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Medicine

मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल सेल अलगाव और कतरनी तनाव और खिंचाव के नियंत्रित स्तर के संपर्क में

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65122
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg
* These authors contributed equally

Summary

हम मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) को अलग करने और कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एचएसवीईसी में यांत्रिक तनाव का अध्ययन करने के लिए कतरनी तनाव और खिंचाव का उत्पादन करने के लिए विस्तृत तरीके भी प्रदान करते हैं।

Abstract

कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्ट (सीएबीजी) सर्जरी इस्केमिक मायोकार्डियम को पुनर्जीवित करने की एक प्रक्रिया है। धमनी नाली की तुलना में कम दीर्घकालिक पैटेंसी के बावजूद सफेनोस नस का उपयोग सीएबीजी नाली के रूप में किया जाता है। ग्राफ्ट धमनीकरण से जुड़े हेमोडायनामिक तनाव की अचानक वृद्धि के परिणामस्वरूप संवहनी क्षति, विशेष रूप से एंडोथेलियम, जो सफेनोस नस ग्राफ्ट (एसवीजी) की कम पैटेंसी को प्रभावित कर सकती है। यहां, हम मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) के अलगाव, लक्षण वर्णन और विस्तार का वर्णन करते हैं। कोलेजनेस पाचन द्वारा पृथक कोशिकाएं विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं और एंडोथेलियल सेल मार्कर सीडी 31 और वीई-कैडरिन को व्यक्त करती हैं। यांत्रिक तनाव प्रभाव का आकलन करने के लिए, इस अध्ययन में दो मुख्य शारीरिक उत्तेजनाओं, कतरनी तनाव और खिंचाव की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। एचएसवीईसी को कतरनी तनाव पैदा करने के लिए एक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष में सुसंस्कृत किया जाता है, जो प्रवाह की दिशा में संरेखण दिखाता है और केएलएफ 2, केएलएफ 4 और एनओएस 3 की अभिव्यक्ति में वृद्धि करता है। एचएसवीईसी को सिलिकॉन झिल्ली में भी सुसंस्कृत किया जा सकता है जो शिरापरक (कम) और धमनी (उच्च) खिंचाव की नकल करते हुए नियंत्रित सेलुलर खिंचाव की अनुमति देता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं के एफ-एक्टिन पैटर्न और नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) स्राव को धमनी खिंचाव द्वारा तदनुसार संशोधित किया जाता है। सारांश में, हम एंडोथेलियल फेनोटाइप पर हेमोडायनामिक यांत्रिक तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एचएसवीईसी को अलग करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

एंडोथेलियल सेल (ईसी) डिसफंक्शन सफेनोस नस ग्राफ्ट विफलता 1,2,3,4 में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है। कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव की निरंतर वृद्धि मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) 3,4,5,6 के प्रोइन्फ्लेमेटरी फेनोटाइप को प्रेरित करती है। अंतर्निहित आणविक मार्ग अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं, और इन विट्रो अध्ययनों के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल क्षेत्र में नवीन अंतर्दृष्टि के प्रयासों का लाभ उठा सकते हैं। यहां, हम एचएसवीईसी को अलग करने, चिह्नित करने और विस्तारित करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और उन्हें शिरापरक और धमनी हेमोडायनामिक स्थितियों की नकल करते हुए कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के परिवर्तनीय स्तरों को कैसे उजागर किया जाए।

एचएसवीईसी को कोलेजनेज इनक्यूबेशन द्वारा अलग किया जाता है और इसका उपयोग 8 तक किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य उपलब्ध प्रोटोकॉल7 की तुलना में पोत के कम हेरफेर की आवश्यकता होती है, जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के साथ संदूषण को कम करता है। दूसरी ओर, कुशल ईसी निष्कर्षण के लिए कम से कम 2 सेमी के बड़े पोत खंड की आवश्यकता होती है। साहित्य में, यह बताया गया है कि बड़े जहाजों से ईसी को यांत्रिक हटाने 7,8 द्वारा भी प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि प्रभावी, भौतिक दृष्टिकोण में कम ईसी उपज और उच्च फाइब्रोब्लास्ट संदूषण के नुकसान हैं। शुद्धता बढ़ाने के लिए, चुंबकीय मोतियों या सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके अतिरिक्त कदमों की आवश्यकता होती है, जिससे मोती और एंटीबॉडी 7,8 के अधिग्रहण के कारण प्रोटोकॉल की लागत बढ़ जाती है। एंजाइमेटिक विधि में ईसी शुद्धता और व्यवहार्यता 7,8 के बारे में तेज और बेहतर परिणाम हैं।

एंडोथेलियल डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक बार इस्तेमाल किए जाने वाले ईसीएस मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी) हैं। यह ज्ञात है कि ईसी फेनोटाइप विभिन्न संवहनी बिस्तरों में बदलता है, और उन तरीकों को विकसित करना आवश्यक है जो जांच के तहत पोत का प्रतिनिधित्व करते हैं 9,10। इस संबंध में, एचएसवीईसी को अलग करने और यांत्रिक तनाव के तहत इसे कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना नस ग्राफ्ट रोग में एचएसवीईसी शिथिलता के योगदान को समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है।

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Protocol

साओ पाउलो मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय के हार्ट इंस्टीट्यूट (इनकोर) में ओर्टोकोरोनरी बाईपास सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से सफेनोस नसों के अप्रयुक्त खंड प्राप्त किए गए थे। सभी व्यक्तियों ने अध्ययन में भाग लेने के लिए सूचित सहमति दी, जिसकी समीक्षा की गई और स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. प्राथमिक मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) का अलगाव, संस्कृति और लक्षण वर्णन।

  1. तैयारी
    1. आटोक्लेव सीधे या घुमावदार बल और ऊतक कैंची (7-8 सेमी) की एक जोड़ी।
    2. बाँझ जिलेटिन तैयार करें। 0.1 ग्राम (0.1% डब्ल्यू / वी) या 3 ग्राम (3% डब्ल्यू / वी) पोर्सिन त्वचा जिलेटिन को 100 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी, 15 मिनट के लिए आटोक्लेव के साथ मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सेल कल्चर व्यंजन और स्लाइड को कोटिंग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    3. लामिनर प्रवाह हुड के अंदर बाँझ कोलेजनेस (1 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। पीबीएस में कोलेजनेस को पतला करें और इसे 0.2 μm फ़िल्टर के साथ निष्फल करें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए 0.1% डब्ल्यू / वी जिलेटिन के साथ एक 60 मिमी सेल कल्चर डिश और एक 8-वेल चैंबर स्लाइड कोट करें। कोशिकाओं को बोने से पहले अतिरिक्त जिलेटिन को हटा दें।
    5. पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम तैयार करें: एंडोथेलियल सेल विकास बेसल माध्यम (ईबीएम -2) ईजीएम 2 विकास कारकों के साथ पूरक।
      नोट: ईजीएम 2 विकास कारक सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध कंपनी द्वारा एक किट के रूप में आपूर्ति की जाती है। कारकों की एकाग्रता कंपनी द्वारा प्रकट नहीं की जाती है।
    6. 2% और 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए), और 0.1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान बनाएं, सभी फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) में।
  2. एचएसवीईसी का अलगाव और संस्कृति
    1. इस प्रक्रिया के लिए कम से कम 2-3 सेमी लंबी सफेनोस नस खंड एकत्र करें।
      नोट। सभी सेल कल्चर प्रक्रियाओं को बाँझ परिस्थितियों में और एक लामिनर प्रवाह हुड के अंदर किया जाना चाहिए।
    2. नस खंड को पहले से गर्म पीबीएस से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। नस के एक छोर में एक पिपेट टिप डालें और लुमेन के अंदर सभी रक्त को हटाने के लिए पीबीएस के साथ धीरे से फ्लश करें। इसे तब तक फ्लश करें जब तक कि धोने का प्रवाह पूरी तरह से स्पष्ट न हो जाए।
    3. एक बाँझ कपास सीवन के साथ नस के सिरों में से एक को बंद करें। ध्यान से बर्तन को 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस टाइप II समाधान से भरें। बर्तन के दूसरे छोर को कपास सीवन से बंद करें (चित्र 1ए)। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के ह्यूमिडिफायर वातावरण में कोलेजनेस समाधान के साथ पोत को इनक्यूबेट करें।
    4. उसके बाद, 15 एमएल ट्यूब के अंदर पोत के सिरों में से एक को काटें और कोलेजनेस समाधान एकत्र करें। दूसरे छोर को काटें और सभी अलग ईसी को इकट्ठा करने के लिए 1-2 एमएल पीबीएस के साथ ल्यूमिनल सतह को फ्लश करें। सभी पीबीएस को एक ही ट्यूब के अंदर कोलेजनेस समाधान के साथ एक साथ रखें।
    5. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट। सेल गोली बहुत छोटी है और कल्पना करना मुश्किल है। यदि कोलेजनेस उपचार (चरण 1.2.2) से पहले रक्त को पूरी तरह से नहीं हटाया जाता है, तो रक्त कोशिकाएं भी अवक्षेपित होंगी, और गोली लाल हो जाएगी।
    6. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम (ईबीएम -2 ईजीएम 2 विकास कारकों के साथ पूरक) और एक अतिरिक्त हेपरिन समाधान (5 यू / एमएल, अंतिम एकाग्रता) के 3-4 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 60 मिमी सेल कल्चर डिश में 3% डब्ल्यू / वी जिलेटिन के साथ पूर्व-लेपित करें।
      नोट: जिलेटिन अपनी पहुंच में आसानी और कम लागत के कारण पहली पसंद थी। चूंकि जिलेटिन के साथ कोटिंग सफलतापूर्वक ईसी फेनोटाइप को बनाए रखती है, इसलिए किसी अन्य कोटिंग पदार्थ का परीक्षण नहीं किया गया था। ईसी आसंजन और फेनोटाइप पर विभिन्न बाह्य मैट्रिक्स घटकों के प्रभाव की जांच करने के उद्देश्य से अध्ययन में कोलेजन और फाइब्रोनेक्टिन का परीक्षण किया जा सकता है।
    7. माध्यम को बदले बिना 4 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। उसके बाद, हर दूसरे दिन मीडिया बदलें। इस क्षण से, हेपरिन के साथ अतिरिक्त सेल मीडिया पूरकता अब आवश्यक नहीं है। माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दिया गया था।
    8. निष्कर्षण के 3-10 दिनों के बाद, नस खंड के आकार और व्यास के आधार पर, चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा एचएसवीईसी की कल्पना करें।
    9. चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी में संगम की डिग्री और उनके कोबलस्टोन आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करें।
    10. हर 2 दिनों में मीडिया को बदलना जारी रखें जब तक कि कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।
    11. एचएसवीईसी को 0.25% ट्रिप्सिन-0.02% एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान के साथ पारित करें।
      1. पहले से गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
      2. 60 मिमी सेल कल्चर डिश में ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें या जब तक सभी कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
      3. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
      4. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और आरटी पर 3 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      5. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 1 एमएल कल्चर माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      6. व्यवहार्य कोशिकाओं को प्लेट करने के लिए सेल निलंबन को 1: 1 ट्राइपैन ब्लू (0.4%) में गिनें।
      7. संस्कृति का विस्तार करने के लिए, कोशिकाओं को 100 मिमी सेल कल्चर डिश में 10 मिलीलीटर पूर्व-गर्म पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम के साथ प्लेट करें और इसे 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर करें।
        नोट। औसतन, 4 x 104 hSVEC/cm2 की सीडिंग 48 घंटे के बाद 100% स्थिर होगी।
    12. कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्व करने के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) में 5% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में चरण 1.2.11.5 से गोली को फिर से निलंबित करें और तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।
  3. एचएसवीईसी का लक्षण वर्णन: सीडी 31 के लिए फ्लो साइटोमेट्री धुंधला।
    1. 1 x 10 5 hSVECs को एक1.5 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें और RT पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और 2% BSA और CD31-FITC मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:100) वाले PBS के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    2. अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को दाग दें।
    3. दाग वाली कोशिकाओं को 0.5 मिलीलीटर पीबीएस जोड़कर धोएं और उन्हें आरटी पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और 2% बीएसए के साथ पीबीएस के 400 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, सीडी 31 एंटीबॉडी के बिना बिना लेबल वाले एचएसवीईसी का उपयोग करें।
    5. ब्लू लेजर और एफआईटीसी चैनल (498/517 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतम [एक्स / ईएम] का उपयोग करके फ्लो साइटोमीटर अधिग्रहण विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें। यदि अन्य फ्लोरोक्रोम का उपयोग किया जाता है, तो जांचें कि साइटोमीटर में उनकी पहचान के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट हैं या नहीं। कोशिकाओं को उनके आकार और ग्रैन्यूलैरिटी के कार्य में मलबे से अलग करें, फिर एकल कोशिकाओं को आगे स्कैटर और साइड स्कैटर द्वारा गेट करें।
  4. एचएसवीईसी का लक्षण वर्णन: सीडी 31 और वीई-कैडरिन के लिए फ्लोरोसेंट धुंधलापन।
    1. जिलेटिन-लेपित 8-वेल चैंबर स्लाइड में प्लेट 0.1 x 105 कोशिकाएं। कोशिकाओं को संस्कृति की सतह से जुड़ने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. माध्यम को हटा दें और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
    3. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 4% पीएफए का 0.3 एमएल / आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    5. कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान का 0.3 एमएल / वेल जोड़ें। आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    7. गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध करने के लिए, कोशिकाओं में 5% बीएसए समाधान के 0.3 एमएल / आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    9. कोशिकाओं को प्राथमिक एंटीबॉडी (सीडी 31 और वीई-कैडरिन, 1: 100) के साथ पीबीएस में पतला किया जाता है, जो रात भर 2% बीएसए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रॉकिंग के साथ होता है। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 2% बीएसए (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नहीं) के साथ पीबीएस के साथ एक अच्छी तरह से इंक्यूबेट छोड़ दें।
    10. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    11. कोशिकाओं को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे के लिए पीबीएस में पतला (1:500) इनक्यूबेट करें। 1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए परमाणु धुंधला होने के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल (डीएपीआई) जोड़ें।
    12. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    13. विभाजक के साथ मीडिया कक्ष को हटा दें। बढ़ते मध्यम अभिकर्मक (पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल) की एक बूंद रखें और बुलबुले को फंसाने से बचते हुए एक ग्लास स्लाइड (24 मिमी x 60 मिमी) रखें।
    14. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
      नोट: DAPI का पता DAPI लाइट क्यूब (उदा: 335-379 nm) के साथ लगाया जाता है; ईएम: 417-477 एनएम), और सीडी 31 / वीई-कैडरिन का पता एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) लाइट क्यूब (उदा: 459-481 एनएम) का उपयोग करके लगाया जाता है; ईएम: 500-550 एनएम)। उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य सीमा वाले प्रकाश क्यूब्स भी इन फ्लोरोक्रोम के लिए पर्याप्त हैं। यदि अन्य फ्लोरोक्रोम का उपयोग किया जाता है, तो जांचें कि क्या उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप में उनकी पहचान के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट हैं।

2. एचएसवीईसी पर कतरनी तनाव।

  1. तैयारी
    1. प्रवाह कक्ष स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए 0.1% डब्ल्यू / वी जिलेटिन के साथ कोट करें। कोशिकाओं को बोने से पहले अतिरिक्त जिलेटिन को हटा दें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के ह्यूमिडिफ़ाइड वातावरण में इनक्यूबेटर के अंदर रात भर 10 एमएल जलाशयों के साथ फ्लूडिक यूनिट और बाँझ छिड़काव सेट को बराबर करें।
  2. कतरनी तनाव प्रयोग
    1. बीज 2 x 105 ईसी को जिलेटिन-लेपित प्रवाह कक्ष स्लाइड में ईसी माध्यम के 100 μL में निलंबित कर दिया जाता है। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाएं संस्कृति की सतह से जुड़ सकें।
    2. निर्माता के निर्देशों में वर्णित द्रव इकाई पर छिड़काव सेट रखें। जलाशयों को भरें और छिड़काव लगभग 12 एमएल पूर्व-गर्म पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम में सेट करें। 5 एमएल पर दोनों जलाशयों के स्तर को बराबर करने के लिए छिड़काव सेट से मैन्युअल रूप से हवा के बुलबुले निकालें।
    3. इनक्यूबेटर में चैंबर स्लाइड के बिना, माउंटेड छिड़काव सेट के साथ फ्लूडिक यूनिट रखें और इसके इलेक्ट्रिक केबल को कंप्यूटर-विनियमित पंप से कनेक्ट करें। पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पूर्वनिर्धारित प्रोटोकॉल चलाते हुए, जलाशयों और छिड़काव सेट से सभी हवा के बुलबुले हटा दें।
      नोट। सिस्टम को सही ढंग से काम करने के लिए हवा के बुलबुले को हटाना बहुत महत्वपूर्ण है।
    4. माउंटेड छिड़काव सेट के साथ फ्लुइडिक यूनिट को लैमिनर फ्लो हुड पर ले जाएं और स्लाइड्स को एक कॉन्फ्लुएंट सेल मोनोलेयर के साथ संलग्न करें।
    5. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ माउंटेड छिड़काव और स्लाइड के साथ फ्लूडिक यूनिट रखें और इसके इलेक्ट्रिक केबल को पंप से कनेक्ट करें।
    6. पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: माध्यम की चिपचिपाहट (0.0072), स्लाइड का प्रकार, छिड़काव सेट अंशांकन कारक, कतरनी तनाव दर (20 डायन / सेमी2), प्रवाह का प्रकार (यूनिडायरेक्शनल), और समय (72 घंटे), और प्रवाह शुरू करें (अधिक विवरण के लिए उपकरण निर्देश देखें)। स्थैतिक नियंत्रण के रूप में प्रवाह के संपर्क में आए बिना एक ही मीडिया के साथ इलाज की गई कोशिकाओं की कटाई करें।
    7. उत्तेजना पूरी होने के बाद, पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और आवश्यक परख के अनुसार नमूने की कटाई के लिए आगे बढ़ें। फ्लोरोसेंट धुंधलापन के लिए, चरण 2.3.1 देखें, और आरएनए निष्कर्षण के लिए, चरण 2.3.2 देखें।
  3. कतरनी तनाव प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन।
    1. एक्टिन फिलामेंट्स (एफ-एक्टिन) का फ्लोरोसेंट धुंधलापन
      1. चरण 1.4.2-1.4.6 में दर्शाए अनुसार कोशिकाओं को ठीक करें और प्रतिरक्षित करें। μ-स्लाइड में 100 μL की मात्रा का उपयोग करें।
      2. फ्लोरोसेंट-लेबल वाले फैलोइडिन (पीबीएस में 1:200 पर पतला) के साथ एफ-एक्टिन को दाग दें और प्रकाश से संरक्षित आरटी पर 2 घंटे के लिए डीएपीआई (पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता) के साथ नाभिक को प्रतिघात करें।
      3. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
      4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
        नोट: DAPI का पता DAPI लाइट क्यूब (उदा: 335-379 nm) के साथ लगाया जाता है; ईएम: 417-477 एनएम) और फेलोइडिन का पता जीएफपी लाइट क्यूब (उदा: 459-481 एनएम) के साथ लगाया जाता है; ईएम: 500-550 एनएम)। उत्तेजना/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की एक समान सीमा वाले हल्के क्यूब्स भी इन फ्लोरोक्रोम के लिए पर्याप्त हैं। यदि अन्य फ्लोरोक्रोम का उपयोग किया जाता है, तो जांचें कि क्या उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप में उनकी पहचान के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट हैं।
    2. वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) द्वारा जीन अभिव्यक्ति
      1. एक वाणिज्यिक गुआनिडाइन-थायोसाइनेट युक्त लाइसिस बफर के 350 μL के साथ μ-स्लाइड से कोशिकाओं को इकट्ठा करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, कॉलम-आधारित निष्कर्षण किट के साथ कुल आरएनए को अलग करें।
        नोट: μ-स्लाइड में संवर्धित कोशिकाओं की सीमित संख्या के कारण, आरएनए के कॉलम-आधारित निष्कर्षण के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
      2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, ट्रांसक्रिप्टेस रिवर्स एंजाइम के साथ सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके सीडीएनए तैयार करें।
      3. कतरनी तनाव द्वारा विनियमित जीन (ओं) की अभिव्यक्ति को सत्यापित करें: केएलएफ 2, केएलएफ 4, और एनओएस 3। परिणामों को सामान्य करने के लिए हाउसकीपर जीन पीपीआईए / साइक्लोफिलिन का उपयोग करें। प्रतिक्रिया के लिए विशिष्ट प्राइमर तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
      4. निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों के तहत एसवाईबीआर ग्रीन फ्लोरोसेंट डीएनए स्टेन किट का उपयोग करके आरटी-क्यूपीसीआर करें: i) 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, ii) 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, iii) 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, iv) 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, v) 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। चरण III से v तक 40 चक्रों के लिए दोहराएँ। प्राइमर की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए प्रतिक्रिया के अंत में एक पिघलने वाला चरण जोड़ें।

3. एचएसवीईसी पर चक्रीय खिंचाव

  1. तैयारी
    1. 25 मिमी के 6-अच्छी तरह से समअक्षीय लोडिंग स्टेशन के शीर्ष और किनारों पर सिलिकॉन-आधारित स्नेहक लागू करें।
      नोट: यह संस्कृति प्लेट झिल्ली और स्टेशन के बीच घर्षण को कम करता है, जिससे चक्रीय तनाव का बेहतर वितरण होता है। यह चरण प्रत्येक प्रयोग से पहले किया जाना चाहिए।
  2. चक्रीय खिंचाव प्रयोग
    1. कोलेजन I (सामग्री की तालिका) के साथ लेपित 6-अच्छी तरह से लचीली-तल वाली संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक कुएं में बीज 4 x 105 कोशिकाओं को 3 मिलीलीटर में निलंबित कर दिया जाता है। एक नियंत्रण समूह के रूप में स्थिर स्थिति में एक प्लेट (ओं) की योजना बनाएं। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में रखें (5% सीओ2 के साथ ह्यूमिडिफायर हवा में 37 डिग्री सेल्सियस) जब तक कि वे 100% कंफ्लुएंसी (आमतौर पर बीजारोपण के 48 घंटे बाद) तक न पहुंच जाएं। खिंचाव प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले, कोशिकाओं को एक बार पहले से गर्म पीबीएस के साथ धो लें और प्रति अच्छी तरह से 3 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    2. इनक्यूबेटर में सभी स्नेहन लोडिंग स्टेशनों के साथ बेसप्लेट डालें और तनाव सेल स्ट्रेचिंग बायोरिएक्टर सिस्टम के नियंत्रक उपकरण के साथ टयूबिंग को उचित रूप से कनेक्ट करें (अधिक विवरण के लिए उपकरण निर्देश देखें)।
    3. प्रत्येक कल्चर प्लेट को एक लाल गैसकेट में संलग्न करें, जो तनाव सेल स्ट्रेचिंग बायोरिएक्टर सिस्टम द्वारा प्रदान किया जाता है। फिर, उन्हें इनक्यूबेटर के अंदर बेसप्लेट में डालें।
      1. सुनिश्चित करें कि वैक्यूम पंपिंग के दौरान हवा के रिसाव से बचने के लिए प्लेटों को पूरी तरह से बैठाया गया है, दबाया गया है और बेसप्लेट पर सील किया गया है। उचित वैक्यूम और स्ट्रेचिंग लोडिंग के लिए बेसप्लेट में सभी चार कल्चर प्लेटों का होना महत्वपूर्ण है।
      2. कम प्रयोगात्मक प्लेटहोने के मामले में, बेसप्लेट में चार पदों को पूरा करने के लिए एक खाली का उपयोग करें। बेसप्लेट सीलिंग को बेहतर बनाने के लिए कल्चर प्लेटों के शीर्ष पर ऐक्रेलिक शीट (उपकरण के साथ आपूर्ति) जोड़ें। स्थैतिक प्लेटों को उसी इनक्यूबेटर में रखें।
    4. नियंत्रक उपकरण और कंप्यूटर सिस्टम चालू करें। सॉफ़्टवेयर आइकन खोलें और वांछित आहार कॉन्फ़िगर करें: उपयोग किए जाने वाले लोडिंग स्टेशन का आकार, तनाव का प्रकार, बढ़ाव का प्रतिशत, तरंग आकार, आवृत्ति और समय। विस्तृत जानकारी के लिए, निर्माता के निर्देश देखें। आहार का चयन करें और डाउनलोड करें। यहां, निम्नलिखित आहार का उपयोग किया गया था: 1/2 साइनस तरंग आकार, 1 हर्ट्ज आवृत्ति, 5% बढ़ाव (शिरापरक खिंचाव की नकल करने के लिए), और 15% बढ़ाव (धमनी खिंचाव की नकल करने के लिए) 72 घंटे तक।
    5. वैक्यूम सिस्टम चालू करें और स्ट्रेचिंग चलाने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन पर स्टार्ट पर क्लिक करें। जांचें कि क्या सिलिकॉन झिल्ली कोशिकाओं को हिला रही है और खींच रही है।
    6. उत्तेजना पूरी होने के बाद, पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और आवश्यक परख के अनुसार नमूने की कटाई के लिए आगे बढ़ें। यहां, चक्रीय खिंचाव की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करने के लिए, एचएसवीईसी संस्कृति माध्यम को इकट्ठा करें, इसे आगे नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) माप के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और फ्लोरोसेंट धुंधला होने के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
      नोट। उपयोग में नहीं होने पर बेसप्लेट को इनक्यूबेटर के अंदर संग्रहीत नहीं किया जा सकता है; अन्यथा, तापमान सपाट आकार को संशोधित कर सकता है और इसे बेकार बना सकता है।
  3. चक्रीय खिंचाव प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन
    1. एफ-एक्टिन का फ्लोरोसेंट धुंधलापन
      1. चरण 1.4.3 में दर्शाए अनुसार कक्षों को ठीक करें। प्रति कुएं 1 एमएल की मात्रा का उपयोग करें।
      2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। पीबीएस में कोशिकाओं को बनाए रखें ताकि वे अगले चरणों के लिए सिलिकॉन झिल्ली तैयार करते समय सूख न जाएं।
      3. झिल्ली के नीचे से अतिरिक्त सिलिकॉन-आधारित स्नेहक को हटाने के लिए कपास के फाहे का उपयोग करें। फिर, धीरे से एक नए कपास के फाहे के साथ विंडो क्लीनर या हाथ साबुन लागू करें। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि झिल्ली से सभी स्नेहक हटा न दिए जाएं। फिर, विआयनीकृत पानी से साफ करें।
        नोट। अच्छी गुणवत्ता की माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए सिलिकॉन झिल्ली से स्नेहक को पूरी तरह से हटाना महत्वपूर्ण है।
      4. धुंधला होने के लिए 8-वेल चैंबर स्लाइड पर फिट होने के लिए सिलिकॉन झिल्ली को सावधानीपूर्वक छोटे टुकड़ों में काट लें। चरण 1.4.5 में दर्शाए अनुसार कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें।
      5. धोने के चरणों के बाद, एफ-एक्टिन को फैलोइडिन और नाभिक को डीएपीआई के साथ दाग दें। विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें, जैसा कि चरण 2.3.1.2 और 2.3.1.3 में दर्शाया गया है। प्रति कक्ष 0.3 एमएल की मात्रा का अच्छी तरह से उपयोग करें।
      6. विभाजक के साथ मीडिया कक्ष को हटा दें। माउंटिंग मध्यम अभिकर्मक (पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल) की एक बूंद रखें और एक ग्लास स्लाइड (24 मिमी x 60 मिमी) रखें।
      7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
        नोट: DAPI का पता DAPI लाइट क्यूब (उदा: 335-379 nm) के साथ लगाया जाता है; ईएम: 417-477 एनएम) और फेलोइडिन का पता लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) लाइट क्यूब (उदा: 511-551 एनएम) के साथ लगाया जाता है; ईएम: 573-613 एनएम)। उत्तेजना/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की एक समान सीमा वाले हल्के क्यूब्स भी इन फ्लोरोक्रोम के लिए पर्याप्त हैं। यदि अन्य फ्लोरोक्रोम का उपयोग किया जाता है, तो जांचें कि क्या उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप में उनकी पहचान के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट हैं।
    2. पोटेशियम आयोडाइड-आधारित रिडक्टिव केमिलुमिनेसेंस परख का उपयोग करके एचएसवीईसी वातानुकूलित माध्यम में नाइट्राइट (एनओ2) संचय द्वारा कोई माप अनुमानित नहीं है।
      1. तैयारी
        1. सोडियम नाइट्राइट (अल्ट्राप्योर पानी में एनएएनओ2 ) समाधान के 0.01-10 एमएम से एक मानक वक्र तैयार करें।
        2. नाइट्रिक ऑक्साइड विश्लेषक के शुद्ध पोत में 5 मिलीलीटर एसिटिक एसिड और 1 मिलीलीटर पोटेशियम आयोडाइड (1 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में 50 मिलीग्राम) जोड़ें।
      2. कोई माप नहीं
        1. नाइट्रिक ऑक्साइड विश्लेषक के शुद्ध पोत में नैनो2 मानक वक्र के 20 μL जोड़ें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इसे मापें।
    3. नाइट्रिक ऑक्साइड विश्लेषक के शुद्ध पोत में वातानुकूलित माध्यम के 20 μL जोड़ें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इसे मापें।
    4. मानक वक्र अंशांकन के आधार परNO2 सांद्रता की गणना करें। विश्लेषण किए गए वातानुकूलित माध्यम की कुल मात्रा द्वारा प्राप्त मूल्यों को समायोजित करें 6,11.

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Representative Results

आमतौर पर, निष्कर्षण के 3-4 दिन बाद पालन किए गए ईसी देखे जा सकते हैं। एचएसवीईसी शुरू में कोशिकाओं के समूह बनाते हैं और एक विशिष्ट "कोबलस्टोन" आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 1 बी)। वे ईसी मार्कर सीडी 31 (चित्रा 1 सी, डी) और वीई-कैडरिन (चित्रा 1 डी) व्यक्त करते हैं। एचएसवीईसी को आसानी से एक गैर-लेपित उपचारित सेल कल्चर डिश पर प्रचारित किया जा सकता है, और वे संस्कृति में एंडोथेलियल फेनोटाइप को आठ मार्ग तक बनाए रखते हैं।

एचएसवीईसी, जब कतरनी तनाव के तहत सुसंस्कृत होते हैं, तो प्रवाह की दिशा में संरेखित होते हैं (चित्रा 2 ए)। 72 घंटे के लिए 20 डायन/सेमी 2 का कतरनी तनाव विशिष्ट मेकेनोसेंसेटिव जीन, केएलएफ 2, केएलएफ 4 और एनओएस 3 की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जो एचएसवीईसी (चित्रा 2 बी) 12,13,14 में कतरनी उत्तेजना की प्रभावशीलता को दर्शाता है।

चक्रीय खिंचाव परिणाम एचएसवीईसी पर लागू तीव्रता पर निर्भर है। कम खिंचाव के तहत कोशिकाएं स्थैतिक कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) के समान एक कॉर्टिकल एफ-एक्टिन पैटर्न दिखाती हैं, 72 घंटे तक एनओ रिलीज में बदलाव के बिना (चित्रा 3 बी)। खिंचाव के धमनी स्तर 24 घंटे (चित्रा 3 ए) के बाद एक्टिन साइटोस्केलेटन को फिर से तैयार करते हैं और 72 घंटे के बाद कोई रिलीज नहीं करते हैं (चित्रा 3 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: मानव सफेनोस नसों (एचएसवीईसी) से एंडोथेलियल कोशिकाएं विशिष्ट एंडोथेलियल आकृति विज्ञान और विशिष्ट ईसी मार्कर अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करती हैं। (ए) ईसीएस के निष्कर्षण के लिए टाइप II कोलेजनेस समाधान के साथ पूरा किया गया सफेनोस नस खंड। (बी) निष्कर्षण के बाद एचएसवीईसी विकास का प्रतिनिधि समय-पाठ्यक्रम। 3-4 दिनों के बाद, कोशिकाओं के समूहों की कल्पना करना संभव है जो तब तक प्रसार करते हैं जब तक कि वे सामंजस्य तक नहीं पहुंच जाते। स्केल बार = 100 μm. (C) परिच्छेद 1 पर सुसंस्कृत HSVECs का FACS विश्लेषण। हरी रेखा इंगित करती है कि कोशिका आबादी का 99.7% एंडोथेलियल-विशिष्ट मार्कर सीडी 31 के लिए सकारात्मक है। काली रेखा नकारात्मक नियंत्रण है। (डी) एचएसवीईसी में सीडी 31 (हरा), (ई) वीई-कैडरिन (हरा), और नाभिक डीएपीआई (नीला) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एचएसवीईसी प्रवाह की दिशा में संरेखित होते हैं और यूनिडायरेक्शनल कतरनी तनाव के संपर्क में आने पर मेकेनोसेंसिटिव जीन व्यक्त करते हैं। एचएसवीईसी के कंफ्लुएंट सेल मोनोलेयर को स्थिर या यूनिडायरेक्शनल लैमिनर कतरनी तनाव स्थितियों के तहत खेती की जाती है। (ए) एचएसवीईसी के चरण-कंट्रास्ट चित्र (ऊपर) और फेलोइडिन धुंधला (नीचे) 72 घंटे के लिए 20 डायन / सेमी2 के कतरनी तनाव के संपर्क में हैं। हरा: एक्टिन फिलामेंट्स; नीला: कोशिका नाभिक। स्केल बार = 100 μm (चरण-कंट्रास्ट) और 20 μm (प्रतिदीप्ति)। (बी) क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित केएलएफ 2, केएलएफ 4 और एनओएस 3 की जीन अभिव्यक्ति। मान माध्य ± SEM. ** p < 0.01 बनाम स्थैतिक समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: चक्रीय खिंचाव के तहत एचएसवीईसी फेनोटाइप लागू तीव्रता पर निर्भर है। (ए) एचएसवीईसी के कंफ्लुएंट सेल मोनोलेयर को 24 घंटे के लिए एक लचीली निचली प्लेट में स्थिर, कम (शिरापरक), या उच्च (धमनी) खिंचाव के तहत खेती की जाती है। चरण-कंट्रास्ट छवियां (ऊपर) और फेलोइडिन धुंधला (नीचे) एक्टिन फाइबर (लाल) और डीएपीआई (नीले) के साथ नाभिक दिखाते हैं। स्केल बार = 100 μm (चरण-कंट्रास्ट) और 50 μm (प्रतिदीप्ति)। (बी) 72 घंटे के लिए सेल कल्चर मीडिया में एनओ2 संचय के आधार पर कोई माप का अनुमान नहीं लगाया गया था। मान माध्य ± SEM. ***p < 0.001 बनाम स्थैतिक समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जीन प्रोटीन फॉरवर्ड 5'-3' रिवर्स 5'-3'
KLF2 क्रुपेल जैसे फैक्टर 2 CCACTCACACCTGCAGCTA GTGGGGCTTCCCcTG
KLF4 क्रुपेल जैसे फैक्टर 4 CACCTGGCGAGTCTCATG CAGGGTTTTCGGGGCAC
NOS3 नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़, एंडोथेलियल GCACAGTTACCAGCTAGCCA GCCGGGGACAGGAAATAGTT
PPIA साइक्लोफिलिन ए, CATTTGGTGCAAGGGTCACA TCTGCTGTCTTTGGGGACCTTGTC
पेप्टिडिलप्रोलिल आइसोमेरेज़ ए

तालिका 1: कतरनी तनाव और संदर्भ जीन के लिए क्यूआरटी-पीसीआर प्राइमर।

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Discussion

एचएसवीईसी को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सफेनोस नस सेगमेंट कम से कम 2 सेमी होना चाहिए। कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोलेजनेस समाधान को बनाए रखने के लिए पोत के सिरों को संभालना और बांधना मुश्किल होता है। कम ल्यूमिनल सतह क्षेत्र संस्कृति का विस्तार करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं का उत्पादन नहीं करता है। गैर-ईसी के साथ संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, पूरी प्रक्रिया के दौरान सफेनोस नस सेगमेंट का हेरफेर बहुत सौम्य होना चाहिए। रक्त को हटाने के लिए और कोलेजनेज़ समाधान की शुरूआत के दौरान ल्यूमिनल सतहों में पिपेट युक्तियों को पेश करते समय सावधान रहना महत्वपूर्ण है। गैर-ईसी के साथ संस्कृति के संदूषण को कम करने के लिए एंजाइम समाधान के संपर्क को बहुत अच्छी तरह से नियंत्रित किया जाना चाहिए (1 घंटे से अधिक नहीं)। विकास कारक कॉकटेल के साथ पूरक एक विशिष्ट ईसी माध्यम का उपयोग एचएसवीईसी संस्कृति विकास के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति के पहले दिनों के दौरान अतिरिक्त हेपरिन नस खंड से अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को कम करने और चिकनी मांसपेशी कोशिका प्रसार को रोकने के लिए महत्वपूर्णहै। प्रयोगों के लिए या संस्कृति को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को पारित करते समय, कोशिकाओं को 40% से अधिक संगम के साथ प्लेट करना सुनिश्चित करें। अच्छे प्रसार और अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए ईसी को न्यूनतम संपर्क की आवश्यकता होती है। एचएसवीईसी को आसानी से एक गैर-लेपित (जैसे, जिलेटिन या फाइब्रोनेक्टिन) सतह पर सुसंस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, ईसी निष्कर्षण के बाद पहले दिनों के दौरान कोटिंग ईसी आसंजन और उपज में वृद्धि करेगी। एचएसवीईसी में एक निरंतर प्रसार दर होती है और मेसेनकाइमल सेल मार्करों (जैसे एसएम 22 और कैल्पोनिन) को व्यक्त किए बिना एंडोथेलियल फेनोटाइप को आठ मार्ग तक बनाए रखा जाता है। हमारे अनुभव में, प्रसार दर ऊतक दाता के आधार पर भिन्न हो सकती है लेकिन कोशिका मार्ग के साथ नहीं। कोशिकाओं को पिघलाने के बाद व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए 5% डीएमएसओ के साथ एफबीएस में एचएसवीईसी को क्रायोप्रिजर्व करने की सिफारिश की जाती है।

एक कतरनी तनाव प्रयोग करने के लिए, विचार किए जाने वाले महत्वपूर्ण कदम हैं। सिस्टम के अंदर बनने वाले हवा के बुलबुले से बचने के लिए, छिड़काव सेट और कनेक्टर्स को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रात भर बराबर किया जाना चाहिए। बुलबुले सिस्टम के माध्यम से प्रवाह को अवरुद्ध कर सकते हैं या सेल फेनोटाइप के साथ हस्तक्षेप करने वाले एंडोथेलियल मोनोलेयर को नुकसान पहुंचा सकते हैं। प्रवाह कक्ष स्लाइड में कोशिकाओं को सीडिंग करते समय, इसे 4 घंटे के बाद या अगले दिन उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, यदि प्रयोग कई दिनों तक चलता है तो स्थिर स्थितियों में हर दिन स्लाइड के माध्यम को बदलना अनिवार्य है। प्रवाह कक्ष स्लाइड की मात्रा ~ 160 μL है, और यह संस्कृति की लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं है। सिस्टम में माइक्रोस्कोपी (फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए ब्राइटफील्ड/ फेज-कंट्रास्ट या धुंधलापन) द्वारा कोशिकाओं को आसानी से देखने का लाभ है। सीमा प्रोटीन (20-25 μg / स्लाइड) और आरएनए (1 μg / स्लाइड) की कम उपज है। इसे दूर करने के लिए, सिस्टम एक ही फ्लूडिक यूनिट का उपयोग करके एक श्रृंखला में कई स्लाइडों के कनेक्शन की अनुमति देता है (निर्माता के निर्देश देखें)। फिर, कई स्लाइडों से प्रोटीन या आरएनए निकालने के लिए एक स्लाइड के लिए लाइसिस बफर की मात्रा का उपयोग करना संभव है।

खिंचाव प्रणाली को संभालना आसान है और विभिन्न तीव्रता और प्रकार के स्ट्रेचिंग के आवेदन की अनुमति देता है। संस्कृति प्लेट झिल्ली और स्टेशन के बीच घर्षण को कम करने और चक्रीय तनाव के उचित वितरण की गारंटी देने के लिए प्रत्येक प्रयोग से पहले सभी लोडिंग स्टेशनों को चिकनाई देना महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि वांछित खिंचाव तक पहुंचने के लिए आवश्यक वैक्यूम का उत्पादन करने के लिए प्लेटों को बेसप्लेट पर पूरी तरह से सील कर दिया गया है। समअक्षीय उत्तेजना कुएं के अंदर एक समान तनाव पैदा नहीं करती है। कुएं के किनारे पर कोशिकाओं को त्यागने की आवश्यकता होती है, जैसा कि निर्माता द्वारा इंगित किया गया है। लोडिंग स्टेशन व्यास और बढ़ाव के प्रतिशत के आधार पर ब्याज का झिल्ली क्षेत्र निर्धारित किया जाता है। परख में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की मात्रा को कम करने के लिए पूरे झिल्ली में इम्यूनोस्टेनिंग करना या इसे छोटे टुकड़ों में काटना संभव है। इस मामले में, झिल्ली को बहुत सावधानी से संभाला जाना चाहिए, कोशिकाओं को नुकसान से बचना चाहिए। शोधकर्ताओं को यह भी ध्यान रखना चाहिए कि धुंधला करते समय झिल्ली को उल्टा न करें और कोशिकाओं को खो न दें। ऑप्टिक माइक्रोस्कोपी के तहत कोशिकाओं के साथ झिल्ली के सही चेहरे की पुष्टि करना हमेशा संभव होता है।

इन जैसे इन विट्रो अध्ययनों की प्रमुख सीमा यह है कि वे विवो वातावरण में पूरी तरह से पुनरावृत्ति नहीं करते हैं। इस कारण से, यह सुनिश्चित करने के लिए हमेशा विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है कि एचएसवीईसी ईसी फेनोटाइप (ईसी मार्करों को व्यक्त करते हुए) को बनाए रखते हैं और यांत्रिक तनाव (एफ-एक्टिन अभिविन्यास और यांत्रिक प्रतिक्रिया प्रोटीन के विनियमन / उत्पादन) के तहत अपेक्षित परिणामों को पुन: पेश करते हैं।

सारांश में, हम एचएसवीईसी को अलग करने और उन्हें कतरनी तनाव और खिंचाव के नियंत्रित स्तर पर उजागर करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं। जब एक एसवी ग्राफ्ट अचानक सीएबीजी के बाद धमनी की स्थिति के संपर्क में आता है, तो एंडोथेलियल क्षति होती है और ग्राफ्ट विफलता में योगदान देती है। ये प्रोटोकॉल हमारी समझ को आगे बढ़ाने में सहायक हो सकते हैं कि यांत्रिक बल नस ग्राफ्ट रोग से जुड़े एचएसवीईसी शिथिलता को कैसे प्रभावित करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

जेईके को फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो [एफएपीईएसपी-आईएनसीटी-20214/50889-7 और 2013/17368-0] और कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको-सीएनपीक्यू (आईएनसीटी-465586/2014-7 और 309179-2014-20) से अनुदान द्वारा समर्थित है। एएएम को फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईएसपी 2015/11139-5) और कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको-सीएनपीक्यू (यूनिवर्सल - 407911/2021-9) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution Gibco 25200072
15 µ slide I 0.4 Luer  Ibidi 80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) Thermo Fisher Scientific D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm  Flexcell International Corporation LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well Thermo Fisher Scientific 154453
Acetic Acid (Glacial) Millipore 100063
Acrylic sheet 1 cm thick Plexiglass
Anti-CD31 antibody Abcam ab24590
Anti-CD31, FITC antibody Thermo Fisher Scientific MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody Cell Signaling 2500
Bioflex plates collagen I Flexcell International Corporation BF3001C
Bovine serum albumin solution Sigma-Aldrich A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm Brasuture AP524
Cyclophilin forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Cyclophilin reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
EBM-2 basal medium Lonza CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements Lonza CC4176
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2657-029
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma-Aldrich F4680
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL Blau Farmacêutica SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) Ibidi 10902
KLF2 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF2 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer Sievers Instruments NOA-280i-1
NOS3 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOS3 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs Ibidi 10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031
Potassium Iodide Sigma-Aldrich 221945
QuanTitec SYBR green PCR kit Qiagen 204143
QuantStudio 12K flex platform  Applied Biosystems 4471087
RNeasy micro kit  Quiagen 74004
Slide glass (24 mm x 60 mm) Knittel Glass VD12460Y1D.01
Sodium nitrite Sigma-Aldrich 31443
SuperScript IV first-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18091200
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypan blue stain 0.4% Gibco 15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C6885

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References

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
  4. Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
  5. Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
  6. Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
  7. Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
  8. Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
  9. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  10. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
  11. Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
  12. Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
  13. Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
  14. Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
  15. Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).

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मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल सेल अलगाव और कतरनी तनाव और खिंचाव के नियंत्रित स्तर के संपर्क में
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Girão-Silva, T.,… More

Girão-Silva, T., Fonseca-Alaniz, M. H., Oliveira Dallan, L. A., Valãdao, I. C., Oliveira da Rocha, G. H., Krieger, J. E., Miyakawa, A. A. Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch. J. Vis. Exp. (194), e65122, doi:10.3791/65122 (2023).

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