के लिए DPBS के 500 μL जोड़ें।

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Representative Results

मानव और एनएचपी मूत्र से कोशिकाओं को अलग करते समय, अलगाव के बाद विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को सीधे पहचाना जा सकता है। स्क्वैमस कोशिकाएं, साथ ही विभिन्न छोटे गोल कोशिकाएं, मूत्र के साथ उत्सर्जित होती हैं; महिला मूत्र में पुरुष मूत्र की तुलना में कहीं अधिक स्क्वैमस कोशिकाएं होती हैं (चित्रा 1 बी - दिन 0; पूरक चित्रा एस 1)। प्राथमिक मूत्र माध्यम में 5 दिनों की संस्कृति के बाद, पहली अनुयायी प्रसार कोशिकाओं को देखा जा सकता है (चित्रा 1 ए, बी - दिन 5)। इस बिंदु पर, माध्यम के आधे हिस्से को हर दिन आरईएमसी प्रसार माध्यम से बदल दिया जाता है, जब तक कि पहली कॉलोनियां दिखाई नहीं देती हैं। लगभग 13 वें दिन, अनुयायी कोशिकाएं बड़ी कॉलोनियों में विकसित होती हैं जिन्हें पारित किया जा सकता है (चित्र 1 बी - दिन 13)। इन कॉलोनियों को दो रूपात्मक रूप से अलग-अलग सेल प्रकारों से बनाया जा सकता है - एक में कोशिकाओं के निकटता से बढ़ने के साथ अधिक उपकला जैसे फेनोटाइप होते हैं, और दूसरा लम्बी आकृति और उच्च माइग्रेटिंग क्षमता के साथ अधिक मेसेनकाइमल जैसी आकृति विज्ञान दिखाता है (चित्रा 1 सी)। पहले मार्ग के बाद, मूत्र कोशिकाएं एक मोनोलेयर के रूप में बढ़ती हैं, और जब संस्कृति 80% प्रवाह तक पहुंच जाती है तो इसे पारित किया जा सकता है (चित्रा 1 बी - दिन 17)।

Figure 1
चित्र 1: मूत्र कोशिकाओं का अलगाव और खेती। (ए) मानव और गैर-मानव प्राइमेट नमूनों से मूत्र कोशिकाओं की स्थापना के लिए वर्कफ़्लो। (बी) चरण-कंट्रास्ट छवियां पहले मार्ग (पी 1) तक मूत्र कोशिकाओं के विकास और कॉलोनी गठन को दर्शाती हैं। (सी) मूत्र के नमूनों से अलग किए गए दो अलग-अलग सेल प्रकारों को संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद अलग किया जा सकता है। स्केल सलाखों = 250 μm (B, C)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूत्र कोशिकाओं से आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए, सेंडाई वायरस के साथ एक पारगमन का उपयोग किया जाता है जो यामानाका कारक OCT3/4, SOX2, KLF4 और c-MYC को पेश करता है। पारगमन दक्षता बढ़ाने के लिए, मूत्र कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित कुओं (चित्रा 2 ए) पर बीज बोने से पहले, निलंबन में 1 घंटे के लिए वायरस के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। कुछ अनुयायी कोशिकाओं को पारगमन के 1 दिन बाद कुओं में देखा जा सकता है (चित्रा 2 बी - दिन 1)। 5-10 दिनों के बाद, ये कोशिकाएं कॉलोनियों का निर्माण करना शुरू कर देती हैं, और प्रारंभिक रूपात्मक परिवर्तन देखे जा सकते हैं, जो कोशिकाओं के पुन: प्रोग्रामिंग का संकेत देते हैं (चित्रा 2 बी - दिन 14)। इनमें से कई कॉलोनियां उत्तरोत्तर ईएससी जैसी आकृति विज्ञान दिखाती हैं, और व्यास 1 मिमी से अधिक होने पर पीएससी संस्कृति माध्यम में चुना जा सकता है। चुनने के बाद, कोशिकाएं लगभग 4 दिनों के भीतर विशिष्ट ईएससी आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने वाली कॉलोनियों का निर्माण करती हैं (चित्रा 2 बी - दिन 21 और 24)। जब आईपीएससी कॉलोनियां काफी बड़ी हो जाती हैं, तो कोशिकाओं को क्लंप पासिंग प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल चरण 5.1) का उपयोग करके पहली बार पारित किया जा सकता है।

इस रीप्रोग्रामिंग दृष्टिकोण का उपयोग मनुष्यों, गोरिल्ला गोरिल्ला (गोरिल्ला ), और पोंगो अबेली (ओरंगुटा) 15 से आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए किया गया है। जबकि मूत्र कोशिकाओं को प्राप्त करने की संभावना काफी परिवर्तनशील है,और मनुष्यों की तुलना में चिंपांज़ी के लिए कम से कम दो से तीन गुना कम है, प्राप्त मूत्र कोशिकाओं की रीप्रोग्रामिंग हमारे अनुभव में ज्यादातर सफल रही। सामान्य तौर पर, संक्रमित मूत्र कोशिकाओं का 0.19% ईएससी जैसी आकृति विज्ञान के साथ कॉलोनियों को जन्म देता है, जिसके परिणामस्वरूप रीप्रोग्रामिंगप्रयासों के 87% में कम से कम एक कॉलोनी होती है। सभी उत्पन्न आईपीएससी समान गुणों को साझा करते हैं और विशिष्ट ईएससी जैसी कॉलोनी आकृति विज्ञान दिखाते हैं, जो स्पष्ट रूप से परिभाषित किनारों (चित्रा 2 सी) के साथ कसकर पैक की गई कोशिकाओं की विशेषता है। इसके अलावा, सभी आईपीएससी एक सामान्य कैरियोटाइप प्रदर्शित करते हैं, और एसईवी रीप्रोग्रामिंग वैक्टर की अनुपस्थिति को कम से कम पांच अंशों के बाद पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था, जैसा कि एसईवी रीप्रोग्रामिंग किट निर्माता (डेटा नहीं दिखाया गया है) द्वारा अनुशंसित किया गया था। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग नाभिक में प्लुरिपोटेंसी से जुड़े प्रोटीन की अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के लिए किया जाता है, जैसे कि एनएएनओजी, ओसीटी 3/4, और एसओएक्स 2। टीआरए -1-60, ईपीकैम और एसएसईए 4 जैसे सतह मार्करों का भी उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 2 डी); हालांकि, एसएसईए 4 मूत्र कोशिकाओं15 में भी व्यक्त किया जाता है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण इन सतह मार्करों का उपयोग करके आईपीएससी की प्लूरिपोटेंसी स्थिति पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए किया जा सकता है (ओहनुकी एट अल .48 द्वारा वर्णित विधि)। इस दृष्टिकोण का उपयोग यह दिखाने के लिए किया जाता है कि विश्लेषण किए गए ओरंगुटान आईपीएससी का 95.3% टीआरए -1-60 (चित्रा 2 ई) के लिए सकारात्मक है। इसके अलावा, एनएचपी आईपीएससी की भेदभाव क्षमता को इन विट्रो एम्ब्रायोइड बॉडी (ईबी) भेदभाव (ग्यूडर एट अल .15 द्वारा वर्णित विधि) के माध्यम से साबित किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 2 एफ में दिखाया गया है, गोरिल्ला आईपीएससी एंडोडर्म (-फेटोप्रोटीन), मेसोडर्म (-चिकनी मांसपेशी एक्टिन), और एक्टोडर्म (β-III ट्यूबुलिन) वंशों में अंतर करने में सक्षम हैं।

Figure 2
चित्र 2: मूत्र व्युत्पन्न आईपीएससी का उत्पादन और लक्षण वर्णन । (ए) मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं के रीप्रोग्रामिंग वर्कफ़्लो। (बी) आईपीएससी कॉलोनियों की स्थापना तक रीप्रोग्रामिंग के दौरान गोरिल्ला मूत्र कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों को दिखाने वाले चरण-कंट्रास्ट चित्र। स्केल बार = 500 μm. (C) मानव, गोरिल्ला और वनमानुष कोशिका संस्कृतियों से स्थापित आईपीएससी कॉलोनियों की आकृति विज्ञान। स्केल बार = 500 μm. (D) मार्ग 8 पर प्लुरिपोटेंसी से जुड़े मार्करों के साथ गोरिल्ला आईपीएससी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EPCAM और TRA-1-60। स्केल बार = 100 μm. (E) एंटी-टीआरए-1-60-पीई से सना हुआ ओरंगुटान आईपीएससी का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। बिना दाग वाली कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। (च) गोरिल्ला आईपीएससी के भ्रूण शरीर विभेदन के बाद एंडोडर्म (एएफपी), मेसोडर्म (-एसएमए), और एक्टोडर्म (β-III टीयूबी) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। नाभिक को DAPI के साथ प्रतिरूप किया गया था। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: आईपीएससी = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एएफपी = α-फेटोप्रोटीन; -एसएमए = अल्फा चिकनी मांसपेशी एक्टिन; β-III TUB = बीटा III ट्यूबुलिन; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जब आईपीएससी कॉलोनियां लगभग 2 मिमी के व्यास तक पहुंच जाती हैं, या एक दूसरे को छूने वाली होती हैं, तो कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए। हम नियमित रखरखाव के लिए क्लंप पासिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। इस प्रोटोकॉल में, कॉलोनी के आकार के आधार पर 3-5 मिनट के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.5 एमएम ईडीटीए का उपयोग किया जाता है। ईडीटीए इनक्यूबेशन के दौरान, कॉलोनियों की सीमाएं छीलने लगती हैं, और कोशिकाओं के बीच दिखाई देने वाले अंतराल दिखाई देते हैं (चित्रा 3 ए)। माइक्रोस्कोप के नीचे एक उपयुक्त टुकड़ी देखे जाने पर ईडीटीए को हटा दिया जाना है। ईडीटीए के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन से एकल कोशिकाओं का एक उच्च अंश होता है जो जीवित रहने में सक्षम नहीं होते हैं। इसके बाद, कोशिकाओं को समान आकार के झुरमुट से अलग किया जाना चाहिए, जैसा कि चित्र 3 ए में दिखाया गया है। कोशिकाओं को छोटे झुरमुट में अलग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि इससे अस्तित्व कम हो जाता है और अधिक विभेदित कोशिकाएं हो सकती हैं।

जब किसी प्रयोग के लिए कोशिकाओं की एक निर्धारित संख्या के सीडिंग की आवश्यकता होती है, तो एकल-सेल पासिंग प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में एक रॉक अवरोधक के साथ माध्यम को पूरक करना शामिल है, जो एकल कोशिकाओं को जीवित रहने में सक्षम बनाता है। यह उम्मीद की जाती है कि झुरमुट सीडिंग के बाद कॉलोनी में बढ़ने वाली कोशिकाओं की तुलना में संलग्न एकल कोशिकाएं एक अलग आकृति विज्ञान दिखाती हैं (चित्रा 3 बी - दिन 0)। संस्कृति के 1-2 दिनों के बाद, एकल कोशिकाएं फिर से कॉलोनियों में बढ़ने लगती हैं, जबकि उनकी आकृति विज्ञान के साथ-साथ उनके ढीले सेल-सेल संपर्क को संरक्षित किया जाता है, अगर एक रॉक अवरोधक को माध्यम में जोड़ा जाता है (चित्रा 3 बी - दिन 2)। जब इन छोटी कॉलोनियों को देखा जाता है, तो रॉक अवरोधक को माध्यम से हटा दिया जाना चाहिए, जिससे कोशिकाओं को फिर से विशिष्ट ईएससी जैसी आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने की अनुमति मिलती है (चित्रा 3 बी - दिन 4)।

यह तय करने के लिए कि क्या एक आईपीएससी कॉलोनी उच्च गुणवत्ता की है, कई पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, यह सामान्य है कि स्वस्थ उपनिवेश सहज भेदभाव की कोई या थोड़ी मात्रा नहीं दिखाते हैं; हालांकि, विभेदित कोशिकाओं की बढ़ी हुई संख्या (>10%) खराब आईपीएससी गुणवत्ता का संकेत है। कम आईपीएससी गुणवत्ता की अतिरिक्त विशेषताएं सीमा अखंडता और एकरूपता का नुकसान हैं (चित्रा 3 सी: दाएं), साथ ही कोशिकाओं के बीच दिखाई देने वाले अंतराल के साथ ढीली सेलुलर पैकेजिंग (चित्रा 3 डी: दाएं)। इसके विपरीत, उच्च गुणवत्ता वाले आईपीएससी को परिभाषित सीमाओं, तंग सेलुलर पैकेजिंग और प्रमुख न्यूक्लियोली (चित्रा 3 सी, डी: बाएं चित्र) की विशेषता है।

Figure 3
चित्र 3: प्राइमेट आईपीएससी संस्कृति। (ए) चरण-कंट्रास्ट छवियां ईडीटीए इनक्यूबेशन के दौरान आईपीएससी कॉलोनियों की टुकड़ी को दिखाती हैं जो क्लंप पासिंग प्रोटोकॉल और पृथक्करण के बाद इष्टतम क्लंप आकार का पालन करती हैं। स्केल बार = 250 μm. (B) एकल-सेल पासिंग के बाद आईपीएससी रिकवरी की समयरेखा। रॉक अवरोधक वाई -27632 को दूसरे दिन से हटा दिया गया था। स्केल बार = 250 μm. (C) बाएं: परिभाषित सीमाओं के साथ एक उच्च गुणवत्ता वाले मानव आईपीएससी कॉलोनी का उदाहरण। दाएं: एक खराब गुणवत्ता वाली कॉलोनी का उदाहरण जो कम सीमा अखंडता और विभेदित कोशिकाओं को दर्शाता है। स्केल बार = 500 μm. (D) शिथिल रूप से पैक कोशिकाओं (दाएं) के साथ कम गुणवत्ता वाले की तुलना में उच्च गुणवत्ता वाले मानव आईपीएससी कॉलोनी (बाएं) के लिए उदाहरण छवियां। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: आईपीएससी = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: मानव मूत्र में पाए जाने वाले सेल प्रकारों का अवलोकन। (ए) महिला मूत्र से अलग कोशिकाएं। (बी) पुरुष मूत्र से अलग कोशिकाएं। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली बफर और मीडिया रचनाएं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

आईपीएससी मूल्यवान सेल प्रकार हैं क्योंकि वे विट्रो में अन्यथा दुर्गम सेल प्रकारों की पीढ़ी की अनुमति देते हैं। रीप्रोग्रामिंग के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में, उदाहरण के लिए, फाइब्रोब्लास्ट सभी प्राइमेट प्रजातियों से आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, यह पेपर मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं से आईपीएससी की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इन कोशिकाओं को गैर-आक्रामक तरीके से प्राप्त किया जा सकता है, यहां तक कि गैर-बाँझ प्राइमेट मूत्र के नमूनों से भी, व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करके।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम कुछ अतिरिक्त चर्चा के लायक हैं। सबसे पहले, गैर-बाँझ मूत्र से कोशिकाओं को अलग करते समय, संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए व्यापक स्पेक्ट्रम रोगाणुरोधी अभिकर्मक के साथ माध्यम को पूरक करना महत्वपूर्ण है। यदि एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग के बावजूद सूक्ष्मजीवविज्ञानी संदूषण की वृद्धि स्पष्ट हो जाती है, तो पूरी संस्कृति को त्यागने और क्षेत्र को कीटाणुरहित करने की सिफारिश की जाती है; इसके अलावा, हमारे अनुभव में, निरंतर संवर्धन स्वस्थ बढ़ती मूत्र कोशिकाओं का उत्पादन नहीं करता है। दूसरा, कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करना शुरू करते समय, एसईवी-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की विभिन्न संख्या के साथ कई व्यंजन तैयार करना अत्यधिक अनुशंसित है, ताकि सभी कोशिकाओं के अलगाव के जोखिम से बचा जा सके और आईपीएससी अधिग्रहण की संभावना बढ़ सके। सामान्य तौर पर, एसईवी-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के उच्च घनत्व को चढ़ाने से अधिक पुन: प्रोग्राम किए गए आईपीएससी कॉलोनियों का उत्पादन होने की उम्मीद है, जबकि ~ 20 दिनों की अवधि के लिए रीप्रोग्रामिंग कोशिकाओं को संवर्धन करने से अक्सर ओवरकॉन्फ्लुएंसी होती है, जिसके बाद पूरे कुएं की टुकड़ी होती है। तीसरा, प्रत्येक चरण में जिसमें आईपीएससी के पृथक्करण की आवश्यकता होती है, व्यापक पाइपिंग से बचना महत्वपूर्ण है, जिससे महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु होती है। विशेष रूप से जब क्लंप पासिंग का प्रदर्शन किया जाता है, तो क्लंप को उचित आकार में रखना महत्वपूर्ण है (चित्रा 3 ए)। बहुत बड़े झुरमुट जो बहुत बड़े होते हैं, वे त्वरित भेदभाव का कारण बन सकते हैं, जबकि बहुत छोटे झुरमुट जीवित रहने में कमी ला सकते हैं।

हमने देखा कि मूत्र कोशिकाओं को प्राप्त करने की संभावना नमूने और एलिकोट के बीच काफी परिवर्तनशील है, लेकिन इस बात का कोई सबूत नहीं मिला कि छोटी मात्रा में कॉलोनियों को प्राप्त करने में कम सफलता दर है। सामान्य तौर पर, हमने मानव मूत्र के 100 एमएल से औसतन 7.6 कॉलोनियों को अलग किया। इस औसत दर और पॉइसन वितरण को मानते हुए, कम से कम एक कॉलोनी प्राप्त करने से 50 एमएल के लिए ~ 98% और 5 एमएल शुरुआती सामग्री के लिए ~ 30% की संभावना है। हमारे मामले में,15 प्रयासों के 42% में मानव मूत्र के 5 एमएल से कम से कम एक कॉलोनी को अलग करना संभव था। इसके आधार पर, कॉलोनियों का अलगाव अभी भी कोशिश करने लायक हो सकता है, भले ही मूत्र की केवल छोटी मात्रा उपलब्ध हो। यदि मूत्र कोशिकाओं की रीप्रोग्रामिंग विफल हो जाती है, और कोई आईपीएससी कालोनियों को नहीं देखा जा सकता है, तो विभिन्न संख्या में ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं को चढ़ाने से मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं की रीप्रोग्रामिंग हो सकती है। उभरती हुई आईपीएससी कॉलोनियों को सतह मार्करों (जैसे, टीआरए -1-60 या क्षारीय फॉस्फेट [एपी]; डेटा नहीं दिखाया गया है) का उपयोग करके लाइव स्टेनिंग द्वारा आईपीएससी के रूप में भी पहचाना जा सकता है। यह ज्ञात है कि प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं में एपी गतिविधि को विनियमित किया जाता है, और इसका उपयोग संस्कृति प्रक्रिया के दौरान स्टेम कोशिकाओं को क्षणिक रूप से दागने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का एक और संभावित दोष एनएचपी आईपीएससी की इष्टतम संस्कृति है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने पुष्टि की कि मानव और एनएचपी आईपीएससी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माध्यम का उपयोग करके 50 से अधिक मार्गों के लिए अपनी प्लुरिपोटेंट स्थिति बनाए रखते हैं। हालांकि, मानव आईपीएससी की तुलना में, एनएचपी आईपीएससी हमारे अनुभव में सहज रूप से अंतर करने के लिए अधिक प्रवण हैं, संभवतः संस्कृति की स्थितियों के कारण जो मानव के लिए अनुकूलित थे और एनएचपी संस्कृतियों के लिए नहीं। इसके अलावा, चढ़ाना, बढ़ती गति और भेदभाव की प्रवृत्ति के बाद जीवित रहने की दर में आईपीएससी क्लोन ों के बीच बहुत परिवर्तनशीलता है। इसलिए, किसी को अक्सर व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक क्लोन के लिए इष्टतम विभाजन अनुपात, मार्ग समय और क्लंप आकार निर्धारित करने की आवश्यकता होती है।

हमने दिखाया है कि एनएचपी15 से मूत्र कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5 एमएल की मात्रा भी पर्याप्त हो सकती है। हालांकि, जबकि हमें मनुष्यों, गोरिल्ला और वनमानुषों में पृथक मूत्र कोशिकाओं की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला, चिंपांज़ी का अनुपात कम था, क्योंकि हम कुल 87 एमएल से मूत्र कोशिकाओं को अलग नहीं कर सकते थे। इसलिए, कुछ प्रजातियों के लिए, दूसरों की तुलना में बहुत अधिक मूत्र एकत्र करना आवश्यक हो सकता है। छोटे प्राइमेट्स से बड़ी मात्रा में एकत्र करना विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन चूंकि मूत्र कोशिकाओं का अलगाव काफी लागत प्रभावी है, इसलिए इसे विशेष प्रजातियों और मूत्र की उपलब्ध मात्रा के लिए आज़माना व्यावहारिक है। दुर्भाग्य से, मूत्र के नमूने जमे हुए नहीं हो सकते हैं, जो उस त्रिज्या को सीमित करता है जिस पर नमूने एकत्र किए जा सकते हैं। हालांकि, हमने दिखाया कि 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के भंडारण समय का15 अलग-थलग कॉलोनियों की संख्या पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, और लंबे समय तक भंडारण समय या भंडारण की स्थिति में सुधार संभव हो सकता है। हमने सत्यापन के लिए कई प्रकार के गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण पेश किए हैं। हालांकि, भले ही एक आईपीएससी लाइन इन मानदंडों को संतुष्ट करती है, क्लोनल विषमता अभी भी पर्याप्त है, जिसे आनुवंशिक पृष्ठभूमि49 और एपिजेनेटिक स्थिति 50,51,52,53,54 द्वारा समझाया गया है। भविष्य के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए प्राइमेट आईपीएससी को लागू करने के लिए, किसी को विषमता पर विचार करना चाहिए और क्लोनल भिन्नता को औसत करने के लिए पर्याप्त क्लोन का उपयोग करना चाहिए, इस प्रकार परिणाम की गलत व्याख्या से बचना चाहिए।

फिर भी, प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक स्रोत के रूप में मूत्र का उपयोग पारंपरिक तरीकों पर एक बड़ा लाभ है, उदाहरण के लिए, रिप्रोग्रामिंग के लिए फाइब्रोब्लास्ट, क्योंकि उन्हें पूरी तरह से गैर-आक्रामक रूप से प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल पारंपरिक रीप्रोग्रामिंग की तुलना में कम अवधि के साथ मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं से आईपीएससी की पीढ़ी की अनुमति देता है। इस विधि के साथ, कॉलोनियां 5-15 दिनों के भीतर दिखाई देती हैं, जबकि हमने पाया है कि प्राइमेट फाइब्रोब्लास्ट (रीसस, बबून) से कॉलोनियां 20-30 दिनों के बाद बाद बाद दिखाई देती हैं। इसके अलावा, इस निलंबन संक्रमण विधि के उपयोग के साथ, 0.19% वायरस-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं ने प्लुरिपोटेंट सेल जैसी आकृति विज्ञान वाली कॉलोनियों को जन्म दिया। इसके परिणामस्वरूप15 प्रयासों के 87% में कम से कम एक कॉलोनी थी। इसकी तुलना में, संलग्न कोशिकाओं के साथ एसईवी की पारंपरिक पारगमन विधि और एपिसोमल प्लास्मिड के साथ लिपोफेक्शन को क्रमशः 0.09% और 0.009% कोशिकाओं के साथ प्लुरिपोटेंट कॉलोनी बनाने के साथ काफी कम रीप्रोग्रामिंग दक्षता दिखाई गईथी।

सारांश में, यह विधि मूत्र कोशिकाओं को गैर-आक्रामक रूप से अलग करने और लगभग किसी भी मानव दाता और कई एनएचपी से फीडर-मुक्त आईपीएससी की पीढ़ी की अनुमति देती है। यह कीमती सेल प्रकारों तक पहुंच बढ़ाता है जिन्हें इन आईपीएससी से अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग रोगी-विशिष्ट आईपीएससी का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है जिसका उपयोग रोग मॉडलिंग या भविष्य के सेल-आधारित उपचारों के लिए किया जा सकता है। अंत में, चूंकि आईपीएससी मूत्र की केवल छोटी मात्रा से उत्पन्न किया जा सकता है, इस विधि को कई अलग-अलग प्राइमेट या यहां तक कि स्तनधारी प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है। इस प्रकार, यह विधि क्रॉस-प्रजाति तुलना के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकती है, जो मानव-विशिष्ट लक्षणों के विकास की बेहतर समझ के लिए अनुमति दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम डीएफजी ईएन 1093/5-1 (परियोजना संख्या 458247426) द्वारा समर्थित था। एमओ को जेएसपीएस ओवरसीज रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। सभी आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे। फ्लो साइटोमेट्री बायोमेडिकल सेंटर म्यूनिख में कोर फैसिलिटी फ्लो साइटोमेट्री की मदद से किया गया था। हम वीडियोग्राफी के समर्थन के लिए एएसएचबीआई, क्योटो विश्वविद्यालय से मकोतो शिदा और तोमोयो मुटो को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) Sigma-Aldrich SCR006
Amphotericin B-Solution Merck A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody  Stem Cell Technologies 60064 Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody  Miltenyi Biotec 130-122-965 Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium) Nippon Genetics BB01
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR Greiner BIO-ONE 665180
Countess™ II automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) Sued-Laborbedarf 52 95-0213 Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) Thermo Fisher Scientific A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) Thermo Fisher Scientific A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride Sigma-Aldrich 10236276001
DMEM High Glucose TH.Geyer L0102
DMEM/F12 w L-glutamine Fisher Scientific 15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 Thermo Fisher Scientific A-21207 Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium TH.Geyer L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) Thermo Fisher Scientific 710524 Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Carl Roth CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) Thermo Fisher Scientific 10500064
FlowJo V10.8.2 FlowJo  663441
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413301
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator Fisher Scientific 16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet Kendro 51017905
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-749
ImageJ  Fiji Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL Nerbe Plus 04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S Nikon TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody R&D Systems MAB1368 Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody R&D Systems MAB1420 Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody R&D Systems MAB1195 Dilution: 1/100
mTeSR™ 1 STEMCELL Technolgies 85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb  Cell Signaling Technology 4903S Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) Invivogen ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  Cell Signaling Technology 2750S Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PeproTech 100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge SIGMA  4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium ATCC PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit ATCC PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 Cell Signaling Technology 4900S Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb NEB 4755S Dilution: 1/500
StemFit® Basic02 Nippon Genetics 3821.00 The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563011
Waterbath Precision GP 05 Thermo Fisher Scientific TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) Biozol BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer For composition see the supplementary table S1
REMC medium For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer For composition see the supplementary table S1

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References

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मूत्र से प्राप्त प्राइमेट प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन और रखरखाव
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Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer,… More

Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer, F. C., Enard, W., Ohnuki, M. Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine. J. Vis. Exp. (197), e64922, doi:10.3791/64922 (2023).

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