Summary
İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.
Abstract
Koroner arter baypas greft (KABG) cerrahisi iskemik miyokardın revaskülarize edilmesi için yapılan bir prosedürdür. Safen ven, arteriyel kanallara kıyasla azalmış uzun süreli açıklığa rağmen CABG kanalı olarak kullanılmaya devam etmektedir. Greft arteriyelizasyonu ile ilişkili hemodinamik stresin ani artışı, safen ven greftinin (SVG) düşük açıklığını etkileyebilecek vasküler hasara, özellikle de endotelle sonuçlanır. Burada, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi anlatılmaktadır. Kollajenaz sindirimi ile izole edilen hücreler tipik parke taşı morfolojisini gösterir ve endotel hücre belirteçleri CD31 ve VE-kadherini eksprese eder. Mekanik stres etkisini değerlendirmek için, bu çalışmada, arteriyalize SVG'ler üzerindeki iki ana fiziksel uyaranı, kayma stresini ve gerilmeyi araştırmak için protokoller kullanılmıştır. hSVEC'ler, kayma gerilmesi üretmek için paralel bir plaka akış odasında kültürlenir, akış yönünde hizalama ve KLF2, KLF4 ve NOS3'ün artan ekspresyonunu gösterir. hSVEC'ler ayrıca venöz (düşük) ve arteriyel (yüksek) gerilmeyi taklit eden kontrollü hücresel gerilmeye izin veren bir silikon membranda kültürlenebilir. Endotel hücrelerinin F-aktin paterni ve nitrik oksit (NO) sekresyonu buna göre arteriyel gerilme ile modüle edilir. Özetle, hemodinamik mekanik stresin endotel fenotipi üzerindeki etkisini incelemek için hSVEC'leri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.
Introduction
Endotel hücre (EC) disfonksiyonu safen ven greft yetmezliğinde anahtar rol oynar1,2,3,4. Kayma stresinin ve siklik gerilmenin sürekli artışı, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) proinflamatuar fenotipini indükler3,4,5,6. Altta yatan moleküler yollar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve in vitro çalışmalar için standartlaştırılmış protokoller, bölgedeki yeni anlayışlar için çabalardan yararlanabilir. Burada, hSVEC'leri izole etmek, karakterize etmek ve genişletmek için basit bir protokolü ve bunların venöz ve arteriyel hemodinamik koşulları taklit ederek değişken seviyelerde kayma stresi ve siklik gerilmeye nasıl maruz bırakılacağını açıklıyoruz.
hSVEC'ler kollajenaz inkübasyonu ile izole edilir ve 8. pasaja kadar kullanılabilir. Bu protokol, mevcut diğer protokollere kıyasla damarın daha az manipülasyonunu gerektirir7, bu da düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonu azaltır. Öte yandan, verimli EC ekstraksiyonuna sahip olmak için en az 2 cm'lik daha büyük bir kap segmenti gerektirir. Literatürde, büyük damarlardan alınan ECs'lerin mekanik uzaklaştırma ile de elde edilebileceği bildirilmiştir 7,8. Etkili olmasına rağmen, fiziksel yaklaşım düşük EC verimi ve daha yüksek fibroblast kontaminasyonu gibi dezavantajlara sahiptir. Saflığı arttırmak için, manyetik boncuklar veya hücre sıralama kullanarak ekstra adımlara ihtiyaç vardır, bu da boncukların ve antikorların elde edilmesi nedeniyle protokolün maliyetini arttırır7,8. Enzimatik yöntem, EC saflığı ve canlılığı ile ilgili daha hızlı ve daha iyi sonuçlara sahiptir 7,8.
Endotel disfonksiyonunu incelemek için en sık kullanılan EC'ler insan umbilikal ven endotel hücreleridir (HUVEC'ler). EC fenotipinin farklı damar yataklarında değiştiği bilinmektedir ve incelenen damarı temsil eden yöntemlerin geliştirilmesi esastır 9,10. Bu bakımdan, bir hSVEC'in izole edilmesi ve mekanik stres altında kültürlenmesi için bir protokol oluşturulması, ven grefti hastalığında hSVEC disfonksiyonunun katkısını anlamak için değerli bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Safen venlerin kullanılmayan segmentleri, São Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp Enstitüsü'nde (InCor) aortokoroner bypass ameliyatı geçiren hastalardan elde edildi. Tüm bireyler, yerel etik kurul tarafından gözden geçirilen ve onaylanan çalışmaya katılmak için bilgilendirilmiş onam vermiştir.
1. Primer insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu
- Hazırlık
- Bir çift düz veya kavisli forseps ve doku makası (7-8 cm) otoklavlayın.
- Steril jelatin hazırlayın. 0,1 g (%0,1 w/v) veya 3 g (%3 w/v) domuz derisi jelatinini 100 mL ultra saf su ile karıştırın, 15 dakika otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın. Hücre kültürü bulaşıklarını ve slaytlarını kaplamadan önce sıvılaştırmak için 37 ° C'ye kadar ısıtın.
- Laminer akış davlumbazının içinde steril kollajenaz (1 mg / mL) hazırlayın. Kollajenazı PBS'de seyreltin ve 0,2 μm'lik bir filtre ile sterilize edin.
- 60 mm'lik bir hücre kültürü kabını ve 8 delikli bir odacık sürgüsünü 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca %0,1 w/v jelatin ile kaplayın. Hücreleri tohumlamadan önce fazla jelatini çıkarın.
- Tam endotel hücre ortamı hazırlayın: EGM2 büyüme faktörleri ile desteklenmiş endotel hücre büyümesi bazal ortamı (EBM-2).
NOT: EGM2 büyüme faktörleri, Malzeme Tablosunda listelenen bir şirket tarafından kit olarak tedarik edilmektedir. Faktörlerin konsantrasyonu şirket tarafından açıklanmaz. - Hepsi fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 ve% 5 sığır serum albümini (BSA),% 4 paraformaldehit (PFA) ve% 0.1 Triton X-100 çözeltileri yapın.
- hSVEC'lerin izolasyonu ve kültürü
- Bu prosedür için en az 2-3 cm uzunluğunda safen damar segmenti toplayın.
NOT. Tüm hücre kültürü prosedürleri steril koşullar altında ve laminer bir akış davlumbazının içinde gerçekleştirilmelidir. - Damar segmentini önceden ısıtılmış PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Damarın bir ucuna bir pipet ucu yerleştirin ve lümenin içindeki tüm kanı çıkarmak için PBS ile hafifçe yıkayın. Yıkama akışı tamamen netleşene kadar yıkayın.
- Damarın uçlarından birini steril bir pamuk sütü ile kapatın. Kabı dikkatlice 1 mg / mL kollajenaz tip II çözeltisi ile doldurun. Kabın diğer ucunu pamuklu bir sütür ile kapatın (Şekil 1A). Kabı kollajenaz çözeltisi ile 1 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.
- Bundan sonra, kabın uçlarından birini 15 mL'lik bir tüp içinde kesin ve kollajenaz çözeltisini toplayın. Diğer ucu kesin ve tüm ayrılmış EC'leri toplamak için luminal yüzeyi 1-2 mL PBS ile yıkayın. Tüm PBS'yi aynı tüpün içine kollajenaz çözeltisi ile bir araya getirin.
- Hücreleri pelet haline getirmek için tüpü oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
NOT. Hücre peleti çok küçüktür ve görselleştirilmesi zordur. Kollajenaz tedavisinden önce kan tamamen çıkarılmazsa (adım 1.2.2.), kan hücreleri de çökelir ve pelet kırmızımsı olur. - Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 3-4 mL tam endotel hücre ortamında (EGM2 büyüme faktörleri ile desteklenmiş EBM-2) ve ek bir heparin çözeltisinde (5 U / mL, nihai konsantrasyon) yeniden askıya alın. Hücreleri, %3 w/v jelatin ile önceden kaplanmış 60 mm'lik bir hücre kültürü kabında kaplayın.
NOT: Jelatin, erişilebilirlik kolaylığı ve düşük maliyeti nedeniyle ilk tercihtir. Jelatinli kaplama EC fenotipini başarıyla koruduğundan, başka hiçbir kaplama maddesi test edilmemiştir. Kollajenler ve fibronektin, farklı hücre dışı matriks bileşenlerinin EC adezyonu ve fenotip üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlayan çalışmalarda test edilebilir. - Hücreleri 37 ° C'de, ortamı değiştirmeden 4 gün boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Bundan sonra, medyayı her geçen gün değiştirin. Bu andan itibaren, heparin ile ek hücre ortamı takviyesi artık gerekli değildir. Kırmızı kan hücrelerinin çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin.
- Ekstraksiyondan 3-10 gün sonra, damar segmentinin boyutuna ve çapına bağlı olarak, hSVEC'leri faz-kontrast mikroskobu ile görselleştirin.
- Faz-kontrast mikroskobunda birleşim derecesini ve parke taşı morfolojisini değerlendirir.
- Hücreler% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar her 2 günde bir ortamı değiştirmeye devam edin.
- HSVEC'leri% 0.25 tripsin-% 0.02 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile geçirin.
- Hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
- 60 mm'lik hücre kültürü kabına 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 2 dakika boyunca veya tüm hücreler ayrılana kadar inkübe edin.
- Tripsini inaktive etmek için 2 mL tam endotel hücre ortamı ekleyin.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı atın ve hücreleri 1 mL kültür ortamında yeniden askıya alın.
- Canlı hücreleri plakalamak için hücre süspansiyonunu 1: 1 tripan mavisinde (% 0.4) sayın.
- Kültürü genişletmek için, hücreleri 100 mm'lik bir hücre kültürü kabında 10 mL önceden ısıtılmış tam endotel hücre ortamı ile kaplayın ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de kültürleyin.
NOT. Ortalama olarak, 4 x 104 hSVEC /cm2'nin tohumlaması 48 saat sonra% 100 akıcı olacaktır.
- Hücreleri kriyoproteksiyona tabi tutmak için, pelet adım 1.2.11.5'ten itibaren fetal sığır serumunda (FBS) %5 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden askıya alın ve sıvı azotta depolayın.
- Bu prosedür için en az 2-3 cm uzunluğunda safen damar segmenti toplayın.
- hSVEC'lerin karakterizasyonu: CD31 için akım sitometri boyama
- 1 x 10 5 hSVEC'leri bir1,5 mL tüpe aktarın ve RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. süpernatantı atın ve peleti% 2 BSA ve CD31-FITC monoklonal antikoru (1:100) içeren 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
- Karanlıkta RT'de hücreleri 30 dakika boyunca lekeleyin.
- Lekeli hücreleri 0.5 mL PBS ekleyerek yıkayın ve RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. süpernatantı atın ve hücre peletini% 2 BSA ile 400 μL PBS'de yeniden askıya alın.
- Negatif kontrol olarak CD31 antikoru olmayan etiketsiz hSVEC'leri kullanın.
- Mavi bir lazer ve FITC kanalı (498/517 nm'lik uyarma/emisyon maksimumu [Ex/Em]) kullanarak akış sitometresi edinme analizine devam edin. Başka florokromlar kullanılıyorsa, sitometrenin algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin. Hücreleri büyüklükleri ve tanecikleri işlevinde enkazdan ayırın, ardından tek hücreleri ileri saçılma ve yan saçılma ile değiştirin.
- hSVEC'lerin karakterizasyonu: CD31 ve VE-kadherin için floresan boyama
- Plaka 0.1 x 105 hücreli jelatin kaplı 8 kuyucuklu odacıklı kızaktadır. Hücrelerin kültür yüzeyine yapışmasını sağlamak için hücreleri gece boyunca 37 ° C, % 5 CO2'de inkübe edin.
- Ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın.
- Hücreleri sabitlemek için 0.3 mL / kuyu% 4 PFA ekleyin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri geçirgenleştirmek için 0.3 mL/kuyu %0.1 Triton X-100 çözeltisi ekleyin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- PBS ile üç kez yıkayın.
- Spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için, hücrelere 0.3 mL/kuyu% 5 BSA çözeltisi ekleyin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- PBS ile üç kez yıkayın.
- PBS'de seyreltilmiş birincil antikorlarla (CD31 ve VE-kadherin, 1:100) hücreleri gece boyunca %2 BSA ile 4 °C'de hafifçe sallanarak inkübe edin. Negatif kontrol olarak% 2 BSA (birincil antikor yok) ile PBS ile inkübe edilen bir kuyu bırakın.
- PBS ile üç kez yıkayın.
- RT'de 1 saat boyunca PBS'de seyreltilmiş (1:500) floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorlarla hücreleri inkübe edin. nükleer boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin 1 mg / mL'lik nihai konsantrasyona.
- PBS ile üç kez yıkayın.
- Ortam odasını ayırıcı ile çıkarın. Montaj ortamı reaktifinin bir damlasını (PBS'de% 50 gliserol) yerleştirin ve kabarcıkları yakalamaktan kaçınırken bir cam slayt (24 mm x 60 mm) yerleştirin.
- Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
NOT: DAPI, bir DAPI ışık küpüyle algılanır (Ör: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) ve CD31/VE-kadherin, yeşil floresan protein (GFP) ışık küpü (Ör: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Benzer uyarma/emisyon dalga boyu aralığına sahip ışık küpleri de bu florokromlar için yeterlidir. Başka florokromlar kullanılıyorsa, kullanılan mikroskopun algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin.
2. hSVEC'lerde kayma gerilmesi
- Hazırlık
- Akış odası sürgüsünü 37 °C'de en az 30 dakika boyunca jelatinle %0,1 oranında kaplayın. Hücreleri tohumlamadan önce fazla jelatini çıkarın.
- Akışkan üniteyi ve steril perfüzyon setini, inkübatörün içinde gece boyunca 10 mL rezervuarlarla 37 ° C'de% 5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde dengeleyin.
- Kesme gerilmesi deneyi
- Tohum 2 x 105 ECs, jelatin kaplı akış odası sürgüsüne 100 μL EC ortamında askıya alınır. Hücrelerin kültür yüzeyine yapışmasını sağlamak için hücreleri 37 ° C'de 4 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Perfüzyon setini, üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi akışkan üniteye yerleştirin. Rezervuarları ve perfüzyonu yaklaşık 12 mL önceden ısıtılmış tam endotel hücre ortamında doldurun. Her iki rezervuarın seviyesini 5 mL'de dengelemek için perfüzyon setinden manuel olarak hava kabarcıklarını çıkarın.
- Akışkan üniteyi, monte edilmiş perfüzyon seti ile, oda sürgüsü olmadan, inkübatöre yerleştirin ve elektrik kablosunu bilgisayar tarafından düzenlenen pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında önceden tanımlanmış bir protokol çalıştırarak rezervuarlardan ve perfüzyon setinden tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
NOT. Sistemin düzgün çalışması için hava kabarcıklarının giderilmesi çok önemlidir. - Akışkan üniteyi, laminer akış başlığına monte edilmiş perfüzyon seti ile alın ve slaytları bir konfluent hücre tek katmanı ile takın.
- Akışkan üniteyi monte edilmiş perfüzyon ve kızaklarla inkübatördeki hücrelerle yerleştirin ve elektrik kablosunu pompaya bağlayın.
- Pompa kontrol yazılımında, aşağıdaki parametreleri ayarlayın: ortamın viskozitesi (0,0072), kızak tipi, perfüzyon seti kalibrasyon faktörü, kayma gerilmesi oranı (20 dyn/cm2), akış tipi (tek yönlü) ve zaman (72 saat) ve akışı başlatın (daha fazla ayrıntı için ekipman talimatlarına bakın). Aynı ortamla muamele edilen hücreleri statik kontroller olarak akışa maruz kalmadan toplayın.
- Uyaran tamamlandıktan sonra, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve numuneleri gerekli tahlile göre toplamaya devam edin. Floresan boyama için adım 2.3.1'e ve RNA ekstraksiyonu için adım 2.3.2'ye bakın.
- Kesme gerilmesi protokolünün etkinliğinin gösterilmesi
- Aktin filamentlerinin floresan boyaması (F-aktin)
- Hücreleri 1.4.2-1.4.6 adımlarında belirtildiği gibi sabitleyin ve geçirgenleştirin. μ slaytta 100 μL'lik bir hacim kullanın.
- F-aktinini floresan etiketli falloidin (PBS'de 1:200'de seyreltilir) ile lekeleyin ve çekirdeği RT'de ışıktan korunmuş 2 saat boyunca DAPI (PBS'de 1 mg / mL'lik son konsantrasyon) ile karşı karşıya getirin.
- PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
NOT: DAPI, bir DAPI ışık küpüyle algılanır (Ör: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) ve falloidin bir GFP ışık küpü ile tespit edilir (Ör: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Benzer bir uyarma / emisyon dalga boyu aralığına sahip ışık küpleri de bu florokromlar için yeterlidir. Başka florokromlar kullanılıyorsa, kullanılan mikroskopun algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin.
- Gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile gen ekspresyonu
- Hücreleri 350 μL ticari guanidin-tiyosiyanat içeren lizis tamponu ile μ slayttan toplayın. Toplam RNA'yı, üreticinin talimatlarına göre kolon tabanlı ekstraksiyon kitleri ile izole edin.
NOT: μ-slaytta kültürlenen sınırlı sayıda hücre nedeniyle, RNA'nın sütun bazlı ekstraksiyonunun kullanılması önerilir. - Üreticinin talimatlarına göre, transkriptaz ters enzimli bir cDNA sentez kiti kullanarak cDNA'yı hazırlayın.
- Kesme gerilimi tarafından düzenlenen genlerin ekspresyonunu doğrulayın: KLF2, KLF4 ve NOS3. Sonuçları normalleştirmek için kahya geni PPIA / siklofilin kullanın. Reaksiyon için spesifik primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
- RT-qPCR'yi aşağıdaki reaksiyon koşulları altında bir SYBR yeşil floresan DNA boyama kiti kullanarak gerçekleştirin: i) 2 dakika boyunca 50 °C, ii) 15 dakika boyunca 95 °C, iii) 15 s için 94 °C, iv) 30 s için 60 °C, v) 30 s için 72 °C. 40 döngü boyunca iii ile v arasındaki adımları tekrarlayın. Astarın özgüllüğünü doğrulamak için reaksiyonun sonuna bir eritme adımı ekleyin.
- Hücreleri 350 μL ticari guanidin-tiyosiyanat içeren lizis tamponu ile μ slayttan toplayın. Toplam RNA'yı, üreticinin talimatlarına göre kolon tabanlı ekstraksiyon kitleri ile izole edin.
- Aktin filamentlerinin floresan boyaması (F-aktin)
3. hSVEC'lerde döngüsel gerilme
- Hazırlık
- 25 mm'lik 6 delikli eşeksenli yükleme istasyonunun üst kısımlarına ve yanlarına silikon bazlı yağlayıcı uygulayın.
NOT: Bu, kültür plakası membranı ile istasyon arasındaki sürtünmeyi azaltarak döngüsel gerinimin daha iyi dağıtılmasını sağlar. Bu adım her denemeden önce yapılmalıdır.
- 25 mm'lik 6 delikli eşeksenli yükleme istasyonunun üst kısımlarına ve yanlarına silikon bazlı yağlayıcı uygulayın.
- Döngüsel esneme deneyi
- Tohum 4 x 10Kollajen I ile kaplanmış 6 kuyucuklu esnek tabanlı kültür plakalarının her bir kuyucuğuna 3 mL olarak asılı 5 hücre (Malzeme Tablosu). Kontrol grubu olarak statik durumda bir plaka (lar) a sahip olmayı planlayın. Hücreleri inkübatörde (% 5 CO2 ile nemlendirilmiş havada 37 ° C) % 100 akıcılığa ulaşana kadar (genellikle tohumlamadan 48 saat sonra) tutun. Germe protokolünün başlamasından önce, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın ve kuyucuk başına 3 mL taze kültür ortamı ekleyin.
- Taban plakasını inkübatördeki tüm yağlanmış yükleme istasyonlarıyla birlikte yerleştirin ve boruyu gerilim hücresi germe biyoreaktör sisteminin kontrolör ekipmanına uygun şekilde bağlayın (daha fazla ayrıntı için ekipman talimatlarına bakın).
- Her kültür plakasını, gerilim hücresi germe biyoreaktör sistemi tarafından sağlanan bir kırmızı contaya takın. Ardından, bunları inkübatörün içindeki taban plakasına yerleştirin.
- Vakum pompalama sırasında hava sızıntısını önlemek için plakaların taban plakasına tam olarak oturduğundan, preslendiğinden ve kapatıldığından emin olun. Uygun vakum ve germe yüklemesine sahip olmak için taban plakasında dört kültür plakasının hepsinin bulunması önemlidir.
- Daha az deney plakasına sahip olmanız durumunda, taban plakasındaki dört konumu tamamlamak için boş bir tane (ler) kullanın. Taban plakası sızdırmazlığını iyileştirmek için akrilik levhayı (ekipmanla birlikte verilir) kültür plakalarının üzerine ekleyin. Statik plakaları aynı inkübatöre yerleştirin.
- Oyun kumandası ekipmanını ve bilgisayar sistemini açın. Yazılım simgesini açın ve istediğiniz rejimi yapılandırın: kullanılacak yükleme istasyonunun boyutu, gerinim tipi, uzama yüzdesi, dalga formu şekli, frekans ve zaman. Ayrıntılı bilgi için üreticinin yönergelerine bakın. Rejimi seçin ve indirin. Burada, aşağıdaki rejim kullanılmıştır: 1/2 sinüs dalga formu şekli, 1 Hz frekans, uzamanın% 5'i (venöz gerilmeyi taklit etmek için) ve uzamanın% 15'i (arteriyel gerilmeyi taklit etmek için) 72 saate kadar.
- Vakum sistemini açın ve germe işlemini çalıştırmak için bilgisayar ekranında Başlat'a tıklayın. Silikon membranın hareket edip etmediğini ve hücreleri gerip germediğini kontrol edin.
- Uyaran tamamlandıktan sonra, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve numuneleri gerekli tahlile göre toplamaya devam edin. Burada, siklik gerilmenin etkinliğini göstermek için, hSVEC kültür ortamını toplayın, daha fazla nitrik oksit (NO) ölçümü için -80 ° C'de tutun ve floresan boyama için hücreleri sabitleyin.
NOT. Taban plakası, kullanılmadığında inkübatörün içinde saklanamaz; Aksi takdirde, sıcaklık düz şekli değiştirebilir ve işe yaramaz hale getirebilir.
- Döngüsel gerilme protokolünün etkinliğinin gösterilmesi
- F-aktinin floresan boyaması
- Hücreleri adım 1.4.3'te gösterildiği gibi düzeltin. Kuyu başına 1 mL'lik bir hacim kullanın.
- Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri PBS'de tutun, böylece silikon membranı sonraki adımlar için hazırlarken kurumazlar.
- Fazla silikon bazlı yağlayıcıyı membranın tabanından çıkarmak için pamuklu çubuk kullanın. Ardından, yeni bir pamuklu çubukla yavaşça pencere temizleyicisi veya el sabunu uygulayın. Tüm yağlayıcı membrandan çıkarılana kadar işlemi tekrarlayın. Ardından, deiyonize su ile temizleyin.
NOT. İyi kalitede mikroskopi görüntülerine sahip olmak için yağlayıcıyı silikon membrandan tamamen çıkarmak önemlidir. - Silikon membranları, boyama için 8 delikli odacıklı slaytlara sığacak şekilde dikkatlice küçük parçalara ayırın. Hücreleri adım 1.4.5'te belirtildiği gibi geçirgenleştirin.
- Yıkama adımlarından sonra, F-aktin'i faloidin kullanarak ve çekirdeği DAPI ile lekeleyin. 2.3.1.2 ve 2.3.1.3 adımlarında belirtildiği gibi analize devam edin. Oda başına 0,3 mL'lik bir hacim kullanın.
- Ortam odasını ayırıcı ile çıkarın. Bir damla montaj ortamı reaktifi (PBS'de% 50 gliserol) yerleştirin ve bir cam slayt (24 mm x 60 mm) yerleştirin.
- Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
NOT: DAPI, bir DAPI ışık küpüyle algılanır (Ör: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) ve faloidin kırmızı floresan protein (RFP) ışık küpü (Ör: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Benzer bir uyarma / emisyon dalga boyu aralığına sahip ışık küpleri de bu florokromlar için yeterlidir. Başka florokromlar kullanılıyorsa, kullanılan mikroskopun algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin.
- NO ölçümü-potasyum iyodür bazlı indirgeyici kemilüminesans testi kullanılarak hSVEC şartlandırılmış ortamdaki nitrit (NO2) birikimi ile tahmin edilir
- Hazırlık
- 0.01-10 mM sodyum nitrit (ultra saf sudaNaNO2 ) çözeltisinden standart bir eğri hazırlayın.
- Nitrik oksit analizörünün temizleme kabına 5 mL asetik asit ve 1 mL potasyum iyodür (1 mL ultra saf suda 50 mg) ekleyin.
- Ölçüm YOK
- Nitrik oksit analizörünün temizleme kabınaNaNO2 standart eğrisinin 20 μL'sini ekleyin. Üreticinin protokolüne göre ölçün.
- Hazırlık
- Nitrik oksit analizörünün temizleme kabına 20 μL şartlandırılmış ortam ekleyin. Üreticinin protokolüne göre ölçün.
- Standart eğri kalibrasyonuna göreNO2 konsantrasyonlarını hesaplayın. Analiz edilen şartlandırılmış ortamın toplam hacmi ile elde edilen değerleri ayarlayın 6,11.
- F-aktinin floresan boyaması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tipik olarak, yapışmış EC'ler ekstraksiyondan 3-4 gün sonra gözlenebilir. hSVEC'ler başlangıçta hücre kümeleri oluşturur ve tipik bir "parke taşı" morfolojisi gösterir (Şekil 1B). EC belirteçleri CD31 (Şekil 1C,D) ve VE-kadherini (Şekil 1D) ifade ederler. hSVEC'ler, kaplanmamış tedavi edilmiş bir hücre kültürü kabında kolayca çoğaltılabilir ve kültürdeki endotel fenotipini sekiz pasaja kadar korurlar.
hSVEC'ler, kesme gerilmesi altında kültürlendiğinde, akış yönünde hizalanır (Şekil 2A). 72 saat boyunca 20 dyn/cm2'lik kayma gerilmesi, tipik mekanosensitif genlerin, KLF2, KLF4 ve NOS3'ün ekspresyonunu indükleyerek, hSVEC'lerde kesme uyaranının etkinliğini gösterir (Şekil 2B)12,13,14.
Döngüsel gerilme sonucu, hSVEC'lere uygulanan yoğunluğa bağlıdır. Düşük gerilme altındaki hücreler, statik hücrelere benzer kortikal bir F-aktin paterni gösterir (Şekil 3A), 72 saate kadar NO salınımında değişiklik olmadan (Şekil 3B). Arteriyel gerilme seviyeleri 24 saat sonra aktin sitoiskeletini yeniden şekillendirir (Şekil 3A) ve 72 saat sonra NO salınımını azaltır (Şekil 3B).
Şekil 1: İnsan safen venlerinden (hSVEC'ler) alınan endotel hücreleri tipik endotel morfolojisi ve spesifik EC belirteç ekspresyonu sergiler. (A) ECs'nin ekstraksiyonu için tip II kollajenaz çözeltisi ile doldurulmuş safen ven segmenti. (B) Ekstraksiyondan sonra hSVEC büyümesinin temsili zaman seyri. 3-4 gün sonra, birleşime ulaşana kadar çoğalan hücre kümelerini görselleştirmek mümkündür. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Geçiş 1'de kültürlenmiş hSVEC'lerin FACS analizi. Yeşil çizgi, hücre popülasyonunun% 99.7'sinin endotelyal spesifik belirteç CD31 için pozitif olduğunu gösterir. Siyah çizgi negatif kontroldür. (D) Geçiş 1'deki hSVEC'lerde CD31 (yeşil), (E) VE-kadherin (yeşil) ve çekirdekler DAPI (mavi) için immünoboyama. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: hSVEC'ler akış yönünde hizalanır ve tek yönlü kayma stresine maruz kaldıklarında mekanosensitif genleri eksprese ederler. Statik veya tek yönlü laminer kayma gerilmesi koşulları altında yetiştirilen hSVEC'lerin konfluent hücre tek katmanı. (A) 72 saat boyunca 20 dyn/cm2 kesme gerilmesine maruz kalan hSVEC'lerin faz-kontrast görüntüleri (üstte) ve faloidin boyamasında (altta). Yeşil: aktin filamentleri; mavi: hücre çekirdekleri. Ölçek çubuğu = 100 μm (faz kontrastı) ve 20 μm (floresan). (B) qRT-PCR ile belirlenen KLF2, KLF4 ve NOS3'ün gen ekspresyonu. Değerler ortalama ± SEM'i temsil eder. ** p < statik gruba karşı 0,01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Siklik gerilme altındaki hSVEC fenotipi, uygulanan yoğunluğa bağlıdır . (A) Statik, düşük (venöz) veya yüksek (arteriyel) altında yetiştirilen hSVEC'lerin konfluent hücre tek katmanı, 24 saat boyunca esnek bir alt plakada gerilir. Dapi (mavi) ile aktin liflerini (kırmızı) ve çekirdekleri gösteren faz-kontrast görüntüleri (üstte) ve faloidin boyama (altta). Ölçek çubuğu = 100 μm (faz kontrastı) ve 50 μm (floresan). (B) NO ölçümü, hücre kültürü ortamında 72 saat boyunca NO2 birikimine dayanarak tahmin edilmemiştir. Değerler ortalama ± SEM'i temsil eder. *** p < 0.001 statik gruba karşı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Gen | Protein | İleri 5'-3' | Ters 5'-3' | ||
| KLF2 | Krüppel benzeri Faktör 2 | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCTCACCTG | ||
| KLF4 | Kruppel benzeri Faktör 4 | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGGGCAC | ||
| NOS3 | Nitrik Oksit Sentaz, Endotelyal | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| PPIA | Siklofilin A, | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC | ||
| Peptidilprolil izomeraz A | |||||
Tablo 1: Kayma gerilmesi ve referans genler için qRT-PCR primerleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hSVEC'leri başarılı bir şekilde izole etmek için safen ven segmenti en az 2 cm olmalıdır. Küçük segmentlerin, hücreleri izole etmek için kollajenaz çözeltisini korumak için damarın uçlarını tutması ve bağlaması zordur. Azaltılmış luminal yüzey alanı, kültürü genişletmek için yeterli hücre vermez. ECs olmayanlarla kontaminasyon riskini en aza indirmek için, safen ven segmentinin manipülasyonu tüm prosedür boyunca çok nazik olmalıdır. Kanı çıkarmak için pipet uçlarını luminal yüzeylere sokarken ve kollajenaz çözeltisinin uygulanması sırasında dikkatli olmak önemlidir. Kültürün ECs olmayan maddelerle kontaminasyonunu azaltmak için enzim çözeltisine maruz kalma çok iyi kontrol edilmelidir (en fazla 1 saat). Büyüme faktörleri kokteyli ile desteklenen belirli bir EC ortamının kullanılması, hSVEC kültürünün büyümesi için çok önemlidir. Kültürün ilk günlerinde ilave heparin, damar segmentinden kalan kırmızı kan hücrelerini azaltmak ve düz kas hücresi proliferasyonunu inhibe etmek için önemlidir15. Hücreleri deneyler için veya kültürü korumak için geçirirken, hücreleri% 40'tan daha yüksek bir birleşimle kapladığınızdan emin olun. EC'lerin iyi bir çoğalma ve hayatta kalma sağlamak için minimum temasa ihtiyacı vardır. hSVEC'ler kaplanmamış (örneğin jelatin veya fibronektin) bir yüzeyde kolayca kültürlenebilir. Bununla birlikte, EC ekstraksiyonundan sonraki ilk günlerde yapılan kaplama, EC yapışmasını ve verimini artıracaktır. hSVEC'ler sabit bir proliferasyon hızına sahiptir ve mezenkimal hücre belirteçlerini (SM22 ve kalponin gibi) eksprese etmeden endotel fenotipini sekiz pasaja kadar korur. Deneyimlerimize göre, proliferasyon hızı doku donörüne bağlı olarak değişebilir, ancak bir hücre geçişi ile değil. Hücreleri çözdükten sonra canlılığı arttırmak için FBS'deki hSVEC'lerin% 5 DMSO ile kriyoproteksiyonu önerilir.
Bir kesme gerilmesi deneyi yapmak için, dikkate alınması gereken kritik adımlar vardır. Sistemin içinde hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için, perfüzyon seti ve konektörler gece boyunca 37 °C ve %5 CO2'de dengelenmelidir. Kabarcıklar sistemdeki akışı engelleyebilir veya hücre fenotipine müdahale eden endotel monokatmanına zarar verebilir. Hücreleri akış odası slaytına tohumlarken, 4 saat sonra veya ertesi gün kullanmak için akıcı olması önerilir. Ayrıca, deneme birkaç gün boyunca çalışıyorsa, slaytın ortamını statik koşullarda her gün değiştirmek zorunludur. Akış odası slaytının hacmi ~ 160 μL'dir ve hücreleri uzun süre kültür için korumak yeterli değildir. Sistem, hücreleri mikroskopi ile kolayca gözlemleme avantajına sahiptir (floresan mikroskobu için parlak alan / faz kontrastı veya boyama). Sınırlama, proteinlerin (20-25 μg / slayt) ve RNA'nın (1 μg / slayt) düşük verimidir. Bunun üstesinden gelmek için, sistem aynı akışkan üniteyi kullanarak bir serideki birkaç slaytın bağlanmasına izin verir (üreticinin talimatlarına bakın). Daha sonra, proteini veya RNA'yı birkaç slayttan çıkarmak için bir slayt için lizis tamponunun hacmini kullanmak mümkündür.
Streç sisteminin kullanımı kolaydır ve farklı yoğunluklarda ve germe tiplerinin uygulanmasına izin verir. Kültür plakası membranı ile istasyon arasındaki sürtünmeyi azaltmak ve döngüsel gerinimin doğru dağılımını garanti etmek için her deneyden önce tüm yükleme istasyonlarının yağlanması önemlidir. İstenilen gerilmeye ulaşmak için gerekli vakumu üretmek için plakaların taban plakasına tamamen kapatıldığından emin olun. Eşeksenel uyaran, kuyu içinde düzgün bir gerinim üretmez. Kuyunun kenarındaki hücrelerin, üretici tarafından belirtildiği gibi atılması gerekir. İlgilenilen membran alanı, yükleme istasyonu çapına ve uzama yüzdesine göre belirlenir. İmmün boyamayı tüm membranda gerçekleştirmek veya tahlilde kullanılan antikorların miktarını azaltmak için daha küçük parçalara ayırmak mümkündür. Bu durumda, zarlar hücrelere zarar vermekten kaçınarak çok dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Araştırmacılar ayrıca boyama yaparken zarı baş aşağı çevirmemeye ve hücreleri kaybetmemeye özen göstermelidir. Optik mikroskopi altında hücrelerle zarın doğru yüzünü doğrulamak her zaman mümkündür.
Bunun gibi in vitro çalışmaların en büyük sınırlaması, in vivo ortamı tam olarak özetlememeleridir. Bu nedenle, hSVEC'lerin EC fenotipini (EC belirteçlerini ifade eden) koruduğundan ve mekanik stres altında (F-aktin oryantasyonu ve mekanik tepki proteinlerinin düzenlenmesi / üretimi) beklenen sonuçları yeniden ürettiğinden emin olmak için her zaman analiz yapmak önemlidir.
Özetle, hSVEC'leri izole etmek ve bunları kontrollü kayma gerilmesi ve gerilme seviyelerine maruz bırakmak için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bir SV grefti KABG sonrası aniden arteriyel koşullara maruz kaldığında, endotel hasarı oluşur ve greft yetmezliğine katkıda bulunur. Bu protokoller, mekanik kuvvetlerin ven grefti hastalığı ile ilişkili hSVEC disfonksiyonunu nasıl etkilediğine dair anlayışımızı geliştirmede etkili olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
JEK, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ve 2013/17368-0] ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ve 309179/2013-0) hibeleriyle desteklenmektedir. AAM, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9) hibeleriyle desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
