Summary
В настоящем протоколе описывается способ выделения, расширения и перепрограммирования клеток, полученных из мочи приматов человека и нечеловека, в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), а также инструкции по поддержанию вновь генерируемых ИПСК без фидера.
Abstract
Межвидовые подходы к изучению плюрипотентных стволовых клеток приматов и их производных имеют решающее значение для лучшего понимания молекулярных и клеточных механизмов заболевания, развития и эволюции. Чтобы сделать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) приматов более доступными, в этой статье представлен неинвазивный метод получения ИПСК человека и нечеловека приматов из клеток, полученных из мочи, и их поддержание с использованием метода культивирования без фидера.
Моча может быть взята из нестерильной среды (например, клетки животного) и обработана коктейлем антибиотиков широкого спектра действия во время первичной клеточной культуры для эффективного снижения загрязнения. После размножения клеток, полученных из мочи, ИПСК генерируются модифицированным методом трансдукции коммерчески доступной системы векторного вируса Сендай. Первые колонии ИПСК могут быть видны уже через 5 дней и могут быть собраны не ранее чем через 10 дней. Рутинное пассирование комков с бесферментным диссоциационным буфером поддерживает плюрипотентность сгенерированных ИПСК в течение более чем 50 пассажей.
Introduction
Геномные сравнения человека и нечеловекообразных приматов (NHP) имеют решающее значение для понимания нашей эволюционной истории и эволюции специфических для человека черт1. Кроме того, эти сравнения позволяют сделать вывод о функции путем идентификации консервативных последовательностейДНК 2, например, для определения приоритетности вариантов3, связанных с заболеванием. Сравнения молекулярных фенотипов, таких как уровни экспрессии генов, имеют решающее значение для лучшей интерпретации геномных сравнений и обнаружения, например, клеточных фенотипических различий. Кроме того, они, подобно сравнениям на уровне ДНК, обладают потенциалом для вывода о функциональной значимости и, следовательно, для лучшей интерпретации медицинских различий у людей4. Включение всеобъемлющих молекулярно-фенотипических данных в эти сравнительные исследования требует соответствующих биологических ресурсов (т.е. ортологичных клеток разных видов). Однако этические и практические причины затрудняют или делают невозможным доступ к таким сопоставимым клеткам, особенно во время развития. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) позволяют генерировать такие недоступные типы клеток in vitro5,6, доступны экспериментально и используются для сравнения приматов 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Чтобы генерировать ИПСК, необходимо приобрести первичные клетки, подлежащие перепрограммированию. Клетки, выделенные из мочи, имеют то преимущество, что они могут быть отобраны неинвазивным путем у приматов и что они могут быть легко перепрограммированы, вероятно, из-за их молекулярных профилей, подобных стволовым клеткам15. Условия культивирования для поддержания ИПСК приматов так же важны, как и перепрограммирование; Классически культура плюрипотентных стволовых клеток человека требовала неопределенной среды на основе сыворотки и совместной культуры эмбриональных фибробластов мыши - так называемых фидерных клеток, которые обеспечивают необходимые питательные вещества и каркас для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)16. С момента разработки химически определенных и не содержащих питательных культур17,18 в настоящее время существуют различные варианты коммерчески доступных питательных сред и матриц ИПСК. Тем не менее, большинство из этих условий культивирования были оптимизированы для ЭСК и ИПСК человека и, следовательно, могут работать хуже в культуре НПК ИПСК. В этом видеопротоколе мы предоставляем инструкции по созданию и поддержанию ИПСК человека и NHP, полученных из культуры мочевых клеток.
С момента первого сообщения о генерации ИПСК путем принудительной экспрессии определенных факторов в фибробластах в 2006 году этот метод применялся ко многим различным типам клеток различного происхождения 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Среди них только клетки, полученные из мочи, могут быть получены совершенно неинвазивным способом. Основываясь на ранее описанном протоколе Zhou et al.33, можно выделять и расширять клетки из мочи приматов даже из нестерильных образцов, добавляя антибиотики широкого спектра действия15. Примечательно, что клетки, полученные из мочи, отобранные по этому протоколу, демонстрируют высокий потенциал для продуцирования ИПСК в течение более короткого периода времени (колонии становятся видимыми через 5-15 дней), чем обычное перепрограммирование фибробластов (20-30 дней, по нашему опыту), и с достаточно высокой вероятностью успеха. Эти клетки, полученные из мочи, были классифицированы как смешанная популяция мезенхимальных стволовых клеток, подобных клеткам, и эпителиальных клеток мочевого пузыря, что обусловливало высокую эффективность перепрограммирования15.
В дополнение к различиям в первичных ячейках, методы перепрограммирования для генерации ИПСК также различаются в зависимости от цели использования. Обычные процедуры перепрограммирования для соматических клеток человека проводились путем сверхэкспрессии факторов перепрограммирования ретровирусными или лентивирусными векторами, что позволило интегрировать экзогенную ДНК в геном 5,34,35. Чтобы сохранить геномно сгенерированные ИПСК нетронутыми, исследователи разработали широкий спектр неинтегрирующихся систем - акцизный вектор PiggyBac 36,37, эписомальный вектор38,39, неинтегрирующиеся вирусные векторы, такие как вирус Сендай 40 и аденовирус 41, трансфекциямРНК 42, трансфекция белка 43,44 и обработка химическими соединениями 45. Из-за эффективности и простоты в обращении в этом протоколе используются векторы перепрограммирования на основе вирусов Sendai. Инфекцию первичных клеток проводят в суспензионной культуре клеток и вирусов за 1 ч при кратности инфекции (MOI) 5 до нанесения покрытия. Эта модифицированная стадия может увеличить вероятность контакта между клеточными поверхностями и вирусами по сравнению с традиционным методом, при котором вирусы добавляются непосредственно к адгезивной клеточной культуре и, таким образом, дают больше колоний iPSC15.
Пассаж плюрипотентных стволовых клеток человека и NHP может быть осуществлен путем пассажирования комков и пассажа отдельных клеток. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) является экономичным хелатирующим агентом, который связывает ионы кальция и магния и, таким образом, предотвращает адгезивную активность кадгерина и интегрина. ЭДТА также используется в качестве мягкого селективного реагента диссоциации, поскольку недифференцированные клетки отделяются раньше дифференцированных клеток из-за их различных молекул адгезии. Полная диссоциация индуцирует массивную гибель клеток ИПСК приматов через Rho/Rho-ассоциированную спиральную спираль, содержащую протеинкиназу (Rho/Rock)-опосредованную гиперактивацию миозина. Следовательно, добавление в питательную среду ингибитора Rho/Rock имеет важное значение для экспериментов, требующих одиночных клеток в суспензии46,47. В этом протоколе мы рекомендуем пассажирование сгустков в качестве рутинного метода пассажа и рекомендуем пассирование одной ячейки только тогда, когда это необходимо, например, когда требуется заполнение определенных номеров ячеек или во время субклонирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта экспериментальная процедура была одобрена ответственным этическим комитетом по экспериментам на людях (20-122, Ethikkommission LMU München). Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов, связанных с образцами человека и NHP, необходимо получить одобрение соответствующего этического комитета. Все экспериментальные процедуры должны выполняться в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Каждый из следующих шагов должен быть выполнен с использованием стерильной техники в шкафу биологической безопасности. Все композиции буферов и сред можно найти в дополнительной таблице S1. Перед добавлением в ячейки убедитесь, что все среды нагреты до комнатной температуры (22 °C). Каждый этап центрифугирования следует выполнять при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Выделение клеток из образцов мочи
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что доноры не заражены вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита В (ВГВ) и вирусом гепатита С (ВГС). Для NHP убедитесь, что возможные доноры / клетки свободны от специфических патогенов - вируса B (BV), вируса иммунодефицита обезьян (SIV), бетаретровируса обезьян (SRV) и лимфотропного вируса обезьян Т-клеток (STLV).
- Подготовьте 12-луночную пластину с желатиновым покрытием, добавив 500 мкл 0,2% желатина на лунку, и распределите жидкость, перемещая пластину. Поместите при температуре 37 ° C не менее чем на 30 минут до необходимости.
- Соберите образцы мочи человека в конические пробирки объемом 50 мл. Для приматов собирайте мочу с пола животного помещения с помощью шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Было доказано, что объема мочи в 5 мл достаточно для выделения по крайней мере одной колонии в 42% попыток. Тем не менее, рекомендуется использовать больший объем ~ 50 мл мочи, чтобы увеличить вероятность изоляции колоний. Мочу NHP следует отбирать как можно более свежей, желательно сразу после мочеиспускания. Хранение образцов мочи при температуре 4 °C в течение 4 часов не оказало негативного влияния на успешность протокола, но более длительные сроки хранения не тестировались. - Центрифугируйте пробирку, содержащую мочу, при 400 × г в течение 10 мин и тщательно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно 1 мл в пробирке.
- Ресуспендировать гранулу в остаточном 1 мл жидкости. Объедините суспензии в одну трубку, если было собрано несколько пробирок с мочой.
- Промойте клетки, добавив в пробирку 10 мл буфера для промывания мочи (см. Дополнительную таблицу S1), содержащего 2,5 мкг/мл амфотерицина, и тщательно перемешайте суспензию с помощью серологической пипетки.
- Центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 10 мин и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно <0,2 мл.
- Ресуспендировать клеточную гранулу в 1 мл первичной среды мочи (см. Дополнительную таблицу S1), содержащей 0,5 мкг/мл амфотерицина на 50 мл первоначально обработанной мочи (ресуспендировать в 1 мл, даже если было обработано менее 50 мл мочи).
- Аспирируют желатин из лунок (приготовленных на стадии 1.1) и пластину 1 мл суспензии со стадии 1.7 в одну лунку 12-луночного планшета. Повторите для любого количества лунок или для любого количества миллилитров суспензии.
Дополнительно: Чтобы избежать загрязнения, вызванного антисанитарным сбором проб, добавляйте 100 мкг/мл антимикробного реагента в клетки с этого момента до первого прохождения. - Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 .
- Добавляйте 1 мл первичной среды мочи в лунку ежедневно до 5-го дня, не удаляя существующую среду.
- На 5-й день аспирируют 4 мл среды из пластины, оставляя примерно 1 мл среды. Добавьте 1 мл среды REMC (см. Дополнительную таблицу S1) на лунку, чтобы получить смесь 1:1 с новой питательной средой.
- Заменяйте половину среды средой REMC каждый день до появления первых колоний (рис. 1A, B). Поэтому удалите 1 мл старой среды и добавьте 1 мл свежей среды REMC на лунку.
2. Расширение мочевыводящих клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж мочевых клеток следует проводить до того, как культура достигнет 90% слияния.
- Подготовьте желаемое количество 12-луночных пластин с желатиновым покрытием, как указано в шаге 1.1.
- Аспирируйте старую среду и промойте клетки, добавив 1 мл фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS).
- Аспирируйте DPBS и добавьте 300 мкл 0,5-кратного фермента диссоциации, разбавленного DPBS. Выдерживайте пластину при 37 °C в течение 5 мин.
- Добавьте 700 мкл среды REMC, чтобы остановить ферментативную реакцию. Аккуратно нанесите суспензию с помощью пипетки P1000 до тех пор, пока клетки не диссоциируют на отдельные клетки.
- Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 5 мин.
- Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды REMC.
- Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток (гемоцитометра или автоматического счетчика клеток).
- Для расширения мочевых клеток планшет 1,5 × 10от 4 до 3 × 104 клеток в 1 мл среды REMC в одну 12-луночную пластину, покрытую 0,2% желатином.
- Выполняйте последующие смены среды через день, пока культура не достигнет 80%-90% слияния. Поэтому аспирируйте старую среду и добавьте 1 мл свежей среды REMC.
3. Генерация ИПСК при вирусной векторной инфекции Сендай
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс процедуры перепрограммирования см. на рисунке 2A. Мочевые клетки, используемые для перепрограммирования, должны быть как можно моложе, но заметной потери эффективности перепрограммирования не наблюдается до прохождения 4. Комплект для перепрограммирования вирусов Sendai должен использоваться на объекте BL-2. Работайте с вирусами в шкафу биологической безопасности с ламинарным потоком и всегда используйте соответствующее защитное оборудование для предотвращения воздействия на слизистую оболочку.
- Подготовьте 12-луночную пластину с матричным покрытием из базальной мембраны, добавив 500 мкл матрицы базальной мембраны на лунку, и распределите жидкость, перемещая пластину. Инкубируйте пластину при 37 °C в течение не менее 1 часа и замените матрицу базальной мембраны 900 мкл среды REMC. Храните пластину при температуре 37 °C до использования.
- Быстро разморозьте компоненты комплекта для перепрограммирования Sendai на водяной бане при температуре 37 °C. Смешайте вирусы Сендай (полицистронные KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC и KLF4) с MOI 5 и добавьте среду REMC до 100 мкл. Используйте уравнение (1):
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку титры вируса различаются между партиями, всегда проверяйте титр в сертификате анализа, предоставленном производителем.
Дополнительно: Используйте зеленый флуоресцентный белок (GFP) вируса Сендай в качестве положительного контроля эффективности трансдукции. Для этого подготовьте дополнительные 3,5 × 104 клеток в отдельной пробирке на этапе 3.3. - Для диссоциации мочевых клеток выполните шаги 2.2-2.4. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и перенесите 7 × 104 мочевых клеток в пробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 5 мин и осторожно удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Ресуспендируют гранулы в 100 мкл смеси SeV, приготовленной на этапе 3.2. Инкубировать пробирку в течение 1 ч при 37 °C при суспензионной инфекции.
- Пластинчатую суспензию на 12-луночные пластины с матричным покрытием базальной мембраны, которые были приготовлены на шаге 3.1. Обычно табличка 1 × 10 4 и 2,5 × 104 ячейки на лунку в двух экземплярах.
- Инкубируют клетки при 37 °C и 5%CO2. Замените среду 1 мл свежей среды REMC через 24 часа после трансдукции и на 3-й день.
- На 5-й день после трансдукции смените среду на среду генерации PSC (см. Дополнительную таблицу S1) с последующей сменой среды через день. Поэтому удалите старую среду и добавьте 1 мл среды генерации PSC на лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: До появления первых колоний может пройти до 15 дней. - Собирают отдельные колонии ИПСК, когда размер колонии превышает 1 мм. Для этого соскребит и аккуратно собирает одну колонию пипеткой р10 под микроскопом. Перенесите колонию в новую лунку 12-луночной пластины, покрытой матрицей базальной мембраны, содержащей 750 мкл питательной среды PSC.
Дополнительно: Ополаскивание пластины DPBS и обработка в течение 1 минуты 0,5 мМ ЭДТА перед сбором может поддержать надежную культуру дальнейших шагов. Если клетки должны культивироваться дольше, чтобы дождаться более поздних появляющихся колоний, не выполняйте этот этап лечения ЭДТА. - Выращивают клетки при 37 °C и 5% CO2 с последующей сменой среды через день, как указано в разделе 4 протокола. Когда собранная колония достигнет диаметра 2 мм, продолжайте рутинное прохождение ИПСК, как описано в разделе 5 протокола.
4. Среднее изменение
ПРИМЕЧАНИЕ: Питательную среду следует менять через день, пока колонии не станут достаточно большими для прохождения.
- Аспирируйте старую среду и добавьте 750 мкл свежей среды на 12-луночную пластину. Чтобы переключиться на другой тип носителя, замените носитель по крайней мере через 1 день после прохождения.
5. Пассаж
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки следует проходить, когда колонии ИПСК становятся достаточно большими (диаметр > 2 мм) или колонии вот-вот коснутся друг друга. Обычно ИПСК можно разделять примерно каждые 5 дней. Используйте комковатое пассажирование (этап 5.1) для рутинного обслуживания и одноклеточное пассажирование (этап 5.2) для экспериментов, где требуется определенное количество клеток. В случае, если ИПСК сильно дифференцируются, сбор колоний (этап 5.3) может помочь улучшить чистоту культур.
- Комковатое прохождение
- Подготовьте 12-луночную пластину с матричным покрытием из базальной мембраны, добавив 500 мкл матрицы базальной мембраны на лунку, и распределите жидкость, перемещая пластину. Инкубировать пластину при 37 °C не менее 1 ч. Замените матрицу базальной мембраны 500 мкл питательной среды PSC и храните пластину при температуре 37 °C до использования.
- Аспирируйте среду из культивируемых клеток и промойте клетки, осторожно добавив 500 мкл DPBS. Удалите DPBS и добавьте в лунку 500 мкл 0,5 мМ ЭДТА.
- Инкубируйте пластину при RT в течение 2-5 минут, пока колонии не начнут отделяться. Внимательно наблюдайте за клетками под микроскопом.
- Когда края колоний начнут отслаиваться и станут видны промежутки между клетками (рис. 3А), удалите ЭДТА и осторожно добавьте 500 мкл DPBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда прикладывайте пипетку к боковой стенке лунки и никогда не наносите непосредственно на клетки, чтобы не отрывать клетки от пластины. - Аспирируйте DPBS и промойте лунку 500 мкл питательной среды PSC с помощью пипетки p1000. Пипеткой вверх и вниз 1x-5x, чтобы распределить колонии в комки соответствующего размера (рис. 3A). Не делайте пипетку слишком много.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ИПСК случайно слишком сильно пипетированы, добавьте в среду 10 мкМ ингибитора Rock Y-27632. Это может повысить выживаемость, так как ИПСК не способны выжить в виде одиночных клеток. - Перенесите 1/10-1/50 суспензии сгустков ячеек в новые лунки. Соотношение зависит от слияния лунки перед расщеплением, желаемой плотности засеянных клеток и предпочтения клонального iPSC.
- Равномерно распределите комки в лунке, осторожно перемещая пластину вперед и назад несколько раз. Инкубируйте пластину не менее 30 минут при 37 °C, чтобы комки прикрепились.
- Замените среду 750 мкл питательной среды PSC, если наблюдается много плавающих мертвых клеток; в противном случае добавьте 250 мкл питательной среды PSC. Поместите планшет при температуре 37 ° C и 5% CO2 в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замена среды через 30 минут имеет решающее значение, особенно для нестабильных клеточных линий (например, NHP). - Меняйте среду каждые 2-3 дня, пока колонии не станут достаточно большими для пассажа. Для среднего изменения выполните шаг 4 протокола.
- Пассаж одной клетки
- Готовят культуральную пластину, покрытую матричным покрытием базальной мембраны, как указано на этапе 5.1.1, с добавлением 10 мкМ Y-27632 в питательную среду PSC.
Дополнительно: Добавьте 10 мкМ Y-27632 в клетки за 1-3 ч до пассажа для повышения выживаемости чувствительных клеточных линий. - Аспирируйте среду и промойте клетки, добавив 500 мкл DPBS. Удалите DPBS и добавьте в лунки 300 мкл отслойного раствора.
- Инкубируйте пластину при 37 °C в течение 5-10 минут. Когда под микроскопом наблюдается достаточная отслойка клеток, добавляют 700 мкл питательной среды PSC или DPBS.
- Пипетка вверх и вниз 5-10 раз с помощью пипетки p1000 до тех пор, пока клетки не диссоциируют на отдельные клетки. Не делайте пипетку слишком много, чтобы предотвратить повреждение клеток.
- Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл, содержащую, по крайней мере, 2 мл DPBS, чтобы разбавить раствор отслойки.
- Центрифугируют пробирку при 200 × г в течение 5 мин и полностью аспирируют раствор, не нарушая клеточную гранулу.
- Ресуспендировать гранулу в 500 мкл питательной среды PSC с добавлением 10 мкМ Y-27632.
- Подсчитайте ячейки и засейте 5000-7000 клеток на 12-луночную пластину с матричным покрытием базальной мембраны, подготовленную на шаге 5.2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется другой номер ячейки, измените его на больший или меньший колодец соответственно. - Инкубируйте пластину не менее 30 минут при 37 °C и 5% CO2 , чтобы клетки прикрепились.
- Замените среду на 750 мкл питательной среды PSC + 10 мкМ Y-27632, если наблюдается много мертвых клеток; в противном случае добавьте 250 мкл + 10 мкМ Y-27632.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, особенно для нестабильных клеточных линий (например, NHP). - Поместите планшет при температуре 37 ° C и 5% CO2 в инкубатор.
- Через 1-2 дня после расщепления замените среду на культуральную среду PSC без Y-27632, чтобы клетки снова продемонстрировали классическую морфологию колонии (рис. 3B).
- Меняйте среду каждые 2 дня, пока колонии не станут достаточно большими. Для изменения среды следуйте разделу 4 протокола.
- Готовят культуральную пластину, покрытую матричным покрытием базальной мембраны, как указано на этапе 5.1.1, с добавлением 10 мкМ Y-27632 в питательную среду PSC.
- Прохождение ИПСК путем сбора колоний
- Подготовьте 12 лунок с матричным покрытием фундаментальной мембраны, как указано на шаге 5.1.1.
- Аспирируйте среду и промойте клетки, осторожно добавив 500 мкл DPBS. Удалите DPBS и добавьте в лунку 500 мкл 0,5 мМ ЭДТА.
- Инкубируйте пластину при ЛТ в течение 1-3 мин и наблюдайте за клетками под микроскопом, пока на границах не будет видно отслоение колонии.
- Удалите ЭДТА и осторожно добавьте 500 мкл DPBS. Аспирируйте жидкость перед тем, как медленно добавить 500 мкл питательной среды PSC в лунку, не отделяя клетки.
- Используйте пипетку p200, чтобы выбрать нужную колонию под микроскопом, не собирая дифференцированные клетки. Для этого аккуратно поцарапайте колонию, взяв среду, содержащую клетки.
- Пересадите каждую собранную колонию в одну лунку с матричным покрытием базальной мембраны, как это подготовлено на этапе 5.3.1. Диссоциируйте клетки на небольшие скопления с помощью пипетки p1000, пипетируя клетки 2-5 раз.
- Инкубируйте пластину в течение 30 минут при 37 ° C и 5% CO2, позволяя сгусткам прикрепиться.
- Замените среду 750 мкл питательной среды PSC, если наблюдается много плавающих мертвых клеток; в противном случае добавьте 250 мкл питательной среды PSC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замена среды через 30 минут имеет решающее значение, особенно для нестабильных клеточных линий (например, NHP). - Поместите планшет при температуре 37 ° C и 5% CO2 в инкубатор.
- Меняйте среду каждые 2-3 дня, пока колонии не станут достаточно большими для пассажа. Для этого следуйте разделу 4 протокола.
6. Замораживание мочевых клеток и ИПСК для длительного хранения
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно ИПСК замораживают в виде комков в среде для замораживания клеток без подсчета. Пипетирование должно быть минимальным, чтобы избежать диссоциации на единичные клетки. Для мочевых клеток, как правило, 1,5 × 10от 4 до 3 × 104 клеток замораживаются в одной пробирке, что позволяет пользователю размораживать одну пробирку непосредственно в одной лунке 12-луночной пластины без необходимости еще одного этапа подсчета.
- Приготовьте 5 мл DPBS в пробирке объемом 15 мл.
- Для замораживания мочевых клеток следуйте шагам 2.2-2.4 протокола. Для замораживания ИПСК выполните шаги 5.1.2-5.1.5 из протокола прохождения комков.
- Перенесите суспензию в пробирку объемом 15 мл, приготовленную на шаге 6.1. Для замораживания мочевых клеток отсчитайте 10 мкл клеточной суспензии с помощью гемоцитометра. Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 × г и полностью аспирируют надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте гранулу ячейки в 400 мкл среды для замораживания клеток на пробирку и распределите клетки по желаемому количеству криотрубок.
- Немедленно переместите криотрубки в -80 °C. Перенесите замороженные пробирки в морозильную камеру с температурой -150 °C или жидкий азот через 1 день после замораживания при -80 °C для длительного хранения.
7. Размораживание мочевых клеток и ИПСК
- Для размораживания мочевых клеток подготовьте желаемое количество 12-лунок, покрытых желатином, как указано на шаге 1.1 протокола. Для ИПСК подготовьте 12-луночные пластины с матричным покрытием базальной мембраны, как указано на этапе 5.1.1. В обоих случаях не следует менять матрицу на среднюю.
- Подготовьте пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл DPBS, и храните ее при температуре 37 °C.
- Быстро поместите замороженный флакон с клетками на водяную баню с температурой 37 °C для оттаивания, пока не станет виден кусок плавающего льда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протирайте криотрубку этанолом до и после инкубации на водяной бане, чтобы избежать загрязнения. - Добавьте 500 мкл среды REMC для мочевых клеток или 500 мкл питательной среды PSC для ИПСК в суспензию, содержащую лед, и немедленно перенесите суспензию в предварительно нагретую пробирку объемом 15 мл, приготовленную на этапе 7.2.
- Центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 5 мин и полностью выбросьте надосадочную жидкость.
- Для мочевых клеток ресуспендируют гранулу в 1 мл среды REMC. Для ИПСК осторожно ресуспендируют гранулу в 750 мкл питательной среды PSC. Избегайте слишком частого пипетирования, чтобы сохранить комки нетронутыми.
Дополнительно: добавление в среду 10 мкМ Y-27632 может поддерживать выживание ИПСК после размораживания. - Аспирируйте матрицу из 12-луночных пластин, подготовленных на шаге 7.1, и осторожно перенесите суспензию ячейки в лунку.
- Поместите планшет на ночь при температуре 37 °C и 5% CO2 в инкубатор.
- На следующий день замените среду питательной средой PSC, без Y-27632 для ИПСК и REMC для мочевых клеток.
- Выращивайте клетки при 37 ° C и 5% CO2 в инкубаторе.
- Меняйте среду каждые 2-3 дня, пока клетки не станут достаточно большими для пассажа. Для изменения среды следуйте разделу 4 протокола.
8. Иммуноцитохимия
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноокрашивание антителами, нацеленными на маркеры, связанные с плюрипотентностью, такие как NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 и EpCAM, является одним из наиболее широко используемых подтверждений недавно сгенерированных ИПСК. Дополнительную информацию об антителах и разведениях можно найти в таблице материалов.
- Планшетные ИПСК за 1-3 дня до использования в соответствующем количестве 12-луночных планшетов. Аспирируйте среду, промойте клетки, добавив 500 мкл DPBS, и удалите DPBS. Добавьте 400 мкл 4% параформальдегида (PFA) в лунку и зафиксируйте ячейки на 15 мин при RT.
- Удалите 4% ПФА и промойте ячейки 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 400 мкл блокирующего буфера на лунку и инкубируйте пластину в течение 30 минут при RT.
- Аспирируйте блокирующий буфер и добавьте антитела, разбавленные в 400 мкл буфера разбавления антител (ADB), в каждую лунку. Инкубируйте тарелку при температуре 4 °C в течение ночи.
- Удалите ADB, содержащий первичные антитела, и промойте клетки 3 раза с помощью DPBS.
- Аспирируйте DPBS и добавьте 400 мкл вторичных антител, разведенных в ADB на лунку. Выдерживают пластину в течение 1 ч при РТ в темноте.
- Снимите ADB и промойте ячейки 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), разведенный в DPBS на лунку, и инкубируйте в течение 3 мин при RT.
- Аспирируйте раствор DAPI и промойте ячейку 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 500 мкл DPBS для визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При выделении клеток из мочи человека и NHP различные типы клеток могут быть идентифицированы непосредственно после выделения. Плоскоклеточные клетки, а также различные более мелкие круглые клетки выводятся с мочой; женская моча содержит гораздо больше плоскоклеточных клеток, чем мужская моча (рис. 1B - День 0; Дополнительный рисунок S1). После 5 дней культивирования в первичной среде мочи можно увидеть первые адгезивные пролиферирующие клетки (рис. 1А, Б - 5-й день). В этот момент половина среды заменяется средой пролиферации REMC каждый день, пока не появятся первые колонии. Примерно на 13-й день адгезивные клетки вырастают в большие колонии, которые можно пройти (рис. 1B - 13-й день). Эти колонии могут быть сформированы из двух морфологически различных типов клеток - один имеет более эпителиальный фенотип с тесно прикрепленными клетками, а другой демонстрирует более мезенхимальную морфологию с удлиненной формой и более высокой миграционной способностью (рис. 1C). После первого прохождения мочевые клетки растут как монослой и могут быть пройдены, когда культура достигает 80% слияния (рис. 1B - День 17).
Рисунок 1: Выделение и культивирование мочевыводящих клеток. (A) Рабочий процесс определения мочевых клеток из образцов приматов человека и других людей. (B) Фазово-контрастные изображения, показывающие рост и образование колоний мочевых клеток до первого прохода (p1). (C) Два различных типа клеток, выделенных из образцов мочи, можно различить после 2 недель культивирования. Масштабные линейки = 250 мкм (B,C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Для получения ИПСК из мочевых клеток используется трансдукция с вирусами Сендай, вводящими факторы Яманаки OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC. Для повышения эффективности трансдукции мочевые клетки инкубируют с вирусом в течение 1 ч в суспензии перед посевом в лунки, покрытые матричным покрытием базальной мембраны (рис. 2А). Некоторые адгезивные клетки можно увидеть в лунках через 1 день после трансдукции (рис. 2B - День 1). Через 5-10 дней эти клетки начинают образовывать колонии, и можно наблюдать ранние морфологические изменения, свидетельствующие о перепрограммировании клеток (рис. 2Б - 14-й день). Многие из этих колоний постепенно проявляют морфологию, подобную ESC, и могут быть собраны в питательной среде PSC, когда диаметр превышает 1 мм. После сбора клетки образуют колонии, демонстрирующие типичную морфологию ESC в течение примерно 4 дней (рис. 2B - дни 21 и 24). Когда колонии ИПСК становятся достаточно большими, клетки могут быть впервые пройдены с использованием протокола пассажирования скопления (шаг протокола 5.1).
Этот подход к перепрограммированию был использован для генерации ИПСК от людей, горилл горилл (горилла ) и Pongo abelii (орангутанг)15. В то время как вероятность получения мочевых клеток весьма вариабельна и, по крайней мере, в два-три раза ниже для шимпанзе, чем для людей15, перепрограммирование полученных мочевых клеток было в основном успешным в нашем опыте. В целом, 0,19% инфицированных мочевых клеток дают начало колониям с ESC-подобной морфологией, в результате чего по крайней мере одна колония в 87% попыток перепрограммирования15. Все сгенерированные ИПСК обладают одинаковыми свойствами и демонстрируют типичную ESC-подобную морфологию колоний, характеризующуюся плотно упакованными клетками с четко очерченными краями (рис. 2C). Кроме того, все ИПСК демонстрируют нормальный кариотип, а отсутствие векторов перепрограммирования SeV было проверено с помощью ПЦР как минимум после пяти пассажей, как рекомендовано производителем набора для перепрограммирования SeV (данные не показаны)15. Иммуноцитохимия используется для проверки экспрессии связанных с плюрипотентностью белков в ядре, таких как NANOG, OCT3/4 и SOX2. Также можно использовать поверхностные маркеры, такие как TRA-1-60, EpCAM и SSEA4 (рис. 2D); однако SSEA4 также экспрессируется в клетках мочевыводящихпутей 15. Кроме того, анализ проточной цитометрии может быть выполнен с использованием этих поверхностных маркеров для получения количественной информации о статусе плюрипотентности ИПСК (метод, описанный Ohnuki et al.48). Этот подход используется, чтобы показать, что 95,3% проанализированных ИПСК орангутанов являются положительными на TRA-1-60 (рис. 2E). Кроме того, дифференцировочная способность НПХ ИПСК может быть доказана с помощью дифференцировки эмбриоидных тел (БЭ) in vitro (метод, описанный Geuder et al.15). Как показано на рисунке 2F, ИПСК горилл способны дифференцироваться в линии энтодермы (ɑ-фетопротеин), мезодермы (ɑ-актин гладких мышц) и эктодермы (β-III тубулин).
Рисунок 2: Генерация и характеристика ИПСК, полученных из мочи. (A) Рабочий процесс перепрограммирования клеток, полученных из мочи. (B) Фазово-контрастные изображения, показывающие морфологические изменения мочевыводящих клеток горилл во время перепрограммирования до создания колоний iPSC. Масштабные линейки = 500 мкм. (C) Морфология установленных колоний iPSC из культур клеток человека, горилл и орангутанов. Масштабные линейки = 500 мкм. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание ИПСК горилл маркерами, связанными с плюрипотентностью, на проходе 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM и TRA-1-60. Масштабные линейки = 100 мкм. (E) Проточный цитометрический анализ ИПСК орангутанов, окрашенных анти-TRA-1-60-PE. В качестве контроля использовались неокрашенные клетки. (F) Иммунофлуоресцентный анализ энтодермы (АФП), мезодермы (ɑ-SMA) и эктодермы (β-III TUB) после дифференцировки ИПСК горилл в эмбриоидных телах. Ядра были закрашены DAPI. Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; ПЭ = фикоэритрин; АФП = α-фетопротеин; ɑ-SMA = альфа-актин гладких мышц; β-III TUB = бета-III тубулин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Когда колонии ИПСК достигают диаметра примерно 2 мм или вот-вот коснутся друг друга, клетки должны быть разделены. Мы предлагаем использовать протокол clump passaging для планового обслуживания. В этом протоколе 0,5 мМ ЭДТА используется для отделения клеток в течение 3-5 минут, в зависимости от размера колонии. Во время инкубации ЭДТА границы колоний начинают отслаиваться, а между клетками появляются видимые промежутки (рис. 3А). ЭДТА должна быть удалена, когда под микроскопом наблюдается соответствующая отслойка. Длительная инкубация с ЭДТА приводит к более высокой фракции единичных клеток, которые не способны выжить. Затем клетки должны быть диссоциированы на скопления аналогичного размера, как показано на рисунке 3A. Клетки не должны диссоциировать на небольшие скопления, так как это снижает выживаемость и может привести к большему количеству дифференцирующих клеток.
Когда эксперимент требует засеивания определенного количества клеток, следует использовать протокол прохождения одной клетки. Этот протокол включает в себя добавление в среду ингибитора Rock, который позволяет отдельным клеткам выживать. Ожидается, что прикрепленные одиночные клетки демонстрируют другую морфологию по сравнению с клетками, растущими в колонии после посева комков (рис. 3B - День 0). После 1-2 дней культивирования отдельные клетки снова начинают расти в колонии, сохраняя при этом свою морфологию, а также свободный контакт между клетками, если в среду добавляется ингибитор Rock (рис. 3B - День 2). Когда наблюдаются эти небольшие колонии, ингибитор Rock должен быть удален из среды, что позволяет клеткам снова демонстрировать типичную ESC-подобную морфологию (рис. 3B - День 4).
Чтобы судить о том, является ли колония iPSC высокого качества, необходимо принять во внимание несколько аспектов. Во-первых, это нормально, что здоровые колонии не проявляют спонтанной дифференцировки или демонстрируют небольшое количество; однако увеличение количества дифференцированных клеток (>10%) свидетельствует о плохом качестве ИПСК. Дополнительными характеристиками низкого качества iPSC являются потеря целостности границ и однородности (рис. 3C: справа), а также рыхлая клеточная упаковка с видимыми промежутками между клетками (рис. 3D: справа). Напротив, высококачественные ИПСК характеризуются четкими границами, плотной клеточной оболочкой и выступающими ядрышками (рис. 3C, D: изображения слева).
Рисунок 3: Культура iPSC приматов. (A) Фазово-контрастные изображения, показывающие отрыв колоний iPSC во время инкубации ЭДТА в соответствии с протоколом пассажирования комка и оптимальный размер комка после диссоциации. Масштабные линейки = 250 мкм. (B) Хронология восстановления iPSC после пассажа одной клетки. Ингибитор Rock Y-27632 был удален со 2-го дня. Масштабные линейки = 250 мкм. (C) Слева: пример высококачественной колонии ИПСК человека с определенными границами. Справа: пример некачественной колонии с меньшей целостностью границ и дифференцированными клетками. Масштабные линейки = 500 мкм. (D) Примеры изображений для высококачественной колонии ИПСК человека (слева) в сравнении с низкокачественной колонией со слабо упакованными клетками (справа). Масштабные линейки = 100 мкм. Аббревиатура: ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Обзор типов клеток, обнаруженных в моче человека. (А) Клетки, выделенные из женской мочи. (B) Клетки, выделенные из мужской мочи. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S1: Композиции буферов и сред, использованные в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ИПСК являются ценными типами клеток, поскольку они позволяют генерировать иначе недоступные типы клеток in vitro. В качестве исходных материалов для перепрограммирования, например, фибробласты не всегда доступны для всех видов приматов, в этой статье представлен протокол генерации ИПСК из клеток, полученных из мочи. Эти клетки могут быть получены неинвазивным способом, даже из нестерильных образцов мочи приматов, путем добавления в питательную среду антибиотиков широкого спектра действия.
Несколько важных шагов в протоколе заслуживают дополнительного обсуждения. Во-первых, при выделении клеток из нестерильной мочи важно дополнить среду антимикробным реагентом широкого спектра действия, чтобы снизить риск заражения. Если рост микробиологического загрязнения становится очевидным, несмотря на использование антибиотиков, рекомендуется выбросить всю культуру и продезинфицировать участок; Кроме того, по нашему опыту, непрерывное культивирование не приводит к здоровым растущим клеткам мочевыводящих путей. Во-вторых, при начале перепрограммирования клеток настоятельно рекомендуется приготовить несколько блюд с разным количеством SeV-трансдуцированных клеток, чтобы избежать риска отслоения всех клеток из-за чрезмерного слияния и увеличить вероятность приобретения ИПСК. В целом, ожидается, что покрытие более высокой плотности клеток, трансдуцированных SeV, приведет к образованию большего количества перепрограммированных колоний ИПСК, тогда как культивирование перепрограммирующих клеток в течение ~ 20 дней часто приводит к чрезмерному слиянию с последующим отрывом всей лунки. В-третьих, на каждом этапе, требующем диссоциации ИПСК, крайне важно избегать обширного пипетирования, которое приводит к значительной гибели клеток. Особенно, когда выполняется пассажирование комков, важно поддерживать их соответствующий размер (рис. 3А). Слишком большие скопления могут привести к быстрой дифференциации, в то время как слишком маленькие скопления могут снизить выживаемость.
Мы заметили, что вероятность получения мочевых клеток довольно варьирует между образцами и аликвотами, но не нашли доказательств того, что меньшие объемы имеют более низкий уровень успеха в получении колоний. В целом, мы выделили в среднем 7,6 колоний из 100 мл мочи человека. Предполагая эту среднюю скорость и распределение Пуассона, получение по крайней мере одной колонии имеет вероятность ~ 98% для 50 мл и ~ 30% для 5 мл исходного материала. В нашем случае удалось выделить хотя бы одну колонию из 5 мл мочи человека в 42% попыток15. Исходя из этого, изоляцию колоний все же стоит попробовать, даже если доступны только небольшие объемы мочи. В случае, если перепрограммирование мочевых клеток не удается, и колонии ИПСК не наблюдаются, покрытие различного количества трансфицированных клеток может привести к перепрограммированию клеток, полученных из мочи. Появляющиеся колонии ИПСК также могут быть идентифицированы как ИПСК путем окрашивания живым способом с использованием поверхностных маркеров (например, TRA-1-60 или щелочной фосфатазы [AP]; данные не показаны). Известно, что активность AP повышается в плюрипотентных стволовых клетках, и ее можно использовать для временного окрашивания стволовых клеток в процессе культивирования. Еще одним возможным подводным камнем протокола является оптимальная культура НПК ИПСК. Используя этот протокол, мы подтвердили, что ИПСК человека и NHP сохраняют свое плюрипотентное состояние в течение более 50 проходов с использованием коммерчески доступной среды. Тем не менее, по сравнению с человеческими ИПСК, ИПСК NHP более склонны к спонтанной дифференциации в нашем опыте, возможно, из-за условий культуры, которые были оптимизированы для людей, а не для культур NHP. Кроме того, существует большая вариабельность среди клонов iPSC в показателях выживаемости после нанесения покрытия, скорости роста и тенденции к дифференцировке. Поэтому часто необходимо определить оптимальный коэффициент расщепления, время прохождения и размер комка для каждого клона в отдельности.
Мы продемонстрировали, что даже объем 5 мл может быть достаточным для выделения мочевых клеток из NHP15. Однако, хотя мы не обнаружили существенных различий в количестве изолированных мочевых клеток у людей, горилл и орангутанов, шимпанзе имели более низкое соотношение, поскольку мы не могли выделить мочевые клетки из общего количества 87 мл. Следовательно, для некоторых видов может потребоваться собрать гораздо больше мочи, чем для других. Сбор больших объемов у мелких приматов может быть особенно сложной задачей, но, поскольку выделение мочевых клеток довольно рентабельно, практично просто опробовать его для определенных видов и доступных объемов мочи. К сожалению, образцы мочи не могут быть заморожены, что ограничивает радиус, в котором могут быть собраны образцы. Однако мы показали, что время хранения 4 ч при 4 °C не влияет на количество выделенных15 колоний, и вполне возможно более длительное время хранения или улучшение условий хранения. Мы ввели несколько видов тестов контроля качества для валидации. Однако, даже если линия iPSC удовлетворяет этим критериям, клональная гетерогенность по-прежнему существенна, что объясняется генетическим фоном49 и эпигенетическим статусом 50,51,52,53,54. Чтобы применить ИПСК приматов к будущему сравнительному анализу, следует учитывать гетерогенность и использовать достаточное количество клонов для усреднения клональной вариации, что позволяет избежать неправильной интерпретации результата.
Тем не менее, использование мочи в качестве источника первичных клеток имеет большое преимущество перед традиционными методами с использованием, например, фибробластов для перепрограммирования, так как они могут быть получены совершенно неинвазивно. Кроме того, этот протокол позволяет генерировать ИПСК из клеток, полученных из мочи, с более коротким периодом, чем обычное перепрограммирование. При этом методе колонии становятся видимыми в течение 5-15 дней, тогда как мы обнаружили, что колонии из фибробластов приматов (резусов, бабуинов), как правило, появляются позже, через 20-30 дней. Кроме того, при использовании этого метода суспензионного инфицирования 0,19% трансдуцированных вирусом клеток дали начало колониям с плюрипотентной клеточноподобной морфологией. Это привело к тому, что по крайней мере одна колония в 87% попыток15. Для сравнения, было показано, что традиционный метод трансдукции SeV с прикрепленными клетками и липофекция с эписомальными плазмидами имеют значительно меньшую эффективность перепрограммирования: 0,09% и 0,009% клеток образуют плюрипотентную колонию соответственно15.
Таким образом, этот метод позволяет неинвазивно изолировать мочевые клетки и генерировать ИПСК без фидеров практически от любого донора человека и многих NHP. Это увеличивает доступ к драгоценным типам клеток, которые можно отличить от этих ИПСК. Кроме того, этот метод может быть использован для получения специфических для пациента ИПСК, которые могут быть использованы для моделирования заболеваний или будущих клеточных методов лечения. Наконец, поскольку ИПСК могут быть получены только из небольших объемов мочи, этот метод может быть применен ко многим другим видам приматов или даже млекопитающих. Таким образом, этот метод может быть мощным инструментом для межвидового сравнения, что может позволить лучше понять эволюцию специфических для человека признаков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана DFG EN 1093/5-1 (номер проекта 458247426). М.О. был поддержан JSPS Overseas Research Fellowship. Все фигурки были созданы с BioRender.com. Проточная цитометрия проводилась с помощью проточной цитометрии Core Facility в Биомедицинском центре Мюнхена. Мы хотели бы поблагодарить Макото Шиду и Томоё Муто из ASHBi, Киотский университет, за поддержку видеосъемки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
