Summary
Hier stellen we een protocol voor intratracheale lipopolysaccharide (LPS) levering via niet-invasieve orofaryngeale endotracheale intubatie. Deze methode minimaliseert het trauma van de chirurgische procedure voor het dier en levert LPS nauwkeurig af aan de luchtpijp en vervolgens aan de longen.
Abstract
Het muismodel voor acute longschade (ALI) geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) of endotoxine is nog steeds een van de meest gebruikte modellen in dierstudies van acuut longletsel of acute ontsteking. De huidige meest gebruikte methoden in muismodellen met acuut longletsel zijn een intraperitoneale injectie van LPS en tracheostomie voor de tracheale infusie van LPS. De eerste methode mist echter longtargeting en beschadigt andere organen, en de laatste methode induceert operatief trauma, infectierisico en een lage overlevingskans. Hier raden we een niet-invasieve orofaryngeale endotracheale intubatiemethode aan voor LPS-instillatie bij muizen. Bij deze methode wordt LPS niet-invasief in de luchtpijp ingebracht via de orofaryngeale holte om in de long te worden ingebracht met behulp van een apparaat voor endotracheale intubatie. Deze methode zorgt niet alleen voor longtargeting, maar voorkomt ook schade en het risico op overlijden bij de dieren. We verwachten dat deze aanpak op grote schaal zal worden gebruikt op het gebied van acuut longletsel.
Introduction
Acuut longletsel (ALI) is een veel voorkomend klinisch syndroom. Onder een verscheidenheid aan pathogene factoren leidt de verstoring van de fysiologische barrière van de longepitheelcellen en vasculaire endotheelcellen tot verhoogde alveolaire permeabiliteit, waardoor verminderde longvolgzaamheid, longoedeem en ernstige hypoxemie1 worden veroorzaakt. Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is de meest ernstige vorm van ALI. Ongecontroleerde ontsteking en oxidatieve stressschade worden beschouwd als de belangrijkste oorzaken van ALI en de meer ernstige ARDS2. Wanneer alveolaire epitheelcellen direct gewond raken als gevolg van trauma, wordt de ontstekingsreactieketen van alveolaire macrofagen geactiveerd, wat leidt tot ontsteking in de long3. Wereldwijd zijn er meer dan 3 miljoen patiënten met acute ARDS per jaar, en zij zijn goed voor ongeveer 10% van de opnames op de intensive care; Bovendien is het sterftecijfer in ernstige gevallen zo hoog als 46%4,5,6. Daarom is het nodig om een geschikt diermodel van ALI vast te stellen om de pathogenese ervan te bestuderen. De muis is het meest gebruikte proefdier in de studie van ALI, omdat de luchtwegen de menselijke luchtwegen goed kunnen simuleren voor ALI-studies. Bovendien manifesteert ALI zich als massale inflammatoire celinfiltratie, verhoogde pulmonale vasculaire permeabiliteit en longoedeem. De veranderingen in inflammatoire cytokines in serum en de long dry-wet weight ratio weerspiegelen de mate van ALI7.
Op dit moment omvatten de belangrijkste methoden voor het modelleren van LPS-geïnduceerde ALI bij muizen intranasale en chirurgische tracheale intubatie 8,9. Hier stellen we een nieuwe methode voor om LPS in de luchtpijp af te leveren via niet-invasieve orofaryngeale intubatie. Deze methode maakt gebruik van een verlichte intubator om de luchtpijp van de muis te vinden en levert vervolgens LPS af in de luchtpijp en long. Deze methode levert LPS nauwkeuriger aan de longen dan de intranasale toedieningsmethode. In vergelijking met chirurgische tracheale intubatie vereist deze methode geen operatie, vermijdt het veroorzaken van wonden en vermindert het de pijn bij muizen10. Daarom kan deze methode worden gebruikt om een overtuigender muismodel van ALI vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor dierproeven werd beoordeeld en goedgekeurd door het managementcomité van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (record nr. 2021-11). Mannelijke C57/BL-muizen (20-25 g, 6-8 weken oud) werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden in een dierenkamer gehouden en waren vrij om te drinken en te eten tijdens het experiment.
1. Voorbereiding
- Zorg ervoor dat het intubatieplatform bestaat uit een basis, een riser, een paperclip, twee elastiekjes en enkele snaren. Neem een touw, haal het touw door de twee gaten aan de bovenkant van de riser en bind de twee uiteinden van het touw respectievelijk aan de kleine uitsteeksels aan de bovenkant van de riser.
OPMERKING: Laat ruimte voor de kop van de muis om tussen het touw en de twee gaten door te gaan. - Bind twee elastiekjes aan elk uiteinde van de paperclip en plak de paperclip met de elastiekjes aan de achterkant van de riser. Bevestig ten slotte de riser op de basis op 90° (figuur 1).
- Selecteer een canule van de juiste grootte en lengte. Voor een muis van 20−30 g kan een katheter van 22 G (2,5−3,8 cm lang) worden gebruikt11. Monteer de canule op een canulepen en schakel het lampje van de pen in (figuur 2).
- Bereid kleine chirurgische tangen en een Pasteur-pipet door ze te desinfecteren met 70% alcohol.
2. Bereiding van de teststof
- Weeg 3 mg LPS in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,2) en los deze op tot een LPS-oplossing met een concentratie van 3 mg/ml.
- Weeg en los 10 mg pentobarbitalnatrium op in 1 ml normale zoutoplossing om een 1% pentobarbital-natriumoplossing te vormen. Filtersteriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,45 μm.
3. Niet-invasieve orofaryngeale instillatie
- Verdoof de muizen met een intraperitoneale injectie van 1% pentobarbitalnatrium in een dosis van 50 mg/kg12,13. Bepaal de diepte van de anesthesie door een gebrek aan reactie op de rechtrichtreflex.
- Plaats de verdoofde muis op het intubatieplatform. Bevestig de bovenste voortanden met de draad en de twee voorvoeten met de elastiekjes (figuur 3).
- Trek de tong eruit met een pincet en houd hem vast met de linkerhand. Duw de canule langzaam, langs de mond, met de rechterhand omhoog, naar de mandibulaire epiglottis. Gebruik het licht van de canulepen om de luchtpijp te vinden en steek deze langzaam in de luchtpijp (figuur 4).
- Nadat de canule in de luchtpijp is ingebracht, trekt u de intubatiepen langzaam terug en laat u de canule binnen. Steek de Pasteurpipet in het canulegewricht en druk op de kop (figuur 5).
OPMERKING: Als de borstkas van de muis uitpuilt, is de intubatie succesvol (figuur 6). - Na succesvolle endotracheale intubatie, inbreng de muizen met 3 mg / ml LPS bij 3 mg / kg via de canule met behulp van een platte microsyringe14,15 (figuur 7).
- Als u klaar bent, verwijdert u de canule en de microsyringe. Verwijder de muis van de steiger en plaats hem apart in een kooi om te herstellen. Observeer de ademhalingstoestand van de muis totdat deze is hersteld en weer bij bewustzijn is gekomen.
OPMERKING: Om 12 uur na LPS-tracheale instillatie, euthanaseer de muizen volgens de procedure die is goedgekeurd door de ethische commissie voor dieren. Serum TNF-α-assays en droog-natte longgewichtsmetingen werden uitgevoerd met behulp van standaardprocedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De voorgestelde methode voor LPS-instillatie bij muizen werd geverifieerd door de expressie van het inflammatoire cytokine TNF-α en de longdroog-natgewichtsverhouding 12 uur na LPS-instillatie te evalueren. Er waren vier groepen in het experiment: blanco controle (zonder enige behandeling), chirurgische intubatie16, intranasale17,18 en niet-invasieve orofaryngeale intubatie (n = 6). Vergeleken met de blanco controlegroep waren de serum TNF-α spiegels in de niet-invasieve orofaryngeale intubatiegroep significant verhoogd (figuur 8A). De droog-natte gewichtsverhouding van de longen was ook verhoogd (figuur 8B) en bereikte hetzelfde niveau als in de chirurgische tracheale intubatiegroep. De datasets werden statistisch geanalyseerd met een ongepaarde ANOVA en post-hoc multiple-vergelijkingen Tukey Kramer-tests. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en een niveau van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Figuur 1: Intubatieplatformfittingen en montage. Het platform bestaat uit een basis, een riser, een paperclip, twee elastiekjes en enkele snaren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Intubatiekit. Deze figuur toont de intubatiekit en de montage ervan. Dit omvat een penlamp, een optische vezel en een canule. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Muisfixatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het lokaliseren van de luchtpijp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Controle van de pasteurpipetpomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voor en na beeld van de borstkas met succesvolle intubatie . (A) Borstkas vóór intubatie. (B) borstkas na intubatie; Het gebied met de uitstulping van de borst is gemarkeerd met een rode cirkel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Flat head microsampler voor het leveren van LPS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Beoordeling van de validiteit van de niet-invasieve LPS-instillatie . (A) Expressie van TNF-α in het serum van C57BL/6-muizen 12 h na een endotracheale injectie met LPS. (B) Gegevensanalyse van de droog-natgewichtsverhouding van longweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In eerste instantie keken we in de mondholte om de locatie van de luchtpijp19 te vinden. Tijdens dit proces ontdekten we echter dat de luchtpijp van C57 / BL-muizen smal is, waardoor het moeilijk is om de juiste locatie te vinden met deze methode zonder de hulp van apparatuur zoals een endoscoop20. Bij verder onderzoek ontdekten we dat het licht van de intubatorlamp het oppervlak van het lichaam kon binnendringen, waardoor de operator de positie van de canule21 kon bepalen.
Om te controleren of de buis in de luchtpijp was binnengedrongen, probeerden we in eerste instantie een kleine spiegel te gebruiken, die werd gekoeld door deze op ijs te plaatsen. Na de intubatie gebruikten we een spiegel om de canuleopening te benaderen. Als er mist op de spiegel verscheen, werd de intubatie als succesvol beschouwd. We ontdekten echter dat deze onderzoeksmethode niet nauwkeurig kon bepalen of de canule de luchtpijp was binnengedrongen. Ten eerste bevond de canulekop zich dicht bij de mond van de muis en kon niet worden vastgesteld of de mist die op de spiegel verscheen, werd veroorzaakt door uitgeademd gas uit de mond. Ten tweede moest de spiegel gekoeld worden. Bij constant gebruik leidde de tijd die nodig was om de spiegel te koelen ook tot een toename van de experimenteertijd. Vervolgens gebruikten we een Pasteurpipet om lucht in de luchtpijp te pompen; De borstkas van de muis zou opzwellen als de canule in de luchtpijp werd ingebracht en als deze in de slokdarm werd ingebracht, zou de rechter onderbuik opzwellen22. Daarom hebben we deze methode gebruikt als basis om te beoordelen of de intubatie succesvol was.
In vergelijking met chirurgische tracheale intubatie vermijdt niet-invasieve orofaryngeale intubatie chirurgische wonden en verbetert de overlevingskans van de proefdieren23. In vergelijking met intranasale intubatie leidt niet-invasieve orofaryngeale intubatie tot een nauwkeurigere binnenkomst van de canule in de bronchus en longen24. Het beheersen van deze technische vaardigheden vereist echter veel oefening. In het geval van muizen met kleine lichaamsmaten is het inbrengen van de canule in de luchtpijp moeilijk en kan men de luchtpijp tijdens de operatie gemakkelijk krabben. Daarom stellen we voor dat muizen met grotere lichaamsmaten worden geselecteerd voor het experiment.
De methode kan ook worden gebruikt om andere vloeibare geneesmiddelen aan de bronchus en de longen toe te dienen, wat betekent dat het een breed toepassingspotentieel heeft25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr.: 81903902), de China Postdoctoral Science Foundation (nr.: 2019M663457), het Sichuan Science and Technology Program (nr.: 2020YJ0172) en het Xinglin Scholar Research Premotion Project van Chengdu University of TCM (nr.: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
