Summary
Denne protokol beskriver en teknik til cybridgenerering fra suspensionsvoksende kræftceller som et værktøj til at studere mitokondriernes rolle i den tumorigene proces.
Abstract
I de senere år er antallet af undersøgelser dedikeret til at fastslå forbindelsen mellem mitokondrier og kræft steget betydeligt. Der er dog stadig behov for en større indsats for fuldt ud at forstå linket, der involverer ændringer i mitokondrier og tumorgenese, samt at identificere tumorassocierede mitokondriefænotyper. For eksempel for at evaluere mitokondriernes bidrag i tumorigenese og metastaseprocesser er det vigtigt at forstå mitokondriernes indflydelse fra tumorceller i forskellige nukleare miljøer. Til dette formål består en mulig tilgang i at overføre mitokondrier til en anden nuklear baggrund for at opnå de såkaldte cybridceller. I de traditionelle cybridiseringsteknikker genbefolkes en cellelinje, der mangler mtDNA (ρ0, nuklear donorcelle) med mitokondrier afledt af enten enukleerede celler eller blodplader. Imidlertid kræver enukleationsprocessen god celleadhæsion til kulturpladen, en funktion, der i mange tilfælde helt eller delvist går tabt i invasive celler. Derudover er en anden vanskelighed, der findes i de traditionelle metoder, at opnå fuldstændig fjernelse af det endogene mtDNA fra mitokondrie-modtagercellelinjen for at opnå ren nuklear og mitokondriel DNA-baggrund, idet man undgår tilstedeværelsen af to forskellige mtDNA-arter i den genererede cybrid. I dette arbejde præsenterer vi en mitokondrieudvekslingsprotokol anvendt på suspensionsvoksende kræftceller baseret på genpopulation af rhodamin 6G-forbehandlede celler med isolerede mitokondrier. Denne metode giver os mulighed for at overvinde begrænsningerne i de traditionelle tilgange og kan således bruges som et redskab til at udvide forståelsen af mitokondrierollen i kræftprogression og metastase.
Introduction
Omprogrammering af energimetabolisme er et kendetegn ved kræft1, der blev observeret for første gang af Otto Warburg i 1930'erne2. Under aerobe forhold omdanner normale celler glukose til pyruvat, der derefter genererer acetyl-coA, der brænder mitokondriemaskineriet og fremmer cellulær respiration. Ikke desto mindre demonstrerede Warburg, at selv under normokiske forhold omdanner de fleste kræftceller pyruvat opnået fra glykolyseprocessen til lactat og skifter deres måde at opnå energi på. Denne metaboliske justering er kendt som "Warburg-effekten" og gør det muligt for nogle kræftceller at levere deres energiske behov for hurtig vækst og deling, på trods af at de genererer ATP mindre effektivt end den aerobe proces 3,4,5. I de seneste årtier har adskillige værker støttet implikationen af metabolisme omprogrammering i kræftprogression. Derfor betragtes tumor energetik som et interessant mål mod kræft1. Som et centralt knudepunkt i energisk metabolisme og i forsyningen af essentielle forstadier spiller mitokondrier en nøglerolle i disse celletilpasninger, som vi til dato kun delvist forstår.
I tråd med ovenstående er mitokondrie-DNA (mtDNA) mutationer blevet foreslået som en af de mulige årsager til denne metaboliske omprogrammering, hvilket kan føre til en nedsat elektrontransportkæde (ETC) ydeevne6 og ville forklare, hvorfor nogle kræftceller forbedrer deres glykolytiske metabolisme for at overleve. Faktisk er det blevet rapporteret, at mtDNA akkumulerer mutationer i kræftceller, der er til stede i mindst 50% af tumorer7. For eksempel rapporterede en nylig undersøgelse udført af Yuan et al. tilstedeværelsen af hypermuterede og afkortede mtDNA-molekyler i nyre-, kolorektal- og skjoldbruskkirtelkræft8. Desuden har mange værker vist, at visse mtDNA-mutationer er forbundet med en mere aggressiv tumorfænotype og med en stigning i kræftcellernes metastatiske potentiale 9,10,11,12,13,14,15,16.
På trods af mitokondriegenomets tilsyneladende relevans i kræftprogression har undersøgelsen af disse mutationer og deres bidrag til sygdommen været udfordrende på grund af begrænsninger i de eksperimentelle modeller og teknologier, der i øjeblikket er tilgængelige17. Derfor er der behov for nye teknikker til at forstå den reelle virkning af mitokondrie-DNA i udvikling og progression af kræftsygdomme. I dette arbejde introducerer vi en protokol for transmission af cybrid-generering fra suspensionsvoksende kræftceller baseret på genbefolkning af rhodamin 6G-forbehandlede celler med isolerede mitokondrier, der overvinder de største udfordringer ved traditionelle cybridiseringsmetoder18,19. Denne metode tillader anvendelse af enhver kernedonor uanset tilgængeligheden af deres tilsvarende ρ 0-cellelinje og overførsel af mitokondrier fra celler, der efter de traditionelle teknikker ville være vanskelige at enukleere (dvs. ikke-klæbende cellelinjer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle kulturmedier og buffersammensætninger er specificeret i tabel 1. Før cybrid-generering skal både mitokondrie- og kerne-DNA-profiler fra donor- og modtagercellerne indtastes for at bekræfte tilstedeværelsen af genetiske forskelle i begge genomer mellem cellelinjer. I denne undersøgelse blev en kommercielt tilgængelig L929-cellelinje og dens afledte cellelinje, L929dt, som blev spontant genereret i vores laboratorium (se13 for mere information) brugt. Disse cellelinjer præsenterer to forskelle i sekvensen af deres mt-Nd2-gen , som kan bruges til at bekræfte renheden af mtDNA, når cybridiseringsprocessen er afsluttet13. I dette tilfælde blev renheden af den nukleare baggrund bekræftet af antibiotikafølsomhed, da L929 i modsætning til L929dt-celler var resistente over for genetik.
1. Mitokondriel udtømning ved rhodamin 6G-behandling (modtagerceller)
BEMÆRK: Det første skridt til vellykket cybridgenerering er fuldstændigt og irreversibelt at afskaffe mitokondriefunktioner i modtagercellerne. Til dette formål er det nødvendigt tidligere at bestemme for hver cellelinje den passende koncentration og behandlingsvarighed med rhodamin 6G. Denne passende koncentration bør være lige under lægemiddelinduceret celledød (den højeste, der ikke dræber cellerne under behandlingen). Udfør følgende, når de optimale betingelser er defineret.
- Frø 10 6 celler i en 6-brønds plade ved hjælp af komplet dyrkningsmedium (se tabel 1 for detaljer) og behandl dem dagligt med den optimale koncentration af rhodamin 6G i 3-10 dage afhængigt af cellelinjen. Traditionelle koncentrationer varierer fra 2 til 5 μg/ml i 3-10 dage20,21. I denne undersøgelse, for L929-afledte celler, var 2,5 μg/ml rhodamin 6G i 7 dage den valgte behandling13,22.
- For at holde cellerne i live suppleres cellekulturmediet med 50 μg/ml uridin og 100 μg/ml pyruvat og fornyes hver 24. time.
- Efter behandling og før fusion ændres substratet for rhodamin 6G-behandlede celler til komplet cellekulturmedium uden rhodamin 6G, og lad dem stå i dette medium i 3-4 timer i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
BEMÆRK: Rhodamin 6G toksisk virkning er irreversibel, og celler med ikke-funktionelle mitokondrier bør ikke genvinde20. Efter behandling bør celler, der ikke modtager funktionelle mitokondrier, dø selv i uridin-suppleret dyrkningsmedium. Derfor bør det ikke være nødvendigt at foretage nuklear udvælgelse. Imidlertid anbefales en kontrolfusion af rhodamin 6G-behandlede celler uden mitokondrier.
2. Ekspansion og mitokondriel isolering (donorceller)
- Udvid mitokondriedonorcellerne i løbet af tidsforløbet af rhodamin 6G-behandling for at opnå omkring 25 x 106 celler.
- På dag 7 høstes eksponentielt voksende celler i et 50 ml rør og opsamles ved centrifugering ved 520 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Cellerne vaskes 3x med koldt fosfatbufret saltvand (PBS) og sedimenteres ved centrifugering ved 520 x g i 5 minutter ved RT. Fra nu af skal du udføre alle trin i mitokondrieekstraktion ved 4 ° C ved hjælp af kolde reagenser og holde rørene med celler eller mitokondrier på is.
- Efter den tredje centrifugering kasseres supernatanten ved aspiration med en glaspipette koblet til en vakuumpumpe, og de pakkede celler resuspenderes i et volumen hypotonisk buffer svarende til 7x cellepelletvolumenet. Overfør derefter cellesuspensionen til et homogenisatorrør og lad cellerne svulme op ved at inkubere dem på is i 2 minutter.
- Bryd cellemembranerne ved at udføre 8 til 10 slag i homogenisatoren koblet til en motordrevet støder, der roterer ved 600 o / min.
BEMÆRK: Trinnet med cellemembranforstyrrelse kan variere mellem celletyper; Således skal den optimeres til hver celletype. - Tilsæt det samme volumen hypertonisk buffer til cellesuspensionen (7x cellepelletvolumenet) for at generere et isotonisk miljø.
- Homogenatet overføres til et 15 ml rør og centrifugeres i en fast rotor ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Derefter opsamles kun 3/4 af supernatanten, så der er en stor margen tilbage fra pelleten, for at undgå kontaminering med kerner eller intakte celler, og den overføres til et andet rør. Gentag den samme proces to gange. Bemærk, at supernatanten skal opbevares, og at pellets kasseres.
- Gem mitokondriefraktionen (supernatanten). Overfør det til 1,5 ml rør og centrifuger ved maksimal hastighed (18.000 x g) i 2 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og den mitokondrierberigede pellet vaskes med buffer A, idet indholdet af de to glas kombineres til ét, og der centrifugeres under de samme betingelser som beskrevet i trin 2.7. Gentag den samme proces, indtil alt materialet kun er i et rør.
- Der foretages en yderligere vask med 300 μL buffer A, og mitokondrieproteinkoncentrationen kvantificeres ved hjælp af Bradford-analysen23. For hvert cybridiseringsassay skal den optimale mængde mitokondrier til overførselsproceduren bestemmes (i vores tilfælde en koncentration mellem 10-40 μg mitokondrieprotein pr. 106 celler).
- Forbered samtidig rhodamin 6G-forbehandlede celler til fusionen ved at samle dem i et 15 ml rør og centrifugere ved 520 x g i 5 minutter ved RT. Bemærk, at pelleten får en neonrosa farve på grund af rhodamin 6G-behandling.
- For at sikre, at både mitokondriefunktionsafskaffelse i receptorceller såvel som organeloprensning fra donorer er blevet udført korrekt, frø et lille antal rhodamin 6G-behandlede celler og isolerede mitokondrier ved hjælp af det komplette dyrkningsmedium i en 6-brøndplade og kultur dem i en måned for at kontrollere, at der ikke er nogen overlevende celler tilbage i nogen af brøndene (figur 2).
- Parallelt evalueres fraværet af kernekontaminanter i mitokondriefraktionen ved immunodetektion af nukleare proteiner (dvs. lamin beta, histon H3 osv.) eller ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) amplifikation af et nukleart gen (dvs. SDH, 18S rRNA osv.).
BEMÆRK: For at undgå kontaminering anbefales det at udføre alle trin under aseptiske forhold under arbejde under en laminær strømningshætte.
3. Fusion og cybrid generation
- For at fortsætte med fusionen tilsættes forsigtigt 106 af rhodamin 6G-behandlede celler til den isolerede mitokondripellet (10-40 μg mitokondrieprotein) og centrifugeres ved 520 x g i 5 minutter for at lade cellerne blande sig med mitokondrierne.
- Tilsæt 100 μL polyethylenglycol (PEG, 50%) og resuspender forsigtigt pelleten i 30 s. Lad derefter hvile uberørt i yderligere 30 sekunder.
- Til sidst overføres blandingen til en 6-brønds plade med frisk komplet cellekulturmedium og anbringes i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2. Efter et par dage (normalt 1 uge) bør transmitochondrie cybrider begynde at vokse (figur 2), hvilket giver anledning til kloner, der kan vælges individuelt eller blandes i en pulje inden deres analyse.
4. Verifikation af både mitokondriel og nuklear baggrund
BEMÆRK: Når den nye cellelinje er etableret, og cellerne begynder at vokse eksponentielt, skal renheden af deres mitokondrie og nukleare DNA'er verificeres. Således bør de oprindelige cellelinjer have forskellige mutationer eller polymorfier inden for deres genomer for at gøre dem genkendelige.
- Total DNA-isolering
- Isolerer det genomiske DNA fra alle cellelinjer, der anvendes til cybridgenerering, ved at anvende et kommercielt genomisk DNA-ekstraktionssæt (se materialetabellen) eller ved at udføre en standardprotokol ved hjælp af phenol-chlorform-isoamylalkoholekstraktion og alkoholudfældning24.
- mtDNA-evaluering (figur 3)
BEMÆRK: Flere teknikker, såsom sekventering, restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP) analyse eller allelspecifik qPCR, kan udføres for at analysere renheden af mtDNA. Følg de næste protokoltrin for at bekræfte tilstedeværelsen af mtDNA-sekvensvariationer ved RFLP.- Amplificer et mtDNA-fragment indeholdende nukleotidændringen ved PCR.
- Her præsenterer L929dt-celler en mtDNA-mutation i position 4206 inden for et mt-Nd2-gen (m.4206C>T), der er fraværende i L929-celler. For at bekræfte tilstedeværelsen af denne substitution i de transmitochondriale cybrider forstærkes et 397 bp fragment ved PCR ved hjælp af en standardprotokol og følgende primere: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (position 3862-3884) og 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (position 4236-4258).
- Her præsenterer L929dt-celler en mtDNA-mutation i position 4206 inden for et mt-Nd2-gen (m.4206C>T), der er fraværende i L929-celler. For at bekræfte tilstedeværelsen af denne substitution i de transmitochondriale cybrider forstærkes et 397 bp fragment ved PCR ved hjælp af en standardprotokol og følgende primere: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- Analyser tilstedeværelsen af den ønskede nukleotidsubstitution ved RFLP ved hjælp af en specifik endonuklease, der genkender sekvensændringen og genererer et andet snitmønster for begge cellelinjer.
BEMÆRK: Når L929dt mtDNA-varianten er til stede (4206T), indeholder amplikon opnået i trin 4.2.1 to restriktionssteder for Sspi (se materialetabel), der producerer tre DNA-fragmenter på 306 bp, 52 bp og 39 bp. Begrænsningswebstedet, der genererer 52- og 39-båndene, afbrydes, når wildtype-versionen (WT) C4206 er til stede, og der vises et nyt bånd på 91 bp. Derfor indgår en intern kontrol for fuld fordøjelse for SspI i analysen. Fordøjelsesreaktionen udføres ved 37 °C efter fabrikantens anvisninger. - Adskil restriktionsfragmenterne ved elektroforese og sammenlign båndmønsteret.
- Når fordøjelsen er udført, analyseres de opnåede restriktionsfragmenter ved elektroforese i 10% polyacrylamid-Tris-borat-EDTA (TBE) geler (se tabel 1 for 1x TBE-sammensætning). Kør elektroforesen ved 80 V i 1 time ved RT. Visualiser DNA-fragmenterne efter gelfarvning i en opløsning af ethidiumbromid i 1x TBE i 15 minutter ved RT (se tabel 1 for gelfarvningsopløsningens sammensætning).
- Amplificer et mtDNA-fragment indeholdende nukleotidændringen ved PCR.
- Genotypebestemmelse af nukleart DNA
BEMÆRK: Genotypebestemmelse af nukleart DNA skal udføres ved hjælp af den tidligere DNA-ekstraktionsprøve, der blev anvendt til RFLP-analyse.- Forstærk 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 og AMEL) ved hjælp af en pulje af kommercielt specifikke oligonukleotider (se materialetabel).
- Udfør elektroforese ved hjælp af en genetisk analysator for at adskille de tidligere opnåede fragmenter.
BEMÆRK: Når de er forstærket, analyseres de forskellige loci ved elektroforese ved hjælp af et capilar system (se materialetabel). Fragmenterne adskilles i en 50 cm lang capilar fyldt med en kommerciel polymer. Katode- og anodebuffere er også kommercielt tilgængelige, som vist i materialetabellen. Elektroforese udføres ved 19,5 kV i 20 minutter ved 60 °C. - Brug bioinformatiske værktøjer til at bestemme allelerne svarende til hvert forstærket locus (se materialetabel).
- Dataene i trin 4.3.3 sammenlignes med den nukleare DNA-profildatabase (tabel 1) for at kontrollere, om den nukleare DNA-profil stemmer overens med mitokondriereceptorcellelinjeprofilen (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter at have fulgt ovennævnte protokol skal der opnås en homoplasmatisk cybridcellelinje med en bevaret nuklear baggrund, men med en ny mitokondriegenotype, som vist i skemaerne i figur 1 og figur 2. Renheden af mitokondrie- og nukleart DNA i cybriderne kan bekræftes ved RFLP, som vist i figur 3, og ved nuklear DNA-genotypeanalyse, som vist i figur 4.
Hvis mitokondrieoverførslen blev udført med succes, skal resultaterne opnået med RFLP-analysen for cybridcellelinjen vise forskellige fordøjelsesbåndmønstre sammenlignet med modtagercellelinjen og identiske med mitokondriedonorcellelinjen. Til dette formål skal restriktionsenzymet vælges omhyggeligt og sørge for, at båndmønstrene opnået fra fordøjelsen er forskellige i begge cellelinjer. Et eksempel er vist i figur 3, hvor restriktionsfragmenterne opnået efter SspI-fordøjelse i WT-mitokondrier og mutante mitokondrier (MUT) er vist. I tilfælde af de nye transmitochondrie cellelinjer var restriktionsfragmenter identiske med dem, der blev opnået i deres respektive mitokondriedonorer, og forskellige fra dem, der blev genereret med kernedonorcelleamplikonerne. Dette assay bekræfter således, at mitokondrieudvekslingen blev udført som forventet. Det skal bemærkes, at en prøve fra modtagerceller, der ikke blev underkastet fordøjelsesproceduren, blev inkluderet i denne analyse som en negativ kontrol.
Med hensyn til DNA-nuklear genotypning er en typisk profil opnået ved analyse af 16 nukleare loci for en af de cellelinjer, der anvendes i denne protokol, vist i figur 4. I lighed med RFLP, ved at sammenligne toppe opnået for hvert locus, bør resultaterne opnået fra mitokondriereceptorcellelinjen (nuklear donor) matche med den genererede cybrid.
Det er vigtigt at bemærke, at de opnåede resultater kan variere afhængigt af forskellige faktorer. Som vi angiver i protokollen, er ikke alle cellelinjer modtagelige for den samme mængde rhodamin 6G til fjernelse af totaliteten af funktionelle mitokondrier.
Figur 1: Skematisk repræsentation af cybridgeneration, opsummering af trin 1 til 3 i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk repræsentation, der viser designet af cellekulturpladen efter cybridiseringsprotokollen. En ny cybridcellelinje og kontroller (isolerede mitokondrier og rhodamin 6G-behandlede modtagerceller) podes separat i en 6-brøndplade. Efter et par dages dyrkning begynder cybridceller at vokse, mens ingen overlevende celler forbliver i kontrolbrøndene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Molekylær karakterisering af cybrider. A) RFLP-analyse af m.4206C>T-mutationen i mitokondriedonorcellelinjer (henholdsvis WT og MUT, bane 3 og 4) og deres respektive transmitochondriecellelinjer (MUT WT → bane 5 ogWT MUT → bane 6). MW: markør for molekylvægt (bane 1) uskåret: ikke-fordøjet PCR-produkt (bane 2). B) Sspi-restriktionskort over PCR-produktet for WT- og MUT-mitokondrier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af kerne-DNA-baggrundsanalyse. Eksempel på det nukleare DNA-fingeraftryk opnået efter PCR-amplifikation af 16 loci og adskillelse ved capilar elektroforese. Figuren viser det karakteristiske topmønster for hvert forstærket loci af en cellelinje. Dette mønster skal være forskelligt for de to cellelinjer, der anvendes i cybridiseringsprotokollen for at bekræfte nuklear DNA-renhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Medium | Sammensætning | ||
| Komplet kulturmedium | DMEM høj glukose med L-Gln og pyruvat + FBS (10%) + Penicillin-Streptomycin (1x) | ||
| Hypotonisk buffer | 10 mM MOPS, 83 mM saccharose, pH 7,2 | ||
| Hypertonisk buffer | 30 mM MOPS, 250 mM saccharose, pH 7,2 | ||
| Buffer A | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M saccharose, pH 7,4 | ||
| TBE (1x) | 50 mM Tris, 50 mM Borsyre; 1 mM EDTA | ||
| Gel farvning opløsning | 0,75 μg/ml ethidiumbromid i 1x TBE | ||
Tabel 1: Buffere og mediesammensætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden Otto Warburg rapporterede, at kræftceller ændrer deres stofskifte og forstærker "aerob glykolyse"3,4, samtidig med at mitokondriernes respiration reduceres, er interessen for mitokondriernes rolle i kræfttransformation og progression vokset eksponentielt. I de senere år er mutationer i mtDNA og mitokondriel dysfunktion blevet postuleret som kendetegnende for mange kræfttyper25. Til dato har adskillige undersøgelser analyseret mtDNA-variationen af specifikke tumorer 6,26,27,28,29,30,31,32, og den samlede byrde af erhvervede mtDNA-mutationer er blevet betragtet som en biomarkør for tumorigenicitet 30 i kræftformer som prostatacancer 33. I tråd med dette, mens mtDNA-mutationer betragtes som tumorinitiatorer i nogle tilfælde, såsom i bryst 34,35 eller bugspytkirtlen 36 kræftformer, gynækologiske maligniteter 37,38, lungeadenokarcinommetastaser 15,39 eller akut myeloid leukæmi 40,41, synes de at være mindre relevante i glioblastomer 42.
Selvom mange kræftformer har alvorlige mtDNA-mutationer, der ikke findes i sundt væv43 og kan bidrage til kræftinitiering30, præsenterer andre polymorfe mtDNA-varianter, der er almindelige i forskellige menneskelige populationer. Disse varianter fremmer mildere ændringer, der kan være vigtige for kræftcelletilpasning, når transformationsprocessen er indledt30. Under alle omstændigheder er mtDNA-mutationer og mitokondriemetabolismeændringer involveret i tumorprogression, hvilket ændrer forskellige aspekter af cellehomeostase, såsom produktion af reaktive iltarter eller redoxstatus44,45,46. Imidlertid er de mekanismer, hvormed mtDNA-mutationer og varianter kan favorisere tumorigenese, endnu ikke helt forstået. Desuden kan mtDNA-mutationer i kræftceller sameksistere med ændringer i nukleare gener 8,33, hvilket gør det svært at afgøre, hvilken der er drivermutationen. I andre tilfælde opnås tumorcellernes bioenergetiske krav ved at modulere mtDNA-kopinummer47. På den anden side kan mtDNA-mutationer i nogle tilfælde gøre tumorceller mere modtagelige for specifikke antitumorlægemidler48.
For fuldt ud at forstå mtDNA-mutationernes rolle i kræftens patofysiologi er det nødvendigt at udvikle metoder, hvor muterede mitokondrier kan analyseres i et kontrolleret nukleart miljø. Dette kan hjælpe med at undgå kompenserende virkninger af nukleare gener, der kan udløse cellulær tilpasning. Til dette formål repræsenterer transmitochondrie cybrider en passende model. Traditionelle metoder til cybridisering involverer en mtDNA-udtømt cellelinje (ρ0-celler), der fungerer som en kernedonor (og derfor mitokondrireceptor) og en donor af mitokondrier, normalt en enukleeret cellelinje eller blodplader19, der bærer mtDNA-varianterne eller mutationerne af interesse. Den første udfordring, der skal løses, når man forsøger at generere cybrider, er tilgængeligheden af ρ0-celler, der indeholder den valgte nukleare baggrund. Opnåelsen af disse celler involverer langvarig behandling med ethidiumbromid, en kemisk forbindelse, der hæmmer mtDNA-replikation. Det kan imidlertid også fremkalde dannelsen af mutationer i det nukleare genom, der kan maskere virkningerne af mitokondrieændringerne, der skal undersøges. Derfor foreslår vi i dette arbejde eliminering af hele mitokondrier i kernedonorcellelinjer ved behandling med rhodamin 6G, et lægemiddel, der irreversibelt beskadiger mitokondrier og ville dræbe cellerne, medmindre friske mitokondrier introduceres i deres cytoplasma21,22,49.
En anden udfordring i traditionelle cybridgenereringsmetoder er relateret til enukleationsprocessen af mitokondriedonorcellerne. Til dette formål centrifugeres klæbende celler i nærvær af cytochalasin B, hvilket tillader isolering af enukleerede cytoplaster18 ved at fremme disorganiseringen af cytoskelettet. Hvis celler vokser i suspension (såsom hæmatologiske linjer) eller har mistet cellecelle- og celleekstracellulær matrixadhæsion (hvilket kan ske for dem med et højere metastatisk potentiale50,51,52), ville denne enukleationsprotokol blive kompromitteret, da cytoplaster ville løsne sig fra pladen under centrifugeringen for at fjerne kernerne, hvilket stort set reducerer deres pulje til den efterfølgende fusionsprocedure. For at omgå begge udfordringer foreslår vi her en protokol, hvor isolerede mitokondrier smeltes sammen med rhodamin 6G forbehandlede celler i nærvær af PEG, der har vist sig at være tidsbesparende og effektiv21,22,49.
Når de transmitterokondrie cellelinjer er genereret, er det afgørende at vurdere renheden af både mitokondrie og nukleare genomer. Derfor er det afgørende at vælge donorcellelinjer med sekvensforskelle inden for deres mitokondrie-DNA og med skelnelige egenskaber, såsom antibiotikaresistens eller differentielle mikrosatellitter. Som beskrevet ovenfor er nogle kræftformer blevet rapporteret at modulere deres mtDNA-kopi nummer47, hvilket viser vigtigheden af at analysere mtDNA-belastningen i både originale og transmitochondrie cellelinjer og studere deres OXPHOS-ydeevne under lignende forhold.
De vigtigste faldgruber, der er skjult i denne procedure, er forbundet med processen med eliminering af mitokondrier med rhodamin 6G. Hvert cybridiseringsforsøg bør foregå med assays for at etablere de optimale betingelser for lægemiddelkoncentration og behandlingstid for den valgte kernedonorcellelinje. Hvis rhodamin 6G-koncentrationen eller udstillingstiden ikke er tilstrækkelig, vil den nye cellelinje have bidraget fra to forskellige mtDNA'er, hvilket vil tilføje mere kompleksitet til fænotypisk analyse. Desuden, hvis tiden eller dosis overstiger de optimale, vil cellerne ikke overleve, selv efter mitokondrier genpopulation. Endelig er det vigtigt at være forsigtig under mitokondrieisoleringsprocessen for at undgå forurening med ubrudte celler, hvilket kan ændre fænotypisk karakterisering.
På trods af de tekniske vanskeligheder er genereringen af transmitochondrie cybrider et potent værktøj til at optrævle mitokondriebidraget til kræft- og metastaseprocesser og generere cellemodeller, hvor potentielle kræftbehandlinger med mitokondrier som terapeutisk mål kan testes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af bevillingsnummer PID2019-105128RB-I00 til RSA, JMB og AA og PGC2018-095795-B-I00 til PFS og RML, begge finansieret af MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 og bevillingsnumre B31_20R (RSA, JMA og AA) og E35_17R (PFS og RML) og finansieret af Gobierno de Aragón. RSA's arbejde blev støttet af et tilskud fra Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Forfatterne vil gerne anerkende brugen af Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D.
- Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O.
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C.
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T.
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A.
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S.
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C.
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V.
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
