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Isolamento de Células Endoteliais da Veia Samá Humana e Exposição a Níveis Controlados de Tensão de Cisalhamento e Estiramento

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65122
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg
* These authors contributed equally

Summary

Descrevemos um protocolo para isolar e cultivar células endoteliais da veia safena humana (hSVECs). Também fornecemos métodos detalhados para produzir tensão de cisalhamento e alongamento para estudar tensões mecânicas em hSVECs.

Abstract

A cirurgia de revascularização miocárdica (CRM) é um procedimento para revascularizar o miocárdio isquêmico. A veia safena continua sendo utilizada como conduto de revascularização miocárdica, apesar da reduzida perviedade a longo prazo em relação aos condutos arteriais. O aumento abrupto do estresse hemodinâmico associado à arterialização do enxerto resulta em dano vascular, principalmente endotélio, que pode influenciar na baixa patência da ponte de veia safena (EVS). Descrevemos o isolamento, caracterização e expansão das células endoteliais da veia safena humana (HCSV). As células isoladas por digestão da colagenase exibem a morfologia típica do paralelepípedo e expressam marcadores de células endoteliais CD31 e VE-caderina. Para avaliar a influência das tensões mecânicas, protocolos foram utilizados neste estudo para investigar os dois principais estímulos físicos, tensão de cisalhamento e estiramento, em EVS arterializadas. As HVEs são cultivadas em uma câmara de fluxo de placa paralela para produzir tensão de cisalhamento, mostrando alinhamento na direção do fluxo e aumento da expressão de KLF2, KLF4 e NOS3. hSVECs também podem ser cultivados em uma membrana de silicone que permite o estiramento celular controlado mimetizando estiramento venoso (baixo) e arterial (alto). O padrão de F-actina das células endoteliais e a secreção de óxido nítrico (NO) são modulados de acordo com o estiramento arterial. Em resumo, apresentamos um método detalhado para isolar as HVECs para estudar a influência do estresse mecânico hemodinâmico em um fenótipo endotelial.

Introduction

A disfunção das células endoteliais (CE) é peça-chave na falência do enxerto de veia safena 1,2,3,4. O aumento sustentado do shear stress e do estiramento cíclico induz o fenótipo pró-inflamatório das células endoteliais da veia safena humana (hSVECs)3,4,5,6. As vias moleculares subjacentes ainda não são totalmente compreendidas, e protocolos padronizados para estudos in vitro podem alavancar os esforços para novos insights na área. Aqui, descrevemos um protocolo simples para isolar, caracterizar e expandir as HVECs e como expô-las a níveis variáveis de tensão de cisalhamento e estiramento cíclico, mimetizando as condições hemodinâmicas venosas e arteriais.

As hSVECs são isoladas por incubação da colagenase e podem ser utilizadas até a passagem 8. Esse protocolo requer menor manipulação do vaso em comparação com os outros protocolosdisponíveis7, o que reduz a contaminação com células musculares lisas e fibroblastos. Por outro lado, é necessário um segmento de vaso maior, de pelo menos 2 cm, para que a extração do CE seja eficiente. Na literatura, tem sido relatado que CEs de grandes vasos também podem ser obtidas por remoçãomecânica7,8. Embora eficaz, a abordagem física tem como desvantagens o baixo rendimento da CE e a maior contaminação por fibroblastos. Para aumentar a pureza, são necessários passos extras utilizando esferas magnéticas ou triagem celular, aumentando o custo do protocolo devido à aquisição de esferas e anticorpos 7,8. O método enzimático apresenta resultados mais rápidos e melhores quanto à pureza e viabilidade da CE 7,8.

As CE mais utilizadas para o estudo da disfunção endotelial são as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Sabe-se que o fenótipo da CE se altera nos diferentes leitos vasculares, sendo essencial o desenvolvimento de métodos que representem o vaso sobinvestigação9,10. Nesse sentido, o estabelecimento de um protocolo para isolar uma EVSS e cultivá-la sob estresse mecânico é uma ferramenta valiosa para entender a contribuição da disfunção da VExs na doença do enxerto venoso.

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Protocol

Segmentos não utilizados de veias safenas foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica aortoventricular no Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Todos os indivíduos deram consentimento informado para participar do estudo, que foi revisado e aprovado pelo comitê de ética local.

1. Isolamento, cultura e caracterização de células endoteliais primárias da veia safena humana (hSVECs)

  1. Preparação
    1. Autoclave um par de pinças retas ou curvas e tesoura de tecido (7-8 cm).
    2. Prepare gelatina estéril. Misturar 0,1 g (0,1% p/v) ou 3 g (3% p/v) de gelatina de pele suína com 100 mL de água ultrapura, autoclave por 15 min e armazenar a 4 °C. Aqueça a 37 °C para liquefazer antes de revestir as placas e lâminas de cultura celular.
    3. Preparar colagenase estéril (1 mg/mL) dentro da capela de fluxo laminar. Diluir a colagenase em PBS e esterilizá-la com filtro de 0,2 μm.
    4. Revestir uma placa de cultura celular de 60 mm e uma lâmina de câmara de 8 poços com gelatina 0,1% p/v por pelo menos 30 min a 37 °C. Retire o excesso de gelatina antes de semear as células.
    5. Preparar meio celular endotelial completo: meio basal de crescimento de células endoteliais (EBM-2) suplementado com fatores de crescimento EGM2.
      NOTA: Os fatores de crescimento EGM2 são fornecidos como um kit por uma empresa listada na Tabela de Materiais. A concentração dos fatores não é divulgada pela empresa.
    6. Produzir soluções de albumina de soro bovino (BSA) a 2% e 5%, paraformaldeído (PFA) a 4% e Triton X-100 a 0,1%, todas em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  2. Isolamento e cultura de hSVECs
    1. Coletar pelo menos um segmento de veia safena parva de 2-3 cm de comprimento para este procedimento.
      NOTA. Todos os procedimentos de cultura celular devem ser realizados em condições estéreis e dentro de uma capela de fluxo laminar.
    2. Transfira o segmento da veia para uma placa de Petri preenchida com PBS pré-aquecido. Insira uma ponta de pipeta em uma extremidade da veia e lave suavemente com PBS para remover todo o sangue dentro do lúmen. Lave-o até que o fluxo de lavagem fique completamente claro.
    3. Feche uma das extremidades da veia com uma sutura de algodão estéril. Encher cuidadosamente o vaso com 1 mg/mL de solução de colagenase tipo II. Fechar a outra extremidade do vaso com fio de algodão (Figura 1A). Incubar o vaso com solução de colagenase em atmosfera umidificada de CO2 a 5% a 37 °C durante 1 h.
    4. Em seguida, corte uma das extremidades do vaso dentro de um tubo de 15 mL e colete a solução de colagenase. Corte a outra extremidade e lave a superfície luminal com 1-2 mL de PBS para coletar todas as CE destacadas. Coloque todo o PBS junto com a solução de colagenase dentro do mesmo tubo.
    5. Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR) para pellet das células.
      NOTA. A pastilha celular é muito pequena e de difícil visualização. Se o sangue não for completamente removido antes do tratamento com colagenase (passo 1.2.2.), as células sanguíneas também se precipitarão e o pellet ficará avermelhado.
    6. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 3-4 mL de meio endotelial celular completo (EBM-2 suplementado com fatores de crescimento EGM2) e uma solução adicional de heparina (5 U/mL, concentração final). Planear as células em uma placa de cultura celular de 60 mm pré-revestida com gelatina 3% p/v.
      OBS: A gelatina foi a primeira escolha devido à sua facilidade de acessibilidade e baixo custo. Como o revestimento com gelatina mantém com sucesso o fenótipo CE, nenhuma outra substância de revestimento foi testada. O colágeno e a fibronectina podem ser testados em estudos que visam investigar a influência de diferentes componentes da matriz extracelular na adesão ao CE e no fenótipo.
    7. Incubar as células a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 durante 4 dias sem alterar o meio. Depois disso, mude a mídia a cada dois dias. A partir deste momento, a suplementação adicional de meios celulares com heparina não é mais necessária. Examine a placa sob o microscópio para garantir que os glóbulos vermelhos foram removidos.
    8. Após 3-10 dias pós-extração, dependendo do tamanho e diâmetro do segmento venoso, visualizar as hSVECs por microscopia de contraste de fase.
    9. Avaliar o grau de confluência e sua morfologia de paralelepípedos em microscopia de contraste de fase.
    10. Continue trocando o meio a cada 2 dias até que as células atinjam 70%-80% de confluência.
    11. Passagem das hSVECs com solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% tripsina-0,02%.
      1. Lave as células com PBS pré-aquecido.
      2. Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA à placa de cultura celular de 60 mm. Incubar a 37 °C durante 2 minutos ou até que todas as células estejam separadas.
      3. Adicionar 2 mL de meio celular endotelial completo para inativar a tripsina.
      4. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrifugar a 300 x g por 3 min no TR.
      5. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio de cultura.
      6. Contar a suspensão celular em azul de tripano 1:1 (0,4%) para plaquear as células viáveis.
      7. Para expandir a cultura, plaquear as células em uma placa de cultura de 100 mm com 10 mL de meio de células endoteliais completo pré-aquecido e cultivá-las a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2.
        NOTA. Em média, a semeadura de 4 x 104 hSVEC/cm2 será 100% confluente após 48 h.
    12. Para criopreservar as células, ressuspender o pellet da etapa 1.2.11.5 em dimetilsulfóxido (DMSO) a 5% no soro fetal bovino (SFB) e armazenar em nitrogênio líquido.
  3. Caracterização de hSVECs: coloração por citometria de fluxo para CD31
    1. Transferir 1 x 10 5 hSVECs para um tubo de1,5 mL e centrifugar a 300 x g por 3 min no RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de PBS contendo 2% de BSA e anticorpo monoclonal CD31-FITC (1:100).
    2. Manchar as células por 30 min no RT no escuro.
    3. Lavar as células coradas adicionando 0,5 mL de PBS e centrifuga-las a 300 x g por 3 min em RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células em 400 μL de PBS com BSA 2%.
    4. Utilizar hSVECs não marcados, sem anticorpo CD31, como controle negativo.
    5. Proceder à análise de aquisição do citômetro de fluxo usando um laser azul e canal FITC (excitação/emissão max [Ex/Em] de 498/517 nm). Se forem utilizados outros fluorocromos, verifique se o citómetro tem conjuntos de filtros adequados para a sua detecção. Separe as células dos detritos em função de seu tamanho e granularidade e, em seguida, feche as células individuais por dispersão direta e dispersão lateral.
  4. Caracterização de hSVECs: coloração fluorescente para CD31 e VE-caderina
    1. Placa 0,1 x 105 células na lâmina da câmara de 8 poços revestida com gelatina. Incubar as células durante a noite a 37 °C, 5 % CO2, para permitir que as células se fixem à superfície de cultura.
    2. Retire o meio e lave as células uma vez com PBS.
    3. Adicionar 0,3 mL/poço de PFA a 4% para fixar as células. Incubar por 15 min no TR.
    4. Lave três vezes com PBS.
    5. Adicionar 0,3 mL/poço de solução de Triton X-100 a 0,1% para permeabilizar as células. Incubar por 15 min no TR.
    6. Lave três vezes com PBS.
    7. Para bloquear os sítios de ligação de anticorpos inespecíficos, adicione 0,3 mL/poço de solução de BSA a 5% às células. Incubar por 15 min no TR.
    8. Lave três vezes com PBS.
    9. Incubar as células com os anticorpos primários (CD31 e VE-caderina, 1:100) diluídos em PBS com BSA a 2% durante a noite com balanço suave a 4 °C. Deixar um poço incubando com PBS com BSA a 2% (sem anticorpo primário) como controle negativo.
    10. Lave três vezes com PBS.
    11. Incubar as células com anticorpos secundários fluorescentemente marcados diluídos (1:500) em PBS por 1 h no TR. Adicionar 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para coloração nuclear até uma concentração final de 1 mg/mL.
    12. Lave três vezes com PBS.
    13. Remova a câmara de mídia com o separador. Coloque uma gota do reagente médio de montagem (50% de glicerol em PBS) e coloque uma lâmina de vidro (24 mm x 60 mm), evitando prender bolhas.
    14. Observe as células sob um microscópio de fluorescência.
      NOTA: DAPI é detectado com um cubo de luz DAPI (Ex: 335-379 nm; Em: 417-477 nm), e CD31/VE-caderina é detectada usando um cubo de luz de proteína fluorescente verde (GFP) (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Cubos de luz com uma faixa de comprimento de onda de excitação/emissão semelhante também são adequados para esses fluorocromos. Se forem utilizados outros fluorocromos, verifique se o microscópio utilizado possui conjuntos de filtros apropriados para a sua detecção.

2. Tensão de cisalhamento em hSVECs

  1. Preparação
    1. Revestir a lâmina da câmara de fluxo com gelatina 0,1% p/v por pelo menos 30 min a 37 °C. Retire o excesso de gelatina antes de semear as células.
    2. Equilibrar a unidade fluídica e o conjunto de perfusão estéril com reservatórios de 10 mL durante a noite dentro da incubadora em uma atmosfera umidificada de 5% CO2 a 37 °C.
  2. Experimento de tensão de cisalhamento
    1. Semente 2 x 105 CEs suspensas em 100 μL de meio CE na lâmina da câmara de fluxo revestida com gelatina. Incubar as células durante 4 h a 37 °C e 5% de CO2 para permitir que as células se fixem à superfície de cultura.
    2. Coloque o conjunto de perfusão na unidade fluídica conforme descrito nas instruções do fabricante. Preencher os reservatórios e o conjunto de perfusão em cerca de 12 mL de meio celular endotelial completo pré-aquecido. Remova manualmente as bolhas de ar do conjunto de perfusão para equilibrar o nível de ambos os reservatórios em 5 mL.
    3. Coloque a unidade fluídica com o conjunto de perfusão montado, sem a corrediça da câmara, na incubadora e conecte seu cabo elétrico à bomba regulada por computador. Remova todas as bolhas de ar dos reservatórios e do conjunto de perfusão, executando um protocolo pré-definido no software de controle da bomba.
      NOTA. É muito importante remover bolhas de ar para que o sistema funcione corretamente.
    4. Pegue a unidade fluídica com a perfusão montada ajustada para a capela de fluxo laminar e prenda as lâminas com uma monocamada de célula confluente.
    5. Coloque a unidade fluídica com a perfusão montada e deslize com células na incubadora e conecte seu cabo elétrico à bomba.
    6. No software de controle da bomba, configure os seguintes parâmetros: viscosidade do meio (0,0072), tipo de lâmina, fator de calibração do conjunto de perfusão, taxa de tensão de cisalhamento (20 dyn/cm2), tipo de fluxo (unidirecional) e tempo (72 h), e inicie o fluxo (consulte as instruções do equipamento para mais detalhes). Colher as células tratadas com o mesmo meio sem exposição ao fluxo como controles estáticos.
    7. Após o término do estímulo, lavar as células uma vez com PBS e proceder à colheita das amostras de acordo com o ensaio requerido. Para coloração fluorescente, ver etapa 2.3.1, e para extração de RNA, ver etapa 2.3.2.
  3. Demonstração da eficácia do protocolo de tensão de cisalhamento
    1. Coloração fluorescente de filamentos de actina (F-actina)
      1. Fixar e permeabilizar as células conforme indicado nos passos 1.4.2-1.4.6. Use um volume de 100 μL na μ-slide.
      2. Manchar a F-actina com faloidina fluorescente marcada (diluída a 1:200 em PBS) e contracolorir o núcleo com DAPI (concentração final de 1 mg/mL em PBS) por 2 h em TR, protegido da luz.
      3. Lave três vezes com PBS.
      4. Observe as células sob um microscópio de fluorescência.
        NOTA: DAPI é detectado com um cubo de luz DAPI (Ex: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) e a faloidina é detectada com um cubo de luz GFP (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Cubos de luz com uma faixa semelhante de comprimento de onda de excitação/emissão também são adequados para esses fluorocromos. Se forem utilizados outros fluorocromos, verifique se o microscópio utilizado possui conjuntos de filtros apropriados para a sua detecção.
    2. Expressão gênica por transcrição reversa quantitativa em tempo real (RT-qPCR)
      1. Coletar as células da lâmina de μ com 350 μL de um tampão de lise comercial contendo guanidina-tiocianato. Isole o RNA total com kits de extração baseados em coluna, de acordo com as instruções do fabricante.
        NOTA: Devido ao número limitado de células cultivadas na lâmina de μ, recomenda-se o uso de extração de RNA baseada em coluna.
      2. Prepare o cDNA usando um kit de síntese de cDNA com enzima reversa transcriptase, de acordo com as instruções do fabricante.
      3. Verificar a expressão do(s) gene(s) regulado(s) pela tensão de cisalhamento: KLF2, KLF4 e NOS3. Use o gene da governanta PPIA/ciclofilina para normalizar os resultados. Os primers específicos para a reação estão listados na Tabela 1.
      4. Realizar RT-qPCR usando um kit de coloração de DNA fluorescente verde SYBR nas seguintes condições de reação: i) 50 °C por 2 min, ii) 95 °C por 15 min, iii) 94 °C por 15 s, iv) 60 °C por 30 s, v) 72 °C por 30 s. Repita as etapas iii a v por 40 ciclos. Adicione uma etapa de fusão no final da reação para verificar a especificidade do primer.

3. Alongamento cíclico em hSVECs

  1. Preparação
    1. Aplique lubrificante à base de silicone nas partes superiores e laterais da estação de carregamento equibiaxial de 6 poços de 25 mm.
      OBS: Reduz o atrito entre a membrana da placa de cultura e a estação, permitindo melhor distribuição da deformação cíclica. Essa etapa deve ser feita antes de cada experimento.
  2. Experimento de estiramento cíclico
    1. Sementes 4 x 105 células suspensas em 3 mL para cada poço das placas de cultura de fundo flexível de 6 poços revestidas com colágeno I (Tabela de Materiais). Planeje ter uma(s) placa(s) em condição estática como grupo controle. Manter as células na incubadora (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2) até atingirem 100% de confluência (geralmente 48 h após a semeadura). Antes do início do protocolo de alongamento, lavar as células uma vez com PBS pré-aquecido e adicionar 3 mL de meio de cultura fresco por poço.
    2. Insira a placa de base com todas as estações de carregamento lubrificadas na incubadora e conecte adequadamente a tubulação com o equipamento controlador do sistema de biorreator de estiramento de células de tensão (consulte as instruções do equipamento para obter mais detalhes).
    3. Conecte cada placa de cultura a uma junta vermelha, fornecida pelo sistema de biorreator de estiramento de células de tensão. Em seguida, coloque-os na placa de base dentro da incubadora.
      1. Certifique-se de que as placas estejam totalmente assentadas, pressionadas e seladas à placa de base para evitar vazamento de ar durante o bombeamento a vácuo. É importante ter todas as quatro placas de cultura na placa de base para ter o vácuo adequado e a carga de alongamento.
      2. No caso de ter menos placas experimentais, use uma(s) vazia(s) para completar as quatro posições na placa de base. Adicione a folha de acrílico (fornecida com o equipamento) sobre as placas de cultura para melhorar a vedação da placa de base. Coloque as placas estáticas na mesma incubadora.
    4. Ligue o equipamento controlador e o sistema do computador. Abra o ícone do software e configure o regime desejado: tamanho da estação de carregamento a ser utilizada, tipo de deformação, porcentagem de alongamento, forma de onda, frequência e tempo. Para obter informações detalhadas, consulte as instruções do fabricante. Selecione e baixe o regime. Neste caso, foi utilizado o seguinte esquema: forma de onda sinusal de 1/2, frequência de 1 Hz, alongamento de 5% (para mimetizar estiramento venoso) e 15% de alongamento (para mimetizar estiramento arterial) até 72 h.
    5. Ligue o sistema de vácuo e clique em Iniciar na tela do computador para executar o alongamento. Verifique se a membrana de silicone está se movendo e esticando as células.
    6. Após o término do estímulo, lavar as células uma vez com PBS e proceder à colheita das amostras de acordo com o ensaio requerido. Aqui, para demonstrar a eficácia do estiramento cíclico, colete o meio de cultura hSVEC, mantenha-o a -80 °C para medição adicional de óxido nítrico (NO) e fixe as células para coloração fluorescente.
      NOTA. A placa de base não pode ser armazenada dentro da incubadora quando não está em uso; caso contrário, a temperatura pode modificar a forma plana e torná-la inútil.
  3. Demonstração da efetividade do protocolo de alongamento cíclico
    1. Coloração fluorescente da F-actina
      1. Fixe as células conforme indicado na etapa 1.4.3. Use um volume de 1 mL por poço.
      2. Lave as células três vezes com PBS. Mantenha as células em PBS para que não sequem enquanto prepara a membrana de silicone para os próximos passos.
      3. Use um cotonete para remover o excesso de lubrificante à base de silicone do fundo da membrana. Em seguida, aplique suavemente o limpador de janelas ou sabonete para as mãos com um novo cotonete. Repita o processo até que todo o lubrificante seja removido da membrana. Em seguida, limpe com água deionizada.
        NOTA. É importante remover completamente o lubrificante da membrana de silicone para ter imagens de microscopia de boa qualidade.
      4. Corte cuidadosamente as membranas de silicone em pequenos pedaços para caber em lâminas de câmara de 8 poços para coloração. Permeabilizar as células conforme indicado no passo 1.4.5.
      5. Após as etapas de lavagem, corar a F-actina com faloidina e o núcleo com DAPI. Proceder à análise, conforme indicado nos passos 2.3.1.2 e 2.3.1.3. Use bem um volume de 0,3 mL por câmara.
      6. Remova a câmara de mídia com o separador. Coloque uma gota do reagente médio de montagem (glicerol 50% em PBS) e coloque uma lâmina de vidro (24 mm x 60 mm).
      7. Observe as células sob um microscópio de fluorescência.
        NOTA: DAPI é detectado com um cubo de luz DAPI (Ex: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) e a faloidina é detectada com um cubo de luz de proteína fluorescente vermelha (RFP) (Ex: 511-551 nm; EM: 573-613 nm). Cubos de luz com uma faixa semelhante de comprimento de onda de excitação/emissão também são adequados para esses fluorocromos. Se forem utilizados outros fluorocromos, verifique se o microscópio utilizado possui conjuntos de filtros apropriados para a sua detecção.
    2. Medição de NO - estimada pelo acúmulo de nitrito (NO2) no meio condicionado por hSVEC usando um ensaio de quimioluminescência redutiva à base de iodeto de potássio
      1. Preparação
        1. Preparar uma curva padrão de 0,01-10 mM de solução de nitrito de sódio (NaNO2 em água ultrapura).
        2. Adicionar 5 ml de ácido acético e 1 ml de iodeto de potássio (50 mg em 1 ml de água ultrapura) no vaso de purga do analisador de óxido nítrico.
      2. Medição de NO
        1. Adicionar 20 μL da curva padrão NaNO2 no vaso de purga do analisador de óxido nítrico. Meça de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Adicionar 20 μL do meio condicionado no recipiente de purga do analisador de óxido nítrico. Meça de acordo com o protocolo do fabricante.
    4. Calcular as concentrações de NO2 com base na calibração da curva padrão. Ajustar os valores obtidos pelo volume total do meio condicionado analisado 6,11.

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Representative Results

Normalmente, as CE aderidas podem ser observadas 3-4 dias após a extração. Os hSVECs inicialmente formam aglomerados de células e exibem uma morfologia típica de "paralelepípedos" (Figura 1B). Expressam os marcadores CE CD31 (Figura 1C,D) e VE-caderina (Figura 1D). Os hSVECs podem ser facilmente propagados em uma placa de cultura celular tratada não revestida e retêm o fenótipo endotelial em cultura até oito passagens.

As hSVECs, quando cultivadas sob tensão de cisalhamento, alinham-se na direção do fluxo (Figura 2A). A tensão de cisalhamento de 20 dyn/cm2 por 72 h induz a expressão de genes mecanossensíveis típicos, KLF2, KLF4 e NOS3, indicando a eficácia do estímulo de cisalhamento em hSVECs (Figura 2B)12,13,14.

O resultado do estiramento cíclico é dependente da intensidade aplicada às hSVECs. Células em baixo estiramento mostram um padrão cortical de F-actina semelhante ao estático (Figura 3A), sem alteração na liberação de NO até 72 h (Figura 3B). Os níveis arteriais de estiramento remodelam o citoesqueleto da actina após 24 h (Figura 3A) e diminuem a liberação de NO após 72 h (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: Células endoteliais de veias safenas humanas (hSVECs) exibem morfologia endotelial típica e expressão específica de marcadores EC. (A) Segmento de veia safena preenchido com solução de colagenase tipo II para extração de CE. (B) Curso temporal representativo do crescimento de hSVEC após a extração. Após 3-4 dias, é possível visualizar aglomerados de células que se proliferam até atingirem a confluência. Barra de escala = 100 μm. (C) Análise FACS de hSVECs cultivadas na passagem 1. A linha verde indica que 99,7% da população celular é positiva para o marcador endotélio-específico CD31. A linha preta é o controle negativo. (D) Imunomarcação para CD31 (verde), (E) VE-caderina (verde) e núcleos DAPI (azul) em hSVECs na passagem 1. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: As hSVECs alinham-se na direção do fluxo e expressam genes mecanossensíveis quando expostos a tensões de cisalhamento unidirecionais. Monocamada celular confluente de hSVECs cultivadas sob condições de tensão de cisalhamento laminar estática ou unidirecional. (A) Imagens de contraste de fase (superior) e coloração de faloidina (inferior) de hSVECs expostos a tensão de cisalhamento de 20 dyn/cm2 por72 h. Verde: filamentos de actina; azul: núcleos celulares. Barra de escala = 100 μm (contraste de fase) e 20 μm (fluorescência). (B) Expressão gênica de KLF2, KLF4 e NOS3 determinada por qRT-PCR. Os valores representam ± EPM média.** p < 0,01 versus o grupo estático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O fenótipo hSVEC sob estiramento cíclico é dependente da intensidade aplicada . (A) Monocamada de células confluentes de hSVECs cultivadas sob estiramento estático, baixo (venoso) ou alto (arterial) em uma placa de fundo flexível por 24 h. Imagens de contraste de fase (superior) e coloração com faloidina (inferior) mostrando as fibras de actina (vermelho) e núcleos com DAPI (azul). Barra de escala = 100 μm (contraste de fase) e 50 μm (fluorescência). (B) A medida do NO foi estimada com base no acúmulo de NO2 no meio de cultura celular por 72 h. Os valores representam ± EPM média.*** p < 0,001 versus o grupo estático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gene Proteína Avançado 5'-3' Reverso 5'-3'
KLF2 Fator 2 semelhante ao de Krüppel CCACTCACACCTGCAGCTA GTGGGGGGCTTCTCACCTG
KLF4 Kruppel-like Fator 4 CACCTGGCGAGTCTGACATG CAGCGGTTATTCGGGGCAC
NOS3 Óxido Nítrico Sintase Endotelial GCACAGTTACCAGCTAGCCA GCCGGGGACAGGAAATAGTT
PPIA Ciclofilina A, CATTTGGTGCAAGGGTCACA TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC
Peptidilprolil isomerase A

Tabela 1: Primers qRT-PCR para tensão de cisalhamento e genes de referência.

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Discussion

O segmento da veia safena deve ter pelo menos 2 cm para isolar com sucesso as HCSV. Pequenos segmentos são difíceis de manusear e amarrar as extremidades do vaso para manter a solução de colagenase para isolar as células. A área luminal reduzida não produz células suficientes para expandir a cultura. Para minimizar o risco de contaminação com não-CE, a manipulação do segmento da veia safena precisa ser muito suave durante todo o procedimento. É importante ter cuidado ao introduzir as pontas da pipeta nas superfícies luminais para remover o sangue e durante a introdução da solução de colagenase. A exposição à solução enzimática deve ser muito bem controlada (não mais do que 1 h) para reduzir a contaminação da cultura com não-CE. O uso de um meio EC específico suplementado com o coquetel de fatores de crescimento é crucial para o crescimento da cultura hSVEC. A heparina adicional durante os primeiros dias de cultura é importante para reduzir as hemácias residuais do segmento venoso e inibir a proliferação de células musculares lisas15. Ao passar as células para experimentos ou para manter a cultura, certifique-se de plaquear as células com uma confluência superior a 40%. As CEs precisam de contato mínimo para garantir uma boa proliferação e sobrevivência. Os hSVECs podem ser facilmente cultivados em uma superfície não revestida (por exemplo, gelatina ou fibronectina). No entanto, o revestimento durante os primeiros dias após a extração do CE aumentará a adesão e o rendimento do CE. As hSVECs têm taxa de proliferação constante e mantêm o fenótipo endotelial até oito passagens, sem expressar marcadores de células mesenquimais (como SM22 e calponina). Em nossa experiência, a taxa de proliferação pode variar dependendo do doador de tecido, mas não com a passagem de uma célula. Recomenda-se criopreservar hSVECs em SFB com DMSO a 5% para aumentar a viabilidade após o descongelamento das células.

Para conduzir um experimento de tensão de cisalhamento, existem etapas críticas a serem consideradas. Para evitar a formação de bolhas de ar no interior do sistema, o conjunto de perfusão e os conectores devem ser equilibrados durante a noite a 37 °C e 5% CO2. As bolhas podem bloquear o fluxo através do sistema ou danificar a monocamada endotelial, interferindo com o fenótipo celular. Ao semear as células na lâmina da câmara de fluxo, recomenda-se tê-la confluente para usar após 4 h ou no dia seguinte. Além disso, é obrigatório trocar o meio da lâmina todos os dias em condições estáticas se o experimento durar vários dias. O volume da lâmina da câmara de fluxo é de ~160 μL, e não é suficiente para manter as células por longos períodos de cultura. O sistema tem a vantagem de observar prontamente as células por microscopia (campo claro/contraste de fase ou coloração para microscopia de fluorescência). A limitação é o baixo rendimento de proteínas (20-25 μg/lâmina) e RNA (1 μg/lâmina). Para superar isso, o sistema permite a conexão de várias lâminas em série usando a mesma unidade fluídica (veja as instruções do fabricante). Então, é possível usar o volume do tampão de lise para uma lâmina para extrair a proteína ou RNA de várias lâminas.

O sistema de alongamento é de fácil manuseio e permite a aplicação de diferentes intensidades e tipos de alongamento. É importante lubrificar todas as estações de carregamento antes de cada experimento para reduzir o atrito entre a membrana da placa de cultura e a estação e garantir a distribuição adequada da deformação cíclica. Certifique-se de que as placas sejam completamente seladas à placa de base para produzir o vácuo necessário para alcançar o trecho desejado. O estímulo equiaxial não produz uma deformação uniforme no interior do poço. As células na borda do poço precisam ser descartadas, conforme indicação do fabricante. A área de interesse da membrana é determinada com base no diâmetro da estação de carregamento e na porcentagem de alongamento. É possível realizar a imunomarcação em toda a membrana ou cortá-la em pedaços menores para reduzir a quantidade de anticorpos utilizados no ensaio. Neste caso, as membranas devem ser manuseadas com muito cuidado, evitando danos às células. Os pesquisadores também devem tomar cuidado para não virar a membrana de cabeça para baixo e perder as células ao fazer a coloração. É sempre possível confirmar a face correta da membrana com as células sob microscopia óptica.

A principal limitação de estudos in vitro como esses é que eles não recapitulam totalmente o ambiente in vivo . Por essa razão, é importante sempre realizar análises para garantir que as hSVECs mantenham o fenótipo EC (expressando marcadores CE) e reproduzam os resultados esperados sob estresse mecânico (orientação da actina F e regulação/produção de proteínas de resposta mecânica).

Em resumo, fornecemos um procedimento detalhado para isolar hSVECs e expô-los a níveis controlados de tensão de cisalhamento e estiramento. Quando um enxerto de VS é subitamente exposto a condições arteriais após a CRM, ocorre dano endotelial que contribui para a falência do enxerto. Esses protocolos podem ser fundamentais para avançar em nossa compreensão de como as forças mecânicas influenciam a disfunção da VHSh associada à doença do enxerto venoso.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

O JEK é apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 e 2013/17368-0] e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 e 309179/2013-0). A AAM é apoiada por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution Gibco 25200072
15 µ slide I 0.4 Luer  Ibidi 80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) Thermo Fisher Scientific D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm  Flexcell International Corporation LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well Thermo Fisher Scientific 154453
Acetic Acid (Glacial) Millipore 100063
Acrylic sheet 1 cm thick Plexiglass
Anti-CD31 antibody Abcam ab24590
Anti-CD31, FITC antibody Thermo Fisher Scientific MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody Cell Signaling 2500
Bioflex plates collagen I Flexcell International Corporation BF3001C
Bovine serum albumin solution Sigma-Aldrich A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm Brasuture AP524
Cyclophilin forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Cyclophilin reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
EBM-2 basal medium Lonza CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements Lonza CC4176
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2657-029
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma-Aldrich F4680
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL Blau Farmacêutica SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) Ibidi 10902
KLF2 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF2 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer Sievers Instruments NOA-280i-1
NOS3 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOS3 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs Ibidi 10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031
Potassium Iodide Sigma-Aldrich 221945
QuanTitec SYBR green PCR kit Qiagen 204143
QuantStudio 12K flex platform  Applied Biosystems 4471087
RNeasy micro kit  Quiagen 74004
Slide glass (24 mm x 60 mm) Knittel Glass VD12460Y1D.01
Sodium nitrite Sigma-Aldrich 31443
SuperScript IV first-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18091200
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypan blue stain 0.4% Gibco 15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C6885

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References

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Isolamento de Células Endoteliais da Veia Samá Humana e Exposição a Níveis Controlados de Tensão de Cisalhamento e Estiramento
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Girão-Silva, T., Fonseca-Alaniz, M. H., Oliveira Dallan, L. A., Valãdao, I. C., Oliveira da Rocha, G. H., Krieger, J. E., Miyakawa, A. A. Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch. J. Vis. Exp. (194), e65122, doi:10.3791/65122 (2023).

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