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Medicine

Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65122
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg
* These authors contributed equally

Summary

Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Forniamo anche metodi dettagliati per produrre stress di taglio e allungamento per studiare lo stress meccanico nelle hSVEC.

Abstract

La chirurgia dell'innesto di bypass coronarico (CABG) è una procedura per rivascolarizzare il miocardio ischemico. La vena safena rimane utilizzata come condotto CABG nonostante la ridotta pervietà a lungo termine rispetto ai condotti arteriosi. Il brusco aumento dello stress emodinamico associato all'arterializzazione dell'innesto provoca danni vascolari, in particolare l'endotelio, che possono influenzare la bassa pervietà dell'innesto della vena safena (SVG). Qui, descriviamo l'isolamento, la caratterizzazione e l'espansione delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Le cellule isolate dalla digestione della collagenasi mostrano la tipica morfologia del ciottolo ed esprimono i marcatori delle cellule endoteliali CD31 e VE-caderina. Per valutare l'influenza dello stress meccanico, in questo studio sono stati utilizzati protocolli per studiare i due principali stimoli fisici, sforzo di taglio e allungamento, su SVG arterializzati. Le hSVEC sono coltivate in una camera di flusso a piastre parallele per produrre stress di taglio, mostrando allineamento nella direzione del flusso e una maggiore espressione di KLF2, KLF4 e NOS3. Le hSVEC possono anche essere coltivate in una membrana di silicio che consente l'allungamento cellulare controllato che imita l'allungamento venoso (basso) e arterioso (alto). Il pattern F-actina delle cellule endoteliali e la secrezione di ossido nitrico (NO) sono modulati di conseguenza dall'allungamento arterioso. In sintesi, presentiamo un metodo dettagliato per isolare le hSVEC per studiare l'influenza dello stress meccanico emodinamico su un fenotipo endoteliale.

Introduction

La disfunzione delle cellule endoteliali (EC) è un attore chiave nel fallimento dell'innesto di vena safena 1,2,3,4. L'aumento sostenuto dello sforzo di taglio e dello stiramento ciclico induce il fenotipo proinfiammatorio delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC)3,4,5,6. I percorsi molecolari sottostanti non sono ancora completamente compresi e protocolli standardizzati per studi in vitro possono sfruttare gli sforzi per nuove intuizioni nell'area. Qui, descriviamo un semplice protocollo per isolare, caratterizzare ed espandere le hSVEC e come esporle a livelli variabili di stress da taglio e allungamento ciclico, imitando le condizioni emodinamiche venose e arteriose.

Le hSVEC sono isolate mediante incubazione della collagenasi e possono essere utilizzate fino al passaggio 8. Questo protocollo richiede meno manipolazione del vaso rispetto agli altri protocolli disponibili7, che riduce la contaminazione con cellule muscolari lisce e fibroblasti. D'altra parte, richiede un segmento di vaso più grande di almeno 2 cm per avere un'estrazione EC efficiente. In letteratura, è stato riportato che le EC da grandi navi possono anche essere ottenute mediante rimozione meccanica 7,8. Sebbene efficace, l'approccio fisico presenta gli svantaggi di una bassa resa EC e di una maggiore contaminazione da fibroblasti. Per aumentare la purezza, sono necessari ulteriori passaggi utilizzando sfere magnetiche o smistamento cellulare, aumentando il costo del protocollo a causa dell'acquisizione di perline e anticorpi 7,8. Il metodo enzimatico ha risultati più rapidi e migliori per quanto riguarda la purezza e la vitalità CE 7,8.

Le EC più frequentemente utilizzate per studiare la disfunzione endoteliale sono le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). È noto che il fenotipo EC cambia in diversi letti vascolari, ed è essenziale sviluppare metodi che rappresentino il vaso in esame 9,10. A questo proposito, l'istituzione di un protocollo per isolare una hSVEC e coltivarla sotto stress meccanico è uno strumento prezioso per comprendere il contributo della disfunzione hSVEC nella malattia del trapianto venoso.

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Protocol

Segmenti inutilizzati di vene safene sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia di bypass aortocoronarico presso l'Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Tutti gli individui hanno dato il consenso informato a partecipare allo studio, che è stato esaminato e approvato dal comitato etico locale.

1. Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule endoteliali primarie della vena safena umana (hSVECs)

  1. Preparazione
    1. Autoclave un paio di pinze dritte o curve e forbici di tessuto (7-8 cm).
    2. Preparare la gelatina sterile. Mescolare 0,1 g (0,1% p/v) o 3 g (3% p/v) di gelatina suina con 100 ml di acqua ultrapura, in autoclave per 15 minuti e conservare a 4 °C. Riscaldare a 37 °C per liquefare prima di rivestire le piastre e i vetrini di coltura cellulare.
    3. Preparare collagenasi sterile (1 mg/ml) all'interno della cappa a flusso laminare. Diluire la collagenasi in PBS e sterilizzarla con un filtro da 0,2 μm.
    4. Rivestire un piatto di coltura cellulare da 60 mm e un vetrino a 8 pozzetti con gelatina allo 0,1% p/v per almeno 30 minuti a 37 °C. Rimuovere la gelatina in eccesso prima di seminare le cellule.
    5. Preparare un mezzo cellulare endoteliale completo: mezzo basale di crescita delle cellule endoteliali (EBM-2) integrato con fattori di crescita EGM2.
      NOTA: I fattori di crescita EGM2 sono forniti in kit da una società elencata nella tabella dei materiali. La concentrazione dei fattori non è divulgata dalla società.
    6. Produrre soluzioni di sieroalbumina bovina al 2% e al 5% (BSA), paraformaldeide (PFA) al 4% e Triton X-100 allo 0,1%, il tutto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  2. Isolamento e cultura delle hSVEC
    1. Raccogliere almeno un segmento di vena safena lungo almeno 2-3 cm per questa procedura.
      NOTA. Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in condizioni sterili e all'interno di una cappa a flusso laminare.
    2. Trasferire il segmento di vena in una capsula di Petri riempita con PBS preriscaldato. Inserire una punta di pipetta in un'estremità della vena e sciacquare delicatamente con PBS per rimuovere tutto il sangue all'interno del lume. Sciacquare fino a quando il flusso di lavaggio diventa completamente chiaro.
    3. Chiudere una delle estremità della vena con una sutura di cotone sterile. Riempire accuratamente il recipiente con 1 mg/mL di soluzione di collagenasi di tipo II. Chiudere l'altra estremità del recipiente con una sutura di cotone (Figura 1A). Incubare il recipiente con una soluzione di collagenasi in atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C per 1 ora.
    4. Successivamente, tagliare una delle estremità della nave all'interno di un tubo da 15 ml e raccogliere la soluzione di collagenasi. Tagliare l'altra estremità e lavare la superficie luminale con 1-2 ml di PBS per raccogliere tutti gli EC staccati. Mettere tutto il PBS insieme con la soluzione di collagenasi all'interno dello stesso tubo.
    5. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per pellettare le celle.
      NOTA. Il pellet cellulare è molto piccolo e difficile da visualizzare. Se il sangue non viene completamente rimosso prima del trattamento con collagenasi (fase 1.2.2.), anche le cellule del sangue precipiteranno e il pellet sarà rossastro.
    6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3-4 ml di mezzo cellulare endoteliale completo (EBM-2 integrato con fattori di crescita EGM2) e una soluzione aggiuntiva di eparina (5 U/mL, concentrazione finale). Placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 60 mm pre-rivestito con gelatina al 3% p/v.
      NOTA: La gelatina è stata la prima scelta grazie alla sua facilità di accessibilità e basso costo. Poiché il rivestimento con gelatina mantiene con successo il fenotipo CE, non è stata testata nessun'altra sostanza di rivestimento. Il collagene e la fibronectina possono essere testati in studi volti a studiare l'influenza di diversi componenti della matrice extracellulare sull'adesione EC e sul fenotipo.
    7. Incubare le celle a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 per 4 giorni senza cambiare il mezzo. Dopodiché, cambia i media a giorni alterni. Da questo momento in poi, l'integrazione di mezzi cellulari aggiuntivi con eparina non è più necessaria. Esaminare la piastra al microscopio per assicurarsi che i globuli rossi siano stati rimossi.
    8. Dopo 3-10 giorni dall'estrazione, a seconda delle dimensioni e del diametro del segmento venoso, visualizzare le hSVEC mediante microscopia a contrasto di fase.
    9. Valutare il grado di confluenza e la loro morfologia di ciottoli in microscopia a contrasto di fase.
    10. Continuare a cambiare il supporto ogni 2 giorni fino a quando le celle raggiungono il 70% -80% di confluenza.
    11. Far passare le hSVEC con una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25% di tripsina-0,02%.
      1. Lavare le celle con PBS preriscaldato.
      2. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA al piatto di coltura cellulare da 60 mm. Incubare a 37 °C per 2 minuti o fino al distacco di tutte le cellule.
      3. Aggiungere 2 ml di mezzo completo di cellule endoteliali per inattivare la tripsina.
      4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT.
      5. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura.
      6. Contare la sospensione cellulare in blu tripano 1:1 (0,4%) per placcare le cellule vitali.
      7. Per espandere la coltura, placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 100 mm con 10 ml di mezzo cellulare endoteliale completo preriscaldato e coltivarlo a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
        NOTA. In media, la semina di 4 x 104 hSVEC/cm2 sarà confluente al 100% dopo 48 ore.
    12. Per crioconservare le cellule, risospendere il pellet dal punto 1.2.11.5 in 5% di dimetilsolfossido (DMSO) nel siero fetale bovino (FBS) e conservare in azoto liquido.
  3. Caratterizzazione delle hSVEC: colorazione con citometria a flusso per CD31
    1. Trasferire 1 x 10 5 hSVEC in una provetta da1,5 mL e centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di PBS contenente il 2% di BSA e anticorpo monoclonale CD31-FITC (1:100).
    2. Macchiare le celle per 30 minuti a RT al buio.
    3. Lavare le cellule colorate aggiungendo 0,5 ml di PBS e centrifugarle a 300 x g per 3 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 400 μL di PBS con il 2% di BSA.
    4. Utilizzare hSVEC non etichettate, senza anticorpi CD31, come controllo negativo.
    5. Procedere all'analisi di acquisizione del citometro a flusso utilizzando un laser blu e un canale FITC (eccitazione/emissione max [Ex/Em] di 498/517 nm). Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il citometro dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento. Separare le cellule dai detriti in funzione delle loro dimensioni e granularità, quindi eliminare le singole celle mediante dispersione in avanti e dispersione laterale.
  4. Caratterizzazione delle hSVEC: colorazione fluorescente per CD31 e VE-caderina
    1. Piastra 0,1 x 105 celle nel vetrino a 8 pozzetti rivestito di gelatina. Incubare le cellule per una notte a 37 °C, 5 % CO2, per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie di coltura.
    2. Rimuovere il mezzo e lavare le celle una volta con PBS.
    3. Aggiungere 0,3 ml / pozzetto di PFA al 4% per fissare le cellule. Incubare per 15 minuti a RT.
    4. Lavare tre volte con PBS.
    5. Aggiungere 0,3 mL/pozzetto di soluzione Triton X-100 allo 0,1% per permeabilizzare le cellule. Incubare per 15 minuti a RT.
    6. Lavare tre volte con PBS.
    7. Per bloccare i siti di legame anticorpale non specifici, aggiungere 0,3 ml / pozzetto di soluzione BSA al 5% alle cellule. Incubare per 15 minuti a RT.
    8. Lavare tre volte con PBS.
    9. Incubare le cellule con gli anticorpi primari (CD31 e VE-caderina, 1:100) diluiti in PBS con 2% di BSA durante la notte con oscillazione delicata a 4 °C. Lasciare un pozzo in incubazione con PBS con BSA al 2% (nessun anticorpo primario) come controllo negativo.
    10. Lavare tre volte con PBS.
    11. Incubare le cellule con anticorpi secondari marcati con fluorescenza diluiti (1:500) in PBS per 1 ora a RT. Aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la colorazione nucleare ad una concentrazione finale di 1 mg/ml.
    12. Lavare tre volte con PBS.
    13. Rimuovere la camera dei supporti con il separatore. Posizionare una goccia del reagente del mezzo di montaggio (50% di glicerolo in PBS) e posizionare un vetrino (24 mm x 60 mm) evitando di intrappolare le bolle.
    14. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza.
      NOTA: DAPI viene rilevato con un cubo luminoso DAPI (Es: 335-379 nm; Em: 417-477 nm), e la CD31/VE-caderina viene rilevata utilizzando un cubo luminoso di proteina fluorescente verde (GFP) (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Anche i cubi luminosi con una gamma di lunghezze d'onda di eccitazione / emissione simili sono adeguati per questi fluorocromi. Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il microscopio utilizzato dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento.

2. Sforzo di taglio sulle hSVEC

  1. Preparazione
    1. Rivestire il vetrino della camera di flusso con gelatina allo 0,1% p/v per almeno 30 minuti a 37 °C. Rimuovere la gelatina in eccesso prima di seminare le cellule.
    2. Equilibrare l'unità fluidica e il set di perfusione sterile con serbatoi da 10 ml durante la notte all'interno dell'incubatore in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 a 37 °C.
  2. Esperimento di sforzo di taglio
    1. Seme 2 x 105 EC sospeso in 100 μL di terreno EC nel vetrino della camera di flusso rivestito di gelatina. Incubare le cellule per 4 ore a 37 °C e 5% di CO2 per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie di coltura.
    2. Posizionare il set di perfusione sull'unità fluidica come descritto nelle istruzioni del produttore. Riempire i serbatoi e la perfusione impostata in circa 12 ml di mezzo cellulare endoteliale completo preriscaldato. Rimuovere manualmente le bolle d'aria dal set di perfusione per equilibrare il livello di entrambi i serbatoi a 5 ml.
    3. Posizionare l'unità fluidica con il set di perfusione montato, senza la slitta della camera, nell'incubatore e collegare il suo cavo elettrico alla pompa regolata dal computer. Rimuovere tutte le bolle d'aria dai serbatoi e dal set di perfusione, eseguendo un protocollo predefinito nel software di controllo della pompa.
      NOTA. È molto importante rimuovere le bolle d'aria affinché il sistema funzioni correttamente.
    4. Prendere l'unità fluidica con la perfusione montata impostata sulla cappa a flusso laminare e fissare i vetrini con un monostrato a cella confluente.
    5. Posizionare l'unità fluidica con la perfusione montata e le guide con le celle nell'incubatore e collegare il suo cavo elettrico alla pompa.
    6. Nel software di controllo della pompa, impostare i seguenti parametri: viscosità del fluido (0,0072), tipo di slitta, fattore di calibrazione del set di perfusione, velocità di sollecitazione di taglio (20 dyn/cm2), tipo di flusso (unidirezionale) e tempo (72 h) e avviare il flusso (vedere le istruzioni dell'apparecchiatura per ulteriori dettagli). Raccogliere le cellule trattate con gli stessi mezzi senza esposizione al flusso come controlli statici.
    7. Dopo che lo stimolo è completato, lavare le cellule una volta con PBS e procedere alla raccolta dei campioni secondo il test richiesto. Per la colorazione fluorescente, vedere il punto 2.3.1, e per l'estrazione dell'RNA, vedere il punto 2.3.2.
  3. Dimostrazione dell'efficacia del protocollo di sforzo di taglio
    1. Colorazione fluorescente dei filamenti di actina (F-actina)
      1. Fissare e permeabilizzare le cellule come indicato nei punti 1.4.2-1.4.6. Utilizzare un volume di 100 μL nel vetrino μ.
      2. Colorare la F-actina con falloidina marcata con fluorescenza (diluita a 1:200 in PBS) e controcolorare il nucleo con DAPI (concentrazione finale di 1 mg/ml in PBS) per 2 ore a RT, al riparo dalla luce.
      3. Lavare tre volte con PBS.
      4. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza.
        NOTA: DAPI viene rilevato con un cubo luminoso DAPI (Es: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) e la falloidina viene rilevata con un cubo luminoso GFP (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Anche i cubi di luce con una gamma simile di lunghezza d'onda di eccitazione / emissione sono adeguati per questi fluorocromi. Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il microscopio utilizzato dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento.
    2. Espressione genica mediante trascrizione inversa quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
      1. Raccogliere le cellule dal vetrino μ con 350 μL di un tampone commerciale di lisi contenente guanidina-tiocianato. Isolare l'RNA totale con kit di estrazione basati su colonne, secondo le istruzioni del produttore.
        NOTA: A causa del numero limitato di cellule coltivate nel vetrino μ, si raccomanda l'uso dell'estrazione basata su colonne di RNA.
      2. Preparare il cDNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA con enzima inverso trascrittasi, secondo le istruzioni del produttore.
      3. Verificare l'espressione dei geni regolati dallo sforzo di taglio: KLF2, KLF4 e NOS3. Utilizzare il gene governante PPIA / ciclofilina per normalizzare i risultati. I primer specifici per la reazione sono elencati nella Tabella 1.
      4. Eseguire RT-qPCR utilizzando un kit di colorazione di DNA fluorescente verde SYBR nelle seguenti condizioni di reazione: i) 50 °C per 2 min, ii) 95 °C per 15 min, iii) 94 °C per 15 s, iv) 60 °C per 30 s, v) 72 °C per 30 s. Ripetere i passaggi da iii a v per 40 cicli. Aggiungere una fase di fusione alla fine della reazione per verificare la specificità del primer.

3. Allungamento ciclico su hSVEC

  1. Preparazione
    1. Applicare lubrificante a base di silicone sulle parti superiori e laterali della stazione di carico equibiassiale a 6 pozzetti da 25 mm.
      NOTA: Questo riduce l'attrito tra la membrana della piastra di coltura e la stazione, consentendo una migliore distribuzione della deformazione ciclica. Questo passaggio deve essere fatto prima di ogni esperimento.
  2. Esperimento di allungamento ciclico
    1. Seme 4 x 105 cellule sospese in 3 ml a ciascun pozzetto delle piastre di coltura a fondo flessibile a 6 pozzetti rivestite con collagene I (Tabella dei materiali). Pianificare di avere una o più piastre in condizioni statiche come gruppo di controllo. Tenere le celle nell'incubatore (37 °C in aria umidificata con 5% di CO2) fino a quando non raggiungono il 100% di confluenza (di solito 48 ore dopo la semina). Prima dell'inizio del protocollo di allungamento, lavare le cellule una volta con PBS preriscaldato e aggiungere 3 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto.
    2. Inserire la piastra di base con tutte le stazioni di carico lubrificate nell'incubatore e collegare opportunamente il tubo con l'apparecchiatura di controllo del sistema di allungamento del bioreattore della cella di trazione (vedere le istruzioni dell'apparecchiatura per ulteriori dettagli).
    3. Attaccare ogni piastra di coltura a una guarnizione rossa, fornita dal sistema di allungamento del bioreattore della cella di tensione. Quindi, inseriscili nella piastra di base all'interno dell'incubatore.
      1. Assicurarsi che le piastre siano completamente posizionate, pressate e sigillate alla piastra di base per evitare perdite d'aria durante il pompaggio del vuoto. È importante avere tutte e quattro le piastre di coltura nella piastra di base per avere il vuoto e il carico di allungamento appropriati.
      2. In caso di numero inferiore di piastre sperimentali, utilizzarne una vuota per completare le quattro posizioni nella piastra di base. Aggiungere il foglio acrilico (fornito con l'apparecchiatura) sopra le piastre di coltura per migliorare la tenuta della piastra di base. Posizionare le piastre statiche nella stessa incubatrice.
    4. Accendere l'apparecchiatura del controller e il sistema informatico. Aprire l'icona del software e configurare il regime desiderato: dimensioni della stazione di carico da utilizzare, tipo di deformazione, percentuale di allungamento, forma d'onda, frequenza e tempo. Per informazioni dettagliate, consultare le istruzioni del produttore. Seleziona e scarica il regime. Qui è stato utilizzato il seguente regime: forma d'onda sinusale 1/2, frequenza 1 Hz, 5% di allungamento (per imitare l'allungamento venoso) e 15% di allungamento (per imitare l'allungamento arterioso) fino a 72 ore.
    5. Accendere il sistema di aspirazione e fare clic su Start sullo schermo del computer per eseguire lo stretching. Controlla se la membrana di silicone si muove e allunga le cellule.
    6. Dopo che lo stimolo è completato, lavare le cellule una volta con PBS e procedere alla raccolta dei campioni secondo il test richiesto. Qui, per dimostrare l'efficacia dell'allungamento ciclico, raccogliere il terreno di coltura hSVEC, mantenerlo a -80 °C per ulteriori misurazioni dell'ossido nitrico (NO) e fissare le cellule per la colorazione fluorescente.
      NOTA. La piastra di base non può essere conservata all'interno dell'incubatore quando non viene utilizzata; Altrimenti, la temperatura può modificare la forma piatta e renderla inutilizzabile.
  3. Dimostrazione dell'efficacia del protocollo cyclic stretch
    1. Colorazione fluorescente di F-actina
      1. Fissare le celle come indicato al punto 1.4.3. Utilizzare un volume di 1 mL per pozzetto.
      2. Lavare le celle tre volte con PBS. Mantenere le cellule in PBS in modo che non si asciughino mentre si prepara la membrana di silicone per i passaggi successivi.
      3. Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere il lubrificante a base di silicone in eccesso dal fondo della membrana. Quindi, applicare delicatamente il detergente per vetri o il sapone per le mani con un nuovo batuffolo di cotone. Ripetere il processo fino a quando tutto il lubrificante viene rimosso dalla membrana. Quindi, pulire con acqua deionizzata.
        NOTA. È importante rimuovere completamente il lubrificante dalla membrana siliconica per avere immagini al microscopio di buona qualità.
      4. Tagliare con cura le membrane siliconiche in piccoli pezzi per adattarle ai vetrini a 8 pozzetti per la colorazione. Permeabilizzare le cellule come indicato al punto 1.4.5.
      5. Dopo le fasi di lavaggio, colorare la F-actina usando la falloidina e il nucleo con DAPI. Procedere all'analisi, come indicato nei punti 2.3.1.2 e 2.3.1.3. Utilizzare un volume di 0,3 ml per camera pozzetto.
      6. Rimuovere la camera dei supporti con il separatore. Posizionare una goccia di reagente del mezzo di montaggio (50% di glicerolo in PBS) e posizionare un vetrino (24 mm x 60 mm).
      7. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza.
        NOTA: DAPI viene rilevato con un cubo luminoso DAPI (Es: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) e la falloidina viene rilevata con un cubo luminoso a proteina fluorescente rossa (RFP) (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Anche i cubi di luce con una gamma simile di lunghezza d'onda di eccitazione / emissione sono adeguati per questi fluorocromi. Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il microscopio utilizzato dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento.
    2. Misura di NO stimata dall'accumulo di nitriti (NO2) nel mezzo condizionato hSVEC utilizzando un saggio di chemiluminescenza riduttiva a base di ioduro di potassio
      1. Preparazione
        1. Preparare una curva standard da 0,01-10 mM di soluzione di nitrito di sodio (NaNO2 in acqua ultrapura).
        2. Aggiungere 5 mL di acido acetico e 1 mL di ioduro di potassio (50 mg in 1 mL di acqua ultrapura) nel recipiente di spurgo dell'analizzatore di ossido nitrico.
      2. NESSUNA misurazione
        1. Aggiungere 20 μL della curva standard NaNO2 nel recipiente di spurgo dell'analizzatore di ossido nitrico. Misurarlo secondo il protocollo del produttore.
    3. Aggiungere 20 μL del mezzo condizionato nel recipiente di spurgo dell'analizzatore di ossido nitrico. Misurarlo secondo il protocollo del produttore.
    4. Calcolare le concentrazioni di NO2 in base alla calibrazione della curva standard. Regolare i valori ottenuti dal volume totale del mezzo condizionato analizzato 6,11.

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Representative Results

Tipicamente, le EC aderenti possono essere osservate 3-4 giorni dopo l'estrazione. Le hSVEC formano inizialmente gruppi di cellule e mostrano una tipica morfologia "ciottolata" (Figura 1B). Esprimono i marcatori EC CD31 (Figura 1C,D) e VE-caderina (Figura 1D). Le hSVEC possono essere facilmente propagate su un piatto di coltura cellulare trattata non rivestita e mantengono il fenotipo endoteliale in coltura fino a otto passaggi.

Le hSVEC, quando coltivate sotto sforzo di taglio, si allineano nella direzione del flusso (Figura 2A). Lo sforzo di taglio di 20 dyn/cm2 per 72 h induce l'espressione di geni meccanosensibili tipici, KLF2, KLF4 e NOS3, indicando l'efficacia dello stimolo di taglio nelle hSVEC (Figura 2B)12,13,14.

Il risultato dell'allungamento ciclico dipende dall'intensità applicata alle hSVEC. Le cellule a basso allungamento mostrano un pattern corticale F-actina simile alle cellule statiche (Figura 3A), senza cambiamenti nel rilascio di NO fino a 72 ore (Figura 3B). I livelli arteriosi di allungamento rimodellano il citoscheletro di actina dopo 24 ore (Figura 3A) e diminuiscono il rilascio di NO dopo 72 ore (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: Le cellule endoteliali delle vene safene umane (hSVEC) presentano una morfologia endoteliale tipica e un'espressione specifica dei marcatori EC. (A) Segmento di vena safena realizzato con soluzione di collagenasi di tipo II per l'estrazione di EC . (B) Andamento rappresentativo della crescita di hSVEC dopo l'estrazione. Dopo 3-4 giorni, è possibile visualizzare gruppi di cellule che proliferano fino a raggiungere la confluenza. Barra di scala = 100 μm. (C) Analisi FACS di hSVEC in coltura al passaggio 1. La linea verde indica che il 99,7% della popolazione cellulare è positiva per il marcatore endoteliale-specifico CD31. La linea nera è il controllo negativo. (D) Immunocolorazione per CD31 (verde), (E) VE-caderina (verde) e nuclei DAPI (blu) in hSVEC al passaggio 1. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Le hSVEC si allineano nella direzione del flusso ed esprimono geni meccanosensibili quando esposte a sollecitazioni di taglio unidirezionali. Monostrato a cellule confluenti di hSVEC coltivato in condizioni di sforzo di taglio laminare statico o unidirezionale. (A) Immagini a contrasto di fase (in alto) e colorazione alla falloidina (in basso) di hSVEC esposte a uno sforzo di taglio di 20 dyn/cm2 per 72 h. Verde: filamenti di actina; Blu: nuclei cellulari. Barra di scala = 100 μm (contrasto di fase) e 20 μm (fluorescenza). (B) Espressione genica di KLF2, KLF4 e NOS3 determinata mediante qRT-PCR. I valori rappresentano la media ± SEM. ** p < 0,01 rispetto al gruppo statico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Il fenotipo hSVEC sotto tratto ciclico dipende dall'intensità applicata . (A) Monostrato a cellule confluenti di hSVEC coltivato in fase statica, bassa (venosa) o alta (arteriosa) in una piastra inferiore flessibile per 24 ore. Immagini a contrasto di fase (in alto) e colorazione alla falloidina (in basso) che mostrano le fibre di actina (rosso) e i nuclei con DAPI (blu). Barra di scala = 100 μm (contrasto di fase) e 50 μm (fluorescenza). (B) La misurazione di NO è stata stimata sulla base dell'accumulo di NO2 nei terreni di coltura cellulare per 72 ore. I valori rappresentano la media ± SEM. *** p < 0,001 rispetto al gruppo statico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gene Proteina Avanti 5'-3' Inversa 5'-3'
KLF2 Fattore 2 simile a Krüppel CCACTCACACCTGCAGCTA GTGGTAGGGCTTCTCACCTG
KLF4 Fattore 4 simile a Kruppel CACCTGGCGAGTCTGACATG CAGCGGTTATTCGGGGCAC
NOS3 Ossido nitrico sintasi, endoteliale GCACAGTTACCAGCTAGCCA GCCGGGGACAGGAAATAGTT
PPIA Ciclofilina A, CATTTGGTGCAAGGGTCACA TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC
Peptidilprolil isomerasi A

Tabella 1: primer qRT-PCR per lo sforzo di taglio e geni di riferimento.

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Discussion

Il segmento della vena safena deve essere di almeno 2 cm per isolare con successo le hSVEC. Piccoli segmenti sono difficili da gestire e legano le estremità del vaso per mantenere la soluzione di collagenasi per isolare le cellule. La ridotta superficie luminale non produce cellule sufficienti per espandere la coltura. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione con non-EC, la manipolazione del segmento della vena safena deve essere molto delicata durante l'intera procedura. È importante prestare attenzione quando si introducono le punte delle pipette nelle superfici luminali per rimuovere il sangue e durante l'introduzione della soluzione di collagenasi. L'esposizione alla soluzione enzimatica deve essere molto ben controllata (non più di 1 ora) per ridurre la contaminazione della coltura con non-EC. L'uso di uno specifico terreno EC integrato con il cocktail dei fattori di crescita è cruciale per la crescita della coltura hSVEC. L'eparina aggiuntiva durante i primi giorni di coltura è importante per ridurre i globuli rossi residui dal segmento venoso e per inibire la proliferazione delle cellule muscolari lisce15. Quando si passano le cellule per esperimenti o per mantenere la coltura, assicurarsi di placcare le cellule con una confluenza superiore al 40%. Le CE hanno bisogno di contatti minimi per garantire una buona proliferazione e sopravvivenza. Le hSVEC possono essere facilmente coltivate su una superficie non rivestita (ad esempio, gelatina o fibronectina). Tuttavia, il rivestimento durante i primi giorni dopo l'estrazione EC aumenterà l'adesione e la resa EC. Le hSVEC hanno un tasso di proliferazione costante e mantengono il fenotipo endoteliale fino a otto passaggi, senza esprimere marcatori cellulari mesenchimali (come SM22 e calponina). Nella nostra esperienza, il tasso di proliferazione può variare a seconda del donatore di tessuto ma non con un passaggio cellulare. Si raccomanda di crioconservare le hSVEC in FBS con DMSO al 5% per aumentare la vitalità dopo lo scongelamento delle cellule.

Per condurre un esperimento di sforzo di taglio, ci sono passaggi critici da considerare. Per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del sistema, il set di perfusione e i connettori devono essere bilanciati durante la notte a 37 °C e al 5% di CO2. Le bolle possono bloccare il flusso attraverso il sistema o danneggiare il monostrato endoteliale interferendo con il fenotipo cellulare. Quando si seminano le cellule nel vetrino della camera di flusso, si consiglia di averlo confluente da utilizzare dopo 4 ore o il giorno successivo. Inoltre, è obbligatorio cambiare il mezzo della diapositiva ogni giorno in condizioni statiche se l'esperimento viene eseguito per diversi giorni. Il volume del vetrino della camera di flusso è ~ 160 μL e non è sufficiente per mantenere le cellule per lunghi periodi di coltura. Il sistema ha il vantaggio di osservare prontamente le cellule al microscopio (contrasto di fase in campo chiaro/fase o colorazione per microscopia a fluorescenza). Il limite è la bassa resa di proteine (20-25 μg/vetrino) e RNA (1 μg/vetrino). Per ovviare a questo, il sistema consente il collegamento di più vetrini in serie utilizzando la stessa unità fluidica (vedere le istruzioni del produttore). Quindi, è possibile utilizzare il volume del tampone di lisi per un vetrino per estrarre la proteina o l'RNA da diversi vetrini.

Il sistema di allungamento è maneggevole e permette l'applicazione di diverse intensità e tipi di stretching. È importante lubrificare tutte le stazioni di carico prima di ogni esperimento per ridurre l'attrito tra la membrana della piastra di coltura e la stazione e garantire una corretta distribuzione della deformazione ciclica. Assicurarsi che le piastre siano completamente sigillate alla piastra di base per produrre il vuoto necessario per raggiungere l'allungamento desiderato. Lo stimolo equiassiale non produce una tensione uniforme all'interno del pozzo. Le celle sul bordo del pozzo devono essere scartate, come indicato dal produttore. L'area di interesse della membrana viene determinata in base al diametro della stazione di carico e alla percentuale di allungamento. È possibile eseguire l'immunocolorazione nell'intera membrana o tagliarla in pezzi più piccoli per ridurre la quantità di anticorpi utilizzati nel test. In questo caso, le membrane devono essere maneggiate con molta attenzione, evitando danni alle cellule. I ricercatori dovrebbero anche fare attenzione a non capovolgere la membrana e perdere le cellule durante la colorazione. È sempre possibile confermare la corretta faccia della membrana con le cellule al microscopio ottico.

Il principale limite di studi in vitro come questi è che non ricapitolano completamente l'ambiente in vivo . Per questo motivo, è importante eseguire sempre analisi per garantire che le hSVEC mantengano il fenotipo EC (che esprime marcatori EC) e riproducano i risultati attesi sotto stress meccanico (orientamento F-actina e regolazione/produzione di proteine di risposta meccanica).

In sintesi, forniamo una procedura dettagliata per isolare le hSVEC ed esporle a livelli controllati di sforzo di taglio e stiramento. Quando un innesto SV viene improvvisamente esposto a condizioni arteriose dopo CABG, si verifica un danno endoteliale che contribuisce al fallimento dell'innesto. Questi protocolli possono essere strumentali per far progredire la nostra comprensione di come le forze meccaniche influenzano la disfunzione hSVEC associata alla malattia del trapianto venoso.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

JEK è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 e 2013/17368-0] e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 e 309179/2013-0). AAM è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution Gibco 25200072
15 µ slide I 0.4 Luer  Ibidi 80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) Thermo Fisher Scientific D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm  Flexcell International Corporation LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well Thermo Fisher Scientific 154453
Acetic Acid (Glacial) Millipore 100063
Acrylic sheet 1 cm thick Plexiglass
Anti-CD31 antibody Abcam ab24590
Anti-CD31, FITC antibody Thermo Fisher Scientific MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody Cell Signaling 2500
Bioflex plates collagen I Flexcell International Corporation BF3001C
Bovine serum albumin solution Sigma-Aldrich A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm Brasuture AP524
Cyclophilin forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Cyclophilin reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
EBM-2 basal medium Lonza CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements Lonza CC4176
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2657-029
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma-Aldrich F4680
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL Blau Farmacêutica SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) Ibidi 10902
KLF2 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF2 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer Sievers Instruments NOA-280i-1
NOS3 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOS3 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs Ibidi 10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031
Potassium Iodide Sigma-Aldrich 221945
QuanTitec SYBR green PCR kit Qiagen 204143
QuantStudio 12K flex platform  Applied Biosystems 4471087
RNeasy micro kit  Quiagen 74004
Slide glass (24 mm x 60 mm) Knittel Glass VD12460Y1D.01
Sodium nitrite Sigma-Aldrich 31443
SuperScript IV first-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18091200
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypan blue stain 0.4% Gibco 15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C6885

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References

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Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento
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Girão-Silva, T., Fonseca-Alaniz, M. H., Oliveira Dallan, L. A., Valãdao, I. C., Oliveira da Rocha, G. H., Krieger, J. E., Miyakawa, A. A. Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch. J. Vis. Exp. (194), e65122, doi:10.3791/65122 (2023).

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