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Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65122
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg
* These authors contributed equally

Summary

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células endoteliales de venas safenas humanas (hSVECs). También proporcionamos métodos detallados para producir esfuerzo cortante y estiramiento para estudiar el estrés mecánico en hSVEC.

Abstract

La cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG, por sus siglas en inglés) es un procedimiento para revascularizar el miocardio isquémico. La vena safena sigue siendo utilizada como conducto de la CABG a pesar de la reducción de la permeabilidad a largo plazo en comparación con los conductos arteriales. El aumento abrupto del estrés hemodinámico asociado con la arterialización del injerto resulta en daño vascular, especialmente el endotelio, que puede influir en la baja permeabilidad del injerto de vena safena (SVG). Aquí, describimos el aislamiento, caracterización y expansión de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVEC). Las células aisladas por digestión de colagenasa muestran la morfología típica de adoquines y expresan marcadores celulares endoteliales CD31 y VE-cadherina. Para evaluar la influencia del estrés mecánico, se utilizaron protocolos en este estudio para investigar los dos estímulos físicos principales, el esfuerzo cortante y el estiramiento, en SVG arterializados. Los hSVEC se cultivan en una cámara de flujo de placa paralela para producir esfuerzo cortante, mostrando alineación en la dirección del flujo y mayor expresión de KLF2, KLF4 y NOS3. Los hSVEC también se pueden cultivar en una membrana de silicio que permite un estiramiento celular controlado que imita el estiramiento venoso (bajo) y arterial (alto). El patrón de actina F de las células endoteliales y la secreción de óxido nítrico (NO) se modulan en consecuencia por el estiramiento arterial. En resumen, presentamos un método detallado para aislar hSVECs para estudiar la influencia del estrés mecánico hemodinámico en un fenotipo endotelial.

Introduction

La disfunción de las células endoteliales (CE) es un actor clave en el fracaso del injerto de vena safena 1,2,3,4. El aumento sostenido del esfuerzo cortante y el estiramiento cíclico induce el fenotipo proinflamatorio de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVECs)3,4,5,6. Las vías moleculares subyacentes aún no se comprenden completamente, y los protocolos estandarizados para estudios in vitro pueden aprovechar los esfuerzos para obtener nuevos conocimientos en el área. Aquí, describimos un protocolo simple para aislar, caracterizar y expandir los hSVEC y cómo exponerlos a niveles variables de esfuerzo cortante y estiramiento cíclico, imitando las condiciones hemodinámicas venosas y arteriales.

Los hSVEC se aíslan por incubación de colagenasa y se pueden utilizar hasta el paso 8. Este protocolo requiere menos manipulación del vaso en comparación con los otros protocolos disponibles7, lo que reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. Por otro lado, requiere un segmento de recipiente más grande de al menos 2 cm para tener una extracción eficiente de la CE. En la literatura, se ha relatado que las CE de grandes vasos también pueden obtenerse por eliminación mecánica 7,8. Aunque eficaz, el enfoque físico tiene las desventajas de un bajo rendimiento de EC y una mayor contaminación por fibroblastos. Para aumentar la pureza, se necesitan pasos adicionales utilizando perlas magnéticas o clasificación celular, aumentando el costo del protocolo debido a la adquisición de perlas y anticuerpos 7,8. El método enzimático tiene resultados más rápidos y mejores en cuanto a la pureza y viabilidad de la CE 7,8.

Las CE más utilizadas para estudiar la disfunción endotelial son las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Se sabe que el fenotipo CE cambia en diferentes lechos vasculares, y es esencial desarrollar métodos que representen el vaso investigado 9,10. En este sentido, el establecimiento de un protocolo para aislar un hSVEC y cultivarlo bajo estrés mecánico es una herramienta valiosa para comprender la contribución de la disfunción hSVEC en la enfermedad del injerto venoso.

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Protocol

Se obtuvieron segmentos no utilizados de venas safenas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario en el Instituto del Corazón (InCor), Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo. Todos los individuos dieron su consentimiento informado para participar en el estudio, que fue revisado y aprobado por el comité de ética local.

1. Aislamiento, cultivo y caracterización de células endoteliales primarias de venas safenas humanas (hSVECs)

  1. Preparación
    1. Autoclave un par de pinzas rectas o curvas y tijeras de tejido (7-8 cm).
    2. Preparar gelatina estéril. Mezclar 0,1 g (0,1% p/v) o 3 g (3% p/v) de gelatina de piel porcina con 100 ml de agua ultrapura, en autoclave durante 15 min, y conservar a 4 °C. Calentar a 37 °C para licuar antes de cubrir las placas y portaobjetos de cultivo celular.
    3. Prepare colagenasa estéril (1 mg/ml) dentro de la campana de flujo laminar. Diluir la colagenasa en PBS y esterilizarla con un filtro de 0,2 μm.
    4. Cubra una placa de cultivo celular de 60 mm y un portaobjetos de cámara de 8 pocillos con gelatina al 0,1% p/v durante al menos 30 min a 37 °C. Retire el exceso de gelatina antes de sembrar las células.
    5. Preparar medio celular endotelial completo: medio basal de crecimiento celular endotelial (EBM-2) suplementado con factores de crecimiento EGM2.
      NOTA: Los factores de crecimiento EGM2 se suministran como un kit por una empresa que figura en la Tabla de materiales. La concentración de los factores no es revelada por la empresa.
    6. Hacer albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y 5%, paraformaldehído al 4% (PFA) y Triton X-100 al 0,1%, todo en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Aislamiento y cultivo de hSVECs
    1. Recoja al menos un segmento de vena safena de 2-3 cm de largo para este procedimiento.
      NOTA. Todos los procedimientos de cultivo celular deben llevarse a cabo en condiciones estériles y dentro de una campana de flujo laminar.
    2. Transfiera el segmento de la vena a una placa de Petri llena de PBS precalentado. Inserte una punta de pipeta en un extremo de la vena y enjuague suavemente con PBS para eliminar toda la sangre dentro de la luz. Enjuague hasta que el flujo de lavado se aclare por completo.
    3. Cierre uno de los extremos de la vena con una sutura de algodón estéril. Llene cuidadosamente el vaso con 1 mg/ml de solución de colagenasa tipo II. Cierre el otro extremo del recipiente con una sutura de algodón (Figura 1A). Incubar el recipiente con solución de colagenasa en una atmósfera humidificada de 5% deCO2 a 37 °C durante 1 h.
    4. Después de eso, corte uno de los extremos del vaso dentro de un tubo de 15 ml y recoja la solución de colagenasa. Corte el otro extremo y enjuague la superficie luminal con 1-2 ml de PBS para recoger todos los EC separados. Coloque todo el PBS junto con la solución de colagenasa dentro del mismo tubo.
    5. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) para granular las células.
      NOTA. El pellet celular es muy pequeño y difícil de visualizar. Si la sangre no se elimina completamente antes del tratamiento con colagenasa (paso 1.2.2.), las células sanguíneas también precipitarán y el pellet será rojizo.
    6. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 3-4 mL de medio celular endotelial completo (EBM-2 suplementado con factores de crecimiento EGM2) y una solución adicional de heparina (5 U/mL, concentración final). Coloque las células en una placa de cultivo celular de 60 mm pre-recubierta con gelatina al 3% p/v.
      NOTA: La gelatina fue la primera opción debido a su facilidad de accesibilidad y bajo costo. Como el recubrimiento con gelatina mantiene con éxito el fenotipo CE, no se probó ninguna otra sustancia de recubrimiento. Los colágenos y la fibronectina se pueden probar en estudios destinados a investigar la influencia de diferentes componentes de la matriz extracelular en la adhesión de la CE y el fenotipo.
    7. Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2 durante 4 días sin cambiar el medio. Después de eso, cambie los medios cada dos días. A partir de este momento, la suplementación adicional de medios celulares con heparina ya no es necesaria. Examine la placa bajo el microscopio para asegurarse de que se hayan eliminado los glóbulos rojos.
    8. Después de 3-10 días después de la extracción, dependiendo del tamaño y diámetro del segmento de la vena, visualice los hSVEC mediante microscopía de contraste de fase.
    9. Evaluar el grado de confluencia y su morfología de adoquines en microscopía de contraste de fase.
    10. Continuar cambiando los medios cada 2 días hasta que las células alcancen el 70%-80% de confluencia.
    11. Pasar los hSVEC con solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% de tripsina-0,02%.
      1. Lave las celdas con PBS precalentado.
      2. Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA a la placa de cultivo celular de 60 mm. Incubar a 37 °C durante 2 min o hasta que se desprendan todas las células.
      3. Agregue 2 ml de medio celular endotelial completo para inactivar la tripsina.
      4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT.
      5. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo.
      6. Contar la suspensión celular en azul de tripano 1:1 (0,4%) para placar células viables.
      7. Para expandir el cultivo, emplatar las células en una placa de cultivo celular de 100 mm con 10 ml de medio celular endotelial completo precalentado y cultivarlo a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2.
        NOTA. En promedio, la siembra de 4 x 104 hSVEC/cm2 será 100% confluente después de 48 h.
    12. Para criopreservar las células, resuspender el pellet del paso 1.2.11.5 en dimetilsulfóxido al 5% (DMSO) en suero bovino fetal (FBS) y almacenar en nitrógeno líquido.
  3. Caracterización de hSVECs: Tinción por citometría de flujo para CD31
    1. Transfiera 1 x 10 5 hSVEC a un tubo de1,5 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de PBS que contenga 2% de BSA y anticuerpo monoclonal CD31-FITC (1:100).
    2. Manche las celdas durante 30 minutos en RT en la oscuridad.
    3. Lave las células teñidas añadiendo 0,5 ml de PBS y centrifugarlas a 300 x g durante 3 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 400 μL de PBS con BSA al 2%.
    4. Use hSVEC no marcados, sin anticuerpos CD31, como control negativo.
    5. Proceda al análisis de adquisición del citómetro de flujo utilizando un láser azul y un canal FITC (excitación/emisión máx. [Ex/Em] de 498/517 nm). Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el citómetro tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección. Separe las celdas de los desechos en función de su tamaño y granularidad, luego compruebe celdas individuales mediante dispersión hacia adelante y dispersión lateral.
  4. Caracterización de hSVECs: Tinción fluorescente para CD31 y VE-cadherina
    1. Placa 0.1 x 105 celdas en el portaobjetos de cámara de 8 pocillos recubierto de gelatina. Incubar las células durante la noche a 37 °C, 5 % deCO2, para permitir que las células se adhieran a la superficie de cultivo.
    2. Retire el medio y lave las células una vez con PBS.
    3. Agregue 0.3 ml / pocillo de PFA al 4% para fijar las células. Incubar durante 15 min en RT.
    4. Lavar tres veces con PBS.
    5. Agregue 0.3 ml / pocillo de solución Triton X-100 al 0.1% para permeabilizar las células. Incubar durante 15 min en RT.
    6. Lavar tres veces con PBS.
    7. Para bloquear los sitios de unión de anticuerpos no específicos, agregue 0.3 ml / pocillo de solución BSA al 5% a las células. Incubar durante 15 min en RT.
    8. Lavar tres veces con PBS.
    9. Incubar las células con los anticuerpos primarios (CD31 y VE-cadherina, 1:100) diluidos en PBS con BSA al 2% durante la noche con balanceo suave a 4 °C. Dejar un pozo incubando con PBS con BSA al 2% (sin anticuerpo primario) como control negativo.
    10. Lavar tres veces con PBS.
    11. Incubar las células con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia diluidos (1:500) en PBS durante 1 h en RT. Añadir 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción nuclear a una concentración final de 1 mg/ml.
    12. Lavar tres veces con PBS.
    13. Retire la cámara de medios con el separador. Coloque una gota del reactivo del medio de montaje (50% de glicerol en PBS) y coloque un portaobjetos de vidrio (24 mm x 60 mm) evitando atrapar burbujas.
    14. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia.
      NOTA: DAPI se detecta con un cubo de luz DAPI (Ej: 335-379 nm; Em: 417-477 nm), y CD31/VE-cadherina se detecta utilizando un cubo de luz de proteína fluorescente verde (GFP) (Ej: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Los cubos de luz con un rango de longitud de onda de excitación/emisión similar también son adecuados para estos fluorocromos. Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el microscopio utilizado tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección.

2. Esfuerzo cortante en hSVECs

  1. Preparación
    1. Cubra el portaobjetos de la cámara de flujo con gelatina al 0,1% p/v durante al menos 30 min a 37 °C. Retire el exceso de gelatina antes de sembrar las células.
    2. Equilibrar la unidad fluídica y el conjunto de perfusión estéril con depósitos de 10 ml durante la noche dentro de la incubadora en una atmósfera humidificada de 5% deCO2 a 37 °C.
  2. Experimento de esfuerzo cortante
    1. Semilla 2 x 105 EC suspendidas en 100 μL de medio EC en el portaobjetos de la cámara de flujo recubierta de gelatina. Incubar las células durante 4 h a 37 °C y 5% deCO2 para permitir que las células se adhieran a la superficie de cultivo.
    2. Coloque el equipo de perfusión en la unidad fluídica como se describe en las instrucciones del fabricante. Llene los reservorios y la perfusión en aproximadamente 12 ml de medio celular endotelial completo precalentado. Retire manualmente las burbujas de aire del conjunto de perfusión para equilibrar el nivel de ambos depósitos a 5 ml.
    3. Coloque la unidad fluídica con el conjunto de perfusión montado, sin la corredera de la cámara, en la incubadora y conecte su cable eléctrico a la bomba regulada por computadora. Elimine todas las burbujas de aire de los depósitos y el conjunto de perfusión, ejecutando un protocolo predefinido en el software de control de la bomba.
      NOTA. Es muy importante eliminar las burbujas de aire para que el sistema funcione correctamente.
    4. Tome la unidad fluídica con el conjunto de perfusión montado en la campana de flujo laminar y fije los portaobjetos con una monocapa de celda confluente.
    5. Coloque la unidad fluídica con la perfusión montada y los portaobjetos con celdas en la incubadora y conecte su cable eléctrico a la bomba.
    6. En el software de control de la bomba, configure los siguientes parámetros: viscosidad del medio (0,0072), tipo de portaobjetos, factor de calibración del conjunto de perfusión, velocidad de esfuerzo cortante (20 dina/cm2), tipo de caudal (unidireccional) y tiempo (72 h), e inicie el caudal (consulte las instrucciones del equipo para obtener más detalles). Cosechar las células tratadas con los mismos medios sin exposición al flujo como controles estáticos.
    7. Después de completar el estímulo, lave las células una vez con PBS y proceda a cosechar las muestras de acuerdo con el ensayo requerido. Para la tinción fluorescente, ver paso 2.3.1, y para la extracción de ARN, ver paso 2.3.2.
  3. Demostración de la eficacia del protocolo de esfuerzo cortante
    1. Tinción fluorescente de filamentos de actina (F-actina)
      1. Fijar y permeabilizar las células como se indica en los pasos 1.4.2-1.4.6. Utilice un volumen de 100 μL en el portaobjetos μ.
      2. Teñir la actina F con faloidina marcada con fluorescencia (diluida a 1:200 en PBS) y contrateñir el núcleo con DAPI (concentración final de 1 mg/ml en PBS) durante 2 h en RT, protegido de la luz.
      3. Lavar tres veces con PBS.
      4. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia.
        NOTA: DAPI se detecta con un cubo de luz DAPI (Ej: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) y la faloidina se detecta con un cubo de luz GFP (Ej: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Los cubos de luz con un rango similar de longitud de onda de excitación/emisión también son adecuados para estos fluorocromos. Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el microscopio utilizado tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección.
    2. Expresión génica por transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
      1. Recoja las células del portaobjetos de μ con 350 μL de un tampón de lisis comercial que contiene guanidina-tiocianato. Aísle el ARN total con kits de extracción basados en columnas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
        NOTA: Debido al número limitado de células cultivadas en el portaobjetos de μ, se recomienda el uso de la extracción de ARN basada en columnas.
      2. Prepare el ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc con enzima inversa transcriptasa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      3. Verificar la expresión de los genes regulados por el esfuerzo cortante: KLF2, KLF4 y NOS3. Use el gen del ama de llaves PPIA/ciclofilina para normalizar los resultados. Los cebadores específicos para la reacción se enumeran en la Tabla 1.
      4. Realizar RT-qPCR utilizando un kit de tinción de ADN fluorescente verde SYBR bajo las siguientes condiciones de reacción: i) 50 °C durante 2 min, ii) 95 °C durante 15 min, iii) 94 °C durante 15 s, iv) 60 °C durante 30 s, v) 72 °C durante 30 s. Repita los pasos iii a v durante 40 ciclos. Agregue un paso de fusión al final de la reacción para verificar la especificidad del cebador.

3. Estiramiento cíclico en hSVECs

  1. Preparación
    1. Aplicar lubricante a base de silicona en la parte superior y lateral de la estación de carga equibiaxial de 6 pocillos de 25 mm.
      NOTA: Esto reduce la fricción entre la membrana de la placa de cultivo y la estación, lo que permite una mejor distribución de la tensión cíclica. Este paso debe realizarse antes de cada experimento.
  2. Experimento de estiramiento cíclico
    1. Semilla 4 x 105 células suspendidas en 3 mL a cada pocillo de las placas de cultivo de fondo flexible de 6 pocillos recubiertas con colágeno I (Tabla de materiales). Planifique tener una placa (s) en condición estática como grupo de control. Mantener las células en la incubadora (37 °C en aire humidificado con 5% deCO2) hasta que alcancen el 100% de confluencia (generalmente 48 h después de la siembra). Antes del inicio del protocolo de estiramiento, lave las células una vez con PBS precalentado y agregue 3 ml de medio de cultivo fresco por pocillo.
    2. Inserte la placa base con todas las estaciones de carga lubricadas en la incubadora y conecte adecuadamente el tubo con el equipo controlador del sistema de biorreactor de estiramiento de células de tensión (consulte las instrucciones del equipo para obtener más detalles).
    3. Fije cada placa de cultivo a una junta roja, proporcionada por el sistema de biorreactor de estiramiento de células de tensión. Luego, colóquelos en la placa base dentro de la incubadora.
      1. Asegúrese de que las placas estén completamente asentadas, presionadas y selladas a la placa base para evitar fugas de aire durante el bombeo de vacío. Es importante tener las cuatro placas de cultivo en la placa base para tener el vacío adecuado y la carga de estiramiento.
      2. En caso de tener menos placas experimentales, use una(s) vacía(s) para completar las cuatro posiciones en la placa base. Agregue la lámina de acrílico (suministrada con el equipo) encima de las placas de cultivo para mejorar el sellado de la placa base. Coloque las placas estáticas en la misma incubadora.
    4. Encienda el equipo controlador y el sistema informático. Abra el icono del software y configure el régimen deseado: tamaño de la estación de carga a utilizar, tipo de deformación, porcentaje de elongación, forma de onda, frecuencia y tiempo. Para obtener información detallada, consulte las instrucciones del fabricante. Seleccione y descargue el régimen. Aquí, se utilizó el siguiente régimen: 1/2 forma de onda sinusal, frecuencia de 1 Hz, 5% de elongación (para imitar el estiramiento venoso) y 15% de elongación (para imitar el estiramiento arterial) hasta 72 h.
    5. Encienda el sistema de vacío y haga clic en Inicio en la pantalla de la computadora para ejecutar el estiramiento. Compruebe si la membrana de silicona se está moviendo y estirando las células.
    6. Después de completar el estímulo, lave las células una vez con PBS y proceda a cosechar las muestras de acuerdo con el ensayo requerido. Aquí, para demostrar la efectividad del estiramiento cíclico, recolecte el medio de cultivo hSVEC, manténgalo a -80 ° C para una mayor medición de óxido nítrico (NO) y fije las células para la tinción fluorescente.
      NOTA. La placa base no se puede almacenar dentro de la incubadora cuando no está en uso; De lo contrario, la temperatura puede modificar la forma plana y hacerla inútil.
  3. Demostración de la eficacia del protocolo de estiramiento cíclico
    1. Tinción fluorescente de F-actina
      1. Corrija las celdas como se indica en el paso 1.4.3. Use un volumen de 1 ml por pocillo.
      2. Lave las celdas tres veces con PBS. Mantenga las células en PBS para que no se sequen mientras prepara la membrana de silicona para los próximos pasos.
      3. Use un hisopo de algodón para eliminar el exceso de lubricante a base de silicona de la parte inferior de la membrana. Luego, aplique suavemente el limpiador de ventanas o jabón de manos con un nuevo hisopo de algodón. Repita el proceso hasta que se elimine todo el lubricante de la membrana. Luego, limpie con agua desionizada.
        NOTA. Es importante eliminar completamente el lubricante de la membrana de silicona para tener imágenes de microscopía de buena calidad.
      4. Corte cuidadosamente las membranas de silicona en trozos pequeños para que quepan en portaobjetos de cámara de 8 pocillos para teñir. Permeabilizar las células como se indica en el paso 1.4.5.
      5. Después de los pasos de lavado, tiñe la actina F usando faloidina y el núcleo con DAPI. Proceda al análisis, como se indica en los pasos 2.3.1.2 y 2.3.1.3. Use un volumen de 0.3 ml por pocillo de cámara.
      6. Retire la cámara de medios con el separador. Coloque una gota de medio de montaje de reactivo (50% de glicerol en PBS) y coloque un portaobjetos de vidrio (24 mm x 60 mm).
      7. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia.
        NOTA: DAPI se detecta con un cubo de luz DAPI (Ej: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) y la faloidina se detecta con un cubo de luz de proteína fluorescente roja (RFP) (Ej: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Los cubos de luz con un rango similar de longitud de onda de excitación/emisión también son adecuados para estos fluorocromos. Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el microscopio utilizado tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección.
    2. Medición de NO: estimada por la acumulación de nitrito (NO2) en el medio acondicionado hSVEC mediante un ensayo de quimioluminiscencia reductiva a base de yoduro de potasio
      1. Preparación
        1. Preparar una curva estándar de 0,01-10 mM de solución de nitrito de sodio (NaNO2 en agua ultrapura).
        2. Agregue 5 ml de ácido acético y 1 ml de yoduro de potasio (50 mg en 1 ml de agua ultrapura) en el recipiente de purga del analizador de óxido nítrico.
      2. SIN medición
        1. Añadir 20 μL de la curva estándar NaNO2 en el recipiente de purga del analizador de óxido nítrico. Mítelo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    3. Añadir 20 μL del medio acondicionado en el recipiente de purga del analizador de óxido nítrico. Mítelo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    4. Calcule las concentraciones de NO2 basándose en la calibración de la curva estándar. Ajustar los valores obtenidos por el volumen total del medio acondicionado analizado 6,11.

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Representative Results

Por lo general, los CE adheridos se pueden observar 3-4 días después de la extracción. Los hSVEC inicialmente forman grupos de células y muestran una morfología típica de "adoquines" (Figura 1B). Expresan los marcadores CE CD31 (Figura 1C,D) y VE-cadherina (Figura 1D). Los hSVEC se pueden propagar fácilmente en una placa de cultivo celular tratado no recubierto, y conservan el fenotipo endotelial en cultivo hasta ocho pasajes.

Los hSVEC, cuando se cultivan bajo esfuerzo cortante, se alinean en la dirección del flujo (Figura 2A). El esfuerzo cortante de 20 dyn/cm2 durante 72 h induce la expresión de genes mecanosensibles típicos, KLF2, KLF4 y NOS3, indicando la efectividad del estímulo de cizallamiento en hSVECs (Figura 2B)12,13,14.

El resultado del estiramiento cíclico depende de la intensidad aplicada a los hSVEC. Las células bajo estiramiento bajo muestran un patrón cortical de actina F similar a las células estáticas (Figura 3A), sin cambios en la liberación de NO hasta 72 h (Figura 3B). Los niveles arteriales de estiramiento remodelan el citoesqueleto de actina después de 24 h (Figura 3A) y disminuyen la liberación de NO después de 72 h (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: Las células endoteliales de las venas safenas humanas (hSVEC) exhiben una morfología endotelial típica y una expresión específica del marcador EC. (A) Segmento de vena safena cumplido con solución de colagenasa tipo II para la extracción de CE. (B) Curso temporal representativo del crecimiento de hSVEC después de la extracción. Después de 3-4 días, es posible visualizar grupos de células que proliferan hasta llegar a la confluencia. Barra de escala = 100 μm. (C) Análisis FACS de hSVEC cultivados en el paso 1. La línea verde indica que el 99,7% de la población celular es positiva para el marcador endotelial específico CD31. La línea negra es el control negativo. (D) Inmunotinción para CD31 (verde), (E) VE-cadherina (verde) y núcleos DAPI (azul) en hSVECs en el pasaje 1. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Los hSVEC se alinean en la dirección del flujo y expresan genes mecanosensibles cuando se exponen a un esfuerzo cortante unidireccional. Monocapa de células confluentes de hSVECs cultivadas bajo condiciones de esfuerzo cortante laminar estático o unidireccional. (A) Imágenes de contraste de fase (arriba) y tinción de faloidina (abajo) de hSVECs expuestas a un esfuerzo cortante de 20 dyn/cm2 durante72 h. Verde: filamentos de actina; Azul: núcleos celulares. Barra de escala = 100 μm (contraste de fase) y 20 μm (fluorescencia). (B) Expresión génica de KLF2, KLF4 y NOS3 determinada por qRT-PCR. Los valores representan la media ± SEM. ** p < 0,01 frente al grupo estático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El fenotipo hSVEC bajo estiramiento cíclico depende de la intensidad aplicada. (A) Monocapa de células confluentes de hSVEC cultivadas bajo estiramiento estático, bajo (venoso) o alto (arterial) en una placa inferior flexible durante 24 h. Imágenes de contraste de fase (arriba) y tinción de faloidina (abajo) que muestran las fibras de actina (rojo) y núcleos con DAPI (azul). Barra de escala = 100 μm (contraste de fase) y 50 μm (fluorescencia). (B) La medición de NO se estimó en base a la acumulación de NO2 en los medios de cultivo celular durante 72 h. Los valores representan la media ± SEM. *** p < 0,001 frente al grupo estático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gen Proteína Adelante 5'-3' Reverso 5'-3'
KLF2 Factor 2 similar a Krüppel CCACTCACACCTGCAGCTA GTGGTAGGGCTTCTCACCTG
KLF4 Factor 4 similar a Kruppel CACCTGGCGAGTCTGACATG CAGCGGTTATTCGGGGCAC
NOS3 Óxido nítrico sintasa endotelial GCACAGTTACCAGCTAGCCA GCCGGGGACAGGAAATAGTT
PPIA ciclofilina A, CATTTGGTGCAAGGGTCACA TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC
Peptidilprolil isomerasa A

Tabla 1: cebadores qRT-PCR para esfuerzo cortante y genes de referencia.

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Discussion

El segmento de la vena safena debe tener al menos 2 cm para aislar con éxito los hSVEC. Los segmentos pequeños son difíciles de manejar y atan los extremos del vaso para mantener la solución de colagenasa para aislar las células. La superficie luminal reducida no produce suficientes células para expandir el cultivo. Para minimizar el riesgo de contaminación con no CE, la manipulación del segmento de la vena safena debe ser muy suave durante todo el procedimiento. Es importante tener cuidado al introducir las puntas de la pipeta en las superficies luminales para eliminar la sangre y durante la introducción de la solución de colagenasa. La exposición a la solución enzimática debe estar muy bien controlada (no más de 1 h) para reducir la contaminación del cultivo con no CE. El uso de un medio EC específico complementado con el cóctel de factores de crecimiento es crucial para el crecimiento del cultivo hSVEC. La heparina adicional durante los primeros días de cultivo es importante para reducir los glóbulos rojos residuales del segmento venoso e inhibir la proliferación de células musculares lisas15. Al pasar las células para experimentos o para mantener el cultivo, asegúrese de colocar las células en placa con una confluencia superior al 40%. Las CE necesitan un contacto mínimo para garantizar una buena proliferación y supervivencia. Los hSVEC se pueden cultivar fácilmente en una superficie no recubierta (por ejemplo, gelatina o fibronectina). Sin embargo, el recubrimiento durante los primeros días después de la extracción EC aumentará la adhesión y el rendimiento de EC. Los hSVEC tienen una tasa de proliferación constante y mantienen el fenotipo endotelial hasta ocho pasajes, sin expresar marcadores celulares mesenquimales (como SM22 y calponina). En nuestra experiencia, la tasa de proliferación puede variar dependiendo del donante de tejido, pero no con un pasaje celular. Se recomienda criopreservar hSVECs en FBS con DMSO al 5% para aumentar la viabilidad después de descongelar las células.

Para llevar a cabo un experimento de esfuerzo cortante, hay pasos críticos a considerar. Para evitar la formación de burbujas de aire en el interior del sistema, el conjunto de perfusión y los conectores deben equilibrarse durante la noche a 37 °C y 5% deCO2. Las burbujas pueden bloquear el flujo a través del sistema o dañar la monocapa endotelial interfiriendo con el fenotipo celular. Al sembrar las células en el portaobjetos de la cámara de flujo, se recomienda tenerlo confluente para usar después de 4 h o al día siguiente. Además, es obligatorio cambiar el medio de la diapositiva todos los días en condiciones estáticas si el experimento se ejecuta durante varios días. El volumen del portaobjetos de la cámara de flujo es ~160 μL, y no es suficiente para mantener las células durante largos períodos de cultivo. El sistema tiene la ventaja de observar fácilmente las células por microscopía (campo claro/contraste de fase o tinción para microscopía de fluorescencia). La limitación es el bajo rendimiento de proteínas (20-25 μg/portaobjetos) y ARN (1 μg/portaobjetos). Para superar esto, el sistema permite la conexión de varias guías en una serie utilizando la misma unidad fluídica (consulte las instrucciones del fabricante). Luego, es posible usar el volumen del tampón de lisis para un portaobjetos para extraer la proteína o ARN de varios portaobjetos.

El sistema de estiramiento es fácil de manejar y permite la aplicación de diferentes intensidades y tipos de estiramiento. Es importante lubricar todas las estaciones de carga antes de cada experimento para reducir la fricción entre la membrana de la placa de cultivo y la estación y garantizar una distribución adecuada de la deformación cíclica. Asegúrese de que las placas estén completamente selladas a la placa base para producir el vacío necesario para alcanzar el estiramiento deseado. El estímulo equiaxial no produce una tensión uniforme dentro del pozo. Las celdas en el borde del pozo deben descartarse, según lo indicado por el fabricante. El área de interés de la membrana se determina en función del diámetro de la estación de carga y el porcentaje de alargamiento. Es posible realizar la inmunotinción en toda la membrana o cortarla en trozos más pequeños para reducir la cantidad de anticuerpos utilizados en el ensayo. En este caso, las membranas deben manejarse con mucho cuidado, evitando daños a las células. Los investigadores también deben tener cuidado de no voltear la membrana al revés y perder las células mientras se hace la tinción. Siempre es posible confirmar la cara correcta de la membrana con las células bajo microscopía óptica.

La principal limitación de los estudios in vitro como estos es que no recapitulan completamente el entorno in vivo . Por esta razón, es importante realizar siempre análisis para garantizar que las hSVEC mantengan el fenotipo EC (expresando marcadores CE) y reproduzcan los resultados esperados bajo estrés mecánico (orientación de la actina F y regulación/producción de proteínas de respuesta mecánica).

En resumen, proporcionamos un procedimiento detallado para aislar los hSVEC y exponerlos a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento. Cuando un injerto SV se expone repentinamente a afecciones arteriales después de la CABG, se produce daño endotelial y contribuye al fracaso del injerto. Estos protocolos pueden ser fundamentales para avanzar en nuestra comprensión de cómo las fuerzas mecánicas influyen en la disfunción hSVEC asociada con la enfermedad del injerto venoso.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

JEK cuenta con el apoyo de donaciones de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 y 2013/17368-0] y del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 y 309179/2013-0). La AAM cuenta con el apoyo de donaciones de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) y del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution Gibco 25200072
15 µ slide I 0.4 Luer  Ibidi 80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) Thermo Fisher Scientific D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm  Flexcell International Corporation LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well Thermo Fisher Scientific 154453
Acetic Acid (Glacial) Millipore 100063
Acrylic sheet 1 cm thick Plexiglass
Anti-CD31 antibody Abcam ab24590
Anti-CD31, FITC antibody Thermo Fisher Scientific MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody Cell Signaling 2500
Bioflex plates collagen I Flexcell International Corporation BF3001C
Bovine serum albumin solution Sigma-Aldrich A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm Brasuture AP524
Cyclophilin forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Cyclophilin reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
EBM-2 basal medium Lonza CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements Lonza CC4176
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2657-029
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma-Aldrich F4680
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL Blau Farmacêutica SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) Ibidi 10902
KLF2 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF2 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer Sievers Instruments NOA-280i-1
NOS3 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOS3 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs Ibidi 10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031
Potassium Iodide Sigma-Aldrich 221945
QuanTitec SYBR green PCR kit Qiagen 204143
QuantStudio 12K flex platform  Applied Biosystems 4471087
RNeasy micro kit  Quiagen 74004
Slide glass (24 mm x 60 mm) Knittel Glass VD12460Y1D.01
Sodium nitrite Sigma-Aldrich 31443
SuperScript IV first-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18091200
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypan blue stain 0.4% Gibco 15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C6885

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References

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
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  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
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Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento
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