Summary
Vi beskriver en protokoll for å isolere og dyrke humane endotelceller i saphenøse vene (hSVECs). Vi tilbyr også detaljerte metoder for å produsere skjærspenning og strekk for å studere mekanisk belastning i hSVEC.
Abstract
Koronar bypass graft (CABG) kirurgi er en prosedyre for å revaskularisere iskemisk myokard. Safenøs vene forblir brukt som en CABG-ledning til tross for redusert langsiktig patency sammenlignet med arterielle ledninger. Den brå økningen av hemodynamisk stress forbundet med transplantatarterien resulterer i vaskulær skade, spesielt endotelet, som kan påvirke den lave patenen til saphenøs venetransplantat (SVG). Her beskriver vi isolering, karakterisering og utvidelse av humane endotelceller i saphenøse vener (hSVEC). Celler isolert av kollagenasefordøyelse viser den typiske brosteinsmorfologien og uttrykker endotelcellemarkørene CD31 og VE-cadherin. For å vurdere den mekaniske spenningspåvirkningen ble protokoller brukt i denne studien for å undersøke de to viktigste fysiske stimuliene, skjærspenning og strekk, på arterialiserte SVGer. hSVEC dyrkes i et parallelt platestrømningskammer for å produsere skjærspenning, som viser justering i strømningsretningen og økt ekspresjon av KLF2, KLF4 og NOS3. hSVEC kan også dyrkes i en silisiummembran som tillater kontrollert cellulær strekk som etterligner venøs (lav) og arteriell (høy) strekk. Endotelcellenes F-aktinmønster og nitrogenoksid (NO) sekresjon moduleres tilsvarende av arteriell strekk. Oppsummert presenterer vi en detaljert metode for å isolere hSVEC for å studere påvirkningen av hemodynamisk mekanisk stress på en endotelial fenotype.
Introduction
Endotelcelle (EC) dysfunksjon er en nøkkelspiller i saphenøs venetransplantatsvikt 1,2,3,4. Den vedvarende økningen av skjærspenning og syklisk strekk induserer den proinflammatoriske fenotypen av humane endotelceller i saphenøse vene (hSVECs)3,4,5,6. De underliggende molekylære veiene er fortsatt ikke fullt ut forstått, og standardiserte protokoller for in vitro-studier kan utnytte innsatsen for ny innsikt i området. Her beskriver vi en enkel protokoll for å isolere, karakterisere og utvide hSVEC og hvordan de skal utsettes for variable nivåer av skjærspenning og syklisk strekk, som etterligner de venøse og arterielle hemodynamiske forholdene.
hSVEC isoleres ved kollagenaseinkubasjon og kan brukes frem til passasje 8. Denne protokollen krever mindre manipulering av fartøyet sammenlignet med de andre tilgjengelige protokollene7, noe som reduserer forurensning med glatte muskelceller og fibroblaster. På den annen side krever det et større fartøysegment på minst 2 cm for å ha effektiv EC-utvinning. I litteraturen er det rapportert at EC fra store fartøy også kan oppnås ved mekanisk fjerning 7,8. Selv om den er effektiv, har den fysiske tilnærmingen ulempene med lavt EC-utbytte og høyere fibroblastforurensning. For å øke renheten er det nødvendig med ekstra trinn ved hjelp av magnetiske perler eller cellesortering, noe som øker kostnadene for protokollen på grunn av oppkjøpet av perler og antistoffer 7,8. Den enzymatiske metoden har raskere og bedre resultater med hensyn til EC-renhet og levedyktighet 7,8.
De mest brukte ECene for å studere endoteldysfunksjon er humane endotelceller i navlestrengen (HUVEC). Det er kjent at EF-fenotypen endres i forskjellige vaskulære senger, og det er viktig å utvikle metoder som representerer fartøyet som undersøkes 9,10. I denne forbindelse er etableringen av en protokoll for å isolere en hSVEC og dyrke den under mekanisk stress et verdifullt verktøy for å forstå bidraget fra hSVEC dysfunksjon i venetransplantatsykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ubrukte segmenter av saphenøse vener ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår aortokoronar bypassoperasjon ved Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alle ga informert samtykke til å delta i studien, som ble gjennomgått og godkjent av den lokale etiske komiteen.
1. Isolasjon, kultur og karakterisering av primære humane endotelceller i saphenøse vener (hSVECs)
- Forberedelse
- Autoklav et par rette eller buede tang og vevsaks (7-8 cm).
- Forbered steril gelatin. Bland 0,1 g (0,1 % w/v) eller 3 g (3 % w/v) gelatin fra svin med 100 ml ultrarent vann, autoklav i 15 minutter og oppbevar ved 4 °C. Varm til 37 °C for å gjøre væsken før cellekulturen belegges, tallerkener og lysbilder.
- Klargjør steril kollagenase (1 mg/ml) inne i avtrekkshetten for laminær luftstrøm. Fortynn kollagenasen i PBS og steriliser den med et 0,2 μm filter.
- Dekk en 60 mm cellekulturskål og en 8-brønns kammersklie med 0,1 % w/v gelatin i minst 30 minutter ved 37 °C. Fjern overflødig gelatin før du sår cellene.
- Forbered komplett endotelcellemedium: endotelcellevekst basalmedium (EBM-2) supplert med EGM2 vekstfaktorer.
MERK: EGM2-vekstfaktorene leveres som et sett av et selskap som er oppført i materialfortegnelsen. Konsentrasjonen av faktorene er ikke avslørt av selskapet. - Lag 2% og 5% bovint serumalbumin (BSA), 4% paraformaldehyd (PFA) og 0,1% Triton X-100-løsninger, alt i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Isolasjon og kultur av hSVEC
- Samle minst et 2-3 cm langt saphenøst venesegment for denne prosedyren.
NOTAT. Alle cellekulturprosedyrene må utføres under sterile forhold og inne i en laminær strømningshette. - Overfør venesegmentet til en petriskål fylt med forvarmet PBS. Sett en pipettespiss inn i den ene enden av venen og skyll forsiktig med PBS for å fjerne alt blodet inne i lumen. Skyll den til vaskestrømmen blir helt klar.
- Lukk en av endene av venen med en steril bomullsutur. Fyll beholderen forsiktig med 1 mg/ml kollagenase type II-oppløsning. Lukk den andre enden av beholderen med en bomullsutur (figur 1A). Inkuber beholderen med kollagenaseoppløsning i en fuktet atmosfære på 5% CO2 ved 37 ° C i 1 time.
- Deretter kutter du en av endene av karet inne i et 15 ml rør og samler kollagenaseoppløsningen. Klipp den andre enden og skyll luminaloverflaten med 1-2 ml PBS for å samle alle frittliggende EC-er. Sett alle PBS sammen med kollagenaseoppløsning inne i samme rør.
- Sentrifuger røret ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT) for å pelletere cellene.
NOTAT. Cellepelleten er veldig liten og vanskelig å visualisere. Hvis blodet ikke fjernes helt før kollagenasebehandling (trinn 1.2.2.), vil blodcellene også felles ut, og pelleten vil være rødlig. - Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 3-4 ml komplett endotelcellemedium (EBM-2 supplert med EGM2 vekstfaktorer) og en ekstra heparinløsning (5 E / ml, endelig konsentrasjon). Plate cellene i en 60 mm cellekulturskål forhåndsbelagt med 3% w / v gelatin.
MERK: Gelatin var førstevalget på grunn av sin enkle tilgjengelighet og lave kostnader. Siden belegget med gelatin opprettholder EC-fenotypen, ble ingen andre beleggstoffer testet. Kollagen og fibronektin kan testes i studier som tar sikte på å undersøke påvirkningen av forskjellige ekstracellulære matrikskomponenter på EC-adhesjon og fenotypen. - Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5% CO2 i 4 dager uten å endre mediet. Etter det, bytt media annenhver dag. Fra dette øyeblikket er det ekstra cellemedietilskuddet med heparin ikke lenger nødvendig. Undersøk platen under mikroskopet for å sikre at de røde blodcellene ble fjernet.
- Etter 3-10 dager etter ekstraksjon, avhengig av størrelsen og diameteren av venesegmentet, visualiser hSVECene ved fasekontrastmikroskopi.
- Evaluere graden av konfluens og deres brosteinsmorfologi i fasekontrastmikroskopi.
- Fortsett å endre media hver 2. dag til cellene når 70% -80% konfluens.
- Passér hSVECene med 0,25% trypsin-0,02% etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning.
- Vask cellene med forvarmet PBS.
- Tilsett 1 ml trypsin-EDTA-oppløsning til 60 mm cellekulturfat. Inkuber ved 37 °C i 2 minutter eller til alle cellene er løsnet.
- Tilsett 2 ml komplett endotelcellemedium for å deaktivere trypsinet.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør og sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml kulturmedium.
- Tell cellesuspensjonen i 1:1 trypanblå (0,4 %) for å plate levedyktige celler.
- For å utvide kulturen, plate cellene i en 100 mm cellekulturskål med 10 ml forvarmet komplett endotelcellemedium og dyrk den ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO2.
NOTAT. I gjennomsnitt vil såing av 4 x 104 hSVEC /cm2 være 100 % konfluent etter 48 timer.
- For å kryokonservere cellene, resuspender pelleten fra trinn 1.2.11.5 i 5% dimetylsulfoksid (DMSO) i føtalt bovint serum (FBS) og oppbevar i flytende nitrogen.
- Samle minst et 2-3 cm langt saphenøst venesegment for denne prosedyren.
- Karakterisering av hSVECs: Flowcytometrifarging for CD31
- Overfør 1 x 10 5 hSVEC til ett1,5 ml rør og sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved RT. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 100 mikrol PBS inneholdende 2 % BSA og CD31-FITC monoklonalt antistoff (1:100).
- Beis cellene i 30 min ved RT i mørket.
- Vask de fargede cellene ved å tilsette 0,5 ml PBS og sentrifuger dem ved 300 x g i 3 minutter ved RT. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 400 μL PBS med 2% BSA.
- Bruk umerkede hSVECs, uten CD31-antistoff, som negativ kontroll.
- Fortsett til analyse av flowcytometerinnsamling ved hjelp av en blå laser og FITC-kanal (eksitasjon / emisjon maks [Ex / Em] på 498/517 nm). Hvis andre fluorokromer brukes, må du kontrollere om cytometeret har passende filtersett for påvisning. Separer cellene fra rusk i funksjonen av deres størrelse og granularitet, og gate deretter enkeltceller ved fremoverspredning og sidespredning.
- Karakterisering av hSVECs: Fluorescerende farging for CD31 og VE-cadherin
- Plate 0,1 x 105 celler i det gelatinbelagte 8-brønns kammerlysbildet. Inkuber cellene over natten ved 37 °C, 5 % CO2, slik at cellene kan feste seg til dyrkningsoverflaten.
- Fjern mediet og vask cellene en gang med PBS.
- Tilsett 0,3 ml / brønn på 4% PFA for å fikse cellene. Inkubere i 15 min på RT.
- Vask tre ganger med PBS.
- Tilsett 0,3 ml / brønn på 0,1% Triton X-100 løsning for å permeabilisere cellene. Inkubere i 15 min på RT.
- Vask tre ganger med PBS.
- For å blokkere ikke-spesifikke antistoffbindingssteder, tilsett 0,3 ml/brønn med 5 % BSA-oppløsning til cellene. Inkubere i 15 min på RT.
- Vask tre ganger med PBS.
- Inkuber cellene med de primære antistoffene (CD31 og VE-cadherin, 1:100) fortynnet i PBS med 2 % BSA over natten med forsiktig gynging ved 4 °C. La en brønn inkubere med PBS med 2% BSA (ingen primære antistoff) som negativ kontroll.
- Vask tre ganger med PBS.
- Inkuber cellene med fluorescerende merkede sekundære antistoffer fortynnet (1:500) i PBS i 1 time ved RT. Tilsett 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for nukleær farging til en endelig konsentrasjon på 1 mg / ml.
- Vask tre ganger med PBS.
- Fjern mediekammeret med separatoren. Plasser en dråpe av monteringsmediereagenset (50% glyserol i PBS) og plasser et glassglass (24 mm x 60 mm) mens du unngår å fange bobler.
- Observer cellene under et fluorescensmikroskop.
MERK: DAPI registreres med en DAPI-lyskube (f.eks. 335–379 nm; Em: 417-477 nm), og CD31 / VE-cadherin detekteres ved hjelp av en grønn fluorescerende protein (GFP) lyskube (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lyskuber med lignende eksitasjons-/emisjonsbølgelengdeområde er også tilstrekkelige for disse fluorokromene. Hvis andre fluorokromer brukes, må du kontrollere om mikroskopet som brukes har passende filtersett for deteksjon.
2. Skjærspenning på hSVEC
- Forberedelse
- Strøk strømningskammeret med 0,1 % w/v gelatin i minst 30 minutter ved 37 °C. Fjern overflødig gelatin før du sår cellene.
- Balansere fluidenheten og det sterile perfusjonssettet med 10 ml reservoarer over natten inne i inkubatoren i en fuktet atmosfære på 5 % CO2 ved 37 °C.
- Eksperiment med skjærspenning
- Frø 2 x 105 EC suspendert i 100 μL EC-medium i det gelatinbelagte strømningskammerlysbildet. Inkuber cellene i 4 timer ved 37 °C og 5 % CO2 for å la cellene feste seg til dyrkningsoverflaten.
- Plasser perfusjonssettet på den fluidiske enheten som beskrevet i produsentens instruksjoner. Fyll reservoarene og perfusjonssettet i ca. 12 ml forvarmet komplett endotelcellemedium. Fjern luftbobler manuelt fra perfusjonssettet for å balansere nivået i begge reservoarene ved 5 ml.
- Plasser den fluidiske enheten med det monterte perfusjonssettet, uten kammerglidningen, i inkubatoren og koble den elektriske kabelen til den datamaskinregulerte pumpen. Fjern alle luftbobler fra reservoarene og perfusjonssettet, ved å kjøre en forhåndsdefinert protokoll i pumpestyringsprogramvaren.
NOTAT. Det er svært viktig å fjerne luftbobler for at systemet skal fungere som det skal. - Ta den fluidiske enheten med den monterte perfusjonen satt til den laminære strømningshetten og fest lysbildene med et konfluent cellemonolag.
- Plasser den fluidiske enheten med den monterte perfusjonen og lysbildene med celler i inkubatoren og koble den elektriske kabelen til pumpen.
- Sett opp følgende parametere i programvaren for pumpestyring: mediets viskositet (0,0072), type lysbilde, kalibreringsfaktor for perfusjonssett, skjærspenningshastighet (20 dyn/cm2), type strømning (ensrettet) og tid (72 timer), og start gjennomstrømningen (se utstyrsinstruksjonene for ytterligere detaljer). Høst cellene behandlet med samme media uten eksponering for strømning som statiske kontroller.
- Etter at stimulansen er fullført, vask cellene en gang med PBS og fortsett å høste prøvene i henhold til den nødvendige analysen. For fluorescerende farging, se trinn 2.3.1, og for RNA-ekstraksjon, se trinn 2.3.2.
- Demonstrasjon av effektiviteten til skjærspenningsprotokollen
- Fluorescerende farging av aktinfilamenter (F-aktin)
- Fiks og permeabiliser cellene som angitt i trinn 1.4.2-1.4.6. Bruk et volum på 100 μL i μ-lysbildet.
- Beis F-aktin med fluorescerende merket falloidin (fortynnet ved 1:200 i PBS) og motflekk kjernen med DAPI (endelig konsentrasjon på 1 mg / ml i PBS) i 2 timer ved RT, beskyttet mot lys.
- Vask tre ganger med PBS.
- Observer cellene under et fluorescensmikroskop.
MERK: DAPI registreres med en DAPI-lyskube (f.eks. 335–379 nm; Em: 417-477 nm) og falloidin detekteres med en GFP-lyskube (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lyskuber med et lignende utvalg av eksitasjon / emisjonsbølgelengde er også tilstrekkelig for disse fluorokromene. Hvis andre fluorokromer brukes, må du kontrollere om mikroskopet som brukes har passende filtersett for deteksjon.
- Genuttrykk ved sanntids kvantitativ revers transkripsjon (RT-qPCR)
- Samle cellene fra μ-lysbildet med 350 μL av en kommersiell guanidin-tiocyanatholdig lysisbuffer. Isoler det totale RNA med kolonnebaserte ekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: På grunn av det begrensede antallet celler dyrket i μ-lysbildet, anbefales bruk av kolonnebasert ekstraksjon av RNA. - Forbered cDNA ved hjelp av et cDNA-syntesesett med transkriptase omvendt enzym, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Verifisere uttrykket av genet (e) regulert av skjærspenning: KLF2, KLF4 og NOS3. Bruk husholderskegenet PPIA / cyclophilin for å normalisere resultatene. De spesifikke primerne for reaksjonen er listet opp i tabell 1.
- Utfør RT-qPCR ved hjelp av et SYBR grønt fluorescerende DNA-flekksett under følgende reaksjonsbetingelser: i) 50 °C i 2 minutter, ii) 95 °C i 15 minutter, iii) 94 °C i 15 s, iv) 60 °C i 30 s, v) 72 °C i 30 s. Gjenta trinn iii til v i 40 sykluser. Legg til et smeltetrinn på slutten av reaksjonen for å verifisere primerens spesifisitet.
- Samle cellene fra μ-lysbildet med 350 μL av en kommersiell guanidin-tiocyanatholdig lysisbuffer. Isoler det totale RNA med kolonnebaserte ekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fluorescerende farging av aktinfilamenter (F-aktin)
3. Syklisk strekning på hSVEC
- Forberedelse
- Påfør silikonbasert smøremiddel på toppen og sidene av 6-brønns ekvibiaksial lastestasjon på 25 mm.
MERK: Dette reduserer friksjonen mellom kulturplatemembranen og stasjonen, noe som gir bedre fordeling av den sykliske belastningen. Dette trinnet må gjøres før hvert eksperiment.
- Påfør silikonbasert smøremiddel på toppen og sidene av 6-brønns ekvibiaksial lastestasjon på 25 mm.
- Syklisk strekkeksperiment
- Frø 4 x 105 celler suspendert i 3 ml til hver brønn av 6-brønns fleksibelbunnede kulturplater belagt med kollagen I (materialfortegnelse). Planlegg å ha en plate (er) i statisk tilstand som en kontrollgruppe. Hold cellene i inkubatoren (37 ° C i fuktet luft med 5% CO2) til de når 100% sammenløp (vanligvis 48 timer etter såing). Før starten av strekkprotokollen, vask cellene en gang med forvarmet PBS og tilsett 3 ml friskdyrkningsmedium per brønn.
- Sett inn grunnplaten med alle smurte lastestasjoner i inkubatoren og koble slangen på riktig måte med kontrollerutstyret til spenningscellens strekkende bioreaktorsystem (se utstyrsinstruksjonene for ytterligere detaljer).
- Fest hver kulturplate til en rød pakning, levert av spenningscellestrekkende bioreaktorsystem. Deretter legger du dem inn i grunnplaten inne i inkubatoren.
- Forsikre deg om at platene sitter helt, presses og er forseglet til bunnplaten for å unngå at luft lekker under vakuumpumpingen. Det er viktig å ha alle fire dyrkningsplatene i bunnplaten for å ha riktig vakuum og strekkbelastning.
- I tilfelle du har færre eksperimentelle plater, bruk en tom (er) for å fullføre de fire posisjonene i baseplaten. Legg akrylplaten (som følger med utstyret) på toppen av kulturplatene for å forbedre bunnplateforseglingen. Plasser de statiske platene i samme inkubator.
- Slå på kontrollerutstyret og datasystemet. Åpne programvareikonet og konfigurer ønsket regime: størrelsen på lastestasjonen som skal brukes, type belastning, prosentandel av forlengelse, bølgeformform, frekvens og tid. For detaljert informasjon, se produsentens instruksjoner. Velg og last ned dietten. Her ble følgende regime brukt: 1/2 sinusbølgeformform, 1 Hz-frekvens, 5% forlengelse (for å etterligne venøs strekk) og 15% forlengelse (for å etterligne arteriell strekk) opp til 72 timer.
- Slå på vakuumsystemet og klikk på Start på dataskjermen for å kjøre strekkingen. Sjekk om silikonmembranen beveger seg og strekker cellene.
- Etter at stimulansen er fullført, vask cellene en gang med PBS og fortsett å høste prøvene i henhold til den nødvendige analysen. Her, for å demonstrere effektiviteten av syklisk strekk, samle hSVEC-kulturmediet, hold det ved -80 ° C for ytterligere nitrogenoksid (NO) måling, og fest cellene for fluorescerende farging.
NOTAT. Grunnplaten kan ikke lagres inne i inkubatoren når den ikke er i bruk; Ellers kan temperaturen endre den flate formen og gjøre den ubrukelig.
- Demonstrasjon av effektiviteten av den sykliske strekningsprotokollen
- Fluorescerende farging av F-aktin
- Løs cellene som angitt i trinn 1.4.3. Bruk et volum på 1 ml per brønn.
- Vask cellene tre ganger med PBS. Vedlikehold cellene i PBS slik at de ikke tørker mens du forbereder silikonmembranen for de neste trinnene.
- Bruk en bomullspinne for å fjerne overflødig silikonbasert smøremiddel fra bunnen av membranen. Påfør deretter forsiktig vindusrens eller håndsåpe med en ny bomullspinne. Gjenta prosessen til alt smøremiddelet er fjernet fra membranen. Rengjør deretter med avionisert vann.
NOTAT. Det er viktig å fjerne smøremiddelet helt fra silikonmembranen for å få mikroskopibilder av god kvalitet. - Klipp silikonmembranene forsiktig i små biter for å passe på 8-brønns kammerglass for farging. Permeabiliser cellene som angitt i trinn 1.4.5.
- Etter vasketrinnene, flekk F-aktinet med falloidin og kjernen med DAPI. Gå videre til analysen, som angitt i trinn 2.3.1.2 og 2.3.1.3. Bruk et volum på 0,3 ml per kammerbrønn.
- Fjern mediekammeret med separatoren. Plasser en dråpe monteringsmedium reagens (50% glyserol i PBS) og plasser et glassglass (24 mm x 60 mm).
- Observer cellene under et fluorescensmikroskop.
MERK: DAPI registreres med en DAPI-lyskube (f.eks. 335–379 nm; Em: 417-477 nm) og falloidin detekteres med en rød fluorescerende protein (RFP) lyskube (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Lyskuber med et lignende utvalg av eksitasjon / emisjonsbølgelengde er også tilstrekkelig for disse fluorokromene. Hvis andre fluorokromer brukes, må du kontrollere om mikroskopet som brukes har passende filtersett for deteksjon.
- NO-måling estimert ved nitrittakkumulering (NO2) i det hSVEC-betingede mediet ved bruk av en kaliumjodidbasert reduktiv kjemiluminescensanalyse
- Forberedelse
- Forbered en standardkurve fra 0,01-10 mM natriumnitritt (NaNO2 i ultrarent vann) løsning.
- Tilsett 5 ml eddiksyre og 1 ml kaliumjodid (50 mg i 1 ml ultrarent vann) i rensebeholderen til nitrogenoksidanalysatoren.
- INGEN måling
- Legg til 20 μL av NaNO 2-standardkurven i spylebeholderen til nitrogenoksidanalysatoren. Mål det i henhold til produsentens protokoll.
- Forberedelse
- Tilsett 20 μL av det kondisjonerte mediet inn i rensebeholderen til nitrogenoksydanalysatoren. Mål det i henhold til produsentens protokoll.
- Beregn NO2-konsentrasjonene basert på standard kurvekalibrering. Juster verdiene oppnådd ved totalvolumet av det betingede medium analysert 6,11.
- Fluorescerende farging av F-aktin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vanligvis kan festede ECs observeres 3-4 dager etter ekstraksjon. hSVEC danner i utgangspunktet klynger av celler og viser en typisk "brosteinsmorfologi" (figur 1B). De uttrykker EC-markørene CD31 (figur 1C,D) og VE-cadherin (figur 1D). hSVEC kan lett forplantes på en ikke-belagt behandlet cellekulturskål, og de beholder endotelfenotypen i kultur opptil åtte passasjer.
hSVEC, når de dyrkes under skjærspenning, justeres i strømningsretningen (figur 2A). Skjærspenningen på 20 dyn/cm2 i 72 timer induserer ekspresjonen av typiske mekanosensitive gener, KLF2, KLF4 og NOS3, noe som indikerer effektiviteten av skjærstimulansen i hSVEC (figur 2B)12,13,14.
Det sykliske strekkutfallet er avhengig av intensiteten som påføres hSVEC-ene. Celler under lav strekk viser et kortikal F-aktinmønster som ligner statiske celler (figur 3A), uten endring i NO-frigjøringen opptil 72 timer (figur 3B). Arterielle nivåer av strekk remodellerer aktincytoskjelettet etter 24 timer (figur 3A) og reduserer NO-frigjøring etter 72 timer (figur 3B).
Figur 1: Endotelceller fra humane saphenøse vener (hSVEC) utviser typisk endotelmorfologi og spesifikt EC-markøruttrykk. (A) Safenøs venesegment oppfylt med type II kollagenaseoppløsning for ekstraksjon av EC. (B) Representativt tidsforløp for hSVEC-vekst etter ekstraksjon. Etter 3-4 dager er det mulig å visualisere klynger av celler som sprer seg til de når sammenløp. Skalastang = 100 μm. (C) FACS-analyse av dyrkede hSVEC ved passasje 1. Den grønne linjen indikerer at 99,7 % av cellepopulasjonen er positive for den endotelspesifikke markøren CD31. Den svarte linjen er den negative kontrollen. (D) Immunfarging for CD31 (grønn), (E) VE-cadherin (grønn) og kjerner DAPI (blå) i hSVEC ved passasje 1. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: hSVEC justerer seg i strømningsretningen og uttrykker mekanosensitive gener når de utsettes for ensrettet skjærspenning. Konfluent cellemonolag av hSVEC dyrket under statiske eller ensrettede laminære skjærspenningsforhold. (A) Fasekontrastbilder (øverst) og falloidinfarging (nederst) av hSVEC utsatt for en skjærspenning på 20 dyn/cm2 i 72 timer. Grønn: aktinfilamenter; Blå: cellekjerner. Skalastang = 100 μm (fasekontrast) og 20 μm (fluorescens). (B) Genuttrykk for KLF2, KLF4 og NOS3 bestemt av qRT-PCR. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. ** p < 0,01 versus den statiske gruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: hSVEC-fenotypen under syklisk strekk er avhengig av intensiteten som påføres . (A) Konfluent cellemonolag av hSVEC dyrket under statisk, lav (venøs) eller høy (arteriell) strekk i en fleksibel bunnplate i 24 timer. Fasekontrastbilder (øverst) og falloidinfarging (nederst) som viser aktinfibrene (rød) og kjernene med DAPI (blå). Skalastang = 100 μm (fasekontrast) og 50 μm (fluorescens). (B) NO-måling ble estimert basert på NO2-akkumulering i cellekulturmediet i 72 timer. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. *** p < 0,001 versus den statiske gruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gen | Protein | Frem 5'-3' | Omvendt 5'-3' | ||
| KLF2 | Krüppel-lignende faktor 2 | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCTCACCTG | ||
| KLF4 | Kruppel-lignende faktor 4 | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGCAC | ||
| NOS3 | nitrogenoksidsyntase, endotel | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| PPIA | Cyclophilin A, | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC | ||
| Peptidylprolyl isomerase A | |||||
Tabell 1: qRT-PCR-primere for skjærspenning og referansegener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det saphenøse venesegmentet bør ha minst 2 cm for å kunne isolere hSVEC. Små segmenter er vanskelige å håndtere og binde endene av karet for å opprettholde kollagenaseoppløsningen for å isolere cellene. Det reduserte luminale overflatearealet gir ikke tilstrekkelige celler til å utvide kulturen. For å minimere risikoen for forurensning med ikke-EC, må manipuleringen av saphenøse venesegmentet være veldig forsiktig under hele prosedyren. Det er viktig å være forsiktig når pipettespissene føres inn i luminaloverflatene for å fjerne blod og under innføring av kollagenaseoppløsningen. Eksponeringen for enzymoppløsning bør kontrolleres meget godt (ikke lenger enn 1 time) for å redusere forurensning av kulturen med ikke-EC. Bruken av et spesifikt EC-medium supplert med vekstfaktorcocktailen er avgjørende for hSVEC-kulturveksten. Det ekstra heparinet i løpet av de første dagene av kulturen er viktig for å redusere gjenværende røde blodlegemer fra venesegmentet og for å hemme glatt muskelcelleproliferasjon15. Når du sender cellene til eksperimenter eller for å opprettholde kulturen, må du sørge for å plate cellene med en sammenløp høyere enn 40%. EF-ene trenger minimal kontakt for å sikre god spredning og overlevelse. hSVECene kan enkelt dyrkes på en ikke-belagt (f.eks. gelatin eller fibronektin) overflate. Imidlertid vil belegget i løpet av de første dagene etter EC-utvinning øke EC-vedheft og utbytte. hSVECene har en konstant proliferasjonshastighet og opprettholder endotelfenotypen opptil åtte passasjer, uten å uttrykke mesenkymale cellemarkører (som SM22 og calponin). Vår erfaring er at proliferasjonsraten kan variere avhengig av vevsdonor, men ikke med cellepassasje. Det anbefales å kryobevare hSVEC i FBS med 5% DMSO for å øke levedyktigheten etter tining av cellene.
For å gjennomføre et skjærspenningseksperiment er det kritiske trinn som skal vurderes. For å unngå at det dannes luftbobler inne i systemet, må perfusjonssettet og koblingene vektlegges over natten ved 37 °C og 5 % CO2. Boblene kan blokkere strømmen gjennom systemet eller skade endotelmonolaget som forstyrrer cellefenotypen. Når du sår cellene inn i lysbildet i strømningskammeret, anbefales det å ha det sammenløpende for bruk etter 4 timer eller neste dag. I tillegg er det obligatorisk å endre lysbildets medium hver dag ved statiske forhold hvis eksperimentet går i flere dager. Volumet av strømningskammerglidningen er ~ 160 μL, og det er ikke tilstrekkelig å opprettholde cellene i lange perioder med kultur. Systemet har fordelen av lett å observere cellene ved mikroskopi (brightfield/fase-kontrast eller farging for fluorescensmikroskopi). Begrensningen er lavt utbytte av proteiner (20-25 μg / lysbilde) og RNA (1 μg / lysbilde). For å overvinne dette tillater systemet tilkobling av flere lysbilder i en serie ved bruk av samme fluidiske enhet (se produsentens instruksjoner). Deretter er det mulig å bruke volumet av lysisbufferen for ett lysbilde for å trekke ut proteinet eller RNA fra flere lysbilder.
Strekksystemet er lett å håndtere og tillater påføring av forskjellige intensiteter og typer strekk. Det er viktig å smøre alle lastestasjoner før hvert eksperiment for å redusere friksjonen mellom kulturplatemembranen og stasjonen og for å garantere riktig fordeling av den sykliske belastningen. Forsikre deg om at platene er helt forseglet til bunnplaten for å produsere vakuumet som er nødvendig for å nå ønsket strekk. Den ekviaksiale stimulansen produserer ikke en jevn belastning inne i brønnen. Cellene på kanten av brønnen må kastes, som angitt av produsenten. Membranområdet av interesse bestemmes basert på lastestasjonens diameter og prosentandelen av forlengelse. Det er mulig å utføre immunfargingen i hele membranen eller kutte den i mindre biter for å redusere mengden antistoffer som brukes i analysen. I dette tilfellet må membranene håndteres svært nøye, og unngå skade på cellene. Forskere bør også passe på å ikke snu membranen opp ned og miste cellene mens de gjør fargingen. Det er alltid mulig å bekrefte membranens korrekte ansikt med cellene under optisk mikroskopi.
Den største begrensningen ved in vitro-studier som disse er at de ikke fullt ut rekapitulerer in vivo-miljøet . Av denne grunn er det viktig å alltid utføre analyser for å sikre at hSVEC opprettholder EC-fenotypen (uttrykker EC-markører) og reproduserer forventede resultater under mekanisk belastning (F-aktinorientering og regulering/produksjon av mekaniske responsproteiner).
Oppsummert gir vi en detaljert prosedyre for å isolere hSVEC og utsette dem for kontrollerte nivåer av skjærspenning og strekk. Når et SV-transplantat plutselig utsettes for arterielle forhold etter CABG, oppstår endotelskader og bidrar til transplantatsvikt. Disse protokollene kan være medvirkende til å fremme vår forståelse av hvordan mekaniske krefter påvirker hSVEC dysfunksjon forbundet med venetransplantatsykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
JEK støttes av tilskudd fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 og 2013/17368-0] og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 og 309179/2013-0). AAM støttes av tilskudd fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
