Summary
Nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de veine saphène humaine (hSVEC). Nous fournissons également des méthodes détaillées pour produire une contrainte de cisaillement et un étirement pour étudier la contrainte mécanique dans les hSVEC.
Abstract
Le pontage aortocoronarien (PAC) est une procédure de revascularisation du myocarde ischémique. La veine saphène reste utilisée comme conduit de pontage coronarien malgré la perméabilité réduite à long terme par rapport aux conduits artériels. L’augmentation brutale du stress hémodynamique associé à l’artérialisation du greffon entraîne des lésions vasculaires, en particulier de l’endothélium, qui peuvent influencer la faible perméabilité de la greffe de la veine saphène (SVG). Ici, nous décrivons l’isolement, la caractérisation et l’expansion des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC). Les cellules isolées par digestion de la collagénase présentent la morphologie typique des pavés et expriment les marqueurs cellulaires endothéliaux CD31 et VE-cadhérine. Pour évaluer l’influence des contraintes mécaniques, des protocoles ont été utilisés dans cette étude pour étudier les deux principaux stimuli physiques, la contrainte de cisaillement et l’étirement, sur les SVG artérialisés. Les hSVEC sont cultivés dans une chambre d’écoulement à plaques parallèles pour produire une contrainte de cisaillement, montrant un alignement dans la direction de l’écoulement et une expression accrue de KLF2, KLF4 et NOS3. Les hSVEC peuvent également être cultivés dans une membrane de silicium qui permet un étirement cellulaire contrôlé imitant l’étirement veineux (bas) et artériel (haut). Le diagramme F-actine des cellules endothéliales et la sécrétion d’oxyde nitrique (NO) sont modulés en conséquence par l’étirement artériel. En résumé, nous présentons une méthode détaillée pour isoler les hSVEC afin d’étudier l’influence du stress mécanique hémodynamique sur un phénotype endothélial.
Introduction
Le dysfonctionnement des cellules endothéliales (CE) est un acteur clé de l’échec de la greffe de veine saphène 1,2,3,4. L’augmentation soutenue de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique induit le phénotype pro-inflammatoire des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC)3,4,5,6. Les voies moléculaires sous-jacentes ne sont pas encore entièrement comprises, et les protocoles normalisés pour les études in vitro peuvent tirer parti des efforts pour de nouvelles connaissances dans le domaine. Ici, nous décrivons un protocole simple pour isoler, caractériser et étendre les hSVEC et comment les exposer à des niveaux variables de contrainte de cisaillement et d’étirement cyclique, imitant les conditions hémodynamiques veineuses et artérielles.
Les hSVEC sont isolés par incubation de collagénase et peuvent être utilisés jusqu’au passage 8. Ce protocole nécessite moins de manipulation du vaisseau par rapport aux autres protocoles disponibles7, ce qui réduit la contamination par les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. D’autre part, il faut un segment de récipient plus grand d’au moins 2 cm pour avoir une extraction EC efficace. Dans la littérature, il a été rapporté que les CEs des grands navires peuvent également être obtenues par enlèvement mécanique 7,8. Bien qu’efficace, l’approche physique présente les inconvénients d’un faible rendement EC et d’une contamination plus élevée par les fibroblastes. Pour augmenter la pureté, des étapes supplémentaires sont nécessaires en utilisant des billes magnétiques ou le tri cellulaire, ce qui augmente le coût du protocole en raison de l’acquisition de billes et d’anticorps 7,8. La méthode enzymatique donne des résultats plus rapides et meilleurs en ce qui concerne la pureté et la viabilité de la CE 7,8.
Les CE les plus fréquemment utilisées pour étudier le dysfonctionnement endothélial sont les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). On sait que le phénotype EC change dans différents lits vasculaires, et il est essentiel de développer des méthodes qui représentent le vaisseau étudié 9,10. À cet égard, la mise en place d’un protocole permettant d’isoler une hSVEC et de la cultiver sous contrainte mécanique est un outil précieux pour comprendre l’apport du dysfonctionnement de l’hSVEC dans la maladie du greffon veineux.
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Protocol
Des segments inutilisés de veines saphènes ont été obtenus chez des patients subissant un pontage aortocoronarien à l’Institut de cardiologie (InCor) de la faculté de médecine de l’Université de São Paulo. Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé pour participer à l’étude, qui a été examinée et approuvée par le comité d’éthique local.
1. Isolement, culture et caractérisation des cellules endothéliales de la veine saphène humaine primaire (CSESh)
- Préparation
- Autoclave une paire de pinces droites ou incurvées et des ciseaux en tissu (7-8 cm).
- Préparer de la gélatine stérile. Mélanger 0,1 g (0,1 % p/v) ou 3 g (3 % p/v) de gélatine pour peau de porc avec 100 mL d’eau ultrapure, autoclaver pendant 15 minutes et conserver à 4 °C. Chauffer à 37 °C pour liquéfier avant d’enrober les boîtes de culture cellulaire et les lames.
- Préparer la collagénase stérile (1 mg/mL) à l’intérieur de la hotte à flux laminaire. Diluer la collagénase dans du PBS et la stériliser avec un filtre de 0,2 μm.
- Enduire une capsule de culture cellulaire de 60 mm et une lame de chambre à 8 puits avec de la gélatine à 0,1 % p/v pendant au moins 30 minutes à 37 °C. Retirez l’excès de gélatine avant d’ensemencer les cellules.
- Préparer un milieu cellulaire endothélial complet : milieu de base de croissance des cellules endothéliales (EBM-2) complété par des facteurs de croissance EGM2.
REMARQUE: Les facteurs de croissance EGM2 sont fournis sous forme de kit par une entreprise répertoriée dans le tableau des matériaux. La concentration des facteurs n’est pas divulguée par la société. - Fabriquer des solutions d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % et à 5 %, de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et de Triton X-100 à 0,1 %, le tout dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Isolement et culture des hSVEC
- Prélever au moins un segment de veine saphène de 2-3 cm de long pour cette procédure.
NOTE. Toutes les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées dans des conditions stériles et à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. - Transférer le segment veineux dans une boîte de Petri remplie de PBS préchauffé. Insérez un embout de pipette dans une extrémité de la veine et rincez doucement avec du PBS pour éliminer tout le sang à l’intérieur de la lumière. Rincez-le jusqu’à ce que le flux de lavage devienne complètement clair.
- Fermez l’une des extrémités de la veine avec une suture de coton stérile. Remplissez délicatement le récipient avec 1 mg/mL de solution de collagénase de type II. Fermez l’autre extrémité du récipient à l’aide d’une suture en coton (figure 1A). Incuber le récipient avec une solution de collagénase dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 °C pendant 1 h.
- Après cela, coupez l’une des extrémités du récipient à l’intérieur d’un tube de 15 ml et recueillez la solution de collagénase. Couper l’autre extrémité et rincer la surface luminale avec 1-2 mL de PBS pour recueillir tous les EC détachés. Mettez tout le PBS ensemble avec la solution de collagénase à l’intérieur du même tube.
- Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) pour granuler les cellules.
NOTE. La pastille de cellule est très petite et difficile à visualiser. Si le sang n’est pas complètement éliminé avant le traitement à la collagénase (étape 1.2.2.), les cellules sanguines précipiteront également et la pastille sera rougeâtre. - Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3-4 mL de milieu cellulaire endothélial complet (EBM-2 complété par des facteurs de croissance EGM2) et une solution d’héparine supplémentaire (5 U/mL, concentration finale). Plaquer les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm pré-enrobée de gélatine à 3 % p/v.
REMARQUE: La gélatine était le premier choix en raison de sa facilité d’accès et de son faible coût. Comme l’enrobage avec de la gélatine maintient avec succès le phénotype CE, aucune autre substance de revêtement n’a été testée. Les collagènes et la fibronectine peuvent être testés dans des études visant à étudier l’influence de différents composants de la matrice extracellulaire sur l’adhésion EC et le phénotype. - Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 pendant 4 jours sans changer le milieu. Après cela, changez de média tous les deux jours. À partir de ce moment, la supplémentation supplémentaire en milieu cellulaire avec de l’héparine n’est plus nécessaire. Examinez la plaque au microscope pour vous assurer que les globules rouges ont été retirés.
- Après 3 à 10 jours après l’extraction, en fonction de la taille et du diamètre du segment veineux, visualisez les hSVEC par microscopie à contraste de phase.
- Évaluer le degré de confluence et leur morphologie pavée en microscopie à contraste de phase.
- Continuez à changer le milieu tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 70% à 80% de confluence.
- Faire passer les hSVEC avec une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25% de trypsine-0,02%.
- Lavez les cellules avec du PBS préchauffé.
- Ajouter 1 mL de solution trypsine-EDTA à la boîte de culture cellulaire de 60 mm. Incuber à 37 °C pendant 2 min ou jusqu’à ce que toutes les cellules soient détachées.
- Ajouter 2 mL de milieu cellulaire endothélial complet pour inactiver la trypsine.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA.
- Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture.
- Compter la suspension cellulaire dans du trypan bleu 1:1 (0,4%) pour plaquer les cellules viables.
- Pour étendre la culture, plaquez les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm avec 10 ml de milieu endothélial complet préchauffé et cultivez-la à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2.
NOTE. En moyenne, l’ensemencement de 4 x 104 hSVEC/cm2 sera 100% confluent après 48 h.
- Pour cryoconserver les cellules, remettre en suspension la pastille de l’étape 1.2.11.5 dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 % dans du sérum fœtal bovin (FBS) et conserver dans de l’azote liquide.
- Prélever au moins un segment de veine saphène de 2-3 cm de long pour cette procédure.
- Caractérisation des hSVECs : coloration par cytométrie de flux pour CD31
- Transvaser 1 x 10 5 hSVEC dans un tube de1,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 100 μL de PBS contenant 2 % d’anticorps monoclonaux BSA et CD31-FITC (1:100).
- Colorer les cellules pendant 30 min à TA dans l’obscurité.
- Laver les cellules colorées en ajoutant 0,5 mL de PBS et les centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 400 μL de PBS avec 2% de BSA.
- Utilisez des hSVEC non marqués, sans anticorps CD31, comme témoin négatif.
- Procéder à l’analyse d’acquisition du cytomètre en flux à l’aide d’un laser bleu et d’un canal FITC (excitation/émission max [Ex/Em] de 498/517 nm). Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le cytomètre dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection. Séparez les cellules des débris en fonction de leur taille et de leur granularité, puis grillez les cellules individuelles par diffusion vers l’avant et par diffusion latérale.
- Caractérisation des hSVECs : coloration fluorescente pour CD31 et VE-cadhérine
- Plaque 0,1 x 105 cellules dans la lame de chambre à 8 puits recouverte de gélatine. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 °C, 5 % de CO2, pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de culture.
- Retirez le milieu et lavez les cellules une fois avec PBS.
- Ajouter 0,3 mL/puits de PFA à 4 % pour fixer les cellules. Incuber pendant 15 min à TA.
- Lavez trois fois avec du PBS.
- Ajouter 0,3 mL/puits de solution de Triton X-100 à 0,1 % pour perméabiliser les cellules. Incuber pendant 15 min à TA.
- Lavez trois fois avec du PBS.
- Pour bloquer les sites de liaison d’anticorps non spécifiques, ajouter 0,3 mL/puits de solution de BSA à 5 % aux cellules. Incuber pendant 15 min à TA.
- Lavez trois fois avec du PBS.
- Incuber les cellules avec les anticorps primaires (CD31 et VE-cadhérine, 1:100) dilués dans du PBS avec 2% de BSA pendant une nuit avec un léger balancement à 4 ° C. Laisser un puits en incubation avec PBS avec 2% BSA (pas d’anticorps primaire) comme témoin négatif.
- Lavez trois fois avec du PBS.
- Incuber les cellules avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence dilués (1:500) dans du PBS pendant 1 h à TA. Ajouter le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire à une concentration finale de 1 mg/mL.
- Lavez trois fois avec du PBS.
- Retirez la chambre multimédia à l’aide du séparateur. Placez une goutte du réactif du milieu de montage (50% de glycérol dans PBS) et placez une lame de verre (24 mm x 60 mm) tout en évitant de piéger les bulles.
- Observez les cellules au microscope à fluorescence.
REMARQUE : DAPI est détecté avec un cube lumineux DAPI (Ex : 335-379 nm ; Em: 417-477 nm) et la cadhérine CD31/VE est détectée à l’aide d’un cube lumineux de protéine fluorescente verte (GFP) (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Des cubes légers avec une gamme de longueurs d’onde d’excitation/émission similaire sont également adéquats pour ces fluorochromes. Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le microscope utilisé dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection.
2. Contrainte de cisaillement sur les CSSVE
- Préparation
- Enduire la lame de la chambre d’écoulement de gélatine à 0,1 % p/v pendant au moins 30 minutes à 37 °C. Enlevez l’excès de gélatine avant d’ensemencer les cellules.
- Équilibrer l’unité fluidique et la perfusion stérile avec des réservoirs de 10 mL pendant une nuit à l’intérieur de l’incubateur dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 à 37 °C.
- Expérience de contrainte de cisaillement
- Semer 2 x 105 EC en suspension dans 100 μL de milieu EC dans la lame de chambre d’écoulement recouverte de gélatine. Incuber les cellules pendant 4 h à 37 °C et 5% de CO2 pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de culture.
- Placez le jeu de perfusion sur l’unité fluidique comme décrit dans les instructions du fabricant. Remplir les réservoirs et la perfusion dans environ 12 mL de milieu endothélial complet préchauffé. Retirer manuellement les bulles d’air du jeu de perfusion pour équilibrer le niveau des deux réservoirs à 5 mL.
- Placez l’unité fluidique avec le jeu de perfusion monté, sans la glissière de la chambre, dans l’incubateur et connectez son câble électrique à la pompe régulée par ordinateur. Retirez toutes les bulles d’air des réservoirs et du jeu de perfusion, en exécutant un protocole prédéfini dans le logiciel de contrôle de la pompe.
NOTE. Il est très important d’éliminer les bulles d’air pour que le système fonctionne correctement. - Prenez l’unité fluidique avec le perfusion monté réglé sur la hotte à flux laminaire et fixez les lames avec une monocouche à cellules confluentes.
- Placez l’unité fluidique avec la perfusion montée et les glissières avec les cellules dans l’incubateur et connectez son câble électrique à la pompe.
- Dans le logiciel de contrôle de la pompe, configurez les paramètres suivants : viscosité du fluide (0,0072), type de glissière, facteur d’étalonnage réglé de perfusion, taux de contrainte de cisaillement (20 dyn/cm2), type d’écoulement (unidirectionnel) et temps (72 h), et démarrez le débit (voir les instructions de l’équipement pour plus de détails). Récolter les cellules traitées avec le même milieu sans exposition au flux que les témoins statiques.
- Une fois le stimulus terminé, lavez les cellules une fois avec du PBS et procédez à la récolte des échantillons selon le test requis. Pour la coloration fluorescente, voir l’étape 2.3.1, et pour l’extraction de l’ARN, voir l’étape 2.3.2.
- Démonstration de l’efficacité du protocole de contrainte de cisaillement
- Coloration fluorescente des filaments d’actine (F-actine)
- Fixez et perméabilisez les cellules comme indiqué aux étapes 1.4.2-1.4.6. Utilisez un volume de 100 μL dans la lame μ.
- Colorer la F-actine avec de la phalloïdine marquée par fluorescence (diluée à 1:200 dans du PBS) et contre-colorer le noyau avec du DAPI (concentration finale de 1 mg/mL dans le PBS) pendant 2 h à TA, à l’abri de la lumière.
- Lavez trois fois avec du PBS.
- Observez les cellules au microscope à fluorescence.
REMARQUE : DAPI est détecté avec un cube lumineux DAPI (Ex : 335-379 nm ; Em: 417-477 nm) et la phalloïdine est détectée avec un cube lumineux GFP (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Des cubes légers avec une gamme similaire de longueurs d’onde d’excitation/émission sont également adéquats pour ces fluorochromes. Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le microscope utilisé dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection.
- Expression génique par transcription inverse quantitative en temps réel (RT-qPCR)
- Recueillir les cellules de la lame de μ avec 350 μL d’un tampon de lyse commercial contenant de la guanidine-thiocyanate. Isoler l’ARN total avec des kits d’extraction à base de colonnes, selon les instructions du fabricant.
REMARQUE: En raison du nombre limité de cellules cultivées dans la lame-μ, l’utilisation de l’extraction de l’ARN par colonne est recommandée. - Préparez l’ADNc à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc contenant une enzyme inverse de transcriptase, conformément aux instructions du fabricant.
- Vérifier l’expression du ou des gènes régulés par la contrainte de cisaillement : KLF2, KLF4 et NOS3. Utilisez le gène de la gouvernante PPIA/cyclophiline pour normaliser les résultats. Les amorces spécifiques de la réaction sont énumérées dans le tableau 1.
- Effectuer la RT-qPCR à l’aide d’un kit de coloration d’ADN fluorescent vert SYBR dans les conditions de réaction suivantes : i) 50 °C pendant 2 min, ii) 95 °C pendant 15 min, iii) 94 °C pendant 15 s, iv) 60 °C pendant 30 s, v) 72 °C pendant 30 s. Répétez les étapes iii à v pendant 40 cycles. Ajouter une étape de fusion à la fin de la réaction pour vérifier la spécificité de l’amorce.
- Recueillir les cellules de la lame de μ avec 350 μL d’un tampon de lyse commercial contenant de la guanidine-thiocyanate. Isoler l’ARN total avec des kits d’extraction à base de colonnes, selon les instructions du fabricant.
- Coloration fluorescente des filaments d’actine (F-actine)
3. Étirement cyclique sur les hSVEC
- Préparation
- Appliquez un lubrifiant à base de silicone sur le dessus et les côtés de la station de chargement équibiaxiale à 6 puits de 25 mm.
REMARQUE: Cela réduit le frottement entre la membrane de la plaque de culture et la station, permettant une meilleure répartition de la déformation cyclique. Cette étape doit être effectuée avant chaque expérience.
- Appliquez un lubrifiant à base de silicone sur le dessus et les côtés de la station de chargement équibiaxiale à 6 puits de 25 mm.
- Expérience d’étirement cyclique
- Ensemencer 4 x 105 cellules en suspension dans 3 mL dans chaque puits des plaques de culture à fond flexible à 6 puits recouvertes de collagène I (Table des matériaux). Prévoyez d’avoir une ou plusieurs plaques en état statique comme groupe témoin. Conserver les cellules dans l’incubateur (37 °C dans de l’air humidifié avec 5% de CO2) jusqu’à ce qu’elles atteignent 100% de confluence (généralement 48 h après l’ensemencement). Avant le début du protocole d’étirement, laver les cellules une fois avec du PBS préchauffé et ajouter 3 ml de milieu de culture frais par puits.
- Insérez la plaque de base avec toutes les stations de chargement lubrifiées dans l’incubateur et connectez correctement le tube à l’équipement de contrôle du système de bioréacteur d’étirement de cellule de tension (voir les instructions d’équipement pour plus de détails).
- Fixez chaque plaque de culture à un joint rouge, fourni par le système de bioréacteur d’étirement de cellule de tension. Ensuite, placez-les dans la plaque de base à l’intérieur de l’incubateur.
- Assurez-vous que les plaques sont bien insérées, pressées et scellées à la plaque de base pour éviter les fuites d’air pendant le pompage sous vide. Il est important d’avoir les quatre plaques de culture dans la plaque de base pour avoir le vide et la charge d’étirement appropriés.
- Si vous avez moins de plaques expérimentales, utilisez une ou plusieurs plaques vides pour compléter les quatre positions dans la plaque de base. Ajoutez la feuille d’acrylique (fournie avec l’équipement) sur les plaques de culture pour améliorer l’étanchéité de la plaque de base. Placez les plaques statiques dans le même incubateur.
- Mettez sous tension le contrôleur et le système informatique. Ouvrez l’icône du logiciel et configurez le schéma souhaité : taille de la station de chargement à utiliser, type de déformation, pourcentage d’allongement, forme d’onde, fréquence et durée. Pour plus d’informations, consultez les instructions du fabricant. Sélectionnez et téléchargez le régime. Ici, le schéma suivant a été utilisé: 1/2 forme d’onde sinusale, fréquence 1 Hz, 5% d’allongement (pour imiter l’étirement veineux) et 15% d’allongement (pour imiter l’étirement artériel) jusqu’à 72 h.
- Allumez le système d’aspiration et cliquez sur Démarrer sur l’écran de l’ordinateur pour exécuter l’étirement. Vérifiez si la membrane de silicone bouge et étire les cellules.
- Une fois le stimulus terminé, lavez les cellules une fois avec du PBS et procédez à la récolte des échantillons selon le test requis. Ici, pour démontrer l’efficacité de l’étirement cyclique, collectez le milieu de culture hSVEC, maintenez-le à -80 °C pour une mesure ultérieure de l’oxyde nitrique (NO) et fixez les cellules pour la coloration fluorescente.
NOTE. La plaque de base ne peut pas être stockée à l’intérieur de l’incubateur lorsqu’elle n’est pas utilisée; Sinon, la température peut modifier la forme plate et la rendre inutile.
- Démonstration de l’efficacité du protocole d’étirement cyclique
- Coloration fluorescente de la F-actine
- Fixez les cellules comme indiqué à l’étape 1.4.3. Utilisez un volume de 1 mL par puits.
- Lavez les cellules trois fois avec du PBS. Maintenez les cellules dans le PBS afin qu’elles ne sèchent pas tout en préparant la membrane de silicone pour les prochaines étapes.
- Utilisez un coton-tige pour enlever l’excès de lubrifiant à base de silicone du bas de la membrane. Ensuite, appliquez délicatement le nettoyant pour vitres ou le savon pour les mains avec un nouveau coton-tige. Répétez le processus jusqu’à ce que tout le lubrifiant soit retiré de la membrane. Ensuite, nettoyez avec de l’eau désionisée.
NOTE. Il est important de retirer complètement le lubrifiant de la membrane de silicone pour avoir des images de microscopie de bonne qualité. - Coupez soigneusement les membranes de silicone en petits morceaux pour les adapter sur des lames de chambre à 8 puits pour les colorer. Perméabiliser les cellules comme indiqué à l’étape 1.4.5.
- Après les étapes de lavage, colorer la F-actine à l’aide de phalloïdine et le noyau avec du DAPI. Procéder à l’analyse, comme indiqué aux étapes 2.3.1.2 et 2.3.1.3. Utiliser un volume de 0,3 mL par puits de chambre.
- Retirez la chambre multimédia à l’aide du séparateur. Placez une goutte de réactif de support de montage (50% de glycérol dans PBS) et placez une lame de verre (24 mm x 60 mm).
- Observez les cellules au microscope à fluorescence.
REMARQUE : DAPI est détecté avec un cube lumineux DAPI (Ex : 335-379 nm ; Em: 417-477 nm) et la phalloïdine est détectée avec un cube lumineux de protéine fluorescente rouge (RFP) (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Des cubes légers avec une gamme similaire de longueurs d’onde d’excitation/émission sont également adéquats pour ces fluorochromes. Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le microscope utilisé dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection.
- Mesure du NO estimée par l’accumulation de nitrite (NO2) dans le milieu conditionné par l’hSVEC à l’aide d’un dosage de chimiluminescence réductrice à base d’iodure de potassium
- Préparation
- Préparer une courbe étalon de 0,01 à 10 mM de solution de nitrite de sodium (NaNO2 dans de l’eau ultrapure).
- Ajouter 5 mL d’acide acétique et 1 mL d’iodure de potassium (50 mg dans 1 mL d’eau ultrapure) dans le récipient de purge de l’analyseur d’oxyde nitrique.
- AUCUNE mesure
- Ajouter 20 μL de la courbe standard NaNO2 dans la cuve de purge de l’analyseur d’oxyde nitrique. Mesurez-le selon le protocole du fabricant.
- Préparation
- Ajouter 20 μL du milieu conditionné dans la cuve de purge de l’analyseur d’oxyde nitrique. Mesurez-le selon le protocole du fabricant.
- Calculer les concentrations de NO2 sur la base de l’étalonnage de la courbe étalon. Ajustez les valeurs obtenues par le volume total du milieu conditionné analysé 6,11.
- Coloration fluorescente de la F-actine
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Representative Results
En règle générale, les EC adhérentes peuvent être observées 3-4 jours après l’extraction. Les hSVEC forment initialement des amas de cellules et présentent une morphologie typique de « pavés » (Figure 1B). Ils expriment les marqueurs CE CD31 (figure 1C, D) et VE-cadhérine (figure 1D). Les hSVEC peuvent être facilement multipliés sur une boîte de culture cellulaire traitée non enrobée, et ils conservent le phénotype endothélial en culture jusqu’à huit passages.
Les hSVEC, lorsqu’elles sont cultivées sous contrainte de cisaillement, s’alignent dans la direction de l’écoulement (figure 2A). La contrainte de cisaillement de 20 dyn/cm2 pendant 72 h induit l’expression de gènes mécanosensibles typiques, KLF2, KLF4 et NOS3, indiquant l’efficacité du stimulus de cisaillement dans les hSVEC (Figure 2B)12,13,14.
Le résultat de l’étirement cyclique dépend de l’intensité appliquée aux hSVEC. Les cellules sous faible étirement présentent un motif cortical F-actine similaire à celui des cellules statiques (Figure 3A), sans changement dans la libération de NO jusqu’à 72 h (Figure 3B). Les niveaux artériels d’étirement remodèlent le cytosquelette d’actine après 24 heures (Figure 3A) et diminuent la libération de NO après 72 h (Figure 3B).
Figure 1 : Les cellules endothéliales des veines saphènes humaines (hSVEC) présentent une morphologie endothéliale typique et une expression spécifique du marqueur EC. (A) Segment de veine saphène rempli avec une solution de collagénase de type II pour l’extraction des CE. (B) Évolution temporelle représentative de la croissance de l’hSVEC après extraction. Après 3-4 jours, il est possible de visualiser des amas de cellules qui prolifèrent jusqu’à ce qu’ils atteignent la confluence. Barre d’échelle = 100 μm. (C) Analyse FACS des hSVEC cultivés au passage 1. La ligne verte indique que 99,7% de la population cellulaire est positive pour le marqueur endothélial spécifique CD31. La ligne noire est le contrôle négatif. (D) Immunomarquage pour CD31 (vert), (E) VE-cadhérine (vert) et noyaux DAPI (bleu) dans les hSVEC au passage 1. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les hSVEC s’alignent dans la direction de l’écoulement et expriment des gènes mécanosensibles lorsqu’ils sont exposés à une contrainte de cisaillement unidirectionnelle. Monocouche cellulaire confluente de hSVEC cultivée dans des conditions de contrainte de cisaillement laminaire statique ou unidirectionnelle. (A) Images à contraste de phase (en haut) et coloration à la phalloïdine (en bas) des CSSVE h, exposées à une contrainte de cisaillement de 20 dyn/cm2 pendant72 h. Vert : filaments d’actine ; bleu : noyaux cellulaires. Barre d’échelle = 100 μm (contraste de phase) et 20 μm (fluorescence). (B) Expression génique de KLF2, KLF4 et NOS3 déterminée par qRT-PCR. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM. ** p < 0,01 par rapport au groupe statique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le phénotype hSVEC sous étirement cyclique dépend de l’intensité appliquée. (A) Monocouche cellulaire confluente de hSVEC cultivées sous étirement statique, bas (veineux) ou haut (artère) dans une plaque inférieure flexible pendant 24 h. Images à contraste de phase (en haut) et coloration à la phalloïdine (en bas) montrant les fibres d’actine (rouge) et les noyaux avec DAPI (bleu). Barre d’échelle = 100 μm (contraste de phase) et 50 μm (fluorescence). (B) Aucune mesure de NO a été estimée sur la base de l’accumulation de NO2 dans les milieux de culture cellulaire pendant 72 h. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM. *** p < 0,001 par rapport au groupe statique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Gène | Protéine | Avant 5'-3' | Inverser 5'-3' | ||
| KLF2 | Facteur 2 de type Krüppel | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCTCACCTG | ||
| KLF4 | Facteur 4 de type Kruppel | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGCAC | ||
| NOS3 | Oxyde nitrique synthase, endothéliale | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| ÉPFVP | Cyclophiline A, | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC | ||
| Peptidylprolyl isomérase A | |||||
Tableau 1 : amorces qRT-PCR pour la contrainte de cisaillement et les gènes de référence.
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Discussion
Le segment de la veine saphène doit avoir été d’au moins 2 cm pour isoler avec succès les hSVEC. Les petits segments sont difficiles à manipuler et attachent les extrémités du vaisseau pour maintenir la solution de collagénase pour isoler les cellules. La surface luminale réduite ne produit pas suffisamment de cellules pour étendre la culture. Pour minimiser le risque de contamination par des non-CE, la manipulation du segment de la veine saphène doit être très douce pendant toute la procédure. Il est important d’être prudent lors de l’introduction des pointes de pipette dans les surfaces luminales pour éliminer le sang et lors de l’introduction de la solution de collagénase. L’exposition à la solution enzymatique doit être très bien contrôlée (pas plus de 1 h) pour réduire la contamination de la culture par des non-CE. L’utilisation d’un milieu CE spécifique complété par le cocktail de facteurs de croissance est cruciale pour la croissance de la culture hSVEC. L’héparine supplémentaire pendant les premiers jours de culture est importante pour réduire les globules rouges résiduels du segment veineux et pour inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses15. Lorsque vous passez les cellules pour des expériences ou pour maintenir la culture, assurez-vous de plaquer les cellules avec une confluence supérieure à 40%. Les CE ont besoin d’un minimum de contacts pour assurer une bonne prolifération et une bonne survie. Les CSSVE peuvent facilement être cultivées sur une surface non revêtue (p. ex. gélatine ou fibronectine). Cependant, le revêtement pendant les premiers jours après l’extraction EC augmentera l’adhérence et le rendement EC. Les hSVEC ont un taux de prolifération constant et maintiennent le phénotype endothélial jusqu’à huit passages, sans exprimer de marqueurs cellulaires mésenchymateux (tels que SM22 et calponine). D’après notre expérience, le taux de prolifération peut varier en fonction du donneur de tissu, mais pas avec un passage cellulaire. Il est recommandé de cryoconserver les hSVEC dans FBS avec 5% de DMSO pour augmenter la viabilité après la décongélation des cellules.
Pour mener une expérience de contrainte de cisaillement, il y a des étapes critiques à considérer. Pour éviter la formation de bulles d’air à l’intérieur du système, le jeu de perfusion et les connecteurs doivent être équilibrés pendant la nuit à 37 °C et 5% de CO2. Les bulles peuvent bloquer le flux à travers le système ou endommager la monocouche endothéliale interférant avec le phénotype cellulaire. Lors de l’ensemencement des cellules dans la lame de chambre d’écoulement, il est recommandé de l’utiliser simultanément après 4 h ou le lendemain. De plus, il est obligatoire de changer le milieu de la lame tous les jours dans des conditions statiques si l’expérience dure plusieurs jours. Le volume de la lame de la chambre d’écoulement est de ~160 μL, et il n’est pas suffisant pour maintenir les cellules pendant de longues périodes de culture. Le système a l’avantage d’observer facilement les cellules par microscopie (contraste de fond clair/phase ou coloration pour la microscopie à fluorescence). La limitation est le faible rendement en protéines (20-25 μg/lame) et en ARN (1 μg/lame). Pour surmonter ce problème, le système permet la connexion de plusieurs glissières en série à l’aide de la même unité fluidique (voir les instructions du fabricant). Ensuite, il est possible d’utiliser le volume du tampon de lyse pour une lame afin d’extraire la protéine ou l’ARN de plusieurs lames.
Le système d’étirement est facile à manipuler et permet l’application de différentes intensités et types d’étirement. Il est important de lubrifier toutes les stations de chargement avant chaque expérience afin de réduire le frottement entre la membrane de la plaque de culture et la station et de garantir une bonne répartition de la déformation cyclique. Assurez-vous que les plaques sont complètement scellées à la plaque de base pour produire le vide nécessaire pour atteindre l’étirement souhaité. Le stimulus équiaxial ne produit pas une contrainte uniforme à l’intérieur du puits. Les cellules au bord du puits doivent être jetées, comme indiqué par le fabricant. La surface d’intérêt de la membrane est déterminée en fonction du diamètre de la station de chargement et du pourcentage d’allongement. Il est possible d’effectuer l’immunomarquage dans toute la membrane ou de la couper en plus petits morceaux pour réduire la quantité d’anticorps utilisés dans le test. Dans ce cas, les membranes doivent être manipulées très soigneusement, en évitant d’endommager les cellules. Les chercheurs doivent également veiller à ne pas retourner la membrane et à ne pas perdre les cellules pendant la coloration. Il est toujours possible de confirmer la face correcte de la membrane avec les cellules sous microscopie optique.
La principale limite des études in vitro comme celles-ci est qu’elles ne récapitulent pas complètement l’environnement in vivo . Pour cette raison, il est important de toujours effectuer des analyses pour s’assurer que les CSVE maintiennent le phénotype EC (exprimant les marqueurs EC) et reproduisent les résultats attendus sous contrainte mécanique (orientation F-actine et régulation/production de protéines de réponse mécanique).
En résumé, nous fournissons une procédure détaillée pour isoler les hSVEC et les exposer à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement. Lorsqu’un greffon SV est soudainement exposé à des conditions artérielles après un pontage coronarien, des dommages endothéliaux se produisent et contribuent à l’échec du greffon. Ces protocoles peuvent contribuer à faire progresser notre compréhension de la façon dont les forces mécaniques influencent le dysfonctionnement de l’hSVEC associé à la maladie du greffon veineux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
JEK est soutenu par des subventions de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 et 2013/17368-0] et Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 et 309179/2013-0). AAM est soutenu par des subventions de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) et du Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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