Summary
Vi beskriver ett protokoll för att isolera och odla humana saphenösa venendotelceller (hSVEC). Vi tillhandahåller också detaljerade metoder för att producera skjuvspänning och stretch för att studera mekanisk spänning i hSVEC.
Abstract
Koronar bypass-transplantation (CABG) kirurgi är ett förfarande för att revaskularisera ischemiskt myokardium. Saphenös ven används fortfarande som en CABG-ledning trots den minskade långsiktiga patencyen jämfört med arteriella ledningar. Den plötsliga ökningen av hemodynamisk stress i samband med transplantatarterialiseringen resulterar i vaskulär skada, särskilt endotelet, som kan påverka den låga patencyen hos saphenous ventransplantat (SVG). Här beskriver vi isolering, karakterisering och expansion av humana saphenösa venendotelceller (hSVEC). Celler isolerade genom kollagenassmältning visar den typiska kullerstensmorfologin och uttrycker endotelcellmarkörer CD31 och VE-cadherin. För att bedöma den mekaniska stresspåverkan användes protokoll i denna studie för att undersöka de två huvudsakliga fysiska stimuli, skjuvspänning och sträckning, på arterialiserade SVG. hSVEC odlas i en parallell plattflödeskammare för att producera skjuvspänning, vilket visar inriktning i flödesriktningen och ökat uttryck av KLF2, KLF4 och NOS3. hSVEC kan också odlas i ett kiselmembran som möjliggör kontrollerad cellulär stretch, efterliknar venös (låg) och arteriell (hög) stretch. Endotelcellernas F-aktinmönster och kväveoxid (NO) utsöndring moduleras följaktligen av arteriell sträcka. Sammanfattningsvis presenterar vi en detaljerad metod för att isolera hSVEC för att studera påverkan av hemodynamisk mekanisk stress på en endotelfenotyp.
Introduction
Endotelcell (EC) dysfunktion är en nyckelspelare i saphenous ven transplantat misslyckande 1,2,3,4. Den ihållande ökningen av skjuvspänning och cyklisk stretch inducerar den proinflammatoriska fenotypen av humana saphenösa venendotelceller (hSVEC)3,4,5,6. De underliggande molekylära vägarna är fortfarande inte helt förstådda, och standardiserade protokoll för in vitro-studier kan utnyttja ansträngningarna för nya insikter inom området. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att isolera, karakterisera och expandera hSVEC och hur man utsätter dem för varierande nivåer av skjuvspänning och cyklisk sträckning, vilket efterliknar de venösa och arteriella hemodynamiska tillstånden.
hSVEC isoleras genom kollagenasinkubation och kan användas fram till passage 8. Detta protokoll kräver mindre manipulation av kärlet jämfört med de andra tillgängliga protokollen7, vilket minskar kontaminering med glattmuskelceller och fibroblaster. Å andra sidan krävs det ett större kärlsegment på minst 2 cm för att ha effektiv EC-extraktion. I litteraturen har det rapporterats att EC från stora fartyg också kan erhållas genom mekaniskt avlägsnande 7,8. Även om det fysiska tillvägagångssättet är effektivt har det nackdelar som låg EC-avkastning och högre fibroblastkontaminering. För att öka renheten behövs extra steg med magnetiska pärlor eller cellsortering, vilket ökar kostnaden för protokollet på grund av förvärv av pärlor och antikroppar 7,8. Den enzymatiska metoden ger snabbare och bättre resultat avseende EC renhet och livskraft 7,8.
De vanligaste EC: erna för att studera endoteldysfunktion är humana navelvenendotelceller (HUVEC). Det är känt att EG-fenotypen förändras i olika kärlbäddar, och det är viktigt att utveckla metoder som representerar det kärl som undersöks 9,10. I detta avseende är upprättandet av ett protokoll för att isolera en hSVEC och odla den under mekanisk belastning ett värdefullt verktyg för att förstå bidraget från hSVEC-dysfunktion vid ventransplantatsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Oanvända segment av saphenösa vener erhölls från patienter som genomgick aortokoronar bypassoperation vid Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alla individer gav informerat samtycke till att delta i studien, som granskades och godkändes av den lokala etiska kommittén.
1. Isolering, odling och karakterisering av primära humana saphenösa venendotelceller (hSVEC)
- Förberedelse
- Autoklav ett par raka eller krökta pincett och vävnadsax (7-8 cm).
- Förbered sterilt gelatin. Blanda 0,1 g (0,1 % vikt/volym) eller 3 g (3 % vikt/volym) gelatin från svinskinn med 100 ml ultrarent vatten, autoklav i 15 minuter och förvara vid 4 °C. Värm till 37 °C för att kondensera innan du täcker cellodlingsskålarna och glasen.
- Bered sterilt kollagenas (1 mg/ml) inuti huven med laminärt flöde. Späd kollagenas i PBS och sterilisera det med ett 0,2 μm filter.
- Täck en 60 mm cellodlingsskål och ett 8-brunns kammarglas med 0,1% w/v gelatin i minst 30 minuter vid 37 °C. Ta bort överflödigt gelatin innan du såddar cellerna.
- Förbered komplett endotelcellmedium: endotelcellstillväxtbasalmedium (EBM-2) kompletterat med EGM2-tillväxtfaktorer.
OBS: EGM2-tillväxtfaktorerna levereras som ett kit av ett företag som anges i materialförteckningen. Koncentrationen av faktorerna avslöjas inte av företaget. - Gör 2% och 5% bovint serumalbumin (BSA), 4% paraformaldehyd (PFA) och 0,1% Triton X-100-lösningar, allt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Isolering och odling av hSVECs
- Samla minst ett 2-3 cm långt saphenöst vensegment för denna procedur.
NOT. Alla cellodlingsprocedurer måste utföras under sterila förhållanden och inuti en laminär flödeshuv. - Överför vensegmentet till en petriskål fylld med förvärmd PBS. Sätt in en pipettspets i ena änden av venen och spola försiktigt med PBS för att ta bort allt blod inuti lumen. Spola det tills tvättflödet blir helt klart.
- Stäng en av ändarna av venen med en steril bomullssutur. Fyll försiktigt kärlet med 1 mg/ml kollagenas typ II-lösning. Stäng den andra änden av kärlet med en bomullssutur (figur 1A). Inkubera kärlet med kollagenaslösning i en fuktad atmosfär med 5 %CO2 vid 37 °C i 1 timme.
- Därefter skär en av ändarna av kärlet inuti ett 15 ml rör och samla kollagenaslösningen. Skär den andra änden och spola luminalytan med 1-2 ml PBS för att samla alla fristående EC. Sätt alla PBS tillsammans med kollagenaslösning inuti samma rör.
- Centrifugera röret vid 400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT) för att pellet cellerna.
NOT. Cellpelleten är mycket liten och svår att visualisera. Om blodet inte avlägsnas helt före kollagenasbehandling (steg 1.2.2.) kommer blodkropparna också att fällas ut och pelleten blir rödaktig. - Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 3-4 ml fullständigt endotelcellmedium (EBM-2 kompletterat med EGM2-tillväxtfaktorer) och ytterligare en heparinlösning (5 E/ml, slutlig koncentration). Platta cellerna i en 60 mm cellodlingsskål förbelagd med 3% w/v gelatin.
OBS: Gelatin var förstahandsvalet på grund av dess lättillgänglighet och låga kostnad. Eftersom beläggningen med gelatin framgångsrikt upprätthåller EC-fenotypen testades inget annat beläggningsämne. Kollagener och fibronektin kan testas i studier som syftar till att undersöka påverkan av olika extracellulära matriskomponenter på EC-vidhäftning och fenotypen. - Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 %CO2 i 4 dagar utan att byta medium. Därefter byter du media varannan dag. Från och med nu är det extra cellmedietillskottet med heparin inte längre nödvändigt. Undersök plattan under mikroskopet för att säkerställa att de röda blodkropparna avlägsnades.
- Efter 3-10 dagar efter extraktion, beroende på vensegmentets storlek och diameter, visualisera hSVECs genom faskontrastmikroskopi.
- Utvärdera graden av sammanflöde och deras kullerstensmorfologi i faskontrastmikroskopi.
- Fortsätt byta media var 2: e dag tills cellerna når 70% -80% sammanflöde.
- Passera hSVECs med 0,25% trypsin-0,02% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning.
- Tvätta cellerna med förvärmd PBS.
- Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA-lösning till 60 mm cellodlingsskålen. Inkubera vid 37 °C i 2 minuter eller tills alla celler har lossnat.
- Tillsätt 2 ml komplett endotelcellmedium för att inaktivera trypsinet.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och centrifugera vid 300 x g i 3 minuter vid RT.
- Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i 1 ml odlingsmedium.
- Räkna cellsuspensionen i 1: 1 trypanblå (0,4%) för att platta livskraftiga celler.
- För att expandera kulturen, plätera cellerna i en 100 mm cellodlingsskål med 10 ml förvärmt komplett endotelcellmedium och odla det vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 5% CO2.
NOT. I genomsnitt kommer sådden av 4 x 104 hSVEC/cm2 att vara 100% sammanflytande efter 48 timmar.
- För att kryokonservera cellerna, suspendera pelleten från steg 1.2.11.5 i 5% dimetylsulfoxid (DMSO) i fetalt bovint serum (FBS) och lagra i flytande kväve.
- Samla minst ett 2-3 cm långt saphenöst vensegment för denna procedur.
- Karakterisering av hSVEC: Flödescytometrifärgning för CD31
- Överför 1 x 10 5 hSVEC till ett1,5 ml rör och centrifugera vid 300 x g i 3 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 100 μl PBS innehållande 2 % monoklonal antikropp mot BSA och CD31-FITC (1:100).
- Färga cellerna i 30 minuter vid RT i mörkret.
- Tvätta de färgade cellerna genom att tillsätta 0,5 ml PBS och centrifugera dem vid 300 x g i 3 minuter vid RT. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 400 μL PBS med 2% BSA.
- Använd omärkta hSVEC, utan CD31-antikropp, som negativ kontroll.
- Fortsätt till flödescytometerförvärvsanalys med en blå laser och FITC-kanal (excitation/emission max [Ex/Em] på 498/517 nm). Om andra fluorokromer används, kontrollera om cytometern har lämpliga filteruppsättningar för detektering. Separera cellerna från skräp i funktionen av deras storlek och granularitet, grinda sedan enskilda celler genom framåtspridning och sidospridning.
- Karakterisering av hSVEC: Fluorescerande färgning för CD31 och VE-cadherin
- Platta 0,1 x 105 celler i gelatinbelagd 8-brunns kammarglas. Inkubera cellerna över natten vid 37 °C, 5 % CO2, så att cellerna fäster på odlingsytan.
- Ta bort mediet och tvätta cellerna en gång med PBS.
- Tillsätt 0,3 ml / brunn med 4% PFA för att fixera cellerna. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med PBS.
- Tillsätt 0,3 ml / brunn av 0,1% Triton X-100-lösning för att permeabilisera cellerna. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med PBS.
- För att blockera icke-specifika antikroppsbindningsställen, tillsätt 0,3 ml / brunn av 5% BSA-lösning till cellerna. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med PBS.
- Inkubera cellerna med de primära antikropparna (CD31 och VE-cadherin, 1:100) utspädda i PBS med 2 % BSA över natten med försiktig gungning vid 4 °C. Lämna en väl inkubation med PBS med 2% BSA (ingen primär antikropp) som den negativa kontrollen.
- Tvätta tre gånger med PBS.
- Inkubera cellerna med fluorescerande märkta sekundära antikroppar utspädda (1:500) i PBS i 1 h vid RT. Tillsätt 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för kärnfärgning till en slutlig koncentration av 1 mg/ml.
- Tvätta tre gånger med PBS.
- Ta bort mediekammaren med separatorn. Placera en droppe av monteringsmediereagenset (50 % glycerol i PBS) och placera en glasskiva (24 mm x 60 mm) samtidigt som du undviker att fånga bubblor.
- Observera cellerna under ett fluorescensmikroskop.
DAPI detekteras med en DAPI-ljuskub (Ex: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) och CD31/VE-cadherin detekteras med hjälp av en ljuskub med grönt fluorescerande protein (GFP) (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Ljuskuber med liknande excitations-/emissionsvåglängdsområde är också lämpliga för dessa fluorokromer. Om andra fluorokromer används, kontrollera om det använda mikroskopet har lämpliga filteruppsättningar för detektering.
2. Skjuvspänning på hSVEC
- Förberedelse
- Belägg flödeskammarens glas med 0,1 % vikt/v gelatin i minst 30 minuter vid 37 °C. Ta bort överskott av gelatin innan du såddar cellerna.
- Balansera fluidenheten och sterilt perfusionsset med 10 ml reservoarer över natten inuti inkubatorn i en fuktad atmosfär på 5%CO2 vid 37 °C.
- Skjuvspänningsexperiment
- Frö 2 x 105 ECs suspenderade i 100 μL EC-medium i det gelatinbelagda flödeskammarglaset. Inkubera cellerna i 4 timmar vid 37 °C och 5 %CO2 så att cellerna kan fästa vid odlingsytan.
- Placera perfusionssatsen på fluidenheten enligt beskrivningen i tillverkarens anvisningar. Fyll behållarna och perfusionen i cirka 12 ml förvärmt komplett endotelcellmedium. Ta bort luftbubblor manuellt från perfusionsuppsättningen för att balansera nivån på båda behållarna vid 5 ml.
- Placera fluidenheten med den monterade perfusionssatsen, utan kammarglaset, i inkubatorn och anslut dess elektriska kabel till den datorreglerade pumpen. Ta bort alla luftbubblor från behållarna och perfusionssetet genom att köra ett fördefinierat protokoll i pumpstyrningsprogramvaran.
NOT. Det är mycket viktigt att ta bort luftbubblor för att systemet ska fungera korrekt. - Ta fluidenheten med den monterade perfusionssatsen till den laminära flödeshuven och fäst objektglasen med ett sammanflytande cellmonolager.
- Placera fluidenheten med den monterade perfusionen och glider med celler i inkubatorn och anslut sin elektriska kabel till pumpen.
- Ställ in följande parametrar i pumpstyrningsprogramvaran: mediets viskositet (0,0072), typ av objektglas, kalibreringsfaktor för perfusionsset, skjuvspänning (20 dyn/cm2), typ av flöde (enkelriktat) och tid (72 timmar) och starta flödet (se utrustningens instruktioner för mer information). Skörda cellerna behandlade med samma media utan exponering för flöde som statiska kontroller.
- När stimulansen är klar, tvätta cellerna en gång med PBS och fortsätt att skörda proverna enligt önskad analys. För fluorescerande färgning, se steg 2.3.1 och för RNA-extraktion, se steg 2.3.2.
- Demonstration av skjuvspänningsprotokollets effektivitet
- Fluorescerande färgning av aktinfilament (F-aktin)
- Fixera och permeabilisera cellerna enligt anvisningarna i steg 1.4.2-1.4.6. Använd en volym på 100 μl i μ-bilden.
- Färga F-aktin med fluorescerande märkt falloidin (utspätt vid 1:200 i PBS) och motfärga kärnan med DAPI (slutlig koncentration av 1 mg / ml i PBS) i 2 timmar vid RT, skyddad från ljus.
- Tvätta tre gånger med PBS.
- Observera cellerna under ett fluorescensmikroskop.
DAPI detekteras med en DAPI-ljuskub (Ex: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) och falloidin detekteras med en GFP-ljuskub (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Ljuskuber med ett liknande intervall av excitation / emissionsvåglängd är också lämpliga för dessa fluorokromer. Om andra fluorokromer används, kontrollera om det använda mikroskopet har lämpliga filteruppsättningar för detektering.
- Genuttryck genom kvantitativ omvänd transkription i realtid (RT-qPCR)
- Samla upp cellerna från det μ-objektglaset med 350 μl av en kommersiell guanidintiocyanatinnehållande lysbuffert. Isolera det totala RNA med kolonnbaserade extraktionssatser enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: På grund av det begränsade antalet celler odlade i μ-bilden rekommenderas användning av kolonnbaserad extraktion av RNA. - Förbered cDNA med hjälp av ett cDNA-synteskit med transkriptas omvänt enzym, enligt tillverkarens instruktioner.
- Kontrollera uttrycket av genen (erna) som regleras av skjuvspänning: KLF2, KLF4 och NOS3. Använd hushållerskans gen PPIA / cyklofilin för att normalisera resultaten. De specifika primrarna för reaktionen anges i tabell 1.
- Utför RT-qPCR med hjälp av ett SYBR-grönt fluorescerande DNA-fläckkit under följande reaktionsbetingelser: i) 50 °C i 2 minuter, ii) 95 °C i 15 minuter, iii) 94 °C i 15 sekunder, iv) 60 °C i 30 sekunder, v) 72 °C i 30 sekunder. Upprepa steg iii till v i 40 cykler. Lägg till ett smältsteg i slutet av reaktionen för att verifiera primerns specificitet.
- Samla upp cellerna från det μ-objektglaset med 350 μl av en kommersiell guanidintiocyanatinnehållande lysbuffert. Isolera det totala RNA med kolonnbaserade extraktionssatser enligt tillverkarens instruktioner.
- Fluorescerande färgning av aktinfilament (F-aktin)
3. Cyklisk stretch på hSVEC
- Förberedelse
- Applicera silikonbaserat smörjmedel på toppen och sidorna av den 6-brunns ekvibiaxiella laststationen på 25 mm.
OBS: Detta minskar friktionen mellan odlingsplattans membran och stationen, vilket möjliggör bättre fördelning av den cykliska töjningen. Detta steg måste göras före varje experiment.
- Applicera silikonbaserat smörjmedel på toppen och sidorna av den 6-brunns ekvibiaxiella laststationen på 25 mm.
- Cykliskt stretchexperiment
- Frö 4 x 105 celler suspenderade i 3 ml till varje brunn av de 6-brunniga flexibla bottenodlingsplattorna belagda med kollagen I (Table of Materials). Planera att ha en platta (er) i statiskt tillstånd som kontrollgrupp. Håll cellerna i inkubatorn (37 °C i fuktad luft med 5%CO2) tills de når 100% sammanflöde (vanligtvis 48 timmar efter sådd). Innan stretchprotokollet börjar, tvätta cellerna en gång med förvärmd PBS och tillsätt 3 ml färskt odlingsmedium per brunn.
- Sätt in basplattan med alla smorda laddningsstationer i inkubatorn och anslut slangen på lämpligt sätt med styrutrustningen för spänningscellsträckningsbioreaktorsystemet (se utrustningsanvisningarna för mer information).
- Fäst varje odlingsplatta på en röd packning, som tillhandahålls av spänningscellsträckningsbioreaktorsystemet. Lägg dem sedan i basplattan inuti inkubatorn.
- Se till att plattorna sitter ordentligt, pressas och förseglas till basplattan för att undvika att luft läcker ut under vakuumpumpningen. Det är viktigt att ha alla fyra odlingsplattorna i basplattan för att ha rätt vakuum och sträckbelastning.
- Om du har färre experimentplattor, använd en tom platta för att slutföra de fyra positionerna i basplattan. Lägg akrylplåten (medföljer utrustningen) ovanpå odlingsplattorna för att förbättra basplattans tätning. Placera de statiska plattorna i samma inkubator.
- Slå på styrenheten och datorsystemet. Öppna programvaruikonen och konfigurera önskad regim: storlek på laddningsstationen som ska användas, typ av töjning, procentuell töjning, vågform, frekvens och tid. För detaljerad information, se tillverkarens instruktioner. Välj och ladda ner behandlingen. Här användes följande regim: 1/2 sinusvågform, 1 Hz-frekvens, 5% förlängning (för att efterlikna venös sträckning) och 15% av töjning (för att efterlikna arteriell sträckning) upp till 72 timmar.
- Slå på vakuumsystemet och klicka på Start på datorskärmen för att köra sträckningen. Kontrollera om silikonmembranet rör sig och sträcker cellerna.
- När stimulansen är klar, tvätta cellerna en gång med PBS och fortsätt att skörda proverna enligt önskad analys. Här, för att demonstrera effektiviteten av cyklisk sträckning, samla hSVEC-odlingsmediet, håll det vid -80 ° C för ytterligare kväveoxid (NO) mätning och fixera cellerna för fluorescerande färgning.
NOT. Basplattan kan inte förvaras inuti inkubatorn när den inte används. Annars kan temperaturen ändra den plana formen och göra den värdelös.
- Demonstration av effektiviteten hos det cykliska stretchprotokollet
- Fluorescerande färgning av F-aktin
- Fixa cellerna enligt anvisningarna i steg 1.4.3. Använd en volym på 1 ml per brunn.
- Tvätta cellerna tre gånger med PBS. Behåll cellerna i PBS så att de inte torkar medan du förbereder silikonmembranet för nästa steg.
- Använd en bomullspinne för att ta bort överskottet av silikonbaserat smörjmedel från membranets botten. Applicera sedan försiktigt fönsterputsmedel eller handtvål med en ny bomullspinne. Upprepa processen tills allt smörjmedel har tagits bort från membranet. Rengör sedan med avjoniserat vatten.
NOT. Det är viktigt att helt ta bort smörjmedlet från silikonmembranet för att få mikroskopibilder av god kvalitet. - Skär försiktigt silikonmembranen i små bitar för att passa på 8-brunnskammarglas för färgning. Permeabilisera cellerna enligt anvisningarna i steg 1.4.5.
- Efter tvättstegen, färga F-aktin med falloidin och kärnan med DAPI. Fortsätt med analysen enligt anvisningarna i steg 2.3.1.2 och 2.3.1.3. Använd en volym på 0,3 ml per kammarbrunn.
- Ta bort mediekammaren med separatorn. Placera en droppe monteringsmediumreagens (50% glycerol i PBS) och placera en glasskiva (24 mm x 60 mm).
- Observera cellerna under ett fluorescensmikroskop.
DAPI detekteras med en DAPI-ljuskub (Ex: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) och falloidin detekteras med en röd fluorescerande protein (RFP) ljuskub (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Ljuskuber med ett liknande intervall av excitation / emissionsvåglängd är också lämpliga för dessa fluorokromer. Om andra fluorokromer används, kontrollera om det använda mikroskopet har lämpliga filteruppsättningar för detektering.
- NO-mätning uppskattad genom nitritackumulering (NO2) i det hSVEC-konditionerade mediet med användning av en kaliumjodidbaserad reduktiv kemiluminiscensanalys
- Förberedelse
- Förbered en standardkurva från 0,01-10 mM natriumnitrit (NaNO2 i ultrarent vatten) lösning.
- Tillsätt 5 ml ättiksyra och 1 ml kaliumjodid (50 mg i 1 ml ultrarent vatten) i reningskärlet i kväveoxidanalysatorn.
- INGEN mätning
- Tillsätt 20 μL avNaNO2-standardkurvan i kväveoxidanalysatorns reningskärl. Mät det enligt tillverkarens protokoll.
- Förberedelse
- Tillsätt 20 μL av det konditionerade mediet i kväveoxidanalysatorns reningskärl. Mät det enligt tillverkarens protokoll.
- BeräknaNO2-koncentrationerna baserat på kalibreringen av standardkurvan. Justera de värden som erhålls med den totala volymen av det konditionerade mediet som analyserats 6,11.
- Fluorescerande färgning av F-aktin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vanligtvis kan vidhäftade ECs observeras 3-4 dagar efter extraktion. hSVEC bildar initialt kluster av celler och uppvisar en typisk "kullerstensmorfologi" (figur 1B). De uttrycker EG-markörerna CD31 (figur 1C,D) och VE-cadherin (figur 1D). hSVEC kan enkelt förökas på en icke-belagd behandlad cellodlingsskål, och de behåller endotelfenotypen i odling upp till åtta passager.
hSVEC, när de odlas under skjuvspänning, justeras i flödesriktningen (figur 2A). Skjuvspänningen på 20 dyn/cm2 under 72 timmar inducerar uttrycket av typiska mekanokänsliga gener, KLF2, KLF4 och NOS3, vilket indikerar skjuvstimulansens effektivitet i hSVEC (figur 2B)12,13,14.
Det cykliska stretchresultatet beror på intensiteten som appliceras på hSVEC. Celler under låg sträckning visar ett kortikalt F-aktinmönster som liknar statiska celler (figur 3A), utan förändring av NO-frisättningen upp till 72 timmar (figur 3B). Arteriell nivå av stretch omformar aktincytoskelettet efter 24 timmar (figur 3A) och minskar NO-frisättningen efter 72 timmar (figur 3B).
Figur 1: Endotelceller från humana saphenösa vener (hSVEC) uppvisar typisk endotelmorfologi och specifikt EC-marköruttryck. (A) Saphenous vensegment uppfyllt med typ II kollagenaslösning för extraktion av ECs. (B) Representativt tidsförlopp för hSVEC-tillväxt efter extraktion. Efter 3-4 dagar är det möjligt att visualisera kluster av celler som prolifererar tills de når sammanflöde. Skalstapel = 100 μm. (C) FACS-analys av odlade hSVECs vid passage 1. Den gröna linjen indikerar att 99,7% av cellpopulationen är positiv för den endotelspecifika markören CD31. Den svarta linjen är den negativa kontrollen. (D) Immunfärgning för CD31 (grön), (E) VE-cadherin (grön) och kärnor DAPI (blå) i hSVEC vid passage 1. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: hSVEC justeras i flödesriktningen och uttrycker mekanokänsliga gener när de utsätts för enkelriktad skjuvspänning. Konfluent cellmonolager av hSVEC odlade under statiska eller enkelriktade laminära skjuvspänningsförhållanden. A) Faskontrastbilder (överst) och falloidinfärgning (nederst) av hSVEC som utsätts för en skjuvspänning på 20 dyn/cm2 under72 timmar. Grön: aktinfilament; blå: cellkärnor. Skalstapel = 100 μm (faskontrast) och 20 μm (fluorescens). b) Genuttryck av KLF2, KLF4 och NOS3 bestämt med qRT-PCR. Värdena representerar medelvärdet ± SEM. ** p < 0,01 jämfört med den statiska gruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: hSVEC-fenotypen under cyklisk stretch beror på den applicerade intensiteten . (A) Konfluent cellmonolager av hSVEC odlade under statisk, låg (venös) eller hög (arteriell) stretch i en flexibel bottenplatta i 24 timmar. Faskontrastbilder (överst) och falloidinfärgning (botten) som visar aktinfibrerna (röda) och kärnorna med DAPI (blå). Skalstapel = 100 μm (faskontrast) och 50 μm (fluorescens). (B) NO-mätningen uppskattades baserat på NO2-ackumulering i cellodlingsmediet under72 timmar. Värdena representerar medelvärdet ± SEM. *** p < 0,001 jämfört med den statiska gruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Gen | Protein | Framåt 5'-3' | Omvänd 5'-3' | ||
| KLF2 | Krüppel-liknande faktor 2 | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCACCTG | ||
| KLF4 | Kruppel-liknande faktor 4 | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGGGCAC | ||
| NOS3 | Kväveoxidsyntas, endotel | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| PPIA | cyklofilin A, | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC | ||
| Peptidylprolylisomeras A | |||||
Tabell 1: qRT-PCR-primrar för skjuvspänning och referensgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det saphenösa vensegmentet bör ha varit minst 2 cm för att framgångsrikt isolera hSVEC. Små segment är svåra att hantera och binda ändarna av kärlet för att bibehålla kollagenaslösningen för att isolera cellerna. Den reducerade luminala ytan ger inte tillräckligt med celler för att expandera kulturen. För att minimera risken för kontaminering med icke-ECs måste manipuleringen av det saphenösa vensegmentet vara mycket försiktig under hela proceduren. Det är viktigt att vara försiktig när pipettspetsarna införs i luminalytorna för att avlägsna blod och under införandet av kollagenaslösningen. Exponeringen för enzymlösning bör kontrolleras mycket väl (inte längre än 1 h) för att minska kontamineringen av kulturen med icke-EC. Användningen av ett specifikt EG-medium kompletterat med cocktail av tillväxtfaktorer är avgörande för hSVEC-kulturens tillväxt. Det extra heparinet under de första dagarna av odlingen är viktigt för att minska kvarvarande röda blodkroppar från vensegmentet och för att hämma glattmuskelcellproliferation15. När du passerar cellerna för experiment eller för att upprätthålla kulturen, se till att plattan cellerna med en sammanflöde högre än 40%. EG behöver minimal kontakt för att säkerställa god spridning och överlevnad. hSVECs kan enkelt odlas på en icke-belagd (t.ex. gelatin eller fibronektin) yta. Beläggningen under de första dagarna efter EC-extraktion ökar emellertid EC-vidhäftningen och utbytet. hSVECs har en konstant proliferationshastighet och upprätthåller endotelfenotypen upp till åtta passager, utan att uttrycka mesenkymala cellmarkörer (såsom SM22 och calponin). Enligt vår erfarenhet kan spridningshastigheten variera beroende på vävnadsdonatorn men inte med en cellpassage. Det rekommenderas att kryokonservera hSVEC i FBS med 5% DMSO för att öka livskraften efter upptining av cellerna.
För att genomföra ett skjuvspänningsexperiment finns det kritiska steg som ska beaktas. För att undvika att luftbubblor bildas inuti systemet måste perfusionssatsen och anslutningsdonen balanseras över natten vid 37 °C och 5 %CO2. Bubblorna kan blockera flödet genom systemet eller skada endotelmonoskiktet som stör cellfenotypen. Vid sådd av cellerna i flödeskammarens glid rekommenderas att den flyter samman för att använda efter 4 timmar eller nästa dag. Dessutom är det obligatoriskt att byta medium på bilden varje dag vid statiska förhållanden om experimentet körs i flera dagar. Flödeskammarens glasvolym är ~ 160 μL, och det är inte tillräckligt för att behålla cellerna under långa perioder av odling. Systemet har fördelen att lätt observera cellerna genom mikroskopi (ljusfält/faskontrast eller färgning för fluorescensmikroskopi). Begränsningen är det låga utbytet av proteiner (20-25 μg/slide) och RNA (1 μg/slide). För att övervinna detta tillåter systemet anslutning av flera bilder i en serie med samma fluidenhet (se tillverkarens instruktioner). Sedan är det möjligt att använda volymen av lysbufferten för en bild för att extrahera proteinet eller RNA från flera objektglas.
Stretchsystemet är lätt att hantera och möjliggör applicering av olika intensiteter och typer av stretching. Det är viktigt att smörja alla laddningsstationer före varje experiment för att minska friktionen mellan odlingsplattmembranet och stationen och för att garantera korrekt fördelning av den cykliska töjningen. Försäkra dig om att plattorna är helt förseglade mot basplattan för att producera det vakuum som krävs för att nå önskad sträckning. Den ekviaxiella stimulansen ger inte en enhetlig belastning inuti brunnen. Cellerna vid kanten av brunnen måste kasseras, vilket anges av tillverkaren. Membranområdet av intresse bestäms utifrån laststationens diameter och procentandelen töjning. Det är möjligt att utföra immunfärgningen i hela membranet eller skära det i mindre bitar för att minska mängden antikroppar som används i analysen. I detta fall måste membranen hanteras mycket noggrant och undvika skador på cellerna. Forskare bör också vara försiktiga så att membranet inte vänds upp och ner och förlorar cellerna medan de gör färgningen. Det är alltid möjligt att bekräfta membranets korrekta ansikte med cellerna under optisk mikroskopi.
Den största begränsningen med in vitro-studier som dessa är att de inte helt rekapitulerar in vivo-miljön. Av denna anledning är det viktigt att alltid utföra analyser för att säkerställa att hSVEC bibehåller EC-fenotypen (uttrycker EC-markörer) och reproducerar förväntade resultat under mekanisk belastning (F-aktinorientering och reglering / produktion av mekaniska responsproteiner).
Sammanfattningsvis tillhandahåller vi en detaljerad procedur för att isolera hSVEC och utsätta dem för kontrollerade nivåer av skjuvspänning och sträckning. När ett SV-transplantat plötsligt utsätts för arteriella tillstånd efter CABG uppstår endotelskador och bidrar till transplantatfel. Dessa protokoll kan vara avgörande för att främja vår förståelse för hur mekaniska krafter påverkar hSVEC-dysfunktion i samband med ventransplantatsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
JEK stöds av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 och 2013/17368-0] och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 och 309179/2013-0). AAM stöds av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
