Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Изоляция эндотелиальных клеток подкожных вен человека и воздействие контролируемых уровней напряжения сдвига и растяжения

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65122
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем протокол выделения и культивирования эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs). Мы также предлагаем подробные методы получения напряжения сдвига и растяжения для изучения механического напряжения в hSVEC.

Abstract

Аортокоронарное шунтирование (АКШ) - это процедура реваскуляризации ишемического миокарда. Подкожная вена по-прежнему используется в качестве канала АКШ, несмотря на сниженную долгосрочную проходимость по сравнению с артериальными каналами. Резкое увеличение гемодинамического напряжения, связанного с артериализацией трансплантата, приводит к повреждению сосудов, особенно эндотелия, что может влиять на низкую проходимость трансплантата подкожной вены (SVG). Здесь мы описываем выделение, характеристику и расширение эндотелиальных клеток подкожных вен человека (hSVEC). Клетки, выделенные с помощью коллагеназного расщепления, демонстрируют типичную морфологию булыжника и экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток CD31 и VE-кадгерин. Чтобы оценить влияние механического напряжения, в этом исследовании были использованы протоколы для исследования двух основных физических стимулов, напряжения сдвига и растяжения, на артериализированных SVG. hSVEC культивируют в проточной камере с параллельной пластиной для создания напряжения сдвига, демонстрируя выравнивание в направлении потока и повышенную экспрессию KLF2, KLF4 и NOS3. hSVEC также можно культивировать в кремниевой мембране, которая позволяет контролировать клеточное растяжение, имитирующее венозное (низкое) и артериальное (высокое) растяжение. F-актиновый паттерн эндотелиальных клеток и секреция оксида азота (NO) модулируются соответственно артериальным растяжением. Таким образом, мы представляем подробный метод выделения hSVEC для изучения влияния гемодинамического механического стресса на фенотип эндотелия.

Introduction

Дисфункция эндотелиальных клеток (ЭК) является ключевым фактором в недостаточности трансплантата подкожной вены 1,2,3,4. Устойчивое увеличение напряжения сдвига и циклического растяжения индуцирует провоспалительный фенотип эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs)3,4,5,6. Основные молекулярные пути до сих пор не полностью поняты, и стандартизированные протоколы для исследований in vitro могут использовать усилия для новых идей в этой области. Здесь мы описываем простой протокол для выделения, характеристики и расширения hSVEC и то, как подвергать их различным уровням напряжения сдвига и циклического растяжения, имитируя венозные и артериальные гемодинамические состояния.

hSVEC выделяются путем инкубации коллагеназы и могут использоваться до пассажа 8. Этот протокол требует меньшего количества манипуляций с сосудом по сравнению с другими доступными протоколами7, что снижает загрязнение гладкомышечными клетками и фибробластами. С другой стороны, для эффективного извлечения ЕС требуется больший сегмент сосуда не менее 2 см. В литературе сообщалось, что ЭК из крупных сосудов также могут быть получены путем механического удаления 7,8. Несмотря на эффективность, физический подход имеет недостатки, заключающиеся в низком выходе EC и более высокой контаминации фибробластов. Для повышения чистоты необходимы дополнительные шаги с использованием магнитных шариков или сортировки клеток, что увеличивает стоимость протокола из-за приобретения шариков и антител 7,8. Ферментативный метод дает более быстрые и лучшие результаты в отношении чистоты и жизнеспособности ЕС 7,8.

Наиболее часто используемыми ЭК для изучения эндотелиальной дисфункции являются эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Известно, что фенотип ЭК изменяется в разных сосудистых руслах, и необходимо разработать методы, представляющие исследуемый сосуд 9,10. В этом отношении создание протокола для выделения hSVEC и культивирования его в условиях механического стресса является ценным инструментом для понимания вклада дисфункции hSVEC в заболевание венозного трансплантата.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Неиспользованные сегменты подкожных вен были получены от пациентов, перенесших операцию аортокоронарного шунтирования в Институте сердца (InCor) Медицинской школы Университета Сан-Паулу. Все лица дали информированное согласие на участие в исследовании, которое было рассмотрено и одобрено местным комитетом по этике.

1. Выделение, культивирование и характеристика первичных эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVEC)

  1. Подготовка
    1. Автоклав: пара прямых или изогнутых щипцов и тканевые ножницы (7-8 см).
    2. Приготовьте стерильный желатин. Смешайте 0,1 г (0,1% мас./об.) или 3 г (3% мас./об.) желатина из свиной кожи со 100 мл сверхчистой воды в автоклаве в течение 15 минут и храните при температуре 4 °C. Нагрейте до 37 °C для разжижения перед покрытием посуды и предметных стекол для клеточных культур.
    3. Приготовьте стерильную коллагеназу (1 мг/мл) внутри вытяжки с ламинарным потоком. Разбавьте коллагеназу в PBS и стерилизуйте ее с помощью фильтра 0,2 мкм.
    4. Покройте чашку для культивирования клеток диаметром 60 мм и предметное стекло с 8-луночной камерой желатином 0,1% по массе в течение не менее 30 мин при 37 °C. Удалите излишки желатина перед посевом клеток.
    5. Подготовьте полную среду эндотелиальных клеток: базальную среду для роста эндотелиальных клеток (EBM-2), дополненную факторами роста EGM2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Факторы роста EGM2 поставляются в виде комплекта компанией, указанной в Таблице материалов. Концентрация факторов компанией не раскрывается.
    6. Сделайте 2% и 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), 4% параформальдегид (PFA) и 0,1% растворы Triton X-100, все в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
  2. Выделение и культивирование hSVEC
    1. Для этой процедуры соберите сегмент подкожной вены длиной не менее 2-3 см.
      ЗАМЕТКА. Все процедуры культивирования клеток должны проводиться в стерильных условиях и внутри вытяжки с ламинарным потоком.
    2. Переложите отрезок вены в чашку Петри, наполненную предварительно разогретым PBS. Вставьте наконечник пипетки в один конец вены и осторожно промойте PBS, чтобы удалить всю кровь внутри просвета. Промывайте его до тех пор, пока поток стирки не станет полностью прозрачным.
    3. Закройте один из концов вены стерильным ватным швом. Осторожно наполните сосуд раствором коллагеназы II типа 1 мг/мл. Другой конец сосуда закройте ватным швом (рис. 1А). Инкубируют сосуд с раствором коллагеназы в увлажненной атмосфере 5%СО2 при 37 °C в течение 1 ч.
    4. После этого отрежьте один из концов сосуда внутри пробирки объемом 15 мл и соберите раствор коллагеназы. Отрежьте другой конец и промойте поверхность просвета 1-2 мл PBS, чтобы собрать все отсоединившиеся ЭК. Поместите весь PBS вместе с раствором коллагеназы в одну и ту же пробирку.
    5. Центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), чтобы гранулировать ячейки.
      ЗАМЕТКА. Гранула ячейки очень маленькая, и ее трудно визуализировать. Если кровь не будет полностью удалена перед лечением коллагеназой (этап 1.2.2.), клетки крови также выпадут в осадок, и гранулы будут красноватыми.
    6. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 3-4 мл полной среды эндотелиальных клеток (EBM-2 с добавлением факторов роста EGM2) и дополнительном растворе гепарина (5 Ед / мл, конечная концентрация). Поместите клетки в чашку для культивирования клеток диаметром 60 мм, предварительно покрытую 3% желатином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желатин был первым выбором из-за его простоты доступности и низкой стоимости. Поскольку покрытие желатином успешно поддерживает фенотип ЕС, никакое другое покрывающее вещество не тестировалось. Коллагены и фибронектин могут быть протестированы в исследованиях, направленных на изучение влияния различных компонентов внеклеточного матрикса на адгезию ЭК и фенотип.
    7. Инкубируют клетки при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5%CO2 в течение 4 дней без смены среды. После этого меняйте носитель через день. С этого момента дополнительная добавка гепарина в клеточные среды больше не нужна. Исследуйте пластину под микроскопом, чтобы убедиться, что эритроциты были удалены.
    8. Через 3-10 дней после экстракции, в зависимости от размера и диаметра сегмента вены, визуализируют hSVEC с помощью фазово-контрастной микроскопии.
    9. Оцените степень слияния и их булыжную морфологию в фазово-контрастной микроскопии.
    10. Продолжайте менять среду каждые 2 дня, пока клетки не достигнут слияния 70-80%.
    11. Прохождение hSVEC 0,25% раствором трипсина-0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
      1. Промойте клетки предварительно разогретым PBS.
      2. Добавьте 1 мл раствора трипсина-ЭДТА в чашку для культивирования клеток диаметром 60 мм. Инкубировать при 37 °C в течение 2 мин или до тех пор, пока все клетки не отделятся.
      3. Добавьте 2 мл полной среды эндотелиальных клеток, чтобы инактивировать трипсин.
      4. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 300 x g в течение 3 мин при ЛТ.
      5. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл питательной среды.
      6. Подсчитайте клеточную суспензию в трипановом синем 1:1 (0,4%) до пластинчатых жизнеспособных клеток.
      7. Чтобы расширить культуру, поместите клетки в чашку для культивирования клеток диаметром 100 мм с 10 мл предварительно подогретой полной среды эндотелиальных клеток и культивируйте ее при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.
        ЗАМЕТКА. В среднем посев 4 x 104 hSVEC/см2 будет на 100% сливаться через 48 ч.
    12. Чтобы криоконсервировать клетки, ресуспендируют гранулу с этапа 1.2.11.5 в 5% диметилсульфоксиде (ДМСО) в эмбриональной бычьей сыворотке (FBS) и хранят в жидком азоте.
  3. Характеристика hSVEC: окрашивание проточной цитометрией для CD31
    1. Перенесите 1 x 10 5 hSVEC в одну пробирку объемом1,5 мл и центрифугу при 300 x g в течение 3 мин при ЛТ. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл PBS, содержащей 2% моноклонального антитела BSA и CD31-FITC (1:100).
    2. Окрашивайте клетки в течение 30 мин при РТ в темноте.
    3. Вымойте окрашенные клетки, добавив 0,5 мл PBS, и центрифугируйте их при 300 x g в течение 3 мин при RT. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл PBS с 2% BSA.
    4. Используйте немеченые hSVEC без антител CD31 в качестве отрицательного контроля.
    5. Приступайте к анализу сбора данных проточного цитометра с использованием синего лазера и канала FITC (максимальное возбуждение/излучение [Ex/Em] 498/517 нм). Если используются другие флуорохромы, проверьте, есть ли в цитометре соответствующие наборы фильтров для их обнаружения. Отделите ячейки от мусора в зависимости от их размера и зернистости, затем затворите отдельные ячейки прямым рассеянием и боковым рассеянием.
  4. Характеристика hSVEC: флуоресцентное окрашивание CD31 и VE-кадгерина
    1. Пластина 0,1 х 105 ячеек в 8-луночном предметном стекле камеры с желатиновым покрытием. Инкубируют клетки в течение ночи при 37 °C, 5 % CO2, чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности культуры.
    2. Удалите среду и промойте ячейки один раз с помощью PBS.
    3. Добавьте 0,3 мл / лунку 4% PFA, чтобы зафиксировать клетки. Инкубировать в течение 15 минут при РТ.
    4. Постирайте три раза с помощью PBS.
    5. Добавьте 0,3 мл / лунку 0,1% раствора Triton X-100 для проникновения в клетки. Инкубировать в течение 15 минут при РТ.
    6. Постирайте три раза с помощью PBS.
    7. Чтобы блокировать неспецифические сайты связывания антител, добавьте 0,3 мл / лунку 5% раствора BSA в клетки. Инкубировать в течение 15 минут при РТ.
    8. Постирайте три раза с помощью PBS.
    9. Инкубируйте клетки с первичными антителами (CD31 и VE-кадгерин, 1:100), разбавленными в PBS с 2% BSA, в течение ночи с мягким покачиванием при 4 ° C. Оставьте одну лунку для инкубации с PBS с 2% BSA (без первичных антител) в качестве отрицательного контроля.
    10. Постирайте три раза с помощью PBS.
    11. Инкубируют клетки с флуоресцентно меченными вторичными антителами, разведенными (1:500) в PBS в течение 1 ч при ЛТ. Добавьте 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) для ядерного окрашивания до конечной концентрации 1 мг / мл.
    12. Постирайте три раза с помощью PBS.
    13. Снимите медиакамеру с помощью сепаратора. Поместите одну каплю реагента для монтажной среды (50% глицерина в PBS) и поместите предметное стекло (24 мм x 60 мм), избегая застревания пузырьков.
    14. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI обнаруживается с помощью светового куба DAPI (например: 335-379 нм; Em: 417-477 нм), а CD31/VE-кадгерин детектируется с помощью светового куба зеленого флуоресцентного белка (GFP) (Ex: 459-481 нм; Em: 500-550 нм). Световые кубики с аналогичным диапазоном длин волн возбуждения/излучения также подходят для этих флуорохромов. Если используются другие флуорохромы, проверьте, есть ли в используемом микроскопе соответствующие наборы фильтров для их обнаружения.

2. Напряжение сдвига на hSVEC

  1. Подготовка
    1. Покройте предметное стекло проточной камеры 0,1% желатином в течение не менее 30 мин при 37 °C. Удалите излишки желатина перед посевом клеток.
    2. Уравновесьте жидкостную установку и стерильный перфузионный набор с резервуарами объемом 10 мл в течение ночи внутри инкубатора в увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO2 при 37 ° C.
  2. Эксперимент с напряжением сдвига
    1. Затравка 2 x 105 EC суспендирована в 100 мкл среды EC в предметное стекло проточной камеры, покрытой желатином. Инкубируют клетки в течение 4 ч при 37 °C и 5% CO2 , чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности культуры.
    2. Поместите перфузионный набор на жидкостный блок, как описано в инструкциях производителя. Заполните резервуары и перфузию установите примерно в 12 мл предварительно подогретой полной среды эндотелиальных клеток. Вручную удалите пузырьки воздуха из перфузионного набора, чтобы уравновесить уровень обоих резервуаров на уровне 5 мл.
    3. Поместите жидкостный блок с установленным перфузионным комплектом, без направляющей камеры, в инкубатор и подключите его электрический кабель к насосу с компьютерным управлением. Удалите все пузырьки воздуха из резервуаров и установите перфузию, запустив предопределенный протокол в программном обеспечении управления насосом.
      ЗАМЕТКА. Очень важно удалить пузырьки воздуха, чтобы система функционировала правильно.
    4. Возьмите жидкостный блок с установленной перфузией, установленной на вытяжной шкаф с ламинарным потоком, и прикрепите предметные стекла монослоем сливающейся ячейки.
    5. Поместите жидкостный блок с установленной перфузией и горками с ячейками в инкубатор и подключите его электрический кабель к насосу.
    6. В программном обеспечении управления насосом настройте следующие параметры: вязкость среды (0,0072), тип суппорта, коэффициент калибровки перфузионной установки, коэффициент напряжения сдвига (20 дин/см2), тип потока (однонаправленный) и время (72 ч), а также запустите поток (подробнее см. в инструкциях по оборудованию). Собирайте клетки, обработанные той же средой, без воздействия потока, что и статический контроль.
    7. После того, как стимул будет завершен, промойте клетки один раз PBS и приступайте к сбору образцов в соответствии с требуемым анализом. Для флуоресцентного окрашивания см. шаг 2.3.1, а для экстракции РНК см. шаг 2.3.2.
  3. Демонстрация эффективности протокола сдвиговых напряжений
    1. Флуоресцентное окрашивание актиновых филаментов (F-актин)
      1. Исправьте и проникните клетки, как указано в шагах 1.4.2-1.4.6. Используйте объем 100 мкл в μ-слайде.
      2. Окрашивают F-актин флуоресцентным меченым фаллоидином (разбавленным в соотношении 1:200 в PBS) и окрашивают ядро DAPI (конечная концентрация 1 мг/мл в PBS) в течение 2 ч при ЛТ, защищенном от света.
      3. Постирайте три раза с помощью PBS.
      4. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI обнаруживается с помощью светового куба DAPI (например: 335-379 нм; Em: 417-477 нм) и фаллоидин обнаруживается с помощью светового куба GFP (Ex: 459-481 нм; Em: 500-550 нм). Световые кубики с аналогичным диапазоном длин волн возбуждения/излучения также подходят для этих флуорохромов. Если используются другие флуорохромы, проверьте, есть ли в используемом микроскопе соответствующие наборы фильтров для их обнаружения.
    2. Экспрессия генов с помощью количественной обратной транскрипции в реальном времени (ОТ-кПЦР)
      1. Соберите клетки с μ-предметного стекла с 350 мкл коммерческого буфера для лизиса, содержащего гуанидин-тиоцианат. Изолируйте общую РНК с помощью наборов для экстракции на основе колонки в соответствии с инструкциями производителя.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за ограниченного числа клеток, культивируемых на μ-слайде, рекомендуется использовать экстракцию РНК на основе колонки.
      2. Подготовьте кДНК с помощью набора для синтеза кДНК с обратным ферментом транскриптазы в соответствии с инструкциями производителя.
      3. Проверьте экспрессию генов (генов), регулируемых напряжением сдвига: KLF2, KLF4 и NOS3. Используйте ген экономки PPIA/циклофилин для нормализации результатов. Конкретные праймеры для реакции перечислены в таблице 1.
      4. Выполняйте ОТ-кПЦР с использованием набора для окрашивания ДНК SYBR зеленым флуоресцентным ДНК при следующих условиях реакции: i) 50 °C в течение 2 мин, ii) 95 °C в течение 15 мин, iii) 94 °C в течение 15 с, iv) 60 °C в течение 30 с, v) 72 °C в течение 30 с. Повторяйте шаги с iii по v в течение 40 циклов. Добавьте стадию плавления в конце реакции, чтобы проверить специфичность праймера.

3. Циклическое растяжение на hSVEC

  1. Подготовка
    1. Нанесите смазку на силиконовой основе на верхнюю и боковые стороны 6-луночной равноосной загрузочной станции 25 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это уменьшает трение между мембраной культуральной пластины и станцией, обеспечивая лучшее распределение циклической деформации. Этот шаг необходимо выполнять перед каждым экспериментом.
  2. Эксперимент с циклическим растяжением
    1. Затравка 4 x 105 клеток, взвешенных в 3 мл к каждой лунке 6-луночных культуральных пластин с гибким дном, покрытых коллагеном I (Таблица материалов). Планируйте, чтобы пластина (пластины) находилась в статическом состоянии в качестве контрольной группы. Храните клетки в инкубаторе (37 ° C в увлажненном воздухе с 5% CO2) до тех пор, пока они не достигнут 100% слияния (обычно через 48 ч после посева). Перед началом протокола растяжения промойте клетки один раз предварительно подогретым PBS и добавьте 3 мл свежей питательной среды на лунку.
    2. Вставьте опорную плиту со всеми смазанными загрузочными станциями в инкубатор и соответствующим образом соедините трубку с управляющим оборудованием системы растяжения натяжных ячеек (см. Инструкции по оборудованию для получения дополнительной информации).
    3. Прикрепите каждую культуральную пластину к одной красной прокладке, обеспечиваемой системой биореактора растяжения натяжной ячейки. Затем поместите их в опорную пластину внутри инкубатора.
      1. Убедитесь, что пластины полностью установлены, прижаты и прижаты к опорной плите, чтобы избежать утечки воздуха во время вакуумной откачки. Важно, чтобы все четыре культуральные пластины находились в опорной плите, чтобы обеспечить надлежащий вакуум и растягивающую нагрузку.
      2. В случае меньшего количества экспериментальных пластин используйте пустую пластину (пластины) для заполнения четырех позиций на опорной плите. Добавьте акриловый лист (поставляемый с оборудованием) поверх культуральных пластин, чтобы улучшить герметизацию опорной плиты. Поместите статические пластины в тот же инкубатор.
    4. Включите оборудование контроллера и компьютерную систему. Откройте значок программного обеспечения и настройте желаемый режим: размер используемой станции загрузки, тип деформации, процент удлинения, форму волны, частоту и время. Подробную информацию см. в инструкциях производителя. Выберите и загрузите схему приема. Здесь использовался следующий режим: форма сигнала синуса 1/2, частота 1 Гц, 5% удлинения (для имитации венозного растяжения) и 15% удлинения (для имитации артериального растяжения) до 72 часов.
    5. Включите вакуумную систему и нажмите « Пуск » на экране компьютера, чтобы запустить растяжку. Проверьте, не движется ли силиконовая мембрана и не растягивает ли клетки.
    6. После того, как стимул будет завершен, промойте клетки один раз PBS и приступайте к сбору образцов в соответствии с требуемым анализом. Здесь, чтобы продемонстрировать эффективность циклического растяжения, соберите питательную среду hSVEC, держите ее при -80 ° C для дальнейшего измерения оксида азота (NO) и зафиксируйте клетки для флуоресцентного окрашивания.
      ЗАМЕТКА. Опорную пластину нельзя хранить внутри инкубатора, когда она не используется; В противном случае температура может изменить плоскую форму и сделать ее бесполезной.
  3. Демонстрация эффективности протокола циклического растяжения
    1. Флуоресцентное окрашивание F-актина
      1. Исправьте ячейки, как указано на шаге 1.4.3. Используйте объем 1 мл на лунку.
      2. Трижды промойте клетки ПБС. Поддерживайте клетки в PBS, чтобы они не высыхали, готовя силиконовую мембрану к следующим шагам.
      3. Используйте ватный тампон, чтобы удалить излишки смазки на основе силикона с нижней части мембраны. Затем аккуратно нанесите средство для мытья окон или мыло для рук новым ватным тампоном. Повторяйте процесс до тех пор, пока вся смазка не будет удалена с мембраны. Затем очистите деионизированной водой.
        ЗАМЕТКА. Важно полностью удалить смазку с силиконовой мембраны, чтобы микроскопические изображения были хорошего качества.
      4. Аккуратно разрежьте силиконовые мембраны на мелкие кусочки, чтобы они поместились на 8-луночные предметные стекла камеры для окрашивания. Пермеабилизируйте клетки, как указано в шаге 1.4.5.
      5. После этапов стирки окрашивают F-актин с помощью фаллоидина и ядро с помощью DAPI. Приступайте к анализу, как указано в шагах 2.3.1.2 и 2.3.1.3. Используйте объем 0,3 мл на камеру.
      6. Снимите медиакамеру с помощью сепаратора. Поместите одну каплю реагента для монтажной среды (50% глицерина в PBS) и поместите предметное стекло (24 мм x 60 мм).
      7. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI обнаруживается с помощью светового куба DAPI (например: 335-379 нм; Em: 417-477 нм) и фаллоидин обнаруживается с помощью светового куба красного флуоресцентного белка (RFP) (Ex: 511-551 нм; Em: 573-613 нм). Световые кубики с аналогичным диапазоном длин волн возбуждения/излучения также подходят для этих флуорохромов. Если используются другие флуорохромы, проверьте, есть ли в используемом микроскопе соответствующие наборы фильтров для их обнаружения.
    2. Измерение NO, оцениваемое по накоплению нитритов (NO2) в кондиционированной среде hSVEC с использованием восстановительного хемилюминесцентного анализа на основе йодида калия
      1. Подготовка
        1. Приготовьте стандартную кривую из 0,01-10 мМ раствора нитрита натрия (NaNO2 в сверхчистой воде).
        2. Добавьте 5 мл уксусной кислоты и 1 мл йодида калия (50 мг в 1 мл сверхчистой воды) в продувочный сосуд анализатора оксида азота.
      2. НЕТ измерений
        1. Добавьте 20 мкл стандартной кривой NaNO2 в продувочный сосуд анализатора оксида азота. Измерьте его в соответствии с протоколом производителя.
    3. Добавьте 20 мкл кондиционированной среды в продувочный сосуд анализатора оксида азота. Измерьте его в соответствии с протоколом производителя.
    4. Рассчитайте концентрации NO2 на основе калибровки стандартной кривой. Отрегулируйте полученные значения по общему объему анализируемой кондиционируемой среды 6,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как правило, прилипшие ЭК могут наблюдаться через 3-4 дня после экстракции. hSVEC первоначально образуют скопления клеток и демонстрируют типичную морфологию «булыжника» (рис. 1B). Они экспрессируют ЕС-маркеры CD31 (рис. 1C, D) и VE-кадгерин (рис. 1D). hSVEC можно легко размножать на обработанной чашке для клеточных культур без покрытия, и они сохраняют эндотелиальный фенотип в культуре до восьми пассажей.

hSVEC при культивировании под напряжением сдвига выравниваются по направлению потока (рис. 2A). Напряжение сдвига 20 дин/см2 в течение 72 ч индуцирует экспрессию типичных механочувствительных генов KLF2, KLF4 и NOS3, что указывает на эффективность сдвигового стимула в hSVEC (рис. 2B)12,13,14.

Результат циклического растяжения зависит от интенсивности, приложенной к hSVEC. Клетки при низком растяжении демонстрируют корковый F-актиновый паттерн, сходный со статическими клетками (рис. 3A), без изменения высвобождения NO до 72 ч (рис. 3B). Артериальные уровни растяжения ремоделируют актиновый цитоскелет через 24 ч (рис. 3А) и снижают высвобождение NO через 72 ч (рис. 3Б).

Figure 1
Рисунок 1: Эндотелиальные клетки из подкожных вен человека (hSVEC) демонстрируют типичную морфологию эндотелия и специфическую экспрессию маркеров EC. (A) Сегмент подкожной вены, заполненный раствором коллагеназы II типа для экстракции ЭК. (B) Репрезентативный временной ход роста hSVEC после экстракции. Через 3-4 дня можно визуализировать скопления клеток, которые размножаются до тех пор, пока не достигнут слияния. Масштабная линейка = 100 мкм. (C) FACS-анализ культивируемых hSVEC на проходе 1. Зеленая линия указывает на то, что 99,7% клеточной популяции являются положительными на эндотелиально-специфический маркер CD31. Черная линия - это отрицательный контроль. (D) Иммуноокрашивание на CD31 (зеленый), (E) VE-кадгерин (зеленый) и ядра DAPI (синий) в hSVEC при прохождении 1. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: hSVEC выравниваются в направлении потока и экспрессируют механочувствительные гены при воздействии однонаправленного напряжения сдвига. Монослой конфлюентных клеток hSVEC, культивируемый в условиях статического или однонаправленного ламинарного напряжения сдвига. (A) Фазово-контрастные изображения (вверху) и окрашивание фаллоидином (внизу) hSVEC, подвергшихся воздействию напряжения сдвига 20 дин/см2 в течение72 часов. Зеленый: актиновые нити; синий: ядра клеток. Шкала = 100 мкм (фазовый контраст) и 20 мкм (флуоресценция). (B) Экспрессия генов KLF2, KLF4 и NOS3, определенная с помощью qRT-PCR. Значения представляют собой среднее значение ± SEM. ** p < 0,01 по сравнению со статической группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Фенотип hSVEC при циклическом растяжении зависит от приложенной интенсивности. (A) Монослой сливающихся клеток hSVEC, культивируемый при статическом, низком (венозном) или высоком (артериальном) растяжении в гибкой нижней пластине в течение 24 часов. Фазово-контрастные изображения (вверху) и окрашивание фаллоидином (внизу), показывающие актиновые волокна (красный) и ядра с DAPI (синий). Шкала = 100 мкм (фазовый контраст) и 50 мкм (флуоресценция). (B) Измерение NO оценивалось на основе накопления NO2 в средах для культивирования клеток в течение 72 часов. Значения представляют собой среднее значение ± SEM. *** p < 0,001 по сравнению со статической группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ген Белок Нападающий 5'-3' Реверс 5'-3'
КЛФ2 Крюппель-подобный фактор 2 CCACTCACACCTGCAGCTA GTGGTAGGGCTTCTCACCTG
КЛФ4 Круппелеподобный фактор 4 CACCTGGCGAGTCTGACATG CAGCGGTTATTCGGGGCAC
НОС3 Синтаза оксида азота, эндотелиальная GCACAGTTACCAGCTAGCCA GCCGGGGACAGGAAATAGTT
ППИА Циклофилин А, CATTTGGTGCAAGGGTCACA TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC
Пептидилпролилизомераза А

Таблица 1: праймеры qRT-PCR для стрессовых и референсных генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сегмент подкожной вены должен быть не менее 2 см для успешной изоляции hSVEC. Небольшие сегменты трудно обрабатывать и связывать концы сосуда для поддержания раствора коллагеназы для изоляции клеток. Уменьшенная площадь поверхности просвета не дает достаточного количества клеток для расширения культуры. Чтобы свести к минимуму риск заражения не-ЭК, манипуляции с сегментом подкожной вены должны быть очень щадящими в течение всей процедуры. Важно соблюдать осторожность при введении наконечников пипеток в просветные поверхности для удаления крови и во время введения раствора коллагеназы. Воздействие раствора фермента должно очень хорошо контролироваться (не более 1 ч), чтобы уменьшить загрязнение культуры не-ЭК. Использование специфической среды ЕС, дополненной коктейлем факторов роста, имеет решающее значение для роста культуры hSVEC. Дополнительный гепарин в первые дни культивирования важен для уменьшения остаточных эритроцитов из сегмента вены и для ингибирования пролиферации гладкомышечных клеток15. При сдаче клеток для экспериментов или для поддержания культуры убедитесь, что клетки заполнены пластинами со слиянием выше 40%. ЭК нуждаются в минимальном контакте, чтобы обеспечить хорошее распространение и выживание. hSVEC можно легко культивировать на поверхности без покрытия (например, желатином или фибронектином). Однако покрытие в течение первых дней после экстракции ЕС увеличит адгезию и выход ЕС. hSVEC имеют постоянную скорость пролиферации и поддерживают эндотелиальный фенотип до восьми пассажей, не экспрессируя маркеры мезенхимальных клеток (такие как SM22 и кальпонин). По нашему опыту, скорость пролиферации может варьироваться в зависимости от донора ткани, но не от прохода клеток. Рекомендуется криоконсервировать hSVEC в FBS с 5% ДМСО для повышения жизнеспособности после размораживания клеток.

Чтобы провести эксперимент с напряжением сдвига, необходимо рассмотреть несколько важных шагов. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха внутри системы, перфузионный набор и разъемы должны быть уравновешены в течение ночи при 37 ° C и 5% CO2. Пузырьки могут блокировать поток через систему или повреждать эндотелиальный монослой, мешая фенотипу клетки. При посеве ячеек в горку проточной камеры рекомендуется использовать ее слив через 4 часа или на следующий день. Кроме того, обязательна ежедневная смена среды предметного стекла в статических условиях, если эксперимент длится несколько дней. Объем предметного стекла проточной камеры составляет ~ 160 мкл, и этого недостаточно для поддержания клеток в течение длительных периодов культивирования. Преимущество системы заключается в том, что она легко наблюдает за клетками с помощью микроскопии (светлое поле/фазовый контраст или окрашивание для флуоресцентной микроскопии). Ограничением является низкий выход белков (20-25 мкг/предметное стекло) и РНК (1 мкг/предметное стекло). Чтобы преодолеть это, система позволяет соединять несколько слайдов последовательно с помощью одного и того же жидкостного блока (см. инструкции производителя). Затем можно использовать объем буфера лизиса для одного предметного стекла для извлечения белка или РНК из нескольких слайдов.

Система растяжки проста в обращении и позволяет применять растяжку различной интенсивности и типа. Важно смазывать все загрузочные станции перед каждым экспериментом, чтобы уменьшить трение между мембраной культуральной пластины и станцией и гарантировать правильное распределение циклической деформации. Убедитесь, что пластины полностью прилегают к опорной плите, чтобы создать вакуум, необходимый для достижения желаемого растяжения. Равноосный стимул не вызывает равномерной деформации внутри скважины. Ячейки на краю лунки нужно выбросить, как указано производителем. Площадь интересующей мембраны определяется исходя из диаметра загрузочной станции и процента удлинения. Можно выполнить иммуноокрашивание во всей мембране или разрезать ее на более мелкие кусочки, чтобы уменьшить количество антител, используемых в анализе. При этом с мембранами нужно обращаться очень аккуратно, не допуская повреждения клеток. Исследователи также должны позаботиться о том, чтобы мембрана не перевернулась вверх дном и не потеряла клетки во время окрашивания. Всегда можно подтвердить правильность поверхности мембраны клетками под оптической микроскопией.

Основным ограничением подобных исследований in vitro является то, что они не полностью повторяют среду in vivo . По этой причине важно всегда проводить анализ, чтобы убедиться, что hSVEC поддерживают фенотип EC (экспрессируют маркеры EC) и воспроизводят ожидаемые результаты при механическом стрессе (ориентация F-актина и регуляция/производство белков механического ответа).

Таким образом, мы приводим подробную процедуру выделения hSVEC и воздействия на них контролируемых уровней напряжения сдвига и растяжения. Когда трансплантат SV внезапно подвергается артериальным заболеваниям после АКШ, происходит повреждение эндотелия, что способствует отторжению трансплантата. Эти протоколы могут сыграть важную роль в углублении нашего понимания того, как механические силы влияют на дисфункцию hSVEC, связанную с заболеванием трансплантата вен.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

JEK поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 и 2013/17368-0] и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 и 309179/2013-0). AAM поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution Gibco 25200072
15 µ slide I 0.4 Luer  Ibidi 80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) Thermo Fisher Scientific D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm  Flexcell International Corporation LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well Thermo Fisher Scientific 154453
Acetic Acid (Glacial) Millipore 100063
Acrylic sheet 1 cm thick Plexiglass
Anti-CD31 antibody Abcam ab24590
Anti-CD31, FITC antibody Thermo Fisher Scientific MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody Cell Signaling 2500
Bioflex plates collagen I Flexcell International Corporation BF3001C
Bovine serum albumin solution Sigma-Aldrich A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm Brasuture AP524
Cyclophilin forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Cyclophilin reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
EBM-2 basal medium Lonza CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements Lonza CC4176
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2657-029
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma-Aldrich F4680
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL Blau Farmacêutica SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) Ibidi 10902
KLF2 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF2 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer Sievers Instruments NOA-280i-1
NOS3 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOS3 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs Ibidi 10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031
Potassium Iodide Sigma-Aldrich 221945
QuanTitec SYBR green PCR kit Qiagen 204143
QuantStudio 12K flex platform  Applied Biosystems 4471087
RNeasy micro kit  Quiagen 74004
Slide glass (24 mm x 60 mm) Knittel Glass VD12460Y1D.01
Sodium nitrite Sigma-Aldrich 31443
SuperScript IV first-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18091200
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypan blue stain 0.4% Gibco 15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C6885

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
  4. Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
  5. Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
  6. Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
  7. Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
  8. Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
  9. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  10. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
  11. Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
  12. Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
  13. Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
  14. Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
  15. Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 194
Изоляция эндотелиальных клеток подкожных вен человека и воздействие контролируемых уровней напряжения сдвига и растяжения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Girão-Silva, T.,… More

Girão-Silva, T., Fonseca-Alaniz, M. H., Oliveira Dallan, L. A., Valãdao, I. C., Oliveira da Rocha, G. H., Krieger, J. E., Miyakawa, A. A. Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch. J. Vis. Exp. (194), e65122, doi:10.3791/65122 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter