Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per isolare, espandere e riprogrammare cellule derivate dall'urina di primati umani e non umani in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), nonché istruzioni per il mantenimento senza alimentatore delle iPSC appena generate.
Abstract
Gli approcci interspecie che studiano le cellule staminali pluripotenti dei primati e i loro derivati sono cruciali per comprendere meglio i meccanismi molecolari e cellulari della malattia, dello sviluppo e dell'evoluzione. Per rendere le cellule staminali pluripotenti indotte dai primati (iPSC) più accessibili, questo articolo presenta un metodo non invasivo per generare iPSC di primati umani e non umani da cellule derivate dall'urina e il loro mantenimento utilizzando un metodo di coltura senza alimentatore.
L'urina può essere campionata da un ambiente non sterile (ad esempio, la gabbia dell'animale) e trattata con un cocktail antibiotico ad ampio spettro durante la coltura cellulare primaria per ridurre efficacemente la contaminazione. Dopo la propagazione delle cellule derivate dall'urina, le iPSC sono generate da un metodo di trasduzione modificato di un sistema vettoriale del virus Sendai disponibile in commercio. Le prime colonie di iPSC possono essere già visibili dopo 5 giorni e possono essere raccolte dopo 10 giorni al più presto. Il passaggio di routine del grumo con tampone di dissociazione privo di enzimi supporta la pluripotenza delle iPSC generate per più di 50 passaggi.
Introduction
I confronti genomici dei primati umani e non umani (NHP) sono cruciali per comprendere la nostra storia evolutiva e l'evoluzione dei tratti specifici dell'uomo1. Inoltre, questi confronti consentono l'inferenza della funzione identificando sequenze di DNA conservate2, ad esempio, per dare priorità alle varianti associate alla malattia3. I confronti di fenotipi molecolari come i livelli di espressione genica sono cruciali per interpretare meglio i confronti genomici e scoprire, ad esempio, le differenze fenotipiche cellulari. Inoltre, hanno - analogamente ai confronti a livello del DNA - il potenziale per dedurre la rilevanza funzionale, e quindi per interpretare meglio la variazione clinicamente rilevante all'interno degli esseri umani4. L'incorporazione di dati fenotipici molecolari completi in questi studi comparativi richiede risorse biologiche appropriate (cioè cellule ortologhe tra le specie). Tuttavia, ragioni etiche e pratiche rendono difficile o impossibile accedere a tali cellule comparabili, specialmente durante lo sviluppo. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) consentono la generazione di tali tipi di cellule inaccessibili in vitro5,6, sono sperimentalmente accessibili e sono state utilizzate per confronti di primati 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Per generare iPSC, è necessario acquisire le cellule primarie da riprogrammare. Le cellule isolate dalle urine hanno il vantaggio di poter essere campionate in modo non invasivo dai primati e di poter essere facilmente riprogrammate, probabilmente a causa dei loro profili molecolari simili alle cellule staminali15. Le condizioni colturali per mantenere le iPSC dei primati sono importanti quanto la riprogrammazione; Classicamente, la coltura di cellule staminali pluripotenti umane richiedeva un mezzo non definito, basato sul siero e una co-coltura di fibroblasti embrionali di topo - le cosiddette cellule feeder - che forniscono nutrienti essenziali e un'impalcatura per le cellule staminali embrionali (ESC)16. Dopo lo sviluppo di sistemi di coltura chimicamente definiti e privi di alimentazione17,18, ci sono ora varie opzioni di terreni di coltura e matrici iPSC disponibili in commercio. Tuttavia, la maggior parte di queste condizioni di coltura sono state ottimizzate per ESC e iPSC umane, e quindi potrebbero funzionare meno bene nella coltura NHP iPSC. In questo protocollo video, forniamo istruzioni per generare e mantenere iPSC umane e NHP derivate da colture cellulari urinarie.
Dal primo rapporto sulla generazione di iPSC mediante l'espressione forzata di fattori definiti nei fibroblasti nel 2006, questo metodo è stato applicato a molti diversi tipi cellulari di varia origine 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Tra questi, solo le cellule derivate dall'urina possono essere ottenute in modo completamente non invasivo. Sulla base del protocollo precedentemente descritto da Zhou et al.33, è possibile isolare ed espandere le cellule dall'urina dei primati anche da campioni non sterili, integrando antibiotici ad ampio spettro15. In particolare, le cellule derivate dall'urina campionate da questo protocollo mostrano un alto potenziale di produrre iPSC, in un periodo di tempo più breve (le colonie diventano visibili in 5-15 giorni) rispetto alla riprogrammazione convenzionale dei fibroblasti (20-30 giorni, nella nostra esperienza) e con un tasso di successo sufficientemente elevato. Queste cellule derivate dall'urina sono state classificate come popolazione mista di cellule staminali mesenchimali simili e cellule epiteliali della vescica, causando l'elevata efficienza di riprogrammazione15.
Oltre alla variazione nelle celle primarie, anche i metodi di riprogrammazione per generare iPSC variano a seconda dello scopo di utilizzo. Le procedure convenzionali di riprogrammazione per le cellule somatiche umane sono state effettuate mediante la sovraespressione di fattori di riprogrammazione con vettori di retrovirus o lentivirus, che hanno permesso l'integrazione del DNA esogeno nel genoma 5,34,35. Per mantenere intatte le iPSC generate, i ricercatori hanno sviluppato un'ampia varietà di sistemi non di integrazione - vettore PiggyBac asportabile36,37, vettore episomiale38,39, vettori virali non integranti come il virus Sendai 40 e adenovirus 41, trasfezione mRNA42, trasfezione proteica 43,44 e trattamento con composti chimici 45. A causa dell'efficienza e della facilità di gestione, i vettori di riprogrammazione basati su virus Sendai vengono utilizzati in questo protocollo. L'infezione delle cellule primarie viene eseguita in una coltura in sospensione di 1 ora di cellule e virus a una molteplicità di infezione (MOI) di 5 prima della placcatura. Questo passaggio modificato potrebbe aumentare la probabilità di contatto tra superfici cellulari e virus, rispetto al metodo convenzionale in cui i virus vengono aggiunti direttamente alla coltura cellulare aderente, e quindi produrre più colonie iPSC15.
Il passaggio delle cellule staminali pluripotenti umane e NHP può essere effettuato mediante passaggio di grumi e passaggio di singole cellule. L'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) è un agente chelante economico che lega gli ioni di calcio e magnesio e quindi impedisce l'attività aderente della caderina e dell'integrina. L'EDTA è anche usato come reagente di dissociazione lieve e selettiva, poiché le cellule indifferenziate si staccano prima delle cellule differenziate a causa delle loro diverse molecole di adesione. La dissociazione completa induce la morte cellulare massiccia delle iPSC dei primati attraverso l'iperattivazione della miosina mediata dalla bobina a spirale associata a Rho/Rho contenente la proteina chinasi (Rho/Rock). Pertanto, l'integrazione del terreno di coltura con un inibitore Rho/Rock è essenziale per esperimenti che richiedono singole cellule in sospensione46,47. In questo protocollo, raccomandiamo il clump passaging come metodo di passaggio di routine e raccomandiamo il passaging a singola cella solo quando è necessario, ad esempio, quando è richiesta la semina di numeri di celle definiti o durante la sub-clonazione.
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Protocol
Questa procedura sperimentale è stata approvata dal comitato etico responsabile sulla sperimentazione umana (20-122, Ethikkommission LMU München). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.
NOTA: L'approvazione deve essere ottenuta dal comitato etico appropriato prima di iniziare esperimenti relativi a campioni umani e NHP. Tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Ciascuno dei seguenti passaggi deve essere eseguito utilizzando una tecnica sterile in un armadio di sicurezza biologica. Tutte le composizioni tampone e dei supporti sono disponibili nella tabella supplementare S1. Assicurarsi che tutti i fluidi siano riscaldati a temperatura ambiente (22 °C) prima di essere aggiunti alle celle. Ogni fase di centrifugazione deve essere eseguita a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.
1. Isolamento delle cellule da campioni di urina
ATTENZIONE: Assicurarsi che i donatori umani siano esenti da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV) e virus dell'epatite C (HCV). Per gli NHP, assicurarsi che i possibili donatori / cellule siano privi di agenti patogeni specifici: virus B (BV), virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV), betaretrovirus delle scimmie (SRV) e virus linfotropico delle cellule T delle scimmie (STLV).
- Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita di gelatina aggiungendo 500 μL di gelatina allo 0,2% per pozzetto e distribuire il liquido spostando la piastra. Porre a 37 °C per almeno 30 minuti prima del necessario.
- Raccogliere campioni di urina umana in provette coniche da 50 ml. Per i primati, raccogliere l'urina dal pavimento della struttura per animali con una siringa.
NOTA: Un volume di 5 ml di urina si è dimostrato sufficiente per isolare almeno una colonia nel 42% dei tentativi. Tuttavia, si raccomanda l'utilizzo di un volume maggiore di ~ 50 ml di urina per aumentare la possibilità di isolare le colonie. L'urina NHP deve essere campionata il più fresca possibile, preferibilmente immediatamente dopo la minzione. La conservazione di campioni di urina a 4 °C per 4 ore non ha avuto alcun effetto negativo sul tasso di successo del protocollo, ma non sono stati testati tempi di conservazione più lunghi. - Centrifugare il tubo contenente urina a 400 × g per 10 minuti e aspirare delicatamente il surnatante, lasciando circa 1 mL nel tubo.
- Risospendere il pellet nel residuo 1 mL di liquido. Raggruppare le sospensioni in un tubo se sono stati raccolti più tubi di urina.
- Lavare le cellule aggiungendo 10 mL di tampone per il lavaggio delle urine (vedere Tabella supplementare S1) contenente 2,5 μg/mL di amfotericina al tubo e mescolare accuratamente la sospensione usando una pipetta sierologica.
- Centrifugare il tubo a 200 × g per 10 minuti e aspirare con cura il surnatante, lasciando circa <0,2 ml nel tubo.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno urinario primario (vedere Tabella supplementare S1) contenente 0,5 μg/mL di amfotericina per 50 mL di urina inizialmente trattata (risospendere in 1 ml, anche se sono stati trattati meno di 50 mL di urina).
- Aspirare la gelatina dai pozzetti (preparata al punto 1.1) e la piastra 1 mL della sospensione dal punto 1.7 in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti desiderati o per tutti i millilitri di sospensione disponibili.
Facoltativo: per evitare la contaminazione derivante dalla raccolta di campioni non igienica, aggiungere 100 μg / ml di reagente antimicrobico alle cellule da qui in poi, fino al primo passaggio. - Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 .
- Aggiungere 1 ml di terreno urinario primario per pozzetto al giorno fino al giorno 5, senza rimuovere il terreno esistente.
- Il giorno 5, aspirare 4 mL di terreno dalla piastra, lasciando circa 1 mL di mezzo. Aggiungere 1 mL di terreno REMC (vedere Tabella supplementare S1) per pozzetto per ottenere una miscela 1:1 con il nuovo terreno di coltura.
- Sostituire metà del terreno con terreno REMC ogni giorno fino alla comparsa delle prime colonie (Figura 1A, B). Pertanto, rimuovere 1 mL di vecchio terreno e aggiungere 1 mL di terreno REMC fresco per pozzetto.
2. Espansione delle cellule urinarie
NOTA: Il passaggio delle cellule urinarie deve essere condotto prima che la coltura raggiunga il 90% di confluenza.
- Preparare la quantità desiderata di piastre a 12 pozzetti rivestite di gelatina, come indicato nel passaggio 1.1.
- Aspirare il vecchio mezzo e lavare le cellule aggiungendo 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS).
- Aspirare il DPBS e aggiungere 300 μL di enzima di dissociazione 0,5x diluito con DPBS. Incubare la piastra a 37 °C per 5 min.
- Aggiungere 700 μL di terreno REMC per arrestare la reazione enzimatica. Pipettare delicatamente la sospensione usando una pipetta P1000 fino a quando le cellule non sono dissociate in singole celle.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare la provetta a 200 × g per 5 minuti.
- Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno REMC.
- Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule (un emocitometro o un contatore automatico delle cellule).
- Per l'espansione delle cellule urinarie, la piastra 1,5 × 10 da 4 a 3 × 104 cellule in 1 ml di terreno REMC in una piastrada 12 pozzetti rivestita con gelatina allo 0,2%.
- Eseguire successive modifiche del mezzo a giorni alterni fino a quando la coltura raggiunge l'80% -90% di confluenza. Pertanto, aspirare il vecchio mezzo e aggiungere 1 mL di terreno REMC fresco.
3. Generazione di iPSC da parte dell'infezione da vettore del virus Sendai
Nota : per il flusso di lavoro della procedura di riprogrammazione, vedere la Figura 2A. Le cellule urinarie utilizzate per la riprogrammazione dovrebbero essere il più giovani possibile, ma una notevole perdita di efficienza di riprogrammazione non si osserva prima del passaggio 4. Il Sendai Virus Reprogramming Kit deve essere utilizzato in una struttura BL-2. Maneggiare i virus sotto un armadio di sicurezza biologica con flusso laminare e utilizzare sempre dispositivi di sicurezza appropriati per prevenire l'esposizione alle mucose.
- Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale aggiungendo 500 μL di matrice di membrana basale per pozzetto e distribuire il liquido spostando la piastra. Incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora e sostituire la matrice della membrana basale con 900 μL di terreno REMC. Conservare la piastra a 37 °C fino all'uso.
- Scongelare rapidamente i componenti del Sendai Reprogramming Kit a bagnomaria a 37 °C. Mescolare i virus Sendai (policistronico KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC e KLF4) con un MOI di 5 e aggiungere il mezzo REMC fino a 100 μL. Usa l'equazione (1):
NOTA: poiché i titoli dei virus differiscono tra i lotti, controllare sempre il titolo nel certificato di analisi fornito dal produttore.
Opzionale: Utilizzare il virus Sendai della proteina fluorescente verde (GFP) in aggiunta come controllo positivo per l'efficienza di trasduzione. Per questo, preparare altre 3,5 × 104 celle in un tubo separato durante il passaggio 3.3. - Per la dissociazione delle cellule urinarie, seguire i passaggi 2.2-2.4. Contare le cellule utilizzando il contatore delle cellule e trasferire 7 × 104 cellule urinarie in un tubo da 1,5 ml.
- Centrifugare il tubo a 200 × g per 5 minuti e rimuovere con attenzione il surnatante senza interrompere il pellet cellulare. Risospendere il pellet in 100 μL della miscela SeV preparata nella fase 3.2. Incubare la provetta per 1 ora a 37 °C per l'infezione da sospensione.
- Placcare la sospensione sulle piastre a 12 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale preparate nella fase 3.1. Di routine, piastra 1 × 10 4 e 2,5 × 104 celle per pozzetto in duplicati.
- Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2. Sostituire il terreno con 1 mL di terreno REMC fresco 24 ore dopo la trasduzione e il giorno 3.
- Il giorno 5 dopo la trasduzione, cambiare il mezzo in mezzo di generazione PSC (vedere Tabella supplementare S1), con successive variazioni del terreno a giorni alterni. Pertanto, rimuovere il vecchio mezzo e aggiungere 1 mL di terreno di generazione PSC per pozzetto.
NOTA: possono essere necessari fino a 15 giorni prima che compaiano le prime colonie. - Scegli le singole colonie iPSC quando la dimensione della colonia supera 1 mm. Per fare questo, raschiare e raccogliere con cura una singola colonia con una pipetta p10 al microscopio. Trasferire la colonia in un nuovo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti rivestita con una matrice di membrana basale contenente 750 μL di terreno di coltura PSC.
Facoltativo: il risciacquo della piastra con DPBS e il trattamento per 1 minuto con 0,5 mM di EDTA prima della raccolta potrebbero supportare la coltura robusta di ulteriori passaggi. Se le cellule devono essere coltivate più a lungo per attendere le successive colonie emergenti, non eseguire questa fase di trattamento EDTA. - Far crescere le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 con successive variazioni del mezzo a giorni alterni, come indicato nella sezione 4 del protocollo. Quando la colonia prelevata raggiunge un diametro di 2 mm, continuare con il passaggio iPSC di routine, come spiegato nella sezione 5 del protocollo.
4. Cambio medio
NOTA: Il terreno di coltura deve essere cambiato a giorni alterni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi da passare.
- Aspirare il vecchio mezzo e aggiungere 750 μL di terreno fresco per piastra a 12 pozzetti. Per passare a un diverso tipo di mezzo, sostituire il mezzo almeno 1 giorno dopo il passaggio.
5. Passaggio
NOTA: Le cellule devono essere fatte passare quando le colonie iPSC crescono abbastanza grandi (diametro > 2 mm), o le colonie stanno per toccarsi. Di routine, le iPSC possono essere suddivise circa ogni 5 giorni. Utilizzare il passa-aggregazione (fase 5.1) per la manutenzione ordinaria e il passaggio a singola cella (passaggio 5.2) per esperimenti in cui è necessario un numero definito di cellule. Nel caso in cui le iPSC si differenzino molto, la raccolta delle colonie (fase 5.3) può aiutare a migliorare la purezza delle colture.
- Passante a grumi
- Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale aggiungendo 500 μL di matrice di membrana basale per pozzetto e distribuire il liquido spostando la piastra. Incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora. Sostituire la matrice della membrana basale con 500 μL di terreno di coltura PSC e conservare la piastra a 37 °C fino all'uso.
- Aspirare il terreno dalle cellule in coltura e lavare le cellule aggiungendo con cura 500 μL di DPBS. Rimuovere il DPBS e aggiungere 500 μL di 0,5 mM EDTA al pozzetto.
- Incubare la piastra a RT per 2-5 minuti, fino a quando le colonie iniziano a staccarsi. Osservare attentamente le cellule al microscopio.
- Quando i bordi delle colonie iniziano a staccarsi e gli spazi tra le cellule diventano visibili (Figura 3A), rimuovere l'EDTA e aggiungere con attenzione 500 μL di DPBS.
NOTA: Pipettare sempre contro la parete laterale del pozzetto e mai direttamente sulle celle, in modo da non staccare le celle dalla piastra. - Aspirare il DPBS e lavare il pozzetto con 500 μL di terreno di coltura PSC utilizzando una pipetta p1000. Pipettare su e giù 1x-5x per disperdere le colonie in grumi di dimensioni appropriate (Figura 3A). Non pipetta troppo.
NOTA: se le iPSC vengono accidentalmente pipettate troppo, aggiungere 10 μM di inibitore di roccia Y-27632 al mezzo. Ciò può migliorare la sopravvivenza, poiché le iPSC non sono in grado di sopravvivere come singole cellule. - Trasferire 1/10-1/50 della sospensione del grumo di celle ai nuovi pozzi. Il rapporto dipende dalla confluenza del pozzo prima della scissione, dalla densità desiderata delle cellule seminate e dalla preferenza clonale iPSC.
- Distribuire uniformemente i grumi nel pozzetto spostando delicatamente la piastra avanti e indietro più volte. Incubare la piastra per almeno 30 minuti a 37 °C per far aderire i grumi.
- Sostituire il terreno con 750 μL di terreno di coltura PSC se si osservano molte cellule morte galleggianti; in caso contrario, aggiungere 250 μL di terreno di coltura PSC. Porre la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
NOTA: La sostituzione media dopo 30 minuti è fondamentale, specialmente per le linee cellulari instabili (ad esempio, NHP). - Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi per passare. Per modifiche medie, seguire il passaggio 4 del protocollo.
- Passaggio a cella singola
- Preparare la piastra di coltura rivestita con matrice di membrana basale, come indicato al punto 5.1.1, con l'aggiunta di 10 μM Y-27632 al terreno di coltura PSC.
Opzionale: aggiungere 10 μM Y-27632 alle cellule 1-3 ore prima del passaggio per migliorare la sopravvivenza delle linee cellulari sensibili. - Aspirare il mezzo e lavare le celle aggiungendo 500 μL di DPBS. Rimuovere il DPBS e aggiungere 300 μL di soluzione di distacco ai pozzetti.
- Incubare la piastra a 37 °C per 5-10 min. Quando si osserva un distacco sufficiente delle cellule al microscopio, aggiungere 700 μL di terreno di coltura PSC o DPBS.
- Pipettare su e giù 5-10 volte usando una pipetta p1000 fino a quando le cellule non sono dissociate in singole celle. Non pipettare troppo, al fine di prevenire danni alle cellule.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL contenente almeno 2 mL di DPBS per diluire la soluzione di distacco.
- Centrifugare il tubo a 200 × g per 5 minuti e aspirare completamente la soluzione, senza interrompere il pellet cellulare.
- Risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura PSC integrato con 10 μM Y-27632.
- Contare le cellule e seminare 5.000-7.000 cellule per piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice di membrana basale, preparata al punto 5.2.1.
NOTA: se è necessario un numero di cella diverso, passare a un pozzetto più grande o più piccolo di conseguenza. - Incubare la piastra per almeno 30 minuti a 37 °C e al 5% di CO2 per consentire alle cellule di attaccarsi.
- Sostituire il terreno con 750 μL di terreno di coltura PSC + 10 μM Y-27632 se si osservano molte cellule morte; altrimenti, aggiungere 250 μL + 10 μM Y-27632.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale, specialmente per le linee cellulari instabili (ad esempio, NHPs). - Porre la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
- Cambiare il terreno in terreno di coltura PSC senza Y-27632 da 1 a 2 giorni dopo la scissione, per consentire alle cellule di visualizzare nuovamente la morfologia classica della colonia (Figura 3B).
- Cambia il mezzo ogni 2 giorni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi. Per modifiche medie, seguire la sezione 4 del protocollo.
- Preparare la piastra di coltura rivestita con matrice di membrana basale, come indicato al punto 5.1.1, con l'aggiunta di 10 μM Y-27632 al terreno di coltura PSC.
- Passaggio delle iPSC mediante raccolta delle colonie
- Preparare 12 pozzetti rivestiti di matrice di membrana basale come indicato al punto 5.1.1.
- Aspirare il mezzo e lavare le celle aggiungendo con cura 500 μL di DPBS. Rimuovere il DPBS e aggiungere 500 μL di 0,5 mM EDTA al pozzetto.
- Incubare la piastra a RT per 1-3 minuti e osservare le cellule al microscopio, fino a quando il distacco della colonia è visibile sui bordi.
- Rimuovere l'EDTA e aggiungere con cautela 500 μL di DPBS. Aspirare il liquido prima di aggiungere lentamente 500 μL di terreno di coltura PSC al pozzetto, senza staccare le cellule.
- Utilizzare una pipetta p200 per scegliere la colonia desiderata al microscopio, senza raccogliere le cellule differenziate. Per fare questo, grattare delicatamente sulla colonia mentre si prende il mezzo contenente le cellule.
- Trasferire ogni colonia prelevata in un pozzetto rivestito di matrice di membrana basale, come preparato al punto 5.3.1. Dissociare le cellule in piccoli grumi usando una pipetta p1000, pipettando le celle 2-5 volte.
- Incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2, lasciando che i grumi si attacchino.
- Sostituire il terreno con 750 μL di terreno di coltura PSC se si osservano molte cellule morte galleggianti; in caso contrario, aggiungere 250 μL di terreno di coltura PSC.
NOTA: La sostituzione media dopo 30 minuti è fondamentale, specialmente per le linee cellulari instabili (ad esempio, NHP). - Porre la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
- Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi per passare. Per fare ciò, seguire la sezione 4 del protocollo.
6. Congelamento delle cellule urinarie e delle iPSC per la conservazione a lungo termine
NOTA: Di routine, le iPSC vengono congelate come grumi nel mezzo di congelamento cellulare senza contare. Il pipettaggio dovrebbe essere minimo, per evitare la dissociazione in singole cellule. Per le cellule urinarie, di routine, 1,5 × 10 4 a 3 × 104 cellule sono congelate per tubo, consentendo all'utente di scongelare un tubo direttamente in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti senza la necessità di un'altra fase di conteggio.
- Preparare 5 mL di DPBS in una provetta da 15 mL.
- Per il congelamento delle cellule urinarie, seguire i passaggi 2.2-2.4 del protocollo. Per il congelamento delle iPSC, seguire i passaggi 5.1.2-5.1.5 del protocollo di passaggio del gruppo.
- Trasferire la sospensione nel tubo da 15 mL preparato al punto 6.1. Per il congelamento delle cellule urinarie, contare 10 μL della sospensione cellulare utilizzando un emocitometro. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 × g e aspirare completamente il surnatante
- Risospendere il pellet cellulare in 400 μL di mezzo di congelamento cellulare per provetta e distribuire le cellule alla quantità desiderata di criotubi.
- Trasferire immediatamente i criotubi a -80 °C. Trasferire i tubi congelati in un congelatore a -150 °C o in azoto liquido 1 giorno dopo il congelamento a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
7. Scongelamento delle cellule urinarie e delle iPSC
- Per lo scongelamento delle cellule urinarie, preparare la quantità desiderata di 12 pozzetti rivestiti di gelatina, come indicato nella fase 1.1 del protocollo. Per le iPSC, preparare le piastre a 12 pozzetti rivestite con membrana basale rivestite con matrice di matrice, come indicato al punto 5.1.1. In entrambi i casi, non scambiare la matrice con il mezzo.
- Preparare una provetta da 15 mL contenente 4 mL di DPBS e conservarla a 37 °C.
- Posizionare rapidamente una fiala congelata di cellule a bagnomaria a 37 °C per lo scongelamento, fino a quando un pezzo di ghiaccio galleggiante diventa visibile.
NOTA: Pulire il criotubo con etanolo prima e dopo l'incubazione a bagnomaria per evitare contaminazioni. - Aggiungere 500 μL di terreno REMC per le cellule urinarie o 500 μL di terreno di coltura PSC per le iPSC alla sospensione contenente ghiaccio e trasferire immediatamente la sospensione nel tubo da 15 mL preriscaldato preparato al punto 7.2.
- Centrifugare il tubo a 200 × g per 5 minuti ed eliminare completamente il surnatante .
- Per le cellule urinarie, risospendere il pellet in 1 ml di terreno REMC. Per le iPSC, risospendere accuratamente il pellet in 750 μL di terreno di coltura PSC. Evitare di pipettare troppo, in modo da mantenere intatti i grumi.
Opzionale: l'integrazione del terreno con 10 μM Y-27632 può supportare la sopravvivenza delle iPSC dopo lo scongelamento. - Aspirare la matrice dalle piastre a 12 pozzetti preparate al punto 7.1 e trasferire con attenzione la sospensione cellulare nel pozzetto.
- Posizionare la piastra per una notte a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
- Il giorno successivo, sostituire il terreno con terreno di coltura PSC, senza Y-27632 per iPSC e con REMC per le cellule urinarie.
- Far crescere le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
- Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni fino a quando le cellule diventano abbastanza grandi per passare. Per modifiche medie, seguire la sezione 4 del protocollo.
8. Immunocitochimica
NOTA: L'immunocolorazione con anticorpi mirati a marcatori correlati alla pluripotenza come NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 ed EpCAM è una delle convalide più utilizzate delle iPSC di nuova generazione. Ulteriori informazioni sugli anticorpi e sulle diluizioni sono disponibili nella tabella dei materiali.
- Piastra iPSC 1-3 giorni prima dell'uso in un numero appropriato di piastre a 12 pozzetti. Aspirare il mezzo, lavare le celle aggiungendo 500 μL di DPBS e rimuovere il DPBS. Aggiungere 400 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per pozzetto e fissare le cellule per 15 minuti a RT.
- Rimuovere il PFA al 4% e lavare le celle 3 volte con DPBS. Aggiungere 400 μL di tampone bloccante per pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti a RT.
- Aspirare il tampone bloccante e aggiungere gli anticorpi diluiti in 400 μL di tampone anticorpale di diluizione (ADB) a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 4 °C durante la notte.
- Rimuovere l'ADB contenente gli anticorpi primari e lavare le cellule 3 volte con DPBS.
- Aspirare il DPBS e aggiungere 400 μL di anticorpi secondari diluiti in ADB per pozzetto. Incubare la piastra per 1 ora a RT al buio.
- Rimuovere l'ADB e lavare le celle 3 volte con DPBS. Aggiungere 1 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in DPBS per pozzetto e incubare per 3 minuti a RT.
- Aspirare la soluzione DAPI e lavare la cella 3 volte con DPBS. Aggiungere 500 μL di DPBS per l'imaging.
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Representative Results
Quando si isolano le cellule dall'urina umana e NHP, diversi tipi di cellule possono essere identificati direttamente dopo l'isolamento. Le cellule squamose, così come varie cellule rotonde più piccole, vengono escrete con l'urina; l'urina femminile contiene molte più cellule squamose rispetto all'urina maschile (Figura 1B - Giorno 0; Figura supplementare S1). Dopo 5 giorni di coltura nel mezzo urinario primario, si possono vedere le prime cellule proliferanti aderenti (Figura 1A,B - Giorno 5). A questo punto, metà del terreno viene sostituito con terreno di proliferazione REMC ogni giorno, fino alla comparsa delle prime colonie. Approssimativamente il giorno 13, le cellule aderenti crescono in grandi colonie che possono essere passate (Figura 1B - Giorno 13). Queste colonie possono essere formate da due tipi di cellule morfologicamente distinte - una con un fenotipo più simile all'epitelio con cellule che crescono strettamente attaccate, e l'altra che mostra una morfologia più mesenchimale con forma allungata e maggiore capacità migratoria (Figura 1C). Dopo il primo passaggio, le cellule urinarie crescono come un monostrato e possono essere passate quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza (Figura 1B - Giorno 17).
Figura 1: Isolamento e coltivazione delle cellule urinarie . (A) Flusso di lavoro per la creazione di cellule urinarie da campioni di primati umani e non umani. (B) Immagini a contrasto di fase che mostrano la crescita e la formazione di colonie delle cellule urinarie fino al primo passaggio (p1). (C) Due diversi tipi di cellule isolate da campioni di urina possono essere distinti dopo 2 settimane di coltura. Barre della scala = 250 μm (B,C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Per generare iPSC dalle cellule urinarie, viene utilizzata una trasduzione con virus Sendai che introducono i fattori di Yamanaka OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC. Per aumentare l'efficienza di trasduzione, le cellule urinarie vengono incubate con il virus per 1 ora in sospensione, prima di seminare su pozzetti rivestiti di matrice di membrana basale (Figura 2A). Alcune cellule aderenti possono essere viste nei pozzetti 1 giorno dopo la trasduzione (Figura 2B - Giorno 1). Dopo 5-10 giorni, queste cellule iniziano a formare colonie e si possono osservare cambiamenti morfologici precoci, che indicano la riprogrammazione delle cellule (Figura 2B - Giorno 14). Molte di queste colonie mostrano progressivamente una morfologia simile all'ESC e possono essere raccolte in terreno di coltura PSC quando il diametro supera 1 mm. Dopo la raccolta, le cellule formano colonie che mostrano la tipica morfologia ESC entro circa 4 giorni (Figura 2B - Giorni 21 e 24). Quando le colonie di iPSC diventano abbastanza grandi, le cellule possono essere fatte passare per la prima volta utilizzando il protocollo di passaggio del grumo (fase 5.1 del protocollo).
Questo approccio di riprogrammazione è stato utilizzato per generare iPSC da esseri umani, Gorilla gorilla (gorilla ) e Pongo abelii (orango)15. Mentre la probabilità di ottenere cellule urinarie è abbastanza variabile, e almeno da due a tre volte inferiore per gli scimpanzé rispetto agli esseri umani15, la riprogrammazione delle cellule urinarie ottenute ha avuto per lo più successo nella nostra esperienza. In generale, lo 0,19% delle cellule urinarie infette dà origine a colonie con morfologia simile all'ESC, risultando in almeno una colonia nell'87% dei tentativi di riprogrammazione15. Tutte le iPSC generate condividono le stesse proprietà e mostrano la tipica morfologia delle colonie simili a ESC, caratterizzate da celle strettamente imballate con bordi chiaramente definiti (Figura 2C). Inoltre, tutte le iPSC mostrano un cariotipo normale e l'assenza di vettori di riprogrammazione SeV è stata verificata mediante PCR dopo un minimo di cinque passaggi, come raccomandato dal produttore del kit di riprogrammazione SeV (dati non mostrati)15. L'immunocitochimica viene utilizzata per testare l'espressione di proteine associate alla pluripotenza nel nucleo, come NANOG, OCT3/4 e SOX2. È possibile utilizzare anche marcatori di superficie come TRA-1-60, EpCAM e SSEA4 (Figura 2D); tuttavia, SSEA4 è espresso anche nelle cellule urinarie15. Inoltre, l'analisi della citometria a flusso può essere eseguita utilizzando questi marcatori di superficie per fornire informazioni quantitative sullo stato di pluripotenza delle iPSCs (metodo descritto da Ohnuki et al.48). Questo approccio viene utilizzato per dimostrare che il 95,3% delle iPSC di orango analizzate sono positive per TRA-1-60 (Figura 2E). Inoltre, la capacità di differenziazione delle iPSC NHP può essere dimostrata attraverso la differenziazione in vitro del corpo embrioide (EB) (metodo descritto da Geuder et al.15). Come mostrato nella Figura 2F, le iPSC dei gorilla sono in grado di differenziarsi in endoderma (ɑ-fetoproteina), mesoderma (ɑ-actina della muscolatura liscia) ed ectoderma (tubulina β-III).
Figura 2: Generazione e caratterizzazione di iPSC derivate dall'urina . (A) Riprogrammazione del flusso di lavoro delle cellule derivate dall'urina. (B) Immagini a contrasto di fase che mostrano i cambiamenti morfologici delle cellule urinarie dei gorilla durante la riprogrammazione fino alla creazione di colonie di iPSC. Barre di scala = 500 μm. (C) Morfologia di colonie iPSC stabilite da colture cellulari umane, gorilla e oranghi. Barre della scala = 500 μm. (D) Colorazione in immunofluorescenza di iPSC di gorilla con marcatori associati alla pluripotenza al passaggio 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM e TRA-1-60. Barre di scala = 100 μm. (E) Analisi citometrica a flusso di iPSC di orangutan colorate con anti-TRA-1-60-PE. Le cellule non colorate sono state utilizzate come controllo. (F) Analisi di immunofluorescenza di endoderma (AFP), mesoderma (ɑ-SMA) ed ectoderma (β-III TUB) dopo differenziazione del corpo embrioide di iPSC gorilla. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; PE = ficoeritrina; AFP = α-fetoproteina; ɑ-SMA = actina della muscolatura liscia alfa; β-III TUB = tubulina beta III; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Quando le colonie di iPSC raggiungono un diametro di circa 2 mm, o stanno per toccarsi, le cellule dovrebbero essere divise. Si consiglia di utilizzare il protocollo di passaggio del ciuffo per la manutenzione ordinaria. In questo protocollo, 0,5 mM EDTA viene utilizzato per staccare le cellule per 3-5 minuti, a seconda delle dimensioni della colonia. Durante l'incubazione dell'EDTA, i bordi delle colonie iniziano a staccarsi e appaiono spazi visibili tra le cellule (Figura 3A). L'EDTA deve essere rimosso quando si osserva un distacco appropriato al microscopio. L'incubazione prolungata con EDTA porta a una frazione più elevata di singole cellule che non sono in grado di sopravvivere. Successivamente, le cellule devono essere dissociate in grumi di dimensioni simili, come mostrato nella Figura 3A. Le cellule non devono essere dissociate in piccoli grumi, poiché ciò riduce la sopravvivenza e può portare a cellule più differenzianti.
Quando un esperimento richiede la semina di un numero definito di cellule, è necessario utilizzare il protocollo di passaggio a singola cellula. Questo protocollo include l'integrazione del mezzo con un inibitore di Rock, che consente alle singole cellule di sopravvivere. Ci si aspetta che le singole cellule attaccate mostrino una morfologia diversa, rispetto alle cellule che crescono in una colonia dopo la semina del grumo (Figura 3B - Giorno 0). Dopo 1-2 giorni di coltura, le singole cellule iniziano a crescere di nuovo in colonie, preservando la loro morfologia e il loro contatto cellula-cellula sciolto, se un inibitore della roccia viene aggiunto al terreno (Figura 3B - Giorno 2). Quando si osservano queste piccole colonie, l'inibitore della roccia deve essere rimosso dal mezzo, consentendo alle cellule di mostrare nuovamente la tipica morfologia simile all'ESC (Figura 3B - Giorno 4).
Per giudicare se una colonia iPSC è di alta qualità, è necessario prendere in considerazione diversi aspetti. In primo luogo, è normale che le colonie sane mostrino nessuna o una piccola quantità di differenziazione spontanea; tuttavia, un aumento del numero di cellule differenziate (>10%) è indicativo di scarsa qualità delle iPSC. Ulteriori caratteristiche di bassa qualità iPSC sono una perdita di integrità e uniformità del bordo (Figura 3C: a destra), nonché l'imballaggio cellulare sciolto con spazi visibili tra le celle (Figura 3D: a destra). Al contrario, le iPSC di alta qualità sono caratterizzate da bordi definiti, imballaggio cellulare stretto e nucleoli prominenti (Figura 3C, D: immagini a sinistra).
Figura 3: Coltura iPSC di primati. (A) Immagini a contrasto di fase che mostrano il distacco delle colonie di iPSC durante l'incubazione EDTA seguendo il protocollo di passaggio del grumo e la dimensione ottimale del ciuffo dopo la dissociazione. Barre della scala = 250 μm. (B) Cronologia del recupero di iPSC dopo il passaggio di una singola cella. L'inibitore di roccia Y-27632 è stato rimosso dal giorno 2 in poi. Barre della scala = 250 μm. (C) A sinistra: esempio di colonia umana iPSC di alta qualità con confini definiti. A destra: esempio di una colonia di scarsa qualità che mostra meno integrità dei bordi e cellule differenziate. Barre di scala = 500 μm. (D) Immagini di esempio per una colonia di iPSC umana di alta qualità (a sinistra) rispetto a una di bassa qualità con celle debolmente imballate (a destra). Barre della scala = 100 μm. Abbreviazione: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Panoramica dei tipi di cellule presenti nelle urine umane. (A) Cellule isolate dall'urina femminile. (B) Cellule isolate dall'urina maschile. Barra di scala = 100 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: Composizione tampone e dei supporti utilizzati in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Le iPSC sono tipi di cellule preziose in quanto consentono la generazione di tipi cellulari altrimenti inaccessibili in vitro. Poiché i materiali di partenza per la riprogrammazione, ad esempio, i fibroblasti non sono facilmente disponibili da tutte le specie di primati, questo documento presenta un protocollo per la generazione di iPSC da cellule derivate dall'urina. Queste cellule possono essere ottenute in modo non invasivo, anche da campioni di urina di primati non sterili, integrando il terreno di coltura con antibiotici ad ampio spettro.
Diversi passaggi critici del protocollo meritano un'ulteriore discussione. In primo luogo, quando si isolano le cellule dall'urina non sterile, è importante integrare il terreno con un reagente antimicrobico ad ampio spettro per ridurre il rischio di contaminazione. Se la crescita della contaminazione microbiologica diventa evidente nonostante l'uso di antibiotici, si raccomanda di scartare l'intera coltura e disinfettare l'area; Inoltre, nella nostra esperienza, la coltura continua non produce cellule urinarie sane in crescita. In secondo luogo, quando si inizia a riprogrammare le cellule, si consiglia vivamente di preparare diversi piatti con un numero diverso di cellule trasdotte da SeV, per evitare il rischio di distacco di tutte le cellule per sovraconfluenza e per aumentare la probabilità di acquisizione di iPSC. In generale, la placcatura di una maggiore densità di cellule trasdotte da SeV dovrebbe produrre più colonie di iPSC riprogrammate, mentre la coltura delle cellule di riprogrammazione per un periodo di ~ 20 giorni spesso provoca una sovraconfluenza, seguita dal distacco dell'intero pozzo. In terzo luogo, in ogni fase che richiede la dissociazione delle iPSC, è fondamentale evitare il pipettaggio esteso, che porta a una significativa morte cellulare. Soprattutto quando viene eseguito il passaggio del ciuffo, è importante mantenere i ciuffi a una dimensione appropriata (Figura 3A). Ciuffi troppo grandi possono portare a una rapida differenziazione, mentre grumi troppo piccoli possono ridurre la sopravvivenza.
Abbiamo osservato che la probabilità di ottenere cellule urinarie è piuttosto variabile tra campioni e aliquote, ma non abbiamo trovato prove che volumi più piccoli abbiano un tasso di successo inferiore nell'ottenere colonie. In generale, abbiamo isolato una media di 7,6 colonie da 100 ml di urina umana. Assumendo questo tasso medio e una distribuzione di Poisson, ottenere almeno una colonia ha una probabilità di ~98% per 50 mL e ~30% per 5 mL di materiale di partenza. Nel nostro caso, è stato possibile isolare almeno una colonia da 5 ml di urina umana nel 42% dei tentativi15. Sulla base di questo, vale ancora la pena provare l'isolamento delle colonie, anche se sono disponibili solo piccoli volumi di urina. Nel caso in cui la riprogrammazione delle cellule urinarie fallisca e non si possano osservare colonie di iPSC, la placcatura di un numero diverso di cellule trasfettate può comportare la riprogrammazione delle cellule derivate dall'urina. Le colonie di iPSC emergenti possono anche essere identificate come iPSC mediante colorazione viva utilizzando marcatori superficiali (ad esempio, TRA-1-60 o fosfatasi alcalina [AP]; dati non mostrati). È noto che l'attività AP è sovraregolata nelle cellule staminali pluripotenti e può essere utilizzata per colorare transitoriamente le cellule staminali durante il processo di coltura. Un'altra possibile insidia del protocollo è la coltura ottimale delle iPSC NHP. Utilizzando questo protocollo, abbiamo confermato che le iPSC umane e NHP mantengono il loro stato pluripotente per più di 50 passaggi utilizzando un mezzo disponibile in commercio. Tuttavia, rispetto alle iPSC umane, le iPSC NHP sono più inclini a differenziarsi spontaneamente nella nostra esperienza, potenzialmente a causa delle condizioni di coltura che sono state ottimizzate per le colture umane e non per le colture NHP. Inoltre, vi è una grande variabilità tra i cloni di iPSC nei tassi di sopravvivenza dopo la placcatura, nella velocità di crescita e nella tendenza alla differenziazione. Pertanto, è spesso necessario determinare il rapporto di divisione ottimale, i tempi di passaggio e la dimensione del grumo per ciascun clone individualmente.
Abbiamo dimostrato che anche un volume di 5 ml può essere sufficiente per isolare le cellule urinarie dai NHPs15. Tuttavia, mentre non abbiamo trovato differenze significative nel numero di cellule urinarie isolate negli esseri umani, nei gorilla e negli oranghi, gli scimpanzé avevano un rapporto inferiore, poiché non potevamo isolare le cellule urinarie da un totale di 87 ml. Quindi, per alcune specie, potrebbe essere necessario raccogliere molta più urina rispetto ad altre. Raccogliere grandi volumi da piccoli primati può essere particolarmente impegnativo, ma poiché l'isolamento delle cellule urinarie è abbastanza economico, è pratico provarlo solo per particolari specie e volumi disponibili di urina. Sfortunatamente, i campioni di urina non possono essere congelati, il che limita il raggio su cui i campioni possono essere raccolti. Tuttavia, abbiamo dimostrato che un tempo di conservazione di 4 ore a 4 °C non ha alcuna influenza sul numero di colonie isolate15, e un tempo di conservazione più lungo o un miglioramento delle condizioni di conservazione potrebbero essere possibili. Abbiamo introdotto diversi tipi di test di controllo qualità per la convalida. Tuttavia, anche se una linea iPSC soddisfa questi criteri, l'eterogeneità clonale è ancora sostanziale, il che è stato spiegato dal background genetico49 e dallo stato epigenetico 50,51,52,53,54. Per applicare le iPSC dei primati alle future analisi comparative, si dovrebbe considerare l'eterogeneità e utilizzare abbastanza cloni per calcolare la media della variazione clonale, evitando così un'interpretazione errata del risultato.
Tuttavia, l'uso dell'urina come fonte per le cellule primarie ha un grande vantaggio rispetto ai metodi convenzionali che utilizzano, ad esempio, i fibroblasti per la riprogrammazione, in quanto possono essere ottenuti in modo completamente non invasivo. Inoltre, questo protocollo consente la generazione di iPSC da cellule derivate dall'urina con un periodo più breve rispetto alla riprogrammazione convenzionale. Con questo metodo, le colonie diventano visibili entro 5-15 giorni, mentre abbiamo scoperto che le colonie di fibroblasti di primati (rhesus, babbuino) tendono ad apparire più tardi, dopo 20-30 giorni. Inoltre, con l'uso di questo metodo di infezione in sospensione, lo 0,19% delle cellule trasdotte dal virus ha dato origine a colonie con morfologia cellulare pluripotente. Ciò ha portato ad almeno una colonia nell'87% dei tentativi15. In confronto, il metodo di trasduzione convenzionale di SeV con cellule attaccate e lipofezione con plasmidi episomiali ha dimostrato di avere un'efficienza di riprogrammazione significativamente inferiore, con lo 0,09% e lo 0,009% delle cellule che formano una colonia pluripotente, rispettivamente15.
In sintesi, questo metodo consente l'isolamento delle cellule urinarie in modo non invasivo e la generazione di iPSC senza alimentatore da quasi tutti i donatori umani e molti NHP. Ciò aumenta l'accessibilità a preziosi tipi di cellule che possono essere differenziati da queste iPSC. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per produrre iPSC specifiche per il paziente che possono essere utilizzate per la modellazione della malattia o future terapie basate sulle cellule. Infine, poiché le iPSC possono essere generate solo da piccoli volumi di urina, questo metodo può essere applicato a molte più specie di primati o persino mammiferi. Pertanto, questo metodo può essere un potente strumento per il confronto tra specie, che può consentire una migliore comprensione dell'evoluzione dei tratti specifici dell'uomo.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da DFG EN 1093/5-1 (numero di progetto 458247426). M.O. è stato supportato da JSPS Overseas Research Fellowship. Tutte le figure sono state create con BioRender.com. La citometria a flusso è stata eseguita con l'aiuto del Core Facility Flow Cytometry presso il Biomedical Center di Monaco. Vorremmo ringraziare Makoto Shida e Tomoyo Muto di ASHBi, Università di Kyoto, per il supporto della videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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