Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å isolere, utvide og omprogrammere humane og ikke-humane primaturinavledede celler til induserte pluripotente stamceller (iPSCs), samt instruksjoner for materfritt vedlikehold av de nylig genererte iPSCene.
Abstract
Cross-species tilnærminger som studerer primat pluripotente stamceller og deres derivater er avgjørende for å bedre forstå molekylære og cellulære mekanismer for sykdom, utvikling og evolusjon. For å gjøre primatinduserte pluripotente stamceller (iPSCs) mer tilgjengelige, presenterer denne artikkelen en ikke-invasiv metode for å generere humane og ikke-menneskelige primat-iPSCer fra urinavledede celler, og vedlikeholdet av dem ved hjelp av en materfri dyrkingsmetode.
Urinen kan prøvetas fra et ikke-sterilt miljø (f.eks. dyrets bur) og behandles med en bredspektret antibiotikacocktail under primær cellekultur for å redusere forurensning effektivt. Etter forplantning av de urinavledede cellene genereres iPSCs ved en modifisert transduksjonsmetode av et kommersielt tilgjengelig Sendai-virusvektorsystem. Første iPSC-kolonier kan allerede være synlige etter 5 dager, og kan tidligst plukkes etter 10 dager. Rutinemessig klumppassasje med enzymfri dissosiasjonsbuffer støtter pluripotens av de genererte iPSCene i mer enn 50 passasjer.
Introduction
Genomiske sammenligninger av menneskelige og ikke-menneskelige primater (NHP) er avgjørende for å forstå vår evolusjonære historie og utviklingen av menneskespesifikke egenskaper1. I tillegg tillater disse sammenligningene slutningen av funksjon ved å identifisere konserverte DNA-sekvenser2, for eksempel for å prioritere sykdomsassosierte varianter3. Sammenligninger av molekylære fenotyper som genuttrykksnivåer er avgjørende for bedre å tolke genomiske sammenligninger og for å oppdage for eksempel cellulære fenotypiske forskjeller. Videre har de - i likhet med sammenligninger på DNA-nivå - potensialet til å utlede funksjonell relevans, og dermed bedre tolke medisinsk relevant variasjon innen mennesker4. Inkorporering av omfattende molekylære fenotypiske data i disse komparative studiene krever passende biologiske ressurser (dvs. ortologe celler på tvers av arter). Etiske og praktiske grunner gjør det imidlertid vanskelig eller umulig å få tilgang til slike sammenlignbare celler, spesielt under utvikling. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) tillater generering av slike utilgjengelige celletyper in vitro5,6, er eksperimentelt tilgjengelige og har blitt brukt til primatsammenligninger6,7,8,9,10,11,12,13,14.
For å generere iPSCer må man skaffe seg de primære cellene som skal omprogrammeres. Celler isolert fra urin har den fordelen at de kan prøves ikke-invasivt fra primater, og at de lett kan omprogrammeres, sannsynligvis på grunn av deres stamcellelignende molekylære profiler15. Kulturbetingelsene for å opprettholde primat-iPSCer er like viktige som omprogrammering; Klassisk krevde kulturen av humane pluripotente stamceller et ikke-definert, serumbasert medium og samkultur av embryonale fibroblaster fra mus - såkalte materceller - som gir essensielle næringsstoffer og et stillas for embryonale stamceller (ESC)16. Siden utviklingen av kjemisk definerte og materfrie kultursystemer17,18, er det nå ulike alternativer for kommersielt tilgjengelige iPSC kulturmedier og matriser. Imidlertid har de fleste av disse kulturforholdene blitt optimalisert for menneskelige ESC-er og iPSC-er, og kan derfor fungere mindre bra i NHP iPSC-kulturen. I denne videoprotokollen gir vi instruksjoner for å generere og vedlikeholde humane og NHP iPSCs avledet fra urincellekultur.
Siden den første rapporten om iPSC-generering ved tvungen ekspresjon av definerte faktorer i fibroblaster i 2006, har denne metoden blitt brukt på mange forskjellige celletyper av forskjellig opprinnelse 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Blant dem kan bare urinavledede celler oppnås på en helt ikke-invasiv måte. Basert på den tidligere beskrevne protokollen av Zhou et al.33, kan man isolere og utvide celler fra primaturin selv fra ikke-sterile prøver, ved å supplere bredspektret antibiotika15. Spesielt viser urinavledede celler samplet av denne protokollen et høyt potensial for å produsere iPSCs, innen kortere tid (kolonier blir synlige i 5-15 dager) enn konvensjonell omprogrammering av fibroblaster (20-30 dager, etter vår erfaring), og med en tilstrekkelig høy suksessrate. Disse urinavledede cellene ble klassifisert som den blandede populasjonen av mesenkymale stamcellelignende celler og blæreepitelceller, noe som forårsaket den høye omprogrammeringseffektiviteten15.
I tillegg til variasjonen i primære celler, varierer omprogrammeringsmetodene for å generere iPSCer også i henhold til bruksformålet. Konvensjonelle omprogrammeringsprosedyrer for humane somatiske celler ble utført ved overekspresjon av omprogrammeringsfaktorer med retrovirus- eller lentivirusvektorer, som tillot integrering av eksogent DNA i genomet 5,34,35. For å holde de genererte iPSCene genetisk intakte, har forskere utviklet et bredt utvalg av ikke-integrasjonssystemer - excisable PiggyBac vektor 36,37, episomal vektor38,39, ikke-integrerende virusvektorer som Sendai virus 40 og adenovirus 41, mRNA-transfeksjon 42, proteintransfeksjon 43,44 og kjemisk sammensatt behandling 45. På grunn av effektiviteten og brukervennligheten i håndteringen, brukes Sendai-virusbaserte omprogrammeringsvektorer i denne protokollen. Infeksjon av primære celler utføres i en 1 time suspensjonskultur av celler og virus ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI) på 5 før plating. Dette modifiserte trinnet kan øke sannsynligheten for kontakt mellom celleoverflater og virus, sammenlignet med den konvensjonelle metoden der virusene tilsettes direkte til den adherente cellekulturen, og dermed gi flere iPSC-kolonier15.
Passering av humane og NHP pluripotente stamceller kan gjøres ved klumppassasje og enkeltcellepassasje. Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) er et kostnadseffektivt chelateringsmiddel som binder kalsium- og magnesiumioner, og forhindrer dermed den adherente aktiviteten til cadherin og integrin. EDTA brukes også som et mildt, selektivt dissosiasjonsreagens, da udifferensierte celler løsner før differensierte celler på grunn av deres forskjellige adhesjonsmolekyler. Fullstendig dissosiasjon induserer massiv celledød av primat-iPSCs via den Rho/Rho-assosierte kveile-spoleholdige proteinkinase (Rho/Rock)-mediert myosinhyperaktivering. Derfor er supplering av kulturmediet med en Rho / Rock-hemmer avgjørende for eksperimenter som krever enkeltceller i suspensjon46,47. I denne protokollen anbefaler vi klumppassering som rutinemessig passasjemetode og anbefaler encellepassasje bare når det er nødvendig, f.eks. når såing av definerte cellenumre er nødvendig, eller under underkloning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne eksperimentelle prosedyren ble godkjent av den ansvarlige etiske komiteen for menneskelig eksperimentering (20-122, Ethikkommission LMU München). Alle eksperimenter ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter.
MERK: Godkjenning må innhentes fra den aktuelle etiske komiteen før du starter eksperimenter som omhandler humane og NHP-prøver. Alle eksperimentelle prosedyrer skal utføres i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. Hvert av følgende trinn skal utføres ved hjelp av steril teknikk i et biologisk sikkerhetsskap. Alle buffer- og mediekomposisjoner finnes i tilleggstabell S1. Sørg for at alle medier varmes opp til romtemperatur (22 °C) før de tilsettes cellene. Hvert sentrifugeringstrinn skal utføres ved romtemperatur, med mindre annet er nevnt.
1. Isolering av celler fra urinprøver
FORSIKTIG: Sørg for at menneskelige donorer er fri for humant immunsviktvirus (HIV), hepatitt B-virus (HBV) og hepatitt C-virus (HCV). For NHP, sørg for at mulige givere / celler er fri for spesifikke patogener-B-virus (BV), Simian immunsviktvirus (SIV), Simian Betaretrovirus (SRV) og Simian T-celle lymfotropisk virus (STLV).
- Forbered en gelatinbelagt 12-brønnsplate ved å tilsette 500 μL 0,2% gelatin per brønn, og fordel væsken ved å bevege platen. Plasser ved 37 °C i minst 30 minutter før nødvendig.
- Samle menneskelige urinprøver i 50 ml koniske rør. For primater, samle urin fra gulvet på dyreavdelingen med en sprøyte.
MERK: Et volum på 5 ml urin ble bevist å være tilstrekkelig for å isolere minst en koloni i 42% av forsøkene. Imidlertid anbefales det å bruke et høyere volum på ~ 50 ml urin for å øke sjansen for å isolere kolonier. NHP urin bør prøves så frisk som mulig, helst umiddelbart etter vannlating. Oppbevaring av urinprøver ved 4 °C i 4 timer hadde ingen negativ effekt på suksessraten for protokollen, men lengre lagringstid ble ikke testet. - Sentrifuger den urinholdige slangen ved 400 × g i 10 minutter, og aspirer supernatanten forsiktig, og etterlater ca. 1 ml i slangen.
- Bryt pelleten i de resterende 1 ml væske. Samle suspensjonene i ett rør hvis flere rør med urin ble samlet.
- Vask cellene ved å tilsette 10 ml vaskebuffer for urin (se tilleggstabell S1) inneholdende 2,5 mikrogram/ml amfotericin i slangen, og bland suspensjonen forsiktig med en serologisk pipette.
- Sentrifuger røret ved 200 × g i 10 minutter, og aspirer supernatanten forsiktig, slik at det blir ca. <0,2 ml i røret.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml primært urinmedium (se tilleggstabell S1) som inneholder 0,5 μg/ml amfotericin per 50 ml initialt behandlet urin (resuspendert i 1 ml, selv om mindre enn 50 ml urin ble behandlet).
- Aspirat gelatin fra brønnene (tilberedt i trinn 1.1), og plate 1 ml av suspensjonen fra trinn 1.7 i en brønn på en 12-brønns plate. Gjenta for så mange brønner som ønsket, eller for så mange mililiter fjæring tilgjengelig.
Valgfritt: For å unngå forurensning som stammer fra uhygienisk prøveinnsamling, tilsett 100 μg / ml antimikrobielt reagens til cellene herfra, til første passasje. - Plasser platen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Tilsett 1 ml primært urinmedium per brønn daglig til dag 5, uten å fjerne det eksisterende mediet.
- På dag 5 aspirerer du 4 ml medium fra platen, og etterlater ca. 1 ml medium. Tilsett 1 ml REMC medium (se tilleggstabell S1) per brønn for å få en 1:1-blanding med det nye dyrkningsmediet.
- Bytt ut halvparten av mediet med REMC-medium hver dag til de første koloniene vises (figur 1A, B). Fjern derfor 1 ml gammelt medium, og tilsett 1 ml ferskt REMC-medium per brønn.
2. Utvidelse av urinceller
MERK: Passering av urinceller bør utføres før kulturen når 90% konfluens.
- Forbered ønsket mengde gelatinbelagte 12-brønnsplater, som angitt i trinn 1.1.
- Aspirer det gamle mediet, og vask cellene ved å tilsette 1 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS).
- Aspirer DPBS, og tilsett 300 μL 0,5x dissosiasjonsenzym fortynnet med DPBS. Inkuber platen ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilsett 700 μL REMC medium for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Pipetter suspensjonen forsiktig med en P1000-pipette til cellene dissosieres til enkeltceller.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør, og sentrifuger røret ved 200 × g i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender pelleten i 1 ml REMC medium.
- Telle cellene ved hjelp av en celleteller (et hemocytometer eller en automatisert celleteller).
- For utvidelse av urincellene, plate 1,5 × 10 4 til 3 × 104 celler i 1 ml REMC medium i en 12-brønns plate belagt med 0,2% gelatin.
- Utfør påfølgende middelendringer annenhver dag til kulturen når 80% -90% sammenløp. Aspirer derfor det gamle mediet og tilsett 1 ml friskt REMC-medium.
3. Generering av iPSCs ved Sendai-virusvektorinfeksjon
MERK: For arbeidsflyten for omprogrammeringsprosedyren, se figur 2A. Urinceller som brukes til omprogrammering bør være så unge som mulig, men et bemerkelsesverdig tap av omprogrammeringseffektivitet observeres ikke før passasje 4. Sendai Virus Reprogramming Kit må brukes i et BL-2-anlegg. Håndter virus under et biologisk sikkerhetsskap med laminær strømning, og bruk alltid egnet sikkerhetsutstyr for å forhindre slimhinneeksponering.
- Forbered en kjellermembranmatrisebelagt 12-brønnsplate ved å tilsette 500 μL kjellermembranmatrise per brønn, og fordel væsken ved å flytte platen. Inkuber platen ved 37 °C i minst 1 time, og erstatt membranmatrisen i basen med 900 μL REMC medium. Oppbevar tallerkenen ved 37 °C til bruk.
- Tine komponentene i Sendai Reprogramming Kit raskt i et vannbad på 37 °C. Bland Sendai-virusene (polycistronic KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC og KLF4) med en MOI på 5, og tilsett REMC medium opp til 100 μL. Bruk ligning (1):
MERK: Siden virustitere varierer mellom partier, må du alltid sjekke titeren i analysesertifikatet som leveres av produsenten.
Valgfritt: Bruk grønt fluorescerende protein (GFP) Sendai-virus i tillegg som en positiv kontroll for transduksjonseffektiviteten. For dette, lag ytterligere 3,5 × 104 celler i et eget rør i trinn 3.3. - For dissosiasjon av urincellene, følg trinn 2.2-2.4. Tell cellene ved hjelp av celletelleren, og overfør 7 × 104 urinceller til et 1,5 ml rør.
- Sentrifuger røret ved 200 × g i 5 minutter, og fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Resuspender pelleten i 100 μL av SeV-blandingen fremstilt i trinn 3.2. Inkuber tuben i 1 time ved 37 °C ved suspensjonsinfeksjon.
- Plate suspensjonen på kjellermembranmatrisebelagte 12-brønnsplater som ble klargjort i trinn 3.1. Rutinemessig × plate 1 × 104 og 2,5 104 celler per brønn i duplikater.
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5% CO2. Erstatt mediet med 1 ml ferskt REMC medium 24 timer etter transduksjon og på dag 3.
- På dag 5 etter transduksjon, skift medium til PSC generasjonsmedium (se tilleggstabell S1), med påfølgende middels endringer annenhver dag. Fjern derfor det gamle mediet og tilsett 1 ml PSC-generasjonsmedium per brønn.
MERK: Det kan ta opptil 15 dager før de første koloniene dukker opp. - Velg individuelle iPSC-kolonier når størrelsen på kolonien overstiger 1 mm. For å gjøre dette, skrap og forsiktig samle en enkelt koloni med en p10-pipette under et mikroskop. Overfør kolonien til en ny brønn av en 12-brønns plate belagt med en kjellermembranmatrise som inneholder 750 μL PSC-kulturmedium.
Valgfritt: Skylling av platen med DPBS og behandling i 1 min med 0,5 mM EDTA før plukking kan støtte den robuste kulturen for ytterligere trinn. Hvis cellene skal dyrkes lenger for å vente på senere nye kolonier, må du ikke utføre dette EDTA-behandlingstrinnet. - Dyrk cellene ved 37 °C og 5 % CO2 med påfølgende middels forandringer annenhver dag, som angitt i avsnitt 4 i protokollen. Når den plukkede kolonien når en diameter på 2 mm, fortsetter du med den rutinemessige iPSC-passasjen, som forklart i avsnitt 5 i protokollen.
4. Middels endring
MERK: Kulturmediet bør endres annenhver dag til koloniene vokser seg store nok til å passere.
- Aspirer det gamle mediet og tilsett 750 μL av det friske mediet per 12-brønnsplate. For å bytte til en annen type medium, bytt ut mediet minst 1 dag etter passering.
5. Pasning
MERK: Cellene skal passeres når iPSC-koloniene vokser seg store nok (diameter > 2 mm), eller koloniene er i ferd med å berøre hverandre. Rutinemessig kan iPSCs deles omtrent hver 5. dag. Bruk klumppassasje (trinn 5.1) for rutinemessig vedlikehold, og enkeltcellepassasje (trinn 5.2) for eksperimenter der et definert antall celler er nødvendig. I tilfelle iPSCene skiller seg mye, kan koloniplukking (trinn 5.3) bidra til å forbedre renheten til kulturene.
- Klump-passering
- Forbered en kjellermembranmatrisebelagt 12-brønnsplate ved å tilsette 500 μL kjellermembranmatrise per brønn, og fordel væsken ved å flytte platen. Inkuber platen ved 37 °C i minst 1 time. Bytt ut kjellermembranmatrisen med 500 μL PSC-kulturmedium og oppbevar platen ved 37 °C til bruk.
- Aspirer mediet fra de dyrkede cellene, og vask cellene ved forsiktig å tilsette 500 μL DPBS. Fjern DPBS og tilsett 500 μL 0,5 mM EDTA til brønnen.
- Inkuber platen ved RT i 2-5 min, til koloniene begynner å løsne. Nøye observere cellene under mikroskopet.
- Når kantene på koloniene begynner å skrelle av og hull mellom cellene blir synlige (figur 3A), fjern EDTA og tilsett forsiktig 500 μL DPBS.
MERK: Pipetter alltid mot sideveggen til brønnen og aldri direkte på cellene, slik at cellene ikke løsnes fra platen. - Aspirer DPBS og skyll brønnen med 500 μL PSC-dyrkningsmedium ved hjelp av en p1000-pipette. Pipett opp og ned 1x-5x for å spre koloniene i klumper av passende størrelse (figur 3A). Ikke pipett for mye.
MERK: Hvis iPSCene ved et uhell pipetteres for mye, tilsett 10 μM berghemmer Y-27632 til mediet. Dette kan forbedre overlevelsen, da iPSCs ikke er i stand til å overleve som enkeltceller. - Overfør 1/10-1/50 av celleklumpsuspensjonen til de nye brønnene. Forholdet avhenger av sammenløpet av brønnen før splitting, ønsket tetthet av de frøede cellene og iPSC klonal preferanse.
- Fordel klumpene jevnt i brønnen ved å bevege platen forsiktig frem og tilbake flere ganger. Inkuber platen i minst 30 minutter ved 37 °C for å la klumpene feste seg.
- Erstatt mediet med 750 μL PSC-dyrkningsmedium hvis mange flytende døde celler observeres; ellers tilsett 250 μL PSC-kulturmedium. Plasser platen ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
MERK: Middels erstatning etter 30 minutter er kritisk, spesielt for ustabile cellelinjer (f.eks. NHP). - Bytt medium hver 2-3 dag til koloniene vokser seg store nok til å passere. For middels endring, følg trinn 4 i protokollen.
- Enkeltcelle passering
- Forbered den kjellermembranmatrisebelagte kulturplaten, som angitt i trinn 5.1.1, med tilsetning av 10 μM Y-27632 til PSC-kulturmediet.
Valgfritt: Legg 10 μM Y-27632 til cellene 1-3 timer før passering for å forbedre overlevelsen av følsomme cellelinjer. - Aspirer mediet og vask cellene ved å tilsette 500 μL DPBS. Fjern DPBS og tilsett 300 μL løsrivelsesløsning til brønnene.
- Inkuber platen ved 37 °C i 5–10 minutter. Når tilstrekkelig løsrivelse av cellene observeres under mikroskopet, tilsett 700 μL PSC-kulturmedium eller DPBS.
- Pipett opp og ned 5-10x ved hjelp av en p1000-pipette til cellene dissosieres til enkeltceller. Ikke pipetter for mye for å forhindre celleskade.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør inneholdende minst 2 ml DPBS for å fortynne avløsningsløsningen.
- Sentrifuge røret ved 200 × g i 5 minutter og aspirer løsningen helt uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspender pelleten i 500 μL PSC dyrkningsmedium tilsatt 10 μM Y-27632.
- Tell cellene og frøet 5.000-7.000 celler per kjellermembranmatrisebelagt 12-brønnsplate, utarbeidet i trinn 5.2.1.
MERK: Hvis et annet cellenummer er nødvendig, bytt til en større eller mindre brønn tilsvarende. - Inkuber platen i minst 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2 for å la cellene feste seg.
- Bytt ut mediet med 750 μL PSC-kulturmedium + 10 μM Y-27632 hvis mange døde celler observeres; ellers tilsett 250 μL + 10 μM Y-27632.
MERK: Dette trinnet er kritisk, spesielt for de ustabile cellelinjene (f.eks. NHP). - Plasser platen ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
- Endre medium til PSC-dyrkningsmedium uten Y-27632 1 til 2 dager etter splitting, slik at cellene kan vise den klassiske kolonimorfologien igjen (figur 3B).
- Bytt medium hver 2. dag til koloniene vokser seg store nok. For middels endring, følg protokollens § 4.
- Forbered den kjellermembranmatrisebelagte kulturplaten, som angitt i trinn 5.1.1, med tilsetning av 10 μM Y-27632 til PSC-kulturmediet.
- Passering av iPSCs ved koloniplukking
- Forbered kjellermembranmatrisebelagte 12-brønner som angitt i trinn 5.1.1.
- Aspirer mediet og vask cellene ved forsiktig å tilsette 500 μL DPBS. Fjern DPBS og tilsett 500 μL 0,5 mM EDTA til brønnen.
- Inkuber platen ved RT i 1-3 minutter og observer cellene under mikroskopet, til løsningen av kolonien er synlig på grensene.
- Fjern EDTA og tilsett forsiktig 500 μL DPBS. Aspirer væsken før du sakte tilsetter 500 μL PSC-dyrkningsmedium til brønnen, uten å løsne cellene.
- Bruk en p200-pipette for å velge ønsket koloni under mikroskopet, uten å samle de differensierte cellene. For å gjøre dette, skrap forsiktig over kolonien mens du tar opp mediet som inneholder celler.
- Overfør hver plukkede koloni til en kjellermembranmatrisebelagt brønn, som utarbeidet i trinn 5.3.1. Dissosiere cellene i små klumper ved hjelp av en p1000-pipette, ved å pipetere cellene 2-5x.
- Inkuber platen i 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2, slik at klumpene kan feste seg.
- Erstatt mediet med 750 μL PSC-dyrkningsmedium hvis mange flytende døde celler observeres; ellers tilsett 250 μL PSC-kulturmedium.
MERK: Middels erstatning etter 30 minutter er kritisk, spesielt for de ustabile cellelinjene (f.eks. NHP). - Plasser platen ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
- Bytt medium hver 2-3 dag til koloniene vokser seg store nok til å passere. For å gjøre dette, følg avsnitt 4 i protokollen.
6. Frysing av urinceller og iPSCs for langtidslagring
MERK: Rutinemessig fryses iPSCs som klumper i cellefrysemedium uten å telle. Pipettering bør være minimal for å unngå dissosiasjon i enkeltceller. For urinceller, rutinemessig, 1,5 × 10 4 til 3 × 104 celler fryses per rør, slik at brukeren kan tine ett rør direkte i en brønn på en 12-brønns plate uten behov for et annet telletrinn.
- Forbered 5 ml DPBS i et 15 ml rør.
- For frysing av urinceller, følg trinn 2.2-2.4 i protokollen. For frysing av iPSC-er, følg trinn 5.1.2-5.1.5 fra klumppasseringsprotokollen.
- Overfør suspensjonen til 15 ml slangen klargjort i trinn 6.1. For frysing av urinceller, telle 10 μL av cellesuspensjonen ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuge cellene i 5 minutter ved 200 × g, og aspirer supernatanten helt.
- Resuspender cellepelleten i 400 μL cellefrysemedium per rør, og fordel cellene til ønsket mengde kryorør.
- Overfør kryorørene umiddelbart til -80 °C. Overfør de frosne rørene til en -150 °C fryser eller flytende nitrogen 1 dag etter frysing ved -80 °C for langtidslagring.
7. Tining av urinceller og iPSCs
- For tining av urinceller, klargjør ønsket mengde gelatinbelagte 12-brønner, som angitt i trinn 1.1 i protokollen. For iPSC-er, klargjør kjellermembranmatrisebelagte 12-brønnsplater, som angitt i trinn 5.1.1. I begge tilfeller må du ikke bytte ut matrisen med medium.
- Klargjør et 15 ml rør inneholdende 4 ml DPBS, og oppbevar det ved 37 °C.
- Plasser et frossent hetteglass med celler raskt i et vannbad på 37 °C for tining, til et stykke flytende is blir synlig.
MERK: Tørk kryorøret med etanol før og etter inkubering i vannbadet for å unngå forurensninger. - Tilsett 500 μL REMC medium for urinceller, eller 500 mikrol PSC dyrkningsmedium for iPSC til den isholdige suspensjonen, og overfør suspensjonen umiddelbart til det forvarmede 15 ml røret klargjort i trinn 7.2.
- Sentrifuger røret ved 200 × g i 5 minutter, og kast supernatanten helt.
- For urinceller, resuspender pelleten i 1 ml REMC medium. For iPSCs, resuspender pelleten forsiktig i 750 mikrol PSC-kulturmedium. Unngå å pipettere for mye, for å holde klumpene intakte.
Valgfritt: Supplere mediet med 10 μM Y-27632 kan støtte overlevelsen av iPSCs etter tining. - Aspirer matrisen fra 12-brønnplatene som ble fremstilt i trinn 7.1, og overfør cellesuspensjonen forsiktig til brønnen.
- Plasser platen over natten ved 37 °C og 5 % CO2 i en inkubator.
- Neste dag, erstatt mediet med PSC kultur medium, uten Y-27632 for iPSCs og med REMC for urinceller.
- Dyrk cellene ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
- Bytt medium hver 2-3 dag til cellene vokser seg store nok til å passere. For middels endring, følg protokollens § 4.
8. Immunocytokjemi
MERK: Immunfarging med antistoffer rettet mot pluripotensrelaterte markører som NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 og EpCAM er en av de mest brukte valideringene av nylig genererte iPSCer. Ytterligere informasjon om antistoffene og fortynningene finnes i materialfortegnelsen.
- Plate iPSCs 1-3 dager før bruk i et passende antall 12-brønnsplater. Aspirer mediet, vask cellene ved å tilsette 500 μL DPBS, og fjern DPBS. Tilsett 400 μL 4% paraformaldehyd (PFA) per brønn, og fiks cellene i 15 minutter ved RT.
- Fjern 4% PFA, og vask cellene 3x med DPBS. Tilsett 400 μL blokkeringsbuffer per brønn, og inkuber platen i 30 minutter ved RT.
- Aspirer blokkeringsbufferen, og tilsett antistoffene fortynnet i 400 μL antistofffortynningsbuffer (ADB) til hver brønn. Inkuber platen ved 4 °C over natten.
- Fjern ADB som inneholder de primære antistoffene, og vask celler 3x med DPBS.
- Aspirer DPBS, og tilsett 400 μL sekundære antistoffer fortynnet i ADB per brønn. Inkuber platen i 1 time ved RT i mørket.
- Fjern ADB, og vask celler 3x med DPBS. Tilsett 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fortynnet i DPBS per brønn, og inkuber i 3 min ved RT.
- Aspirer DAPI-løsningen, og vask cellen 3x med DPBS. Legg til 500 μL DPBS for avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved isolering av celler fra human og NHP urin, kan forskjellige typer celler identifiseres direkte etter isolasjon. Plateepitelceller, samt forskjellige mindre runde celler, blir utskilt med urinen; kvinnelig urin inneholder langt flere plateepitelceller enn mannlig urin (figur 1B - dag 0; Tilleggsfigur S1). Etter 5 dagers dyrkning i primært urinmedium kan man se de første adherente prolifererende cellene (figur 1A,B - dag 5). På dette tidspunktet erstattes halvparten av mediet med REMC proliferasjonsmedium hver dag, til de første koloniene vises. På omtrent dag 13 vokser de adherente cellene til store kolonier som kan passeres (figur 1B - dag 13). Disse koloniene kan dannes av to morfologisk distinkte celletyper - den ene har en mer epitellignende fenotype med celler som vokser tett festet, og den andre viser en mer mesenkymallignende morfologi med langstrakt form og høyere migreringsevne (figur 1C). Etter den første passasjen vokser urincellene som et monolag, og kan passeres når kulturen når 80% konfluens (figur 1B - dag 17).
Figur 1 Isolering og dyrking av urinceller. (A) Arbeidsflyt for etablering av urinceller fra humane og ikke-humane primatprøver. (B) Fasekontrastbilder som viser vekst og kolonidannelse av urinceller frem til første passasje (p1). (C) To forskjellige celletyper isolert fra urinprøver kan skilles etter 2 ukers dyrkning. Skalastenger = 250 μm (B,C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å generere iPSCs fra urinceller, brukes en transduksjon med Sendai-virus som introduserer Yamanaka-faktorene OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC. For å øke transduksjonseffektiviteten inkuberes urinceller med viruset i 1 time i suspensjon, før de sås på kjellermembranmatrisebelagte brønner (figur 2A). Noen adherente celler kan ses i brønnene 1 dag etter transduksjon (figur 2B - dag 1). Etter 5-10 dager begynner disse cellene å danne kolonier, og tidlige morfologiske endringer kan observeres, noe som indikerer omprogrammering av cellene (figur 2B - dag 14). Mange av disse koloniene viser gradvis en ESC-lignende morfologi, og kan plukkes i PSC-kulturmedium når diameteren overstiger 1 mm. Etter plukking danner cellene kolonier som viser den typiske ESC-morfologien innen ca. 4 dager (figur 2B - dag 21 og 24). Når iPSC-koloniene vokser seg store nok, kan cellene passeres for første gang ved hjelp av klumppassasjeprotokollen (protokolltrinn 5.1).
Denne omprogrammeringsmetoden har blitt brukt til å generere iPSC fra mennesker, gorillagorilla (gorilla ) og pongo abelii ()15. Mens sannsynligheten for å oppnå urinceller er ganske variabel, og minst to til tre ganger lavere for sjimpanser enn for mennesker15, var omprogrammering av de oppnådde urincellene stort sett vellykket i vår erfaring. Generelt gir 0,19% av de infiserte urincellene opphav til kolonier med ESC-lignende morfologi, noe som resulterer i minst en koloni i 87% av omprogrammeringsforsøkene15. Alle genererte iPSCer deler de samme egenskapene og viser den typiske ESC-lignende kolonimorfologien, karakterisert ved tettpakkede celler med klart definerte kanter (figur 2C). I tillegg viser alle iPSCer en normal karyotype, og fraværet av SeV-omprogrammeringsvektorer ble verifisert ved PCR etter minst fem passasjer, som anbefalt av produsenten av SeV-omprogrammeringssettet (data ikke vist)15. Immunocytokjemi brukes til å teste ekspresjonen av pluripotensassosierte proteiner i kjernen, slik som NANOG, OCT3/4 og SOX2. Overflatemarkører som TRA-1-60, EpCAM og SSEA4 kan også brukes (figur 2D); SSEA4 uttrykkes imidlertid også i urincellene15. Videre kan flowcytometrianalyse utføres ved hjelp av disse overflatemarkørene for å gi kvantitativ informasjon om ipresistensstatusen til iPSCene (metode beskrevet av Ohnuki et al.48). Denne tilnærmingen brukes til å vise at 95,3% av de analyserte-iPSCene er positive for TRA-1-60 (figur 2E). Videre kan differensieringskapasiteten til NHP iPSCs bevises via in vitro embryoid body (EB) differensiering (metode beskrevet av Geuder et al.15). Som vist i figur 2F, er gorilla iPSCs i stand til å differensiere i endoderm (ɑ-fetoprotein), mesoderm (ɑ-glatt muskelaktin) og ektoderm (β-III tubulin) linjer.
Figur 2: Generering og karakterisering av urinavledede iPSCs. (A) Omprogrammering av urinavledede celler. (B) Fasekontrastbilder som viser morfologiske endringer av gorillaurinceller under omprogrammering til etablering av iPSC-kolonier. Skalastenger = 500 μm. (C) Morfologi av etablerte iPSC-kolonier fra menneske-, gorilla- og orangutangcellekulturer. Skalastenger = 500 μm. (D) Immunfluorescensfarging av gorilla iPSCs med pluripotensassosierte markører ved passasje 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM og TRA-1-60. Skalastenger = 100 μm. (E) Flowcytometrianalyse av-iPSCer farget med anti-TRA-1-60-PE. Ufargede celler ble brukt som kontroll. (F) Immunfluorescensanalyse av endoderm (AFP), mesoderm (ɑ-SMA) og ektoderm (β-III TUB) etter embryoid kroppsdifferensiering av gorilla iPSCs. Kjerner ble motfarget med DAPI. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: iPSCs = induserte pluripotente stamceller; PE = phycoerythrin; AFP = α-fetoprotein; ɑ-SMA = alfa glatt muskel aktin; β-III TUB = beta III Tubulin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Når iPSC-koloniene når en diameter på omtrent 2 mm, eller er i ferd med å berøre hverandre, skal cellene deles. Vi foreslår at du bruker klumppassasjeprotokollen for rutinemessig vedlikehold. I denne protokollen brukes 0,5 mM EDTA til å løsne cellene i 3-5 minutter, avhengig av kolonistørrelsen. Under EDTA-inkubasjon begynner koloniens grenser å skrelle av, og synlige hull vises mellom cellene (figur 3A). EDTA skal fjernes når en passende løsrivelse observeres under mikroskopet. Langvarig inkubasjon med EDTA fører til en høyere brøkdel av enkeltceller som ikke er i stand til å overleve. Deretter skal cellene dissosieres til klumper av tilsvarende størrelse, som vist i figur 3A. Cellene bør ikke dissosieres til små klumper, da dette reduserer overlevelsen og kan føre til mer differensierende celler.
Når et eksperiment krever såing av et definert antall celler, bør enkeltcellepassasjeprotokollen brukes. Denne protokollen inkluderer å supplere mediet med en Rock-hemmer, som gjør at enkeltcellene kan overleve. Det forventes at vedlagte enkeltceller viser en annen morfologi, sammenlignet med celler som vokser i en koloni etter klumpsåing (figur 3B - dag 0). Etter 1-2 dager med kultur begynner enkeltcellene å vokse til kolonier igjen, samtidig som de bevarer sin morfologi så vel som deres løse celle-cellekontakt, hvis en Rock-hemmer legges til mediet (figur 3B - Dag 2). Når disse små koloniene observeres, bør steinhemmeren fjernes fra mediet, slik at cellene kan vise den typiske ESC-lignende morfologien igjen (figur 3B - dag 4).
For å bedømme om en iPSC-koloni er av høy kvalitet, må flere aspekter tas i betraktning. For det første er det normalt at sunne kolonier viser ingen eller en liten mengde spontan differensiering; Imidlertid er et økt antall differensierte celler (>10%) en indikasjon på dårlig iPSC-kvalitet. Ytterligere kjennetegn ved lav iPSC-kvalitet er tap av grenseintegritet og ensartethet (figur 3C: høyre), samt løs cellulær emballasje med synlige hull mellom cellene (figur 3D: høyre). I motsetning til dette er iPSCer av høy kvalitet preget av definerte grenser, tett cellulær emballasje og fremtredende nukleoler (figur 3C, D: venstre bilder).
Figur 3: Primat iPSC kultur. (A) Fasekontrastbilder som viser løsrivelsen av iPSC-kolonier under EDTA-inkubasjon etter klumppassasjeprotokollen og den optimale klumpstørrelsen etter dissosiasjon. Skalastenger = 250 μm. (B) Tidslinje for iPSC-gjenoppretting etter enkeltcellepassasje. Berghemmeren Y-27632 ble fjernet fra dag 2 og utover. Skalastenger = 250 μm. (C) Venstre: eksempel på en menneskelig iPSC-koloni av høy kvalitet med definerte grenser. Høyre: eksempel på en koloni av dårlig kvalitet som viser mindre grenseintegritet og differensierte celler. Skalastenger = 500 μm. (D) Eksempelbilder for en menneskelig iPSC-koloni av høy kvalitet (venstre) sammenlignet med en av lav kvalitet med løst pakkede celler (høyre). Skalastenger = 100 μm. Forkortelse: iPSCs = induserte pluripotente stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Oversikt over celletyper funnet i urin hos mennesker. (A) Celler isolert fra kvinnelig urin. (B) Celler isolert fra mannlig urin. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Buffer og mediesammensetninger brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCer er verdifulle celletyper da de tillater generering av ellers utilgjengelige celletyper in vitro. Siden utgangsmaterialene for omprogrammering, for eksempel, fibroblaster ikke er lett tilgjengelige fra alle primatarter, presenterer dette papiret en protokoll for generering av iPSCs fra urinavledede celler. Disse cellene kan oppnås på en ikke-invasiv måte, selv fra ikke-sterile primaturinprøver, ved å supplere kulturmediet med bredspektret antibiotika.
Flere kritiske trinn i protokollen er verdt litt ekstra diskusjon. For det første, når du isolerer celler fra ikke-steril urin, er det viktig å supplere mediet med et bredspektret antimikrobielt reagens for å redusere risikoen for forurensning. Hvis veksten av mikrobiologisk forurensning blir tydelig til tross for bruk av antibiotika, anbefales det å kaste bort hele kulturen og desinfisere området. I tillegg, etter vår erfaring, produserer fortsatt dyrking ikke sunne voksende urinceller. For det andre, når du begynner å omprogrammere celler, anbefales det sterkt å forberede flere retter med forskjellige antall SeV-transducerte celler for å unngå risikoen for frigjøring av alle celler ved overkonfluens og for å øke sannsynligheten for iPSC-oppkjøp. Generelt forventes plating av en høyere tetthet av SeV-transducerte celler å gi flere omprogrammerte iPSC-kolonier, mens dyrking av omprogrammeringscellene i en periode på ~ 20 dager ofte resulterer i overkonfluens, etterfulgt av løsrivelse av hele brønnen. For det tredje, ved hvert trinn som krever dissosiasjon av iPSCs, er det avgjørende å unngå omfattende pipettering, noe som fører til betydelig celledød. Spesielt når klumpen passerer utføres, er det viktig å holde klumpene i en passende størrelse (figur 3A). Klumper som er for store kan føre til rask differensiering, mens klumper som er for små kan redusere overlevelsen.
Vi observerte at sannsynligheten for å få urinceller er ganske variabel mellom prøver og alikoter, men fant ingen bevis for at mindre volumer har lavere suksessrate for å oppnå kolonier. Generelt isolerte vi i gjennomsnitt 7,6 kolonier fra 100 ml menneskelig urin. Forutsatt denne gjennomsnittshastigheten og en Poisson-fordeling, har oppnåelse av minst én koloni en sannsynlighet på ~98 % for 50 ml og ~30 % for 5 ml utgangsmateriale. I vårt tilfelle var det mulig å isolere minst en koloni fra 5 ml human urin i 42% av forsøkene15. Basert på dette kan isolering av kolonier fortsatt være verdt å prøve, selv om bare små mengder urin er tilgjengelig. I tilfelle omprogrammering av urinceller mislykkes, og ingen iPSC-kolonier kan observeres, kan plating av forskjellige antall transfekterte celler resultere i omprogrammering av urinavledede celler. De fremvoksende iPSC-koloniene kan også identifiseres som iPSCer ved levende farging ved hjelp av overflatemarkører (f.eks. TRA-1-60 eller alkalisk fosfatase [AP]; data ikke vist). Det er kjent at AP-aktiviteten er oppregulert i pluripotente stamceller, og den kan brukes til å forbigående flekke stamceller under kulturprosessen. En annen mulig fallgruve ved protokollen er den optimale kulturen til NHP iPSCs. Ved hjelp av denne protokollen bekreftet vi at menneskelige og NHP iPSCs opprettholder sin pluripotente tilstand i mer enn 50 passasjer ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig medium. Imidlertid, i forhold til menneskelige iPSCs, er NHP iPSCs mer tilbøyelige til å spontant differensiere i vår erfaring, potensielt på grunn av kulturforholdene som ble optimalisert for menneskelige og ikke for NHP-kulturer. I tillegg er det stor variasjon blant iPSC-kloner i overlevelsesrater etter plating, økende hastighet og tendens til differensiering. Derfor må man ofte bestemme det optimale delingsforholdet, passasjetidspunktet og klumpstørrelsen for hver klon individuelt.
Vi har vist at selv et volum på 5 ml kan være tilstrekkelig til å isolere urinceller fra NHP15. Men mens vi ikke fant noen signifikante forskjeller i antall isolerte urinceller hos mennesker, gorillaer og, hadde sjimpanser et lavere forhold, da vi ikke kunne isolere urinceller fra totalt 87 ml. Derfor kan det for noen arter være nødvendig å samle mye mer urin enn for andre. Innsamling av store mengder fra små primater kan være spesielt utfordrende, men da isolering av urinceller er ganske kostnadseffektivt, er det praktisk å bare prøve det ut for bestemte arter og tilgjengelige mengder urin. Dessverre kan ikke urinprøvene fryses, noe som begrenser radiusen over hvilke prøver som kan samles inn. Vi viste imidlertid at en lagringstid på 4 timer ved 4 °C ikke hadde noen innflytelse på antall isolerte kolonier15, og lengre lagringstid eller bedre lagringsforhold kunne godt være mulig. Vi har innført flere typer kvalitetskontrolltester for validering. Men selv om en iPSC-linje tilfredsstiller disse kriteriene, er klonal heterogenitet fortsatt betydelig, noe som har blitt forklart av genetisk bakgrunn49 og epigenetisk status 50,51,52,53,54. For å anvende primat-iPSCer til fremtidig komparativ analyse, bør man vurdere heterogeniteten og bruke nok kloner til å gjennomsnitt ut den klonale variasjonen, og dermed unngå feiltolkning av resultatet.
Ikke desto mindre har bruk av urin som kilde for primære celler en stor fordel i forhold til konvensjonelle metoder ved hjelp av for eksempel fibroblaster for omprogrammering, da de kan oppnås helt ikke-invasivt. I tillegg tillater denne protokollen generering av iPSCs fra urinavledede celler med kortere periode enn konvensjonell omprogrammering. Med denne metoden blir kolonier synlige innen 5-15 dager, mens vi har funnet ut at kolonier fra primatfibroblaster (rhesus, bavian) har en tendens til å dukke opp senere, etter 20-30 dager. I tillegg, ved bruk av denne suspensjonsinfeksjonsmetoden, ga 0,19% av virustransducerte celler opphav til kolonier med pluripotent cellelignende morfologi. Dette resulterte i minst en koloni i 87% av forsøkene15. Til sammenligning ble den konvensjonelle transduksjonsmetoden for SeV med vedlagte celler og lipofeksjon med episomale plasmider vist å ha en signifikant lavere omprogrammeringseffektivitet, med henholdsvis 0,09% og 0,009% av cellene som danner en pluripotent koloni15.
Oppsummert tillater denne metoden isolering av urinceller ikke-invasivt og generering av materfrie iPSCer fra nesten enhver menneskelig donor og mange NHP-er. Dette øker tilgjengeligheten til dyrebare celletyper som kan differensieres fra disse iPSC-ene. Videre kan denne metoden brukes til å produsere pasientspesifikke iPSCer som kan brukes til sykdomsmodellering eller fremtidige cellebaserte terapier. Til slutt, da iPSCs kan genereres fra bare små mengder urin, kan denne metoden brukes på mange flere forskjellige primater eller til og med pattedyrarter. Dermed kan denne metoden være et kraftig verktøy for sammenligning av arter på tvers av arter, som kan gi bedre forståelse av utviklingen av menneskespesifikke egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av DFG EN 1093/5-1 (prosjektnummer 458247426). MO ble støttet av JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figurene ble laget med BioRender.com. Flowcytometri ble utført ved hjelp av Core Facility Flow Cytometry ved Biomedical Center München. Vi vil gjerne takke Makoto Shida og Tomoyo Muto fra ASHBi, Kyoto University, for støtte til videografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
