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Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65122
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung humaner Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Wir stellen auch detaillierte Methoden zur Erzeugung von Scherspannung und Dehnung zur Verfügung, um mechanische Spannungen in hSVECs zu untersuchen.

Abstract

Die Koronararterien-Bypass-Transplantation (CABG) ist ein Verfahren zur Revaskularisierung des ischämischen Myokards. Die Vena saphena wird trotz der im Vergleich zu arteriellen Conduits reduzierten Langzeitdurchgängigkeit weiterhin als CABG-Conduit verwendet. Der abrupte Anstieg des hämodynamischen Stresses, der mit der Arterialisierung des Transplantats einhergeht, führt zu einer Schädigung der Gefäße, insbesondere des Endothels, die die geringe Durchgängigkeit des Venentransplantats saphena (SVG) beeinflussen kann. Hier beschreiben wir die Isolierung, Charakterisierung und Expansion von humanen Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Zellen, die durch Kollagenaseverdau isoliert wurden, weisen die typische Kopfsteinpflastermorphologie auf und exprimieren die Endothelzellmarker CD31 und VE-Cadherin. Um den Einfluss der mechanischen Beanspruchung zu beurteilen, wurden in dieser Studie Protokolle verwendet, um die beiden wichtigsten physikalischen Stimuli, Scherspannung und Dehnung, auf arteriale SVGs zu untersuchen. hSVECs werden in einer parallelen Plattenströmungskammer kultiviert, um Scherspannungen zu erzeugen, die eine Ausrichtung in Strömungsrichtung und eine erhöhte Expression von KLF2, KLF4 und NOS3 zeigen. hSVECs können auch in einer Siliziummembran kultiviert werden, die eine kontrollierte Zelldehnung ermöglicht, die venöse (niedrige) und arterielle (hohe) Dehnung nachahmt. Das F-Aktin-Muster der Endothelzellen und die Stickstoffmonoxid (NO)-Sekretion werden entsprechend durch die arterielle Dehnung moduliert. Zusammenfassend stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung von hSVECs vor, um den Einfluss von hämodynamischem mechanischem Stress auf einen endothelialen Phänotyp zu untersuchen.

Introduction

Die Dysfunktion der Endothelzellen (EC) ist ein wichtiger Faktor beim Versagen des Venentransplantatssaphena 1,2,3,4. Die anhaltende Zunahme der Scherspannung und der zyklischen Dehnung induziert den proinflammatorischen Phänotyp der humanen Saphena-Endothelzellen (hSVECs)3,4,5,6. Die zugrunde liegenden molekularen Signalwege sind noch nicht vollständig verstanden, und standardisierte Protokolle für In-vitro-Studien könnten die Bemühungen um neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet unterstützen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Expansion von hSVECs und wie sie unterschiedlichen Scherbelastungen und zyklischen Dehnungen ausgesetzt werden können, um die venösen und arteriellen hämodynamischen Bedingungen nachzuahmen.

hSVECs werden durch Kollagenase-Inkubation isoliert und können bis zur Passage 8 verwendet werden. Dieses Protokoll erfordert im Vergleich zu den anderen verfügbaren Protokollen weniger Manipulation des Gefäßes7, was die Kontamination mit glatten Muskelzellen und Fibroblasten reduziert. Andererseits ist ein größeres Gefäßsegment von mindestens 2 cm erforderlich, um eine effiziente EC-Extraktion zu erreichen. In der Literatur wurde berichtet, dass ECs aus großen Gefäßen auch durch mechanische Entfernung gewonnen werden können 7,8. Obwohl der physikalische Ansatz effektiv ist, hat er die Nachteile einer niedrigen EC-Ausbeute und einer höheren Fibroblastenkontamination. Um die Reinheit zu erhöhen, sind zusätzliche Schritte mit magnetischen Beads oder Zellsortierung erforderlich, was die Kosten des Protokolls aufgrund des Erwerbs von Beads und Antikörpern erhöht 7,8. Die enzymatische Methode führt zu schnelleren und besseren Ergebnissen in Bezug auf EC-Reinheit und Lebensfähigkeit 7,8.

Die am häufigsten verwendeten ECs zur Untersuchung der endothelialen Dysfunktion sind humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs). Es ist bekannt, dass sich der EC-Phänotyp in verschiedenen Gefäßbetten ändert, und es ist wichtig, Methoden zu entwickeln, die das untersuchte Gefäß darstellen 9,10. In dieser Hinsicht ist die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung eines hSVEC und seiner Kultivierung unter mechanischer Belastung ein wertvolles Werkzeug, um den Beitrag der hSVEC-Dysfunktion bei Venentransplantaterkrankungen zu verstehen.

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Protocol

Ungenutzte Segmente der Vena saphena wurden von Patienten entnommen, die sich am Herzinstitut (InCor) der Medizinischen Fakultät der Universität von São Paulo einer aortokoronaren Bypass-Operation unterzogen. Alle Personen gaben ihre Einwilligung zur Teilnahme an der Studie, die von der örtlichen Ethikkommission geprüft und genehmigt wurde.

1. Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären humanen Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs)

  1. Präparat
    1. Autoklavieren Sie eine gerade oder gebogene Pinzette und eine Taschentuchschere (7-8 cm).
    2. Bereiten Sie sterile Gelatine vor. 0,1 g (0,1 Gew.-%) oder 3 g (3 Gew.-%) Schweinehautgelatine mit 100 ml Reinstwasser mischen, 15 min autoklavieren und bei 4 °C lagern. Auf 37 °C erwärmen, um sich zu verflüssigen, bevor die Zellkulturschalen und Objektträger beschichtet werden.
    3. Bereiten Sie sterile Kollagenase (1 mg/ml) in der Laminar-Flow-Haube vor. Verdünnen Sie die Kollagenase in PBS und sterilisieren Sie sie mit einem 0,2 μm-Filter.
    4. Eine 60-mm-Zellkulturschale und einen 8-Well-Objektträger werden mindestens 30 min bei 37 °C mit 0,1 Gew.-% Gelatine bestreichen. Entfernen Sie die überschüssige Gelatine, bevor Sie die Zellen aussäen.
    5. Bereiten Sie ein komplettes Endothelzellmedium vor: Endothelzellwachstum Basalmedium (EBM-2), ergänzt mit EGM2-Wachstumsfaktoren.
      HINWEIS: Die EGM2-Wachstumsfaktoren werden als Kit von einem Unternehmen geliefert, das in der Materialtabelle aufgeführt ist. Über die Konzentration der Faktoren wird vom Unternehmen Stillschweigen vereinbart.
    6. Stellen Sie 2 % und 5 % Rinderserumalbumin (BSA), 4 % Paraformaldehyd (PFA) und 0,1 % Triton X-100-Lösungen her, alles in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Isolation und Kultur von hSVECs
    1. Entnahme eines mindestens 2-3 cm langen Venenabschnitts saphena für diesen Eingriff.
      ANMERKUNG. Alle Zellkulturverfahren müssen unter sterilen Bedingungen und in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
    2. Übertragen Sie das Venensegment in eine Petrischale, die mit vorgewärmtem PBS gefüllt ist. Führen Sie eine Pipettenspitze in ein Ende der Vene ein und spülen Sie sie vorsichtig mit PBS, um das gesamte Blut im Lumen zu entfernen. Spülen Sie es, bis der Waschfluss vollständig klar ist.
    3. Verschließen Sie eines der Enden der Vene mit einer sterilen Baumwollnaht. Füllen Sie das Gefäß vorsichtig mit 1 mg/ml Kollagenase-Typ-II-Lösung. Verschließen Sie das andere Ende des Gefäßes mit einer Baumwollnaht (Abbildung 1A). Inkubieren Sie das Gefäß mit Kollagenaselösung in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 °C für 1 h.
    4. Schneiden Sie danach eines der Enden des Gefäßes in ein 15-ml-Röhrchen und sammeln Sie die Kollagenase-Lösung. Schneiden Sie das andere Ende ab und spülen Sie die luminale Oberfläche mit 1-2 ml PBS, um alle abgelösten ECs aufzufangen. Geben Sie das gesamte PBS zusammen mit der Kollagenaselösung in ein und dasselbe Röhrchen.
    5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um die Zellen zu pelletieren.
      ANMERKUNG. Das Zellpellet ist sehr klein und schwer zu visualisieren. Wenn das Blut vor der Kollagenase-Behandlung (Schritt 1.2.2.) nicht vollständig entfernt wird, fallen auch die Blutzellen aus und das Pellet wird rötlich.
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3-4 ml vollständigem Endothelzellmedium (EBM-2 ergänzt mit EGM2-Wachstumsfaktoren) und einer zusätzlichen Heparinlösung (5 U/ml, Endkonzentration). Die Zellen werden in einer 60-mm-Zellkulturschale mit 3 % Gelatine vorbeschichtet.
      HINWEIS: Gelatine war aufgrund ihrer einfachen Zugänglichkeit und geringen Kosten die erste Wahl. Da die Beschichtung mit Gelatine den EC-Phänotyp erfolgreich beibehält, wurde keine andere Überzugssubstanz getestet. Kollagene und Fibronektin können in Studien getestet werden, die den Einfluss verschiedener extrazellulärer Matrixkomponenten auf die EC-Adhäsion und den Phänotyp untersuchen sollen.
    7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO2 für 4 Tage ohne Wechsel des Mediums. Wechseln Sie danach jeden zweiten Tag die Medien. Ab diesem Moment ist die zusätzliche Zellmedienergänzung mit Heparin nicht mehr notwendig. Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden.
    8. 3-10 Tage nach der Extraktion, je nach Größe und Durchmesser des Venensegments, werden die hSVECs mittels Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht.
    9. Bewerten Sie den Grad der Konfluenz und ihre Kopfsteinpflastermorphologie in der Phasenkontrastmikroskopie.
    10. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 70%-80% erreichen.
    11. Passage der hSVECs mit 0,25%iger Trypsin-0,02%iger Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung.
      1. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem PBS.
      2. Geben Sie 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung in die 60-mm-Zellkulturschale. Bei 37 °C 2 min inkubieren lassen oder bis sich alle Zellen gelöst haben.
      3. Fügen Sie 2 ml des vollständigen Endothelzellmediums hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren.
      4. Die Zellsuspension wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und bei 300 x g 3 min bei RT zentrifugiert.
      5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Nährmedium.
      6. Zählen Sie die Zellsuspension in 1:1 Trypanblau (0,4%), um lebensfähige Zellen zu plattieren.
      7. Um die Kultur zu erweitern, werden die Zellen in einer 100-mm-Zellkulturschale mit 10 mL vorgewärmtem Endothelzellmedium beschichtet und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert.
        ANMERKUNG. Im Durchschnitt ist die Aussaat von 4 x 104 hSVEC/cm2 nach 48 h zu 100 % konfluent.
    12. Um die Zellen zu kryokonservieren, resuspendieren Sie das Pellet aus Schritt 1.2.11.5 in 5%igem Dimethylsulfoxid (DMSO) in fötalem Kälberserum (FBS) und lagern Sie es in flüssigem Stickstoff.
  3. Charakterisierung von hSVECs: Durchflusszytometrische Färbung für CD31
    1. 1 x 105 hSVECs in ein 1,5-ml-Röhrchen überführen und bei 300 x g 3 min bei RT zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl PBS mit 2 % BSA und CD31-FITC-monoklonalen Antikörpern (1:100).
    2. Färben Sie die Zellen 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
    3. Waschen Sie die gefärbten Zellen durch Zugabe von 0,5 ml PBS und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 3 min bei RT. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 μl PBS mit 2 % BSA.
    4. Verwenden Sie unmarkierte hSVECs ohne CD31-Antikörper als Negativkontrolle.
    5. Fahren Sie mit der Durchflusszytometer-Erfassungsanalyse mit einem blauen Laser und einem FITC-Kanal fort (Anregungs-/Emissionsmaximum [Ex/Em] von 498/517 nm). Wenn andere Fluorochrome verwendet werden, prüfen Sie, ob das Zytometer über geeignete Filtersätze für deren Nachweis verfügt. Trennen Sie die Zellen von Trümmern in Abhängigkeit von ihrer Größe und Granularität und ordnen Sie dann einzelne Zellen durch Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung ein.
  4. Charakterisierung von hSVECs: Fluoreszenzfärbung für CD31 und VE-Cadherin
    1. Platte 0,1 x 105 Zellen in den gelatinebeschichteten 8-Well-Kammerobjektträger. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2, damit sich die Zellen an der Kulturoberfläche anheften können.
    2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
    3. Fügen Sie 0,3 ml/Well von 4% PFA hinzu, um die Zellen zu fixieren. 15 min bei RT inkubieren.
    4. Dreimal mit PBS waschen.
    5. Fügen Sie 0,3 ml/well 0,1%ige Triton X-100-Lösung hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren. 15 min bei RT inkubieren.
    6. Dreimal mit PBS waschen.
    7. Um unspezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren, fügen Sie den Zellen 0,3 ml/well einer 5%igen BSA-Lösung hinzu. 15 min bei RT inkubieren.
    8. Dreimal mit PBS waschen.
    9. Inkubation der Zellen mit den in PBS mit 2% BSA verdünnten Primärantikörpern (CD31 und VE-Cadherin, 1:100) über Nacht unter leichtem Schaukeln bei 4 °C. Lassen Sie eine Vertiefung mit PBS mit 2% BSA (kein primärer Antikörper) als Negativkontrolle inkubieren.
    10. Dreimal mit PBS waschen.
    11. Inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, verdünnt (1:500) in PBS für 1 h bei RT. Fügen Sie 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für die Kernfärbung auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml hinzu.
    12. Dreimal mit PBS waschen.
    13. Entfernen Sie die Medienkammer mit dem Abscheider. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums Reagenz (50 % Glycerin in PBS) und legen Sie einen Glasobjektträger (24 mm x 60 mm) ein, um das Einfangen von Blasen zu vermeiden.
    14. Beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
      HINWEIS: DAPI wird mit einem DAPI-Lichtwürfel (Bsp. 335-379 nm; Em: 417-477 nm) und CD31/VE-Cadherin wird mit einem grün fluoreszierenden Protein-Lichtwürfel (GFP) nachgewiesen (Bsp.: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lichtwürfel mit einem ähnlichen Anregungs-/Emissionswellenlängenbereich sind für diese Fluorochrome ebenfalls geeignet. Wenn andere Fluorochrome verwendet werden, prüfen Sie, ob das verwendete Mikroskop über geeignete Filtersätze für deren Detektion verfügt.

2. Schubbeanspruchung von hSVECs

  1. Präparat
    1. Den Objektträger der Strömungskammer mindestens 30 min bei 37 °C mit 0,1 Gew.-% Gelatine bestreichen. Entfernen Sie überschüssige Gelatine, bevor Sie die Zellen aussäen.
    2. Die Fluidikeinheit und das sterile Perfusionsset mit 10-ml-Reservoirs werden über Nacht im Inkubator in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 °C äquilibriert.
  2. Scherspannungs-Experiment
    1. Säen Sie 2 x 105 ECs, suspendiert in 100 μl EC-Medium, in den gelatinebeschichteten Strömungskammerschieber. Inkubieren Sie die Zellen für 4 h bei 37 °C und 5 % CO2 , damit sich die Zellen an der Kulturoberfläche anheften können.
    2. Setzen Sie das Perfusionsset wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben auf die Fluidikeinheit. Füllen Sie die Reservoirs und das Perfusionsset in ca. 12 mL vorgewärmtes vollständiges Endothelzellmedium. Entfernen Sie manuell Luftblasen aus dem Perfusionsset, um den Füllstand beider Reservoirs bei 5 ml auszugleichen.
    3. Setzen Sie die Fluidikeinheit mit dem montierten Perfusionsset ohne Kammerschieber in den Inkubator ein und schließen Sie das Stromkabel an die computergesteuerte Pumpe an. Entfernen Sie alle Luftblasen aus den Behältern und dem Perfusionsset, indem Sie ein vordefiniertes Protokoll in der Pumpensteuerungssoftware ausführen.
      ANMERKUNG. Es ist sehr wichtig, Luftblasen zu entfernen, damit das System richtig funktioniert.
    4. Nehmen Sie die Fluidikeinheit mit dem montierten Perfusionsset an die Laminar-Flow-Haube und befestigen Sie die Objektträger mit einer konfluenten Zellmonoschicht.
    5. Setzen Sie die Fluidikeinheit mit den montierten Perfusions- und Objektträgern mit Zellen in den Inkubator ein und schließen Sie das Stromkabel an die Pumpe an.
    6. Stellen Sie in der Pumpensteuerungssoftware die folgenden Parameter ein: Viskosität des Mediums (0,0072), Art des Schiebers, Kalibrierungsfaktor des Perfusionssatzes, Scherspannungsrate (20 dyn/cm 2), Strömungsart (unidirektional) und Zeit (72 h) und Starten Sie den Durchfluss (weitere Informationen finden Sie in der Geräteanleitung). Ernten Sie die Zellen, die mit den gleichen Medien behandelt wurden, ohne sie dem Durchfluss auszusetzen, wie es bei statischen Kontrollen der Fall ist.
    7. Nachdem der Stimulus abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fahren Sie mit der Entnahme der Proben gemäß dem erforderlichen Assay fort. Für die Fluoreszenzfärbung siehe Schritt 2.3.1 und für die RNA-Extraktion siehe Schritt 2.3.2.
  3. Demonstration der Wirksamkeit des Schubspannungsprotokolls
    1. Fluoreszenzfärbung von Aktinfilamenten (F-Aktin)
      1. Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen wie in den Schritten 1.4.2-1.4.6 beschrieben. Verwenden Sie ein Volumen von 100 μl im μ-Objektträger.
      2. Färben Sie das F-Aktin mit fluoreszenzmarkiertem Phalloidin (verdünnt im Verhältnis 1:200 in PBS) und konfärben Sie den Zellkern mit DAPI (Endkonzentration von 1 mg/ml in PBS) für 2 h bei RT, geschützt vor Licht.
      3. Dreimal mit PBS waschen.
      4. Beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
        HINWEIS: DAPI wird mit einem DAPI-Lichtwürfel (Bsp. 335-379 nm; Em: 417-477 nm) und Phalloidin wird mit einem GFP-Lichtwürfel (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lichtwürfel mit einem ähnlichen Bereich der Anregungs-/Emissionswellenlänge sind für diese Fluorochrome ebenfalls geeignet. Wenn andere Fluorochrome verwendet werden, prüfen Sie, ob das verwendete Mikroskop über geeignete Filtersätze für deren Detektion verfügt.
    2. Genexpression mittels quantitativer reverser Transkription in Echtzeit (RT-qPCR)
      1. Die Zellen werden mit 350 μl eines handelsüblichen Guanidin-Thiocyanat-haltigen Lysepuffers aus dem μ-Objektträger entnommen. Isolieren Sie die gesamte RNA mit säulenbasierten Extraktionskits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
        HINWEIS: Aufgrund der begrenzten Anzahl von Zellen, die im μ-Slide kultiviert werden, wird die Verwendung einer säulenbasierten Extraktion von RNA empfohlen.
      2. Bereiten Sie cDNA mit einem cDNA-Synthesekit mit Transkriptase-Reverse-Enzym gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
      3. Überprüfen Sie die Expression der Gene, die durch Scherspannung reguliert werden: KLF2, KLF4 und NOS3. Verwenden Sie das Haushälter-Gen PPIA/Cyclophilin, um die Ergebnisse zu normalisieren. Die spezifischen Primer für die Reaktion sind in Tabelle 1 aufgeführt.
      4. Führen Sie die RT-qPCR mit einem grün fluoreszierenden SYBR-DNA-Färbekit unter den folgenden Reaktionsbedingungen durch: i) 50 °C für 2 min, ii) 95 °C für 15 min, iii) 94 °C für 15 s, iv) 60 °C für 30 s, v) 72 °C für 30 s. Wiederholen Sie die Schritte iii bis v für 40 Zyklen. Fügen Sie am Ende der Reaktion einen Schmelzschritt hinzu, um die Spezifität des Primers zu überprüfen.

3. Zyklische Dehnung auf hSVECs

  1. Präparat
    1. Tragen Sie silikonbasiertes Schmiermittel auf die Oberseiten und Seiten der gleichachsigen 6-Well-Ladestation von 25 mm auf.
      Anmerkungen: Dadurch wird die Reibung zwischen der Membran der Kulturplatte und der Station verringert, was eine bessere Verteilung der zyklischen Dehnung ermöglicht. Dieser Schritt muss vor jedem Experiment durchgeführt werden.
  2. Zyklisches Dehnungsexperiment
    1. Säen Sie 4 x 105 Zellen, die in 3 ml suspendiert sind, in jede Vertiefung der 6-Well-Kulturplatten mit flexiblem Boden, die mit Kollagen I beschichtet sind (Materialtabelle). Planen Sie, eine oder mehrere Platten im statischen Zustand als Kontrollgruppe zu haben. Bewahren Sie die Zellen im Inkubator (37 °C in befeuchteter Luft mit 5 % CO2) auf, bis sie 100 % Konfluenz erreichen (normalerweise 48 h nach der Aussaat). Waschen Sie die Zellen vor Beginn des Streckprotokolls einmal mit vorgewärmtem PBS und fügen Sie 3 ml frisches Nährmedium pro Vertiefung hinzu.
    2. Setzen Sie die Grundplatte mit allen geschmierten Ladestationen in den Inkubator ein und verbinden Sie den Schlauch entsprechend mit der Steuereinrichtung des Spannzellen-Streckbioreaktorsystems (weitere Details siehe Geräteanweisung).
    3. Befestigen Sie jede Kulturplatte an einer roten Dichtung, die vom Tension Cell Stretching Bioreactor System bereitgestellt wird. Legen Sie sie dann in die Grundplatte im Inneren des Inkubators.
      1. Stellen Sie sicher, dass die Platten vollständig sitzen, gepresst und mit der Grundplatte abgedichtet sind, um ein Austreten von Luft während des Vakuumpumpens zu vermeiden. Es ist wichtig, dass sich alle vier Kulturplatten in der Grundplatte befinden, um das richtige Vakuum und die Streckbelastung zu erreichen.
      2. Falls Sie weniger Versuchsplatten haben, verwenden Sie eine leere(n) Platte(n), um die vier Positionen in der Grundplatte zu vervollständigen. Legen Sie die Acrylplatte (im Lieferumfang enthalten) auf die Kulturplatten, um die Abdichtung der Grundplatte zu verbessern. Legen Sie die statischen Platten in denselben Inkubator.
    4. Schalten Sie die Controller-Geräte und das Computersystem ein. Öffnen Sie das Softwaresymbol und konfigurieren Sie das gewünschte Regime: Größe der zu verwendenden Ladestation, Art der Dehnung, Prozentsatz der Dehnung, Wellenformform, Frequenz und Zeit. Detaillierte Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. Wählen Sie das Programm aus und laden Sie es herunter. Hier wurde das folgende Schema verwendet: 1/2 Sinuswellenform, 1 Hz Frequenz, 5 % Dehnung (zur Nachahmung der venösen Dehnung) und 15 % Dehnung (zur Nachahmung der arteriellen Dehnung) bis zu 72 h.
    5. Schalten Sie das Vakuumsystem ein und klicken Sie auf dem Computerbildschirm auf Start , um das Dehnen auszuführen. Prüfen Sie, ob sich die Silikonmembran bewegt und die Zellen dehnt.
    6. Nachdem der Stimulus abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fahren Sie mit der Entnahme der Proben gemäß dem erforderlichen Assay fort. Um die Wirksamkeit der zyklischen Dehnung zu demonstrieren, sammeln Sie hier das hSVEC-Nährmedium, halten Sie es bei -80 °C für die weitere Stickstoffmonoxid (NO)-Messung und fixieren Sie die Zellen für die Fluoreszenzfärbung.
      ANMERKUNG. Die Grundplatte kann nicht im Inkubator aufbewahrt werden, wenn sie nicht verwendet wird. Andernfalls kann die Temperatur die flache Form verändern und unbrauchbar machen.
  3. Demonstration der Wirksamkeit des zyklischen Dehnungsprotokolls
    1. Fluoreszenzfärbung von F-Aktin
      1. Fixieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.4.3 beschrieben. Verwenden Sie ein Volumen von 1 ml pro Well.
      2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Halten Sie die Zellen in PBS, damit sie nicht austrocknen, während Sie die Silikonmembran für die nächsten Schritte vorbereiten.
      3. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um das überschüssige Gleitmittel auf Silikonbasis von der Unterseite der Membran zu entfernen. Tragen Sie dann vorsichtig Fensterreiniger oder Handseife mit einem neuen Wattestäbchen auf. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte Schmiermittel von der Membran entfernt ist. Anschließend mit deionisiertem Wasser reinigen.
        ANMERKUNG. Es ist wichtig, das Gleitmittel vollständig von der Silikonmembran zu entfernen, um Mikroskopiebilder von guter Qualität zu erhalten.
      4. Schneiden Sie die Silikonmembranen vorsichtig in kleine Stücke, damit sie zum Färben auf Objektträger mit 8 Wells passen. Permeabilisieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.4.5 beschrieben.
      5. Nach den Waschschritten färben Sie das F-Aktin mit Phalloidin und den Zellkern mit DAPI. Fahren Sie mit der Analyse fort, wie in den Schritten 2.3.1.2 und 2.3.1.3 beschrieben. Verwenden Sie ein Volumen von 0,3 ml pro Kammervertiefung.
      6. Entfernen Sie die Medienkammer mit dem Abscheider. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmedium-Reagenzes (50 % Glycerin in PBS) und legen Sie einen Glasobjektträger (24 mm x 60 mm) ein.
      7. Beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
        HINWEIS: DAPI wird mit einem DAPI-Lichtwürfel (Bsp. 335-379 nm; Em: 417-477 nm) und Phalloidin wird mit einem rot fluoreszierenden Protein (RFP) Lichtwürfel (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Lichtwürfel mit einem ähnlichen Bereich der Anregungs-/Emissionswellenlänge sind für diese Fluorochrome ebenfalls geeignet. Wenn andere Fluorochrome verwendet werden, prüfen Sie, ob das verwendete Mikroskop über geeignete Filtersätze für deren Detektion verfügt.
    2. NO-Messung - geschätzt durch die Nitritakkumulation (NO2) im hSVEC-konditionierten Medium unter Verwendung eines reduktiven Chemilumineszenz-Assays auf Kaliumjodidbasis
      1. Präparat
        1. Bereiten Sie eine Standardkurve aus 0,01-10 mM Natriumnitritlösung (NaNO2 in Reinstwasser) vor.
        2. Geben Sie 5 ml Essigsäure und 1 ml Kaliumjodid (50 mg in 1 ml Reinstwasser) in das Spülgefäß des Stickoxidanalysators.
      2. KEINE Messung
        1. Geben Sie 20 μl der NaNO2-Standardkurve in das Spülgefäß des Stickoxidanalysators. Messen Sie es gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    3. Geben Sie 20 μl des konditionierten Mediums in das Spülgefäß des Stickoxidanalysators. Messen Sie es gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    4. Berechnen Sie dieNO2-Konzentrationen auf der Grundlage der Standardkurvenkalibrierung. Passen Sie die Werte an, die sich aus dem Gesamtvolumen des analysierten konditionierten Mediums ergeben 6,11.

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Representative Results

Typischerweise können verklebte ECs 3-4 Tage nach der Extraktion beobachtet werden. hSVECs bilden zunächst Zellhaufen und weisen eine typische "Kopfsteinpflaster"-Morphologie auf (Abbildung 1B). Sie exprimieren die EC-Marker CD31 (Abbildung 1C,D) und VE-Cadherin (Abbildung 1D). hSVECs können leicht auf einer unbeschichteten, behandelten Zellkulturschale vermehrt werden und behalten den endothelialen Phänotyp in Kultur bis zu acht Passagen bei.

Wenn hSVECs unter Scherbeanspruchung kultiviert werden, richten sie sich in Fließrichtung aus (Abbildung 2A). Die Scherspannung von 20 dyn/cm2 für 72 h induziert die Expression typischer mechanosensitiver Gene, KLF2, KLF4 und NOS3, was auf die Wirksamkeit des Scherreizes in hSVECs hinweist (Abbildung 2B)12,13,14.

Das zyklische Dehnungsergebnis hängt von der Intensität ab, die auf die hSVECs angewendet wird. Zellen mit geringer Dehnung zeigen ein kortikales F-Aktin-Muster, das statischen Zellen ähnelt (Abbildung 3A), ohne dass sich die NO-Freisetzung bis zu 72 h ändert (Abbildung 3B). Die arterielle Dehnung modelliert das Aktin-Zytoskelett nach 24 Stunden (Abbildung 3A) und verringert die NO-Freisetzung nach 72 Stunden (Abbildung 3B).

Figure 1
Abbildung 1: Endothelzellen aus humanen Vena saphena (hSVECs) weisen eine typische Endothelmorphologie und eine spezifische EC-Markerexpression auf . (A) Venenabschnitt saphena, gefüllt mit Kollagenaselösung vom Typ II zur Extraktion von ECs. (B) Repräsentativer zeitlicher Verlauf des hSVEC-Wachstums nach Extraktion. Nach 3-4 Tagen ist es möglich, Zellhaufen sichtbar zu machen, die sich vermehren, bis sie Konfluenz erreichen. Maßstabsbalken = 100 μm. (C) FACS-Analyse von kultivierten hSVECs bei Passage 1. Die grüne Linie zeigt an, dass 99,7% der Zellpopulation positiv für den endothelialen Marker CD31 sind. Die schwarze Linie ist die Negativkontrolle. (D) Immunfärbung für CD31 (grün), (E) VE-Cadherin (grün) und Zellkern DAPI (blau) in hSVECs bei Passage 1. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: hSVECs richten sich in Fließrichtung aus und exprimieren mechanosensitive Gene, wenn sie einer unidirektionalen Scherspannung ausgesetzt werden. Konfluente Zellmonoschicht von hSVECs, die unter statischen oder unidirektionalen laminaren Scherspannungsbedingungen kultiviert wurden. (A) Phasenkontrastbilder (oben) und Phalloidinfärbung (unten) von hSVECs, die 72 h lang einer Scherspannung von 20 dyn/cm2 ausgesetzt waren. Grün: Aktinfilamente; blau: Zellkerne. Maßstabsbalken = 100 μm (Phasenkontrast) und 20 μm (Fluoreszenz). (B) Genexpression von KLF2, KLF4 und NOS3 bestimmt mittels qRT-PCR. Die Werte stellen den Mittelwert ± SEM dar. ** p < 0,01 gegenüber der statischen Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Der hSVEC-Phänotyp unter zyklischer Dehnung ist abhängig von der angewendeten Intensität . (A) Konfluente Zellmonoschicht von hSVECs, die unter statischer, niedriger (venöser) oder hoher (arterieller) Dehnung in einer flexiblen Bodenplatte für 24 h kultiviert werden. Phasenkontrastbilder (oben) und Phalloidinfärbung (unten) zeigen die Aktinfasern (rot) und Zellkerne mit DAPI (blau). Maßstabsbalken = 100 μm (Phasenkontrast) und 50 μm (Fluoreszenz). (B) Die NO-Messung wurde auf der Grundlage der NO2-Akkumulation in den Zellkulturmedien für72 h geschätzt. Die Werte stellen den Mittelwert ± SEM dar. *** p < 0,001 gegenüber der statischen Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Gen Protein Vorwärts 5'-3' Rückwärts 5'-3'
KLF2 Krüppel-ähnlicher Faktor 2 CCACTCACACCTGCAGCTA GTGGTAGGGCTTCTCACCTG
KLF4 Kruppel-ähnlicher Faktor 4 CACCTGGCGAGTCTGACATG CAGCGGTTATTCGGGGCAC
NOS3 Stickstoffmonoxid-Synthase, endothelial GCACAGTTACCAGCTAGCCA GCCGGACAGGAAATAGTT
PPIA Cyclophilin A, CATTTGGTGCAAGGGTCACA TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC
Peptidylprolylisomerase A

Tabelle 1: qRT-PCR-Primer für Scherbeanspruchung und Referenzgene.

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Discussion

Das Venensegment saphena sollte mindestens 2 cm groß sein, um hSVECs erfolgreich zu isolieren. Kleine Segmente sind schwer zu handhaben und binden die Enden des Gefäßes zusammen, um die Kollagenaselösung zu erhalten und die Zellen zu isolieren. Die reduzierte luminale Oberfläche liefert nicht genügend Zellen, um die Kultur zu erweitern. Um das Risiko einer Kontamination mit Nicht-ECs zu minimieren, muss die Manipulation des Venenabschnitts saphena während des gesamten Eingriffs sehr schonend erfolgen. Es ist wichtig, beim Einführen der Pipettenspitzen in die luminalen Oberflächen zur Blutentnahme und beim Einführen der Kollagenaselösung vorsichtig zu sein. Die Exposition gegenüber Enzymlösung sollte sehr gut kontrolliert werden (nicht länger als 1 h), um die Kontamination der Kultur mit Nicht-ECs zu reduzieren. Die Verwendung eines spezifischen EC-Mediums, das mit dem Wachstumsfaktoren-Cocktail ergänzt wird, ist entscheidend für das Wachstum der hSVEC-Kultur. Das zusätzliche Heparin in den ersten Tagen der Kultivierung ist wichtig, um verbleibende rote Blutkörperchen aus dem Venenabschnitt zu reduzieren und die Proliferation glatter Muskelzellen zu hemmen15. Wenn Sie die Zellen für Experimente oder zur Pflege der Kultur passieren, achten Sie darauf, die Zellen mit einem Konfluenz von mehr als 40 % zu plattieren. Die ECs brauchen ein Minimum an Kontakt, um eine gute Proliferation und ein gutes Überleben zu gewährleisten. Die hSVECs können problemlos auf einer unbeschichteten Oberfläche (z. B. Gelatine oder Fibronektin) kultiviert werden. Die Beschichtung in den ersten Tagen nach der EC-Extraktion erhöht jedoch die EC-Haftung und die Ausbeute. Die hSVECs haben eine konstante Proliferationsrate und halten den endothelialen Phänotyp bis zu acht Passagen aufrecht, ohne mesenchymale Zellmarker (wie SM22 und Calponin) zu exprimieren. Unserer Erfahrung nach kann die Proliferationsrate je nach Gewebespender variieren, jedoch nicht bei einer Zellpassage. Es wird empfohlen, hSVECs in FBS mit 5% DMSO zu kryokonservieren, um die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen der Zellen zu erhöhen.

Um ein Scherspannungsexperiment durchzuführen, müssen wichtige Schritte berücksichtigt werden. Um die Bildung von Luftblasen im Inneren des Systems zu vermeiden, müssen das Perfusionsset und die Anschlüsse über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 äquilibriert werden. Die Bläschen können den Fluss durch das System blockieren oder die endotheliale Monoschicht beschädigen und den Zellphänotyp stören. Bei der Aussaat der Zellen in den Durchflusskammerschieber wird empfohlen, ihn nach 4 Stunden oder am nächsten Tag konfluent zu verwenden. Darüber hinaus ist es zwingend erforderlich, das Medium des Objektträgers unter statischen Bedingungen täglich zu wechseln, wenn das Experiment mehrere Tage dauert. Das Volumen des Objektträgers in der Durchflusskammer beträgt ~160 μl und reicht nicht aus, um die Zellen über einen längeren Zeitraum zu kultivieren. Das System hat den Vorteil, dass die Zellen leicht mikroskopisch beobachtet werden können (Hellfeld/Phasenkontrast oder Färbung für die Fluoreszenzmikroskopie). Die Einschränkung ist die geringe Ausbeute an Proteinen (20-25 μg/Objektträger) und RNA (1 μg/Objektträger). Um dies zu überwinden, ermöglicht das System die Verbindung mehrerer Schlitten in Reihe mit derselben Fluidikeinheit (siehe Herstellerangaben). Dann ist es möglich, das Volumen des Lysepuffers für einen Objektträger zu nutzen, um das Protein oder die RNA aus mehreren Objektträgern zu extrahieren.

Das Stretchsystem ist einfach zu handhaben und ermöglicht die Anwendung unterschiedlicher Intensitäten und Dehnungsarten. Es ist wichtig, alle Ladestationen vor jedem Versuch zu schmieren, um die Reibung zwischen der Kulturplattenmembran und der Station zu verringern und eine ordnungsgemäße Verteilung der zyklischen Dehnung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Platten vollständig mit der Grundplatte versiegelt sind, um das Vakuum zu erzeugen, das zum Erreichen der gewünschten Dehnung erforderlich ist. Der gleichachsige Stimulus erzeugt keine gleichmäßige Dehnung innerhalb des Bohrlochs. Die Zellen am Rand des Bohrlochs müssen, wie vom Hersteller angegeben, entsorgt werden. Der interessierende Membranbereich wird anhand des Durchmessers der Ladestation und des prozentualen Dehnungsgrads bestimmt. Es ist möglich, die Immunfärbung in der gesamten Membran durchzuführen oder sie in kleinere Stücke zu schneiden, um die Menge der im Assay verwendeten Antikörper zu reduzieren. In diesem Fall müssen die Membranen sehr vorsichtig behandelt werden, um Schäden an den Zellen zu vermeiden. Forscher sollten auch darauf achten, die Membran nicht auf den Kopf zu stellen und die Zellen während der Färbung zu verlieren. Es ist immer möglich, die korrekte Oberfläche der Membran mit den Zellen unter dem Lichtmikroskop zu bestätigen.

Die größte Einschränkung solcher In-vitro-Studien besteht darin, dass sie die In-vivo-Umgebung nicht vollständig rekapitulieren. Aus diesem Grund ist es wichtig, immer Analysen durchzuführen, um sicherzustellen, dass hSVECs den EC-Phänotyp beibehalten (EC-Marker exprimieren) und die erwarteten Ergebnisse unter mechanischer Belastung reproduzieren (F-Aktin-Orientierung und Regulation/Produktion mechanischer Antwortproteine).

Zusammenfassend stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Verfügung, um hSVECs zu isolieren und sie kontrollierten Scherspannungen und Dehnungen auszusetzen. Wenn ein SV-Transplantat nach einer CABG plötzlich arteriellen Erkrankungen ausgesetzt wird, tritt eine Endothelschädigung auf, die zum Versagen des Transplantats beiträgt. Diese Protokolle könnten entscheidend dazu beitragen, unser Verständnis darüber zu verbessern, wie mechanische Kräfte die hSVEC-Dysfunktion im Zusammenhang mit Venentransplantaterkrankungen beeinflussen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

JEK wird durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 und 2013/17368-0] und des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 und 309179/2013-0) unterstützt. AAM wird durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) und des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution Gibco 25200072
15 µ slide I 0.4 Luer  Ibidi 80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) Thermo Fisher Scientific D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm  Flexcell International Corporation LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well Thermo Fisher Scientific 154453
Acetic Acid (Glacial) Millipore 100063
Acrylic sheet 1 cm thick Plexiglass
Anti-CD31 antibody Abcam ab24590
Anti-CD31, FITC antibody Thermo Fisher Scientific MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody Cell Signaling 2500
Bioflex plates collagen I Flexcell International Corporation BF3001C
Bovine serum albumin solution Sigma-Aldrich A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm Brasuture AP524
Cyclophilin forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Cyclophilin reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
EBM-2 basal medium Lonza CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements Lonza CC4176
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2657-029
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma-Aldrich F4680
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL Blau Farmacêutica SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) Ibidi 10902
KLF2 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF2 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer Sievers Instruments NOA-280i-1
NOS3 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOS3 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs Ibidi 10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031
Potassium Iodide Sigma-Aldrich 221945
QuanTitec SYBR green PCR kit Qiagen 204143
QuantStudio 12K flex platform  Applied Biosystems 4471087
RNeasy micro kit  Quiagen 74004
Slide glass (24 mm x 60 mm) Knittel Glass VD12460Y1D.01
Sodium nitrite Sigma-Aldrich 31443
SuperScript IV first-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18091200
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypan blue stain 0.4% Gibco 15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C6885

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References

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Girão-Silva, T., Fonseca-Alaniz, M. H., Oliveira Dallan, L. A., Valãdao, I. C., Oliveira da Rocha, G. H., Krieger, J. E., Miyakawa, A. A. Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch. J. Vis. Exp. (194), e65122, doi:10.3791/65122 (2023).

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