Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ייצור ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים שמקורם בשתן

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/64922
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד, הרחבה ותכנות מחדש של תאים אנושיים ולא אנושיים שמקורם בשתן של פרימטים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כמו גם הוראות לתחזוקה ללא הזנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שנוצרו.

Abstract

גישות חוצות מינים החוקרות תאי גזע פלוריפוטנטיים של פרימטים ונגזרותיהם חיוניות להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים והתאיים של מחלות, התפתחות ואבולוציה. כדי להפוך תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים (iPSCs) לנגישים יותר, מאמר זה מציג שיטה לא פולשנית ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ולא אנושיים מתאים שמקורם בשתן, ותחזוקתם באמצעות שיטת תרבית ללא מזין.

ניתן לדגום את השתן מסביבה לא סטרילית (למשל, הכלוב של החיה) ולטפל בקוקטייל אנטיביוטי רחב טווח במהלך תרבית תאים ראשונית כדי להפחית את הזיהום ביעילות. לאחר התפשטות התאים שמקורם בשתן, iPSCs נוצרים על ידי שיטת התמרה שונה של מערכת וקטור וירוס סנדאי זמינה מסחרית. מושבות iPSC ראשונות עשויות להיות גלויות כבר לאחר 5 ימים, וניתן לקטוף אותן לאחר 10 ימים לכל המוקדם. מעבר גושים שגרתי עם חיץ דיסוציאציה ללא אנזימים תומך בפלוריפוטנציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שנוצרו במשך יותר מ-50 מעברים.

Introduction

השוואות גנומיות של פרימטים אנושיים ולא אנושיים (NHPs) חיוניות להבנת ההיסטוריה האבולוציונית שלנו והאבולוציה של תכונות ספציפיות לבני אדם1. בנוסף, השוואות אלה מאפשרות להסיק את התפקוד על ידי זיהוי רצפי דנ"א שמורים2, למשל, כדי לתעדף וריאנטים הקשורים למחלה3. השוואות של פנוטיפים מולקולריים כגון רמות ביטוי גנים חיוניות כדי לפרש טוב יותר השוואות גנומיות ולגלות, למשל, הבדלים פנוטיפיים תאיים. יתר על כן, יש להם - בדומה להשוואות ברמת הדנ"א - פוטנציאל להסיק רלוונטיות תפקודית, ומכאן לפרש טוב יותר שונות רלוונטית מבחינה רפואית בתוך בני אדם4. שילוב נתונים פנוטיפיים מולקולריים מקיפים במחקרים השוואתיים אלה דורש משאבים ביולוגיים מתאימים (כלומר, תאים אורתולוגיים בין מינים). עם זאת, סיבות אתיות ומעשיות מקשות או בלתי אפשריות על גישה לתאים דומים כאלה, במיוחד במהלך ההתפתחות. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מאפשרים יצירה של סוגי תאים בלתי נגישים כאלה במבחנה 5,6, נגישים בניסוי, ושימשו להשוואות פרימטים6,7,8,9,10,11,12,13,14.

כדי ליצור iPSCs, יש לרכוש את התאים העיקריים כדי להיות מתוכנתים מחדש. לתאים שבודדו משתן יש יתרון בכך שניתן לדגום אותם באופן לא פולשני מפרימטים, וכי ניתן לתכנת אותם מחדש בקלות, כנראה בשל הפרופיל המולקולרי דמוי תאי הגזע שלהם15. תנאי התרבית לשמירה על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של פרימטים חשובים לא פחות מתכנות מחדש; באופן קלאסי, תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים דרשה מדיום לא מוגדר, מבוסס סרום ותרבית משותפת של פיברובלסטים עובריים של עכברים - המכונים תאי הזנה - המספקים חומרי מזון חיוניים ופיגום לתאי גזע עובריים (ESC)16. מאז הפיתוח של מערכות תרבית מוגדרות כימית ונטולות הזנה17,18, קיימות כיום אפשרויות שונות של מדיה ומטריצות תרבית iPSC זמינות מסחרית. עם זאת, רוב תנאי התרבית הללו עברו אופטימיזציה עבור תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע מושרים אנושיים, ולכן עשויים לעבוד פחות טוב בתרבות iPSC של NHP. בפרוטוקול וידאו זה, אנו מספקים הוראות ליצירה ולתחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ו-NHP שמקורם בתרבית תאי שתן.

מאז הדיווח הראשון על יצירת iPSC על ידי ביטוי כפוי של גורמים מוגדרים בפיברובלסטים בשנת 2006, שיטה זו יושמה על סוגי תאים רבים ושונים ממקורות שונים 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. ביניהם, רק תאים שמקורם בשתן ניתן להשיג באופן לא פולשני לחלוטין. בהתבסס על הפרוטוקול שתואר קודם לכן על ידי Zhou et al.33, ניתן לבודד ולהרחיב תאים משתן פרימטים אפילו מדגימות לא סטריליות, על ידי השלמת אנטיביוטיקה רחבת טווח15. יש לציין כי תאים שמקורם בשתן שנדגמו על ידי פרוטוקול זה מפגינים פוטנציאל גבוה לייצר iPSCs, בתוך פרק זמן קצר יותר (מושבות הופכות גלויות תוך 5-15 ימים) מאשר תכנות מחדש קונבנציונלי של פיברובלסטים (20-30 יום, מניסיוננו), ועם שיעור הצלחה גבוה מספיק. תאים אלה שמקורם בשתן סווגו כאוכלוסייה מעורבת של תאים דמויי תאי גזע מזנכימליים ותאי אפיתל של שלפוחית השתן, מה שגרם ליעילות גבוהה של תכנות מחדש15.

בנוסף לשונות בתאים ראשוניים, שיטות התכנות מחדש ליצירת iPSCs משתנות גם בהתאם למטרת השימוש. הליכי תכנות מחדש קונבנציונליים עבור תאים סומטיים אנושיים בוצעו על ידי ביטוי יתר של גורמי תכנות מחדש עם רטרו-וירוס או וקטורים lentivirus, אשר איפשר שילוב של DNA אקסוגני בגנום 5,34,35. כדי לשמור על שלמותם הגנומית של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), חוקרים פיתחו מגוון רחב של מערכות אי-אינטגרציה - וקטור PiggyBac36,37 הניתן לכריתה, וקטור אפיזומלי38,39, וקטורי וירוסים שאינם מתחברים כגון נגיף סנדאי40 ואדנו-וירוס 41, טרנספקציה של mRNA 42, טרנספקציה של חלבונים 43,44 וטיפול בתרכובת כימית 45. בשל היעילות והקלות בטיפול, וקטורי תכנות מחדש מבוססי וירוס Sendai משמשים בפרוטוקול זה. הדבקה של תאים ראשוניים מתבצעת בתרבית תרחיף של שעה אחת של תאים ונגיפים בריבוי זיהומים (MOI) של 5 לפני הציפוי. צעד שונה זה עשוי להגדיל את הסבירות למגע בין משטחי התא לנגיפים, בהשוואה לשיטה המקובלת שבה הנגיפים מתווספים ישירות לתרבית התא הדבקה, ובכך להניב יותר מושבות iPSC15.

העברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ו- NHP יכולה להיעשות על ידי מעבר גושי ומעבר של תא יחיד. חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) היא חומר כלאט חסכוני הקושר יוני סידן ומגנזיום, ובכך מונע את הפעילות הדבקה של קדרין ואינטגרין. EDTA משמש גם כמגיב דיסוציאציה מתון וסלקטיבי, כאשר תאים לא ממוינים מתנתקים לפני תאים ממוינים עקב מולקולות ההיצמדות השונות שלהם. דיסוציאציה מוחלטת גורמת למוות תאי מסיבי של פרימטים מושרים באמצעות היפראקטיבציה של מיוזין בתיווך Rho/Rho המכילה חלבון קינאז (Rho/Rock). לכן, תוספת למדיום התרבית עם מעכב Rho/Rock חיונית לניסויים הדורשים תאים בודדים בתרחיף46,47. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים על Passaging גושי כשיטת ההעברה השגרתית וממליצים על Passaging של תא בודד רק כאשר יש צורך בכך, למשל, כאשר נדרשת זריעה של מספרי תאים מוגדרים, או במהלך שיבוט משנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הליך ניסויי זה אושר על ידי הוועדה האתית האחראית לניסויים בבני אדם (20-122, Ethikkommission LMU München). כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.
הערה: יש לקבל אישור מהוועדה האתית המתאימה לפני תחילת ניסויים העוסקים בדגימות אנושיות ודגימות NHP. כל הליכי הניסוי חייבים להתבצע בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל אחד מהשלבים הבאים צריך להתבצע בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגי. ניתן למצוא את כל הרכבי החיץ והמדיה בטבלה משלימה S1. ודא שכל המדיה מחוממת לטמפרטורת החדר (22 ° C) לפני הוספתה לתאים. כל שלב בצנטריפוגה צריך להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

1. בידוד תאים מדגימות שתן

אזהרה: ודא שתורמים אנושיים נקיים מנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV), נגיף הפטיטיס B (HBV) ונגיף הפטיטיס C (HCV). עבור NHPs, ודא שהתורמים/התאים האפשריים נקיים מפתוגנים ספציפיים - וירוס B (BV), וירוס הכשל החיסוני סימיאן (SIV), סימיאן בטארטרווירוס (SRV) ווירוס לימפוטרופי של תאי T סימיאן (STLV).

  1. הכינו צלחת 12 בארות מצופות ג'לטין על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 0.2% ג'לטין לכל באר, והפיצו את הנוזל על ידי הזזת הצלחת. יש להניח בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות לפחות לפני הצורך.
  2. לאסוף דגימות שתן אנושיות בצינורות חרוטי 50 מ"ל. עבור פרימטים, לאסוף שתן מהרצפה של מתקן בעלי חיים עם מזרק.
    הערה: נפח של 5 מ"ל שתן הוכח כמספיק לבידוד לפחות מושבה אחת ב-42% מהניסיונות. עם זאת, מומלץ להשתמש בנפח גבוה יותר של ~ 50 מ"ל שתן כדי להגדיל את הסיכוי לבידוד מושבות. שתן NHP צריך להיות דגימה טרי ככל האפשר, רצוי מיד לאחר השתנה. אחסון דגימות שתן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לא השפיע לרעה על שיעור ההצלחה של הפרוטוקול, אך זמני אחסון ארוכים יותר לא נבדקו.
  3. צנטריפוגה את הצינור המכיל שתן ב 400 × גרם במשך 10 דקות, בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כ 1 מ"ל בצינור.
  4. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של נוזל. אגרו את המתלים בצינור אחד אם נאספו צינורות שתן מרובים.
  5. יש לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ שטיפת שתן (ראה טבלה משלימה S1) המכיל 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין לצינור, ולערבב בזהירות את התרחיף באמצעות פיפטה סרולוגית.
  6. צנטריפוגו את הצינור ב 200 × גרם במשך 10 דקות, בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כ <0.2 מ"ל בצינור.
  7. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום שתן ראשוני (ראה טבלה משלימה S1) המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין לכל 50 מ"ל שתן מעובד בתחילה (השהיה מחדש ב-1 מ"ל, גם אם עובד פחות מ-50 מ"ל שתן).
  8. שואפים ג'לטין מהבארות (מוכן בשלב 1.1), וצלחת 1 מ"ל של המתלה משלב 1.7 לבאר אחת של צלחת 12 בארות. חזור על הפעולה עבור בארות רבות ככל שתרצה, או עבור מיליליטרים רבים של מתלים זמינים.
    אופציונלי: כדי למנוע זיהום שמקורו באיסוף דגימות לא סניטרי, הוסף מגיב אנטי-מיקרוביאלי של 100 מיקרוגרם / מ"ל לתאים מכאן והלאה, עד המעבר הראשון.
  9. מניחים את הצלחת באינקובטור 37°C, 5% CO2 .
  10. הוסף 1 מ"ל של מדיום שתן ראשוני לכל באר מדי יום עד יום 5, מבלי להסיר את המדיום הקיים.
  11. ביום 5, לשאוף 4 מ"ל של בינוני מן הצלחת, משאיר כ 1 מ"ל של בינוני. הוסף 1 מ"ל של מדיום REMC (ראה טבלה משלימה S1) לכל באר כדי לקבל תערובת של 1:1 עם מדיום התרבית החדש.
  12. החליפו מחצית מהתווך בתווך REMC כל יום עד שיופיעו המושבות הראשונות (איור 1A, B). לכן, להסיר 1 מ"ל של מדיום ישן, ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום REMC טרי לכל באר.

2. הרחבת תאי השתן

הערה: העברת תאי השתן צריכה להתבצע לפני שהתרבית מגיעה למפגש של 90%.

  1. הכינו את הכמות הרצויה של צלחות 12 בארות מצופות ג'לטין, כאמור בשלב 1.1.
  2. שאפו את המדיום הישן, ושטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS).
  3. שאפו את DPBS, והוסיפו 300 μL של אנזים דיסוציאציה 0.5x מדולל ב-DPBS. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 5 דקות.
  4. הוסף 700 μL של תווך REMC כדי לעצור את התגובה האנזימטית. מחזירים בעדינות את התרחיף באמצעות פיפטה P1000 עד שהתאים מנותקים לתאים בודדים.
  5. מעבירים את מתלה התא לצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגות את הצינור ב 200 × גרם למשך 5 דקות.
  6. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום REMC.
  7. ספור את התאים באמצעות מונה תאים (המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי).
  8. להרחבת תאי השתן, צלחת 1.5 × 10 4 עד 3 × 104 תאים ב 1 מ"ל של מדיום REMC לתוך צלחת אחת 12 באר מצופה 0.2% ג'לטין.
  9. בצע שינויי מדיום עוקבים כל יומיים עד שהתרבות מגיעה למפגש של 80%-90%. לכן, לשאוף את המדיום הישן ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום REMC טרי.

3. יצירת iPSCs על ידי זיהום וקטורי וירוס Sendai

הערה: לקבלת זרימת העבודה של הליך התכנות מחדש, ראה איור 2A. תאי השתן המשמשים לתכנות מחדש צריכים להיות צעירים ככל האפשר, אך אובדן יוצא דופן של יעילות תכנות מחדש אינו נצפה לפני מעבר 4. יש להשתמש בערכת התכנות מחדש של וירוסי Sendai במתקן BL-2. טפל בנגיפים תחת ארון בטיחות ביולוגי עם זרימה למינרית, והשתמש תמיד בציוד בטיחות מתאים כדי למנוע חשיפה לרירית.

  1. הכינו פלטת 12 בארות מצופה ממברנת מרתף על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף לכל באר, והפיצו את הנוזל על ידי הזזת הצלחת. דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת לפחות, והחליפו את מטריצת קרום המרתף ב-900 μL של תווך REMC. אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 37°C עד לשימוש.
  2. הפשיר במהירות את רכיבי ערכת התכנות מחדש של סנדאי באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ערבבו את נגיפי סנדאי (KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC ו-KLF4) עם MOI של 5, והוסיפו תווך REMC עד 100 μL. השתמש במשוואה (1):
    Equation 1
    הערה: מכיוון שטיטרים וירוסים שונים בין מגרשים, בדוק תמיד את הטיטר בתעודת הניתוח שסופקה על ידי היצרן.
    אופציונלי: השתמש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בנגיף סנדאי בנוסף כבקרה חיובית ליעילות ההולכה. לשם כך, להכין 3.5 × 104 תאים נוספים בצינור נפרד במהלך שלב 3.3.
  3. עבור דיסוציאציה של תאי השתן, בצע את השלבים 2.2-2.4. לספור את התאים באמצעות מונה התא, ולהעביר 7 × 104 תאי שתן לצינור 1.5 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את הצינור ב 200 × גרם במשך 5 דקות, בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע את כדור התא. להשהות מחדש את הגלולה ב 100 μL של תערובת SeV מוכן בשלב 3.2. לדגור את הצינור במשך 1 שעה ב 37 ° C עבור זיהום השעיה.
  5. לוחית את המתלה על קרום המרתף מטריקס מטריקס 12 צלחות באר שהוכנו בשלב 3.1. באופן שגרתי, צלחת 1 × 104 ו 2.5 × 104 תאים לכל באר בכפילויות.
  6. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2. החלף את המדיום עם 1 מ"ל של מדיום REMC טרי 24 שעות לאחר הטרנסדוקציה וביום 3.
  7. ביום 5 לאחר הטרנסדוקציה, שנה את המדיום למדיום דור PSC (ראה טבלה משלימה S1), עם שינויי מדיום עוקבים כל יומיים. לכן, להסיר את המדיום הישן ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הדור PSC לכל באר.
    הערה: ייתכן שיחלפו עד 15 יום עד להופעת המושבות הראשונות.
  8. בחר מושבות iPSC בודדות כאשר גודל המושבה עולה על 1 מ"מ. כדי לעשות זאת, לגרד בזהירות לאסוף מושבה אחת עם פיפטה p10 תחת מיקרוסקופ. מעבירים את המושבה לבאר חדשה של צלחת בת 12 בארות המצופה במטריצת קרום מרתף המכילה 750 מיקרוליטר של מדיום תרבית PSC.
    אופציונלי: שטיפת הצלחת עם DPBS וטיפול במשך דקה אחת עם 0.5 mM EDTA לפני הקטיף עשויים לתמוך בתרבית החזקה של צעדים נוספים. אם רוצים לגדל את התאים בתרבית זמן רב יותר כדי לחכות למושבות מתפתחות מאוחרות יותר, אל תבצע שלב זה של טיפול EDTA.
  9. לגדל את התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 עם שינויים בינוניים הבאים כל יומיים, כאמור בסעיף 4 של הפרוטוקול. כאשר המושבה שנקטפה מגיעה לקוטר של 2 מ"מ, יש להמשיך במעבר iPSC השגרתי, כמוסבר בסעיף 5 לפרוטוקול.

4. שינוי בינוני

הערה: יש להחליף את מדיום התרבות כל יומיים עד שהמושבות יגדלו מספיק למעבר.

  1. שואפים את המדיום הישן ומוסיפים 750 מיקרוליטר של המדיום הטרי לכל צלחת של 12 בארות. כדי לעבור לסוג אחר של מדיום, החלף את המדיום לפחות יום אחד לאחר המעבר.

5. מעבר

הערה: יש להעביר את התאים כאשר מושבות iPSC גדלות מספיק (קוטר > 2 מ"מ), או שהמושבות עומדות לגעת זו בזו. באופן שגרתי, ניתן לפצל iPSCs בערך כל 5 ימים. השתמש במעבר גושי (שלב 5.1) לתחזוקה שגרתית, ובמעבר תא בודד (שלב 5.2) לניסויים שבהם יש צורך במספר מוגדר של תאים. במקרה שתאי גזע פלוריפוטנטיים מובחנים מאוד, קטיף מושבות (שלב 5.3) יכול לעזור לשפר את טוהר התרבויות.

  1. מעבר גושים
    1. הכינו פלטת 12 בארות מצופה ממברנת מרתף על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף לכל באר, והפיצו את הנוזל על ידי הזזת הצלחת. לדגור את הצלחת ב 37 ° C לפחות 1 שעה. החלף את מטריצת קרום המרתף במדיום תרבית PSC של 500 μL ואחסן את הצלחת בטמפרטורה של 37°C עד לשימוש.
    2. שאפו את התווך מתאי התרבית, ושטפו את התאים על ידי הוספה זהירה של 500 מיקרוליטר של DPBS. הסר את DPBS ולהוסיף 500 μL של 0.5 mM EDTA לבאר.
    3. דוגרים על הצלחת ב-RT במשך 2-5 דקות, עד שהמושבות מתחילות להתנתק. בזהירות להתבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ.
    4. כאשר הקצוות של המושבות מתחילים להתקלף והרווחים בין התאים הופכים גלויים (איור 3A), הסירו את ה-EDTA והוסיפו בזהירות 500 מיקרוליטר של DPBS.
      הערה: תמיד פיפטה על הדופן הצדדית של הבאר ולעולם לא ישירות על התאים, כדי לא לנתק את התאים מהצלחת.
    5. שאפו את ה-DPBS ושטפו את הבאר ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית PSC באמצעות פיפטה p1000. פיפטה מעלה ומטה פי 1x-5x כדי לפזר את המושבות לגושים בגודל המתאים (איור 3A). לא פיפטה יותר מדי.
      הערה: אם iPSCs הם pipeted בטעות יותר מדי, להוסיף 10 μM של מעכב סלע Y-27632 למדיום. זה יכול לשפר את ההישרדות, מכיוון שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אינם מסוגלים לשרוד כתאים בודדים.
    6. העברה 1/10-1/50 של תרחיף גוש התא לבארות החדשות. היחס תלוי במפגש של הבאר לפני הפיצול, בצפיפות הרצויה של תאי הזרע ובהעדפת השבט iPSC.
    7. מפזרים את הגושים באופן שווה בבאר על ידי הזזת הצלחת בעדינות קדימה ואחורה מספר פעמים. לדגור על הצלחת לפחות 30 דקות ב 37 ° C כדי לתת לגושים להיצמד.
    8. החלף את המדיום עם 750 μL של מדיום תרבית PSC אם תאים מתים צפים רבים נצפים; אחרת, הוסף 250 μL של מדיום תרבות PSC. מניחים את הצלחת ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור.
      הערה: החלפה בינונית לאחר 30 דקות היא קריטית, במיוחד עבור קווי תאים לא יציבים (למשל, NHPs).
    9. החליפו את המדיום כל 2-3 ימים עד שהמושבות גדלות מספיק למעבר. לשינוי בינוני, בצע את שלב 4 של הפרוטוקול.
  2. העברת תא יחיד
    1. הכינו את צלחת התרבית מצופה מטריצת קרום המרתף, כאמור בשלב 5.1.1, בתוספת של 10 מיקרומטר Y-27632 למדיום תרבית PSC.
      אופציונלי: הוסף 10 מיקרומטר Y-27632 לתאים 1-3 שעות לפני המעבר כדי לשפר את הישרדותם של קווי תאים רגישים.
    2. שאפו את המדיום ושטפו את התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של DPBS. הסר את DPBS ולהוסיף 300 μL של פתרון ניתוק לבארות.
    3. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 5-10 דקות. כאשר ניתוק מספיק של התאים נצפה תחת המיקרוסקופ, להוסיף 700 μL של מדיום תרבית PSC או DPBS.
    4. פיפטה למעלה ולמטה 5-10x באמצעות פיפטה p1000 עד שהתאים מנותקים לתאים בודדים. אין לפיפטה יותר מדי, על מנת למנוע נזק לתאים.
    5. העבר את תרחיף התא לצינור של 15 מ"ל המכיל לפחות 2 מ"ל של DPBS כדי לדלל את תמיסת הניתוק.
    6. צנטריפוגה את הצינור ב 200 × גרם במשך 5 דקות ולשאוף את הפתרון לחלוטין, מבלי לשבש את כדור התא.
    7. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית PSC בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632.
    8. ספרו את התאים וזרעו 5,000-7,000 תאים לכל צלחת ממברנת מרתף מצופה מטריצה בת 12 בארות, שהוכנה בשלב 5.2.1.
      הערה: אם יש צורך במספר תא אחר, שנה לבאר גדולה או קטנה יותר בהתאם.
    9. לדגור על הצלחת לפחות 30 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2 כדי לאפשר לתאים להתחבר.
    10. החלף את המדיום עם 750 μL של מדיום תרבית PSC + 10 מיקרומטר Y-27632 אם תאים מתים רבים נצפים; אחרת, להוסיף 250 μL + 10 μM Y-27632.
      הערה: שלב זה הוא קריטי, במיוחד עבור קווי תאים לא יציבים (למשל, NHPs).
    11. מניחים את הצלחת ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור.
    12. שנו את המדיום למדיום תרבית PSC ללא Y-27632 יום עד יומיים לאחר הפיצול, כדי לאפשר לתאים להציג שוב את המורפולוגיה הקלאסית של המושבה (איור 3B).
    13. החליפו את המדיום כל יומיים עד שהמושבות יגדלו מספיק. לשינוי בינוני, בצע את סעיף 4 של הפרוטוקול.
  3. העברת iPSCs על ידי קטיף מושבה
    1. הכינו ממברנת מרתף מצופה מטריצה 12 בארות כאמור בשלב 5.1.1.
    2. שאפו את המדיום ושטפו את התאים על ידי הוספה זהירה של 500 מיקרוליטר של DPBS. הסר את DPBS ולהוסיף 500 μL של 0.5 mM EDTA לבאר.
    3. דוגרים על הצלחת ב-RT למשך 1-3 דקות ומתבוננים בתאים מתחת למיקרוסקופ, עד שניתן לראות ניתוק של המושבה על הגבולות.
    4. הסר את EDTA בזהירות להוסיף 500 μL של DPBS. שאפו את הנוזל לפני הוספה איטית של 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית PSC לבאר, מבלי לנתק את התאים.
    5. השתמש פיפטה p200 כדי לבחור את המושבה הרצויה מתחת למיקרוסקופ, מבלי לאסוף את התאים ממוינים. כדי לעשות זאת, לגרד בעדינות מעל המושבה תוך לקיחת התווך המכיל תאים.
    6. מעבירים כל מושבה שנקטפה לממברנה אחת במרתף מצופה היטב כפי שהוכן בשלב 5.3.1. מנתקים את התאים לגושים קטנים באמצעות פיפטה p1000, על ידי צנרת התאים פי 2-5.
    7. דגרו על הצלחת במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, ואפשרו לגושים להיצמד.
    8. החלף את המדיום עם 750 μL של מדיום תרבית PSC אם תאים מתים צפים רבים נצפים; אחרת, הוסף 250 μL של מדיום תרבות PSC.
      הערה: החלפה בינונית לאחר 30 דקות היא קריטית, במיוחד עבור קווי תאים לא יציבים (למשל, NHPs).
    9. מניחים את הצלחת ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור.
    10. החליפו את המדיום כל 2-3 ימים עד שהמושבות גדלות מספיק למעבר. לשם כך, בצע את סעיף 4 של הפרוטוקול.

6. הקפאת תאי שתן ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לאחסון לטווח ארוך

הערה: באופן שגרתי, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מוקפאים כגושים בתווך הקפאת תאים ללא ספירה. פיפטינג צריך להיות מינימלי, כדי למנוע דיסוציאציה לתאים בודדים. עבור תאי שתן, באופן שגרתי, 1.5 × 104 עד 3 × 104 תאים מוקפאים לכל צינור, מה שמאפשר למשתמש להפשיר צינור אחד ישירות בבאר אחת של צלחת 12 בארות ללא צורך בשלב ספירה נוסף.

  1. הכן 5 מ"ל של DPBS בצינור 15 מ"ל.
  2. להקפאת תאי השתן, בצע את שלבים 2.2-2.4 של הפרוטוקול. להקפאת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), בצע את השלבים 5.1.2-5.1.5 מפרוטוקול העברת הגושים.
  3. העבר את המתלה לצינור 15 מ"ל שהוכן בשלב 6.1. להקפאת תאי השתן, לספור 10 μL של השעיית התא באמצעות hemocytometer. צנטריפוגו את התאים במשך 5 דקות ב 200 × גרם, ושאפו את supernatant לחלוטין.
  4. להשהות מחדש את גלולת התא ב 400 μL של תאים הקפאת בינוני לכל צינור, ולהפיץ את התאים לכמות הרצויה של cryotubes.
  5. העבר את cryotubes מיד ל -80 ° C. העבירו את הצינורות הקפואים למקפיא בטמפרטורה של -150°C או לחנקן נוזלי יום אחד לאחר ההקפאה ב-80°C לאחסון לטווח ארוך.

7. הפשרת תאי שתן ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

  1. להפשרת תאי השתן, הכינו את הכמות הרצויה של 12 בארות מצופות ג'לטין, כאמור בשלב 1.1 של הפרוטוקול. עבור iPSCs, הכינו את לוחות 12 הקידוחים המצופים בממברנת המרתף, כאמור בשלב 5.1.1. בשני המקרים, אין להחליף את המטריצה עם מדיום.
  2. הכן צינור 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של DPBS, ולאחסן אותו ב 37 ° C.
  3. הניחו בקבוקון תאים קפוא במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להפשרה, עד שפיסת קרח צפה הופכת גלויה.
    הערה: נגב את צינור ההקפאה באתנול לפני ואחרי הדגירה באמבט המים כדי למנוע זיהום.
  4. הוסף 500 μL של מדיום REMC עבור תאי השתן, או 500 μL של מדיום תרבית PSC עבור iPSCs לתרחיף המכיל קרח, והעבר את התרחיף מיד לצינור 15 מ"ל שחומם מראש והוכן בשלב 7.2.
  5. צנטריפוגה את הצינור ב 200 × גרם במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant לחלוטין.
  6. עבור תאי השתן, להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום REMC. עבור iPSCs, יש להשהות בזהירות את הגלולה ב-750 μL של מדיום תרבית PSC. הימנע pipetting יותר מדי, על מנת לשמור על הגושים שלם.
    אופציונלי: תוספת של 10 מיקרומטר Y-27632 למדיום יכולה לתמוך בהישרדותם של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לאחר ההפשרה.
  7. שואפים את המטריצה מלוחות 12 בארות שהוכנו בשלב 7.1, ומעבירים בזהירות את תרחיף התא לבאר.
  8. הניחו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 באינקובטור.
  9. למחרת, החלף את המדיום בתווך תרבית PSC, ללא Y-27632 עבור iPSCs ועם REMC עבור תאי השתן.
  10. לגדל את התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור.
  11. שנה את המדיום כל 2-3 ימים עד שהתאים גדלים מספיק כדי לעבור. לשינוי בינוני, בצע את סעיף 4 של הפרוטוקול.

8. אימונוציטוכימיה

הערה: צביעה חיסונית עם נוגדנים המכוונים לסמנים הקשורים לפלוריפוטנציה כגון NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 ו- EpCAM היא אחד האימותים הנפוצים ביותר של iPSCs שנוצרו לאחרונה. מידע נוסף על הנוגדנים והדילולים ניתן למצוא בטבלת החומרים.

  1. לוחות iPSC 1-3 ימים לפני השימוש במספר מתאים של צלחות 12 בארות. שואפים את המדיום, לשטוף את התאים על ידי הוספת 500 μL של DPBS, ולהסיר את DPBS. הוסף 400 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) לכל באר, ותקן את התאים במשך 15 דקות ב- RT.
  2. הסר את 4% PFA, ושטוף את התאים 3x עם DPBS. הוסיפו 400 מיקרוליטר של חיץ חוסם לכל באר, ודגרו על הצלחת למשך 30 דקות ב-RT.
  3. שאפו את המאגר החוסם, והוסיפו את הנוגדנים המדוללים ב-400 מיקרוליטר של חיץ דילול נוגדנים (ADB) לכל באר. לדגור על הצלחת ב 4 ° C במשך הלילה.
  4. הסר את ADB המכיל את הנוגדנים הראשוניים, ולשטוף תאים 3x עם DPBS.
  5. שאפו את ה-DPBS, והוסיפו 400 מיקרוליטר של נוגדנים משניים מדוללים ב-ADB לכל באר. לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב RT בחושך.
  6. הסר את ADB ושטוף תאים 3x עם DPBS. הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדולל ב-DPBS לכל באר, ודגר במשך 3 דקות ב-RT.
  7. שאפו את תמיסת DAPI ושטפו את התא פי 3 עם DPBS. הוסף 500 μL של DPBS להדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעת בידוד תאים משתן אנושי ושתן NHP, ניתן לזהות סוגים שונים של תאים ישירות לאחר הבידוד. תאי קשקש, כמו גם תאים עגולים קטנים יותר, מופרשים עם השתן; שתן נשי מכיל הרבה יותר תאי קשקש מאשר שתן זכרי (איור 1B - יום 0; איור משלים S1). לאחר 5 ימים של תרבית בתווך שתן ראשוני, ניתן לראות את התאים המתרבים הדבקים הראשונים (איור 1A,B - יום 5). בשלב זה, מחצית התווך מוחלף בתווך התפשטות REMC מדי יום, עד להופעת המושבות הראשונות. בערך ביום ה-13 התאים הנצמדים גדלים למושבות גדולות שיכולות לעבור (איור 1B – יום 13). המושבות האלה יכולות להיווצר משני סוגי תאים שונים מבחינה מורפולוגית – לאחד יש פנוטיפ דמוי אפיתל יותר עם תאים שגדלים צמודים זה לזה, והשני מראה מורפולוגיה דמוית מזנכימלית יותר עם צורה מוארכת ויכולת נדידה גבוהה יותר (איור 1C). אחרי המעבר הראשון, תאי השתן גדלים כחד-שכבתיים, ויכולים לעבור אותם כאשר התרבית מגיעה למפגש של 80% (איור 1B – יום 17).

Figure 1
איור 1: בידוד וטיפוח תאי שתן. (A) זרימת עבודה ליצירת תאי שתן מדגימות פרימטים אנושיים ולא אנושיים. (B) תמונות ניגודיות פאזה המראות את הצמיחה והיווצרות המושבה של תאי השתן עד המעבר הראשון (עמ' 1). (C) ניתן להבחין בין שני סוגי תאים שונים שבודדו מדגימות שתן לאחר שבועיים של תרבית. פסי קנה מידה = 250 מיקרומטר (B,C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי ליצור iPSCs מתאי השתן, נעשה שימוש בהתמרה עם נגיפי סנדאי המציגים את גורמי יאמאנאקה OCT3/4, SOX2, KLF4 ו- c-MYC. כדי להגביר את יעילות ההתמרה תאי השתן מודגרים עם הנגיף למשך שעה אחת בתרחיף, לפני שהם זורעים לבארות מצופות מטריצת קרום מרתף (איור 2A). אפשר לראות חלק מהתאים הדבקים בבארות יום אחד לאחר ההעברה (איור 2B – יום 1). לאחר 5-10 ימים, התאים האלה מתחילים ליצור מושבות, וניתן להבחין בשינויים מורפולוגיים מוקדמים, מה שמצביע על תכנות מחדש של התאים (איור 2B – יום 14). רבות מהמושבות הללו מציגות בהדרגה מורפולוגיה דמוית ESC, וניתן לקטוף אותן בתווך תרבית PSC כאשר הקוטר עולה על 1 מ"מ. לאחר הקטיף, התאים יוצרים מושבות המציגות את המורפולוגיה הטיפוסית של ESC תוך כ-4 ימים (איור 2B - ימים 21 ו-24). כאשר מושבות iPSC גדלות מספיק, ניתן לעבור את התאים בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול העברת גושים (שלב פרוטוקול 5.1).

גישת תכנות מחדש זו שימשה ליצירת iPSCs מבני אדם, גורילה גורילה ( גורילה ) ופנגו אבלי (אורנגאוטן)15. בעוד שההסתברות להשיג תאי שתן משתנה למדי, ונמוכה לפחות פי שניים עד שלושה עבור שימפנזים מאשר עבור בני אדם15, תכנות מחדש של תאי השתן שהתקבלו היה מוצלח בעיקר מניסיוננו. באופן כללי, 0.19% מתאי השתן הנגועים יוצרים מושבות עם מורפולוגיה דמוית ESC, וכתוצאה מכך לפחות מושבה אחת ב-87% מניסיונות התכנות מחדש15. כל תאי ה- iPSC הנוצרים חולקים את אותן תכונות ומראים את המורפולוגיה הטיפוסית של מושבת ESC, המאופיינת בתאים צפופים עם קצוות מוגדרים בבירור (איור 2C). בנוסף, כל iPSCs מציגים קריוטיפ רגיל, והיעדר וקטורי תכנות מחדש של SeV אומת על ידי PCR לאחר לפחות חמישה מעברים, כפי שהומלץ על ידי יצרן ערכת התכנות מחדש SeV (הנתונים אינם מוצגים)15. אימונוציטוכימיה משמשת לבדיקת הביטוי של חלבונים הקשורים לפלוריפוטנציה בגרעין, כגון NANOG, OCT3/4 ו-SOX2. ניתן להשתמש גם בסמני שטח כגון TRA-1-60, EpCAM ו-SSEA4 (איור 2D); עם זאת, SSEA4 מתבטא גם בתאי השתן15. יתר על כן, ניתוח ציטומטריית זרימה יכול להתבצע באמצעות סמני פני שטח אלה כדי לספק מידע כמותי על מצב הפלוריפוטנציה של iPSCs (שיטה שתוארה על ידי Ohnuki et al.48). גישה זו משמשת כדי להראות ש-95.3% מתאי הגזע הפלוריפוטנים המושרים של האורנגאוטן שנותחו חיוביים ל-TRA-1-60 (איור 2E). יתר על כן, ניתן להוכיח את יכולת ההתמיינות של iPSCs NHP באמצעות התמיינות גוף עוברי במבחנה (EB) (שיטה שתוארה על ידי Geuder et al.15). כפי שניתן לראות באיור 2F, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של גורילות מסוגלים להתמיין לשושלות אנדודרם (ɑ-fetoprotein), מזודרם (ɑ-smooth muscle actin) ואקטודרם (β-III tubulin).

Figure 2
איור 2: יצירה ואפיון של תאי גזע גזעיים מושרים שמקורם בשתן . (A) תכנות מחדש של זרימת עבודה של תאים שמקורם בשתן. (B) תמונות ניגודיות פאזה המציגות את השינויים המורפולוגיים של תאי השתן של גורילה במהלך תכנות מחדש עד להקמת מושבות iPSC. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C) מורפולוגיה של מושבות iPSC מבוססות מתרביות תאים של בני אדם, גורילות ואורנגאוטנים. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. (D) צביעה אימונופלואורסצנטית של iPSCs גורילה עם סמנים הקשורים לפלוריפוטנציה במעבר 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM ו-TRA-1-60. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע פלוריפוטנים מוכתמים באנטי-TRA-1-60-PE. תאים לא מוכתמים שימשו כבקרה. (F) ניתוח אימונופלואורסנציה של אנדודרם (AFP), מזודרם (ɑ-SMA) ואקטודרם (β-III TUB) לאחר התמיינות גוף עוברי של iPSCs של גורילה. גרעינים הוכתמו ב-DAPI. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; PE = phycoerythrin; AFP = α-חלבון עוברי; ɑ-SMA = אקטין שריר חלק אלפא; β-III TUB = בטא III טובולין; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כאשר מושבות iPSC מגיעות לקוטר של כ-2 מ"מ, או עומדות לגעת זו בזו, יש לפצל את התאים. אנו ממליצים להשתמש בפרוטוקול העברת הגושים לתחזוקה שגרתית. בפרוטוקול זה, 0.5 mM EDTA משמש לנתק את התאים למשך 3-5 דקות, בהתאם לגודל המושבה. במהלך הדגירה של EDTA, גבולות המושבות מתחילים להתקלף, ורווחים נראים לעין מופיעים בין התאים (איור 3A). יש להסיר את ה-EDTA כאשר נצפה ניתוק מתאים מתחת למיקרוסקופ. דגירה ממושכת עם EDTA מובילה לחלק גבוה יותר של תאים בודדים שאינם מסוגלים לשרוד. לאחר מכן, התאים צריכים להיות מנותקים לגושים בגודל דומה, כפי שמוצג באיור 3A. אין לנתק את התאים לגושים קטנים, שכן זה מפחית את ההישרדות ויכול להוביל לתאים מתמיינים יותר.

כאשר ניסוי דורש זריעה של מספר מוגדר של תאים, יש להשתמש בפרוטוקול המעבר של תא בודד. פרוטוקול זה כולל השלמת המדיום במעכב רוק, המאפשר לתאים הבודדים לשרוד. צפוי שתאים בודדים מחוברים יראו מורפולוגיה שונה, בהשוואה לתאים שגדלים במושבה לאחר זריעה גושית (איור 3B - יום 0). לאחר 1-2 ימים של תרבית, התאים הבודדים מתחילים לגדול שוב למושבות, תוך שמירה על המורפולוגיה שלהם כמו גם על המגע הרופף בין התא לתא, אם מוסיפים מעכב סלע למדיום (איור 3B – יום 2). כאשר המושבות הקטנות האלה נצפות, יש להסיר את מעכב הסלע מהתווך, מה שמאפשר לתאים להציג שוב את המורפולוגיה הטיפוסית דמוית ESC (איור 3B - יום 4).

כדי לשפוט אם מושבת iPSC היא באיכות גבוהה, יש לקחת בחשבון מספר היבטים. ראשית, זה נורמלי כי מושבות בריאות להראות לא או כמות קטנה של הבחנה ספונטנית; עם זאת, מספר גדל של תאים ממוינים (>10%) מעיד על איכות ירודה של iPSC. מאפיינים נוספים של איכות iPSC נמוכה הם אובדן שלמות ואחידות הגבול (איור 3C: מימין), כמו גם אריזות תאיות רופפות עם רווחים נראים לעין בין התאים (איור 3D: מימין). לעומת זאת, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באיכות גבוהה מאופיינים בגבולות מוגדרים, באריזה תאית הדוקה ובגרעינים בולטים (איור 3C, D: תמונות משמאל).

Figure 3
איור 3: תרבית iPSC של פרימטים. (A) תמונות עם ניגודיות פאזה המראות את הניתוק של מושבות iPSC במהלך הדגירה של EDTA בעקבות פרוטוקול העברת הגושים וגודל הגושים האופטימלי לאחר דיסוציאציה. פסי קנה מידה = 250 מיקרומטר. (B) ציר הזמן של התאוששות iPSC לאחר מעבר של תא יחיד. מעכב הסלע Y-27632 הוסר מהיום השני ואילך. פסי קנה מידה = 250 מיקרומטר. (C) משמאל: דוגמה למושבת iPSC אנושית איכותית עם גבולות מוגדרים. מימין: דוגמה למושבה באיכות ירודה שמראה פחות שלמות גבול ותאים ממוינים. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. (D) תמונות לדוגמה עבור מושבת iPSC אנושית באיכות גבוהה (משמאל) בהשוואה למושבה באיכות נמוכה עם תאים ארוזים באופן רופף (מימין). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: סקירה כללית של סוגי תאים הנמצאים בשתן אנושי. (A) תאים שבודדו משתן נשי. (B) תאים שבודדו משתן זכרי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה S1: חיץ והרכבי מדיה ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

iPSCs הם סוגי תאים יקרי ערך מכיוון שהם מאפשרים יצירה של סוגי תאים שאינם נגישים אחרת במבחנה. מכיוון שחומרי המוצא לתכנות מחדש, למשל, פיברובלסטים אינם זמינים בקלות מכל מיני הפרימטים, מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת iPSCs מתאים שמקורם בשתן. תאים אלה יכולים להתקבל באופן לא פולשני, אפילו מדגימות שתן של פרימטים לא סטריליים, על ידי השלמת מדיום התרבית עם אנטיביוטיקה רחבת טווח.

כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול שווים דיון נוסף. ראשית, בעת בידוד תאים משתן לא סטרילי, חשוב להשלים את המדיום עם מגיב מיקרוביאלי רחב טווח כדי להפחית את הסיכון לזיהום. אם הגידול של זיהום מיקרוביולוגי מתגלה למרות השימוש באנטיביוטיקה, מומלץ להשליך את כל התרבות ולחטא את האזור; בנוסף, מניסיוננו, המשך גידול אינו מייצר תאי שתן בריאים הגדלים. שנית, כאשר מתחילים לתכנת מחדש תאים, הכנת מספר מנות עם מספר שונה של תאים מותמרים SeV מומלצת מאוד, כדי למנוע את הסיכון של ניתוק של כל התאים על ידי overconfluency ולהגדיל את ההסתברות של רכישת iPSC. באופן כללי, ציפוי צפיפות גבוהה יותר של תאים מותמרים SeV צפוי להניב יותר מושבות iPSC מתוכנתות מחדש, בעוד שגידול תאי התכנות מחדש לתקופה של ~20 יום גורם לעתים קרובות למפגש יתר, ואחריו ניתוק של הבאר כולה. שלישית, בכל שלב הדורש דיסוציאציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), חיוני להימנע מצנרת נרחבת, המובילה למוות תאי משמעותי. במיוחד כאשר מבוצעת העברת הגוש, חשוב לשמור על הגושים בגודל מתאים (איור 3A). גושים גדולים מדי עלולים להוביל להתמיינות מהירה, בעוד גושים קטנים מדי יכולים להפחית את ההישרדות.

ראינו כי ההסתברות לקבלת תאי שתן משתנה למדי בין דגימות ו aliquots, אבל לא מצאנו ראיות כי נפחים קטנים יש שיעור הצלחה נמוך יותר בהשגת מושבות. באופן כללי, בודדנו בממוצע 7.6 מושבות מ-100 מ"ל שתן אנושי. בהנחה ששיעור ממוצע זה והתפלגות פואסון, להשגת מושבה אחת לפחות יש הסתברות של ~98% עבור 50 מ"ל ו~30% עבור 5 מ"ל של חומר מוצא. במקרה שלנו, ניתן היה לבודד לפחות מושבה אחת מ 5 מ"ל של שתן אנושי ב 42% מהניסיונות15. בהתבסס על זה, בידוד של מושבות עדיין יכול להיות שווה לנסות, גם אם רק כמויות קטנות של שתן זמינים. במקרה שהתכנות מחדש של תאי השתן נכשל, ולא ניתן להבחין במושבות iPSC, ציפוי מספר שונה של תאים נגועים יכול לגרום לתכנות מחדש של התאים שמקורם בשתן. ניתן לזהות את מושבות iPSC המתעוררות גם כ- iPSCs על ידי צביעה חיה באמצעות סמני פני שטח (לדוגמה, TRA-1-60 או phosphatase אלקליין [AP]; הנתונים אינם מוצגים). ידוע כי פעילות AP מווסתת בתאי גזע פלוריפוטנטים, וניתן להשתמש בה כדי להכתים תאי גזע באופן זמני בתהליך התרבית. מלכודת אפשרית נוספת של הפרוטוקול היא התרבות האופטימלית של iPSCs NHP. באמצעות פרוטוקול זה, אישרנו כי iPSCs אנושיים ו- NHP שומרים על מצבם הפלוריפוטנטי במשך יותר מ- 50 מעברים באמצעות מדיום זמין מסחרית. עם זאת, בהשוואה לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של NHP נוטים יותר להתבדל באופן ספונטני מניסיוננו, אולי בגלל תנאי התרבות שהותאמו לבני אדם ולא לתרבויות NHP. בנוסף, קיימת שונות רבה בין שיבוטים iPSC בשיעורי ההישרדות לאחר ציפוי, מהירות הגידול ונטייה להתמיינות. לכן, לעתים קרובות יש לקבוע את יחס הפיצול האופטימלי, תזמון המעבר וגודל הגוש עבור כל שיבוט בנפרד.

הוכחנו כי אפילו נפח של 5 מ"ל יכול להספיק כדי לבודד תאי שתן מ NHPs15. עם זאת, בעוד שלא מצאנו הבדלים משמעותיים במספר תאי השתן המבודדים בבני אדם, גורילות ואורנגאוטנים, לשימפנזים היה יחס נמוך יותר, מכיוון שלא יכולנו לבודד תאי שתן בסך הכל 87 מ"ל. לכן, עבור מינים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לאסוף הרבה יותר שתן מאשר עבור אחרים. איסוף כמויות גדולות מפרימטים קטנים יכול להיות מאתגר במיוחד, אך מכיוון שהבידוד של תאי השתן הוא חסכוני למדי, זה מעשי פשוט לנסות אותו עבור מינים מסוימים וכמויות זמינות של שתן. למרבה הצער, לא ניתן להקפיא את דגימות השתן, מה שמגביל את הרדיוס שבו ניתן לאסוף דגימות. עם זאת, הראינו כי זמן אחסון של 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס לא השפיע על מספר המושבות המבודדות15, וזמן אחסון ארוך יותר או שיפור תנאי האחסון עשויים בהחלט להיות אפשריים. הצגנו מספר סוגים של בדיקות בקרת איכות לאימות. עם זאת, גם אם קו iPSC עונה על קריטריונים אלה, הטרוגניות השבט היא עדיין משמעותית, אשר הוסברה על ידי רקע גנטי49 ומצב אפיגנטי 50,51,52,53,54. כדי ליישם iPSCs של פרימטים לניתוח השוואתי עתידי, יש לקחת בחשבון את ההטרוגניות ולהשתמש במספיק שיבוטים כדי לחשב את השונות השבטית בממוצע, ובכך להימנע מפרשנות שגויה של התוצאה.

עם זאת, לשימוש בשתן כמקור לתאים ראשוניים יש יתרון גדול על פני שיטות קונבנציונליות המשתמשות, למשל, בפיברובלסטים לתכנות מחדש, שכן ניתן להשיג אותם באופן לא פולשני לחלוטין. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר ייצור של iPSCs מתאים שמקורם בשתן עם פרק זמן קצר יותר מאשר תכנות מחדש קונבנציונלי. בשיטה זו, מושבות הופכות גלויות תוך 5-15 יום, בעוד שמצאנו כי מושבות מפיברובלסטים פרימטים (רזוס, בבון) נוטות להופיע מאוחר יותר, לאחר 20-30 יום. בנוסף, עם השימוש בשיטת זיהום השעיה זו, 0.19% מהתאים המומרים על ידי וירוסים הולידו מושבות עם מורפולוגיה דמוית תאים פלוריפוטנטים. התוצאה הייתה לפחות מושבה אחת ב-87% מהניסיונות,15. לשם השוואה, שיטת הטרנסדוקציה הקונבנציונלית של SeV עם תאים מחוברים וליפופקציה עם פלסמידים אפיזומליים הוכחו כבעלי יעילות תכנות מחדש נמוכה משמעותית, כאשר 0.09% ו -0.009% מהתאים יוצרים מושבה פלוריפוטנטית בהתאמה15.

לסיכום, שיטה זו מאפשרת בידוד תאי שתן באופן לא פולשני ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ללא הזנה כמעט מכל תורם אנושי והרבה NHPs. זה מגביר את הנגישות לסוגי תאים יקרים שניתן להבדיל בינם לבין תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אלה. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לייצור iPSCs ספציפיים למטופל שעשויים לשמש למידול מחלות או טיפולים מבוססי תאים עתידיים. לבסוף, מאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים יכולים להיווצר רק מכמויות קטנות של שתן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הרבה יותר מיני פרימטים או אפילו יונקים שונים. לפיכך, שיטה זו יכולה להיות כלי רב עוצמה להשוואה בין מינים, שעשוי לאפשר הבנה טובה יותר של האבולוציה של תכונות ספציפיות לאדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על-ידי DFG EN 1093/5-1 (מספר פרויקט מספר 458247426). M.O. נתמך על ידי JSPS Overseas Research Fellowship. כל הדמויות נוצרו עם BioRender.com. ציטומטריית זרימה בוצעה בעזרת ציטומטריית זרימה של מתקן הליבה במרכז הביו-רפואי במינכן. ברצוננו להודות למאקוטו שידה ולטומויו מוטו מ-ASHBi, אוניברסיטת קיוטו, על התמיכה בווידיאוגרפיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) Sigma-Aldrich SCR006
Amphotericin B-Solution Merck A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody  Stem Cell Technologies 60064 Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody  Miltenyi Biotec 130-122-965 Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium) Nippon Genetics BB01
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR Greiner BIO-ONE 665180
Countess™ II automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) Sued-Laborbedarf 52 95-0213 Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) Thermo Fisher Scientific A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) Thermo Fisher Scientific A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride Sigma-Aldrich 10236276001
DMEM High Glucose TH.Geyer L0102
DMEM/F12 w L-glutamine Fisher Scientific 15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 Thermo Fisher Scientific A-21207 Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium TH.Geyer L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) Thermo Fisher Scientific 710524 Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Carl Roth CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) Thermo Fisher Scientific 10500064
FlowJo V10.8.2 FlowJo  663441
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413301
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator Fisher Scientific 16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet Kendro 51017905
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-749
ImageJ  Fiji Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL Nerbe Plus 04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S Nikon TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody R&D Systems MAB1368 Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody R&D Systems MAB1420 Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody R&D Systems MAB1195 Dilution: 1/100
mTeSR™ 1 STEMCELL Technolgies 85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb  Cell Signaling Technology 4903S Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) Invivogen ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  Cell Signaling Technology 2750S Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PeproTech 100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge SIGMA  4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium ATCC PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit ATCC PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 Cell Signaling Technology 4900S Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb NEB 4755S Dilution: 1/500
StemFit® Basic02 Nippon Genetics 3821.00 The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563011
Waterbath Precision GP 05 Thermo Fisher Scientific TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) Biozol BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer For composition see the supplementary table S1
REMC medium For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer For composition see the supplementary table S1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 197 תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרה iPSCs iPSCs פרימטים לא פולשניים תכנות מחדש וירוס סנדאי פרימטים תאים שמקורם בשתן תחזוקת iPSC העברת iPSC תרבית תאים ללא מזין
ייצור ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים שמקורם בשתן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer,… More

Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer, F. C., Enard, W., Ohnuki, M. Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine. J. Vis. Exp. (197), e64922, doi:10.3791/64922 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter