Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk for cybridgenerering fra suspensjonsvoksende kreftceller som et verktøy for å studere mitokondrienes rolle i den tumorigene prosessen.
Abstract
I de senere år har antall studier dedikert til å fastslå sammenhengen mellom mitokondrier og kreft økt betydelig. Imidlertid er det fortsatt behov for mer innsats for å forstå sammenhengen som involverer endringer i mitokondrier og tumorigenese, samt å identifisere tumorassosierte mitokondrielle fenotyper. For eksempel, for å evaluere bidraget fra mitokondrier i tumorigenese og metastaseprosesser, er det viktig å forstå påvirkning av mitokondrier fra tumorceller i forskjellige kjernefysiske miljøer. For dette formålet består en mulig tilnærming av å overføre mitokondrier til en annen nukleær bakgrunn for å oppnå de såkalte cybridcellene. I de tradisjonelle cybridiseringsteknikkene blir en cellelinje som mangler mtDNA (ρ0, nukleær donorcelle) befolket med mitokondrier avledet fra enten enucleated celler eller blodplater. Imidlertid krever enukleasjonsprosessen god celleadhesjon til kulturplaten, en egenskap som delvis eller helt går tapt i mange tilfeller i invasive celler. I tillegg er en annen vanskelighet som finnes i de tradisjonelle metodene å oppnå fullstendig fjerning av det endogene mtDNA fra mitokondrie-mottakercellelinjen for å oppnå ren nukleær og mitokondriell DNA-bakgrunn, og unngå tilstedeværelsen av to forskjellige mtDNA-arter i den genererte cybriden. I dette arbeidet presenterer vi en mitokondriell utvekslingsprotokoll anvendt på suspensjonsvoksende kreftceller basert på repopulasjon av rhodamine 6G-forbehandlede celler med isolerte mitokondrier. Denne metoden tillater oss å overvinne begrensningene i de tradisjonelle tilnærmingene, og kan dermed brukes som et verktøy for å utvide forståelsen av mitokondriell rolle i kreftprogresjon og metastase.
Introduction
Reprogrammering av energimetabolisme er et kjennetegn på kreft1 som ble observert for første gang av Otto Warburg på 1930-tallet2. Under aerobe forhold konverterer normale celler glukose til pyruvat, som deretter genererer acetyl-coA, brenner mitokondriemaskineriet og fremmer cellulær respirasjon. Likevel viste Warburg at selv under normoksiske forhold omdanner de fleste kreftceller pyruvat oppnådd fra glykolyseprosessen til laktat, og skifter vei for å skaffe energi. Denne metabolske justeringen er kjent som "Warburg-effekten" og gjør det mulig for noen kreftceller å levere sine energiske krav til rask vekst og deling, til tross for at de genererer ATP mindre effektivt enn den aerobe prosessen 3,4,5. I de siste tiårene har mange arbeider støttet implikasjonen av metabolisme omprogrammering i kreftprogresjon. Derfor anses tumorenergetikk som et interessant mål mot kreft1. Som et sentralt knutepunkt i energisk metabolisme og i tilførsel av essensielle forløpere, spiller mitokondrier en nøkkelrolle i disse celletilpasningene som vi til dags dato bare delvis forstår.
I tråd med ovenstående har mitokondrielle DNA (mtDNA) mutasjoner blitt foreslått som en av de mulige årsakene til denne metabolske omprogrammeringen, noe som kan føre til en nedsatt elektrontransportkjede (ETC) ytelse6 og vil forklare hvorfor noen kreftceller forbedrer deres glykolytiske metabolisme for å overleve. Faktisk har det blitt rapportert at mtDNA akkumulerer mutasjoner i kreftceller, som er tilstede i minst 50% av svulstene7. For eksempel rapporterte en nylig studie utført av Yuan et al. tilstedeværelsen av hypermuterte og avkortede mtDNA-molekyler i nyre-, kolorektal- og skjoldbruskkreft8. Videre har mange arbeider vist at visse mtDNA-mutasjoner er assosiert med en mer aggressiv tumorfenotype og med en økning i det metastatiske potensialet til kreftceller 9,10,11,12,13,14,15,16.
Til tross for den tilsynelatende relevansen av mitokondriegenomet i kreftprogresjon, har studiet av disse mutasjonene og deres bidrag til sykdommen vært utfordrende på grunn av begrensninger i de eksperimentelle modellene og teknologiene som er tilgjengelige17. Dermed er det behov for nye teknikker for å forstå den virkelige effekten av mitokondrier DNA i utvikling og progresjon av kreftsykdom. I dette arbeidet introduserer vi en protokoll for transmitochondrial cybrid generasjon fra suspensjonsvoksende kreftceller, basert på repopulasjon av rhodamine 6G-forbehandlede celler med isolerte mitokondrier, som overvinner hovedutfordringene ved tradisjonelle cybridiseringsmetoder18,19. Denne metoden tillater bruk av en hvilken som helst kjernedonor uavhengig av tilgjengeligheten av deres tilsvarende ρ0-cellelinje og overføring av mitokondrier fra celler som etter de tradisjonelle teknikkene ville være vanskelig å enucleate (dvs. ikke-adherente cellelinjer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle kulturmedier og buffersammensetninger er spesifisert i tabell 1. Før cybridgenerering må både mitokondrielle og nukleære DNA-profiler fra donor- og mottakerceller skrives for å bekrefte tilstedeværelsen av genetiske forskjeller i begge genomene mellom cellelinjer. I denne studien ble en kommersielt tilgjengelig L929-cellelinje og dens avledede cellelinje, L929dt, som spontant ble generert i vårt laboratorium (se13 for mer informasjon) brukt. Disse cellelinjene presenterer to forskjeller i sekvensen av deres mt-Nd2-gen , som kan brukes til å bekrefte renheten av mtDNA når cybridiseringsprosessen er ferdig13. I dette tilfellet ble renheten av den nukleære bakgrunnen bekreftet av antibiotisk følsomhet, siden, i motsetning til L929dt-celler, var L929 resistente mot geneticin.
1. Mitokondriell deplesjon ved rhodamine 6G-behandling (mottakerceller)
MERK: Det første trinnet for vellykket cybridgenerering er å fullstendig og irreversibelt avskaffe mitokondrielle funksjoner i mottakercellene. For dette formål er det nødvendig å tidligere bestemme, for hver cellelinje, riktig konsentrasjon og behandlingsvarighet med rhodamine 6G. Denne tilstrekkelige konsentrasjonen bør være like under legemiddelindusert celledød (den høyeste som ikke dreper cellene under behandlingen). Utfør følgende når de optimale forholdene er definert.
- Frø 10 6 celler i en 6-brønnsplate ved bruk av komplett kulturmedium (se tabell 1 for detaljer) og behandle dem daglig med optimal konsentrasjon av rhodamin 6G i 3-10 dager, avhengig av cellelinjen. Tradisjonelle konsentrasjoner varierer fra 2 til 5 μg / ml i 3-10 dager20,21. I denne studien, for L929-avledede celler, var 2,5 μg / ml rhodamin 6G i 7 dager den valgte behandlingen13,22.
- For å holde cellene i live, suppler cellekulturmediet med 50 μg / ml uridin og 100 μg / ml pyruvat og forny det hver 24. time.
- Etter behandling og før fusjon, bytt medium for rhodamine 6G-behandlede celler for å fullføre cellekulturmedium uten rhodamine 6G, og la dem være i dette mediet i 3-4 timer i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: Den rhodamine 6G toksiske effekten er irreversibel, og celler med ikke-funksjonelle mitokondrier bør ikke gjenopprette20. Således, etter behandling, bør celler som ikke mottar funksjonelle mitokondrier dø selv i uridinsupplert kulturmedium. Derfor bør ingen kjernefysisk seleksjon være nødvendig. Imidlertid anbefales en kontrollfusjon av rhodamine 6G-behandlede celler uten mitokondrier.
2. Ekspansjon og mitokondriell isolasjon (donorceller)
- Utvid mitokondriedonorcellene i løpet av tidsforløpet av rhodamine 6G-behandling for å oppnå rundt 25 x 106 celler.
- På dag 7, høst eksponentielt voksende celler i et 50 ml rør og samle dem ved sentrifugering ved 520 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Vask cellene 3x med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) og sedimenter dem ved sentrifugering ved 520 x g i 5 minutter ved RT. Fra nå av utfører du alle trinnene i mitokondriell ekstraksjon ved 4 ° C, ved hjelp av kalde reagenser og holder rørene med celler eller mitokondrier på is.
- Etter den tredje sentrifugeringen, kast supernatanten ved aspirasjon ved hjelp av en glasspipette koblet til en vakuumpumpe og resuspender de pakkede cellene i et volum hypoton buffer lik 7x cellepelletsvolumet. Deretter overfører du cellesuspensjonen til et homogeniseringsrør og lar cellene svulme ved å inkubere dem på is i 2 minutter.
- Bryt cellemembranene ved å utføre 8 til 10 slag i homogenisatoren koblet til en motordrevet pestle som roterer ved 600 o / min.
MERK: Trinnet med cellemembranforstyrrelser kan variere mellom celletyper; Dermed må den optimaliseres for hver celletype. - Legg til samme volum hypertonisk buffer til cellesuspensjonen (7x cellepelletsvolumet) for å generere et isotont miljø.
- Overfør homogenatet til et 15 ml rør og sentrifuge det i en fast rotor ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Deretter samler du bare 3/4 av supernatanten som etterlater en stor margin fra pelleten, for å unngå forurensning med kjerner eller intakte celler, og overfører den til et annet rør. Gjenta den samme prosessen to ganger. Merk at supernatanten må oppbevares og pelleten kastes.
- Lagre mitokondriefraksjonen (supernatant). Overfør den til 1,5 ml rør og sentrifuge ved maksimal hastighet (18 000 x g) i 2 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og vask den mitokondrieberikede pelleten med buffer A, kombiner innholdet i de to rørene i ett og sentrifuger under samme forhold som beskrevet i trinn 2.7. Gjenta den samme prosessen til alt materialet er i bare ett rør.
- Gjør en ekstra vask med 300 μL buffer A og kvantifiser mitokondrieproteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen23. For hver cybridiseringsanalyse må den optimale mengden mitokondrier for overføringsprosedyren bestemmes (i vårt tilfelle en konsentrasjon mellom 10-40 μg mitokondrieprotein per 106 celler).
- Forbered samtidig de rhodamin 6G-forbehandlede cellene for fusjonen ved å samle dem i et 15 ml rør og sentrifugere ved 520 x g i 5 minutter ved RT. Merk at pelleten får en neonrosa farge på grunn av rhodamine 6G-behandling.
- For å sikre at både avskaffelse av mitokondriell funksjon i reseptorceller samt organellrensing fra donorer er riktig utført, sådde et lite antall rhodamine 6G-behandlede celler og isolerte mitokondrier ved hjelp av hele kulturmediet i en 6-brønnsplate og dyrket dem i en måned for å kontrollere at ingen overlevende celler forblir i noen av brønnene (figur 2).
- Parallelt, vurder fraværet av kjernekontaminanter i mitokondriell fraksjon ved immunodeteksjon av nukleære proteiner (dvs. lamin beta, histon H3, etc.) eller ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) amplifisering av et nukleært gen (dvs. SDH, 18S rRNA, etc.).
MERK: For å unngå kontamineringer anbefales det å utføre alle trinnene under aseptiske forhold ved arbeid under en avtrekk med laminær luftstrøm.
3. Fusjon og cybrid generasjon
- For å fortsette med fusjonen, tilsett forsiktig 106 av de rhodamine 6G-behandlede cellene til den isolerte mitokondriepelleten (10-40 μg mitokondrielt protein) og sentrifuge ved 520 x g i 5 minutter for å la cellene blande seg med mitokondriene.
- Tilsett 100 μL polyetylenglykol (PEG, 50%) og resuspender pelleten forsiktig i 30 s. La deretter hvile uberørt i ytterligere 30 s.
- Til slutt overfører du blandingen til en 6-brønnsplate med friskt komplett cellekulturmedium og plasseres i inkubatoren ved 37 ° C med 5% CO2. Etter noen dager (vanligvis 1 uke) bør transmitokondrielle cybrider begynne å vokse (figur 2), noe som gir opphav til kloner som kan velges individuelt eller blandes i et basseng før analysen.
4. Verifikasjon av både mitokondriell og nukleær bakgrunn
MERK: Når den nye cellelinjen er etablert og celler begynner å vokse eksponentielt, må renheten av deres mitokondrielle og nukleære DNA verifiseres. Dermed bør de opprinnelige cellelinjene ha forskjellige mutasjoner eller polymorfismer i genomene for å gjøre dem gjenkjennelige.
- Total DNA-isolasjon
- Isoler genomisk DNA fra alle cellelinjer som brukes til cybridgenerering ved å bruke et kommersielt genomisk DNA-ekstraksjonssett (se materialtabell) eller ved å utføre en standardprotokoll ved bruk av fenol-kloroform-isoamylalkoholekstraksjon og alkoholutfelling24.
- mtDNA-evaluering (figur 3)
MERK: Flere teknikker, for eksempel sekvensering, restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP) analyse, eller allel-spesifikk qPCR, kan utføres for å analysere renheten til mtDNA. For å bekrefte tilstedeværelsen av mtDNA-sekvensvariasjoner av RFLP, følg de neste protokolltrinnene.- Forsterk et mtDNA-fragment som inneholder nukleotidendringen ved PCR.
- Her presenterer L929dt-celler en mtDNA-mutasjon i posisjon 4206, innenfor et mt-Nd2-gen (m.4206C>T) som er fraværende i L929-celler. For å bekrefte tilstedeværelsen av denne substitusjonen i transmitokondrielle cybrider, forsterk et 397 bp-fragment ved PCR ved bruk av en standardprotokoll og følgende primere: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (posisjon 3862-3884) og 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posisjoner 4236-4258).
- Her presenterer L929dt-celler en mtDNA-mutasjon i posisjon 4206, innenfor et mt-Nd2-gen (m.4206C>T) som er fraværende i L929-celler. For å bekrefte tilstedeværelsen av denne substitusjonen i transmitokondrielle cybrider, forsterk et 397 bp-fragment ved PCR ved bruk av en standardprotokoll og følgende primere: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- Analyser tilstedeværelsen av ønsket nukleotidsubstitusjon ved RFLP, ved hjelp av en spesifikk endonuklease som gjenkjenner sekvensendringen og genererer et annet kuttmønster for begge cellelinjer.
MERK: Når L929dt mtDNA-varianten er tilstede (4206T), inneholder amplikonen oppnådd i trinn 4.2.1 to restriksjonssteder for SspI (se materialtabellen) som produserer tre DNA-fragmenter på 306 bp, 52 bp og 39 bp. Begrensningsområdet som genererer 52- og 39-båndene, forstyrres når villtypeversjonen (WT) C4206 finnes, og et nytt bånd på 91 bp vises. Derfor er en internkontroll for full fordøyelse for SspI inkludert i analysen. Fordøyelsesreaksjonen utføres ved 37 °C, i henhold til produsentens instruksjoner. - Separer restriksjonsfragmentene ved elektroforese og sammenlign båndmønsteret.
- Når fordøyelsen er utført, analyser de oppnådde restriksjonsfragmentene ved elektroforese i 10% polyakrylamid-Tris-borat-EDTA (TBE) geler (se tabell 1 for 1x TBE-sammensetning). Kjør elektroforesen ved 80 V i 1 time ved RT. Visualiser DNA-fragmentene etter gelfarging i en løsning av ethidiumbromid i 1x TBE i 15 minutter ved RT (se tabell 1 for gelfargingsløsningssammensetning).
- Forsterk et mtDNA-fragment som inneholder nukleotidendringen ved PCR.
- Nukleær DNA-genotyping
MERK: Nukleær DNA-genotyping må utføres ved bruk av den forrige DNA-ekstraksjonsprøven som brukes til RFLP-analyse.- Forsterk 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 og AMEL) ved å bruke en pool av kommersielle-spesifikke oligonukleotider (se Materialfortegnelse).
- Utfør elektroforese ved å bruke en genetisk analysator for å skille fragmentene som tidligere er oppnådd.
MERK: Når de er forsterket, analyseres de forskjellige stedene ved elektroforese ved hjelp av et capilar system (se materialfortegnelse). Fragmentene separeres i en 50 cm lang capilar fylt med en kommersiell polymer. Katode- og anodebuffere er også kommersielt tilgjengelige, som vist i materialfortegnelsen. Elektroforese utføres ved 19,5 kV i 20 minutter ved 60 °C. - Bruk bioinformatiske verktøy for å bestemme allelene som tilsvarer hvert forsterket locus (se Tabell over materialer).
- Sammenlign dataene som ble oppnådd i trinn 4.3.3 med den nukleære DNA-profildatabasen (tabell 1), for å sjekke om den nukleære DNA-profilen samsvarer med mitokondriereseptorens cellelinjeprofil (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter å ha fulgt den ovenfor presenterte protokollen, bør en homoplasmatisk cybridcellelinje med en konservert nukleær bakgrunn, men med en ny mitokondriegenotype, oppnås, som representert i skjemaene i figur 1 og figur 2. Renheten av mitokondrielt og nukleært DNA tilstede i cybridene kan bekreftes av RFLP, som vist i figur 3, og ved nukleær DNA-genotypingsanalyse, som vist i figur 4.
Hvis mitokondriell overføring ble gjort vellykket, må resultatene oppnådd med RFLP-analysen for cybridcellelinjen vise forskjellige fordøyelsesbåndmønstre sammenlignet med mottakercellelinjen og identisk med mitokondriedonorcellelinjen. Til dette formål må restriksjonsenzymet velges nøye, og sørg for at båndmønstrene oppnådd fra fordøyelsen er forskjellige i begge cellelinjer. Et eksempel er gitt i figur 3, der restriksjonsfragmentene oppnådd etter SspI fordøyelse i WT-mitokondrier og muterte mitokondrier (MUT) er vist. Når det gjelder de nye transmitokondrielle cellelinjene, var restriksjonsfragmentene identiske med de som ble oppnådd i deres respektive mitokondriedonorer og forskjellige fra de som ble generert med kjernedonorcelleamplikonene. Dermed bekrefter denne analysen at mitokondrieutvekslingen ble utført som forventet. Det er verdt å merke seg at en prøve fra mottakerceller som ikke ble utsatt for fordøyelsesprosedyren, ble inkludert i denne analysen som en negativ kontroll.
Når det gjelder DNA-nukleær genotyping, er en typisk profil hentet fra analysen av 16 nukleære loci for en av cellelinjene som brukes i denne protokollen vist i figur 4. I likhet med RFLP, ved å sammenligne toppene oppnådd for hvert sted, bør resultatene oppnådd fra mitokondriereseptorcellelinjen (nukleær donor) samsvare med det genererte cybridet.
Det er viktig å merke seg at de oppnådde resultatene kan variere i henhold til ulike faktorer. Som vi indikerer i protokollen, er ikke alle cellelinjer utsatt for samme mengde rhodamine 6G for å fjerne totaliteten av funksjonelle mitokondrier.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av cybridgenerering, oppsummering av trinn 1 til 3 i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk fremstilling som viser utformingen av cellekulturplaten etter cybridiseringsprotokollen. En ny cybridcellelinje og kontroller (isolerte mitokondrier og rhodamine 6G-behandlede mottakerceller) blir sådd separat i en 6-brønnsplate. Etter noen dager med kultur begynner cybridceller å vokse, mens ingen overlevende celler forblir i kontrollbrønnene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Molekylær karakterisering av cybrider. (A) RFLP-analyse av m.4206C>T-mutasjonen i mitokondrielle donorcellelinjer (henholdsvis WT og MUT, bane 3 og 4) og deres respektive transmitokondriecellelinjer (MUT WT → bane 5 ogWT MUT → bane 6). MW: molekylvektmarkør (bane 1); uncut: ikke-fordøyd PCR-produkt (lane 2). (B) SSPI-restriksjonskart over PCR-produktet for WT- og MUT-mitokondrier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av nukleær DNA-bakgrunnsanalyse. Eksempel på nukleært DNA-fingeravtrykk oppnådd etter PCR-amplifisering av 16 loci og separasjon ved kapilar elektroforese. Figuren viser det karakteristiske toppmønsteret for hvert forsterkede loci i en cellelinje. Dette mønsteret må være forskjellig for de to cellelinjene som brukes i cybridiseringsprotokollen for å bekrefte nukleær DNA-renhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Middels | Komposisjon | ||
| Komplett kulturmedium | DMEM høy glukose med L-Gln og pyruvat + FBS (10%) + Penicillin-Streptomycin (1x) | ||
| Hypotonisk buffer | 10 mM MOPS, 83 mM sukrose, pH 7,2 | ||
| Hyperton buffer | 30 mM MOPS, 250 mM sukrose, pH 7,2 | ||
| Buffer A | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sukrose, pH 7,4 | ||
| TBE (1x) | 50 mM Tris, 50 mM borsyre; 1 mM EDTA | ||
| Gel farging løsning | 0,75 μg/ml ethidiumbromid i 1x TBE | ||
Tabell 1: Buffere og mediesammensetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden Otto Warburg rapporterte at kreftceller skifter metabolisme og forsterker "aerob glykolyse"3,4 samtidig som mitokondriell respirasjon reduseres, har interessen for mitokondrienes rolle i krefttransformasjon og progresjon vokst eksponentielt. De siste årene har mutasjoner i mtDNA og mitokondriell dysfunksjon blitt postulert som kjennetegn på mange krefttyper25. Hittil har mange studier analysert mtDNA-variasjonen av spesifikke svulster 6,26,27,28,29,30,31,32, og den totale byrden av ervervede mtDNA-mutasjoner har blitt ansett som en biomarkør for tumorigenisitet 30 i kreft som prostatakreft 33. I tråd med dette, mens mtDNA-mutasjoner betraktes som tumorinitiatorer i noen tilfeller, for eksempel i brystkreft 34,35 eller kreft i bukspyttkjertelen 36, gynekologiske maligniteter 37,38, lungeadenokarsinommetastaser 15,39 eller akutt myelogen leukemi 40,41, synes de å være mindre relevantei glioblastomer 42.
Selv om mange kreftformer har alvorlige mtDNA-mutasjoner som ikke finnes i sunt vev43 og kan bidra til kreftinitiering30, presenterer andre polymorfe mtDNA-varianter som er vanlige i forskjellige menneskelige populasjoner. Disse variantene fremmer mildere endringer som kan være viktige for kreftcelletilpasning når transformasjonsprosessen er igangsatt30. I alle fall er mtDNA-mutasjoner og mitokondrielle metabolismeendringer involvert i tumorprogresjon, og modifiserer forskjellige aspekter av cellehomeostase som reaktiv oksygenartsproduksjon eller redoksstatus44,45,46. Imidlertid er mekanismene som mtDNA-mutasjoner og varianter kan favorisere tumorigenese ikke helt forstått ennå. Dessuten kan mtDNA-mutasjoner i kreftceller sameksistere med endringer i kjernefysiske gener 8,33, noe som gjør det vanskelig å bestemme hvilken som er drivermutasjonen. I andre tilfeller oppnås de bioenergetiske kravene til tumorceller ved å modulere mtDNA-kopinummeret47. På den annen side kan mtDNA-mutasjoner i noen tilfeller gjøre tumorceller mer utsatt for spesifikke antitumormedisiner48.
For fullt ut å forstå rollen som mtDNA-mutasjoner i patofysiologien av kreft, er det nødvendig å utvikle metoder der muterte mitokondrier kan analyseres i et kontrollert kjernefysisk miljø. Dette kan bidra til å unngå kompenserende effekter av nukleære gener som kan utløse cellulær tilpasning. Til dette formål representerer transmitokondrielle cybrider en passende modell. Tradisjonelle metoder for cybridisering involverer en mtDNA-utarmet cellelinje (ρ0-celler) som fungerer som en kjernedonor (og derfor mitokondriereseptor) og en donor av mitokondrier, vanligvis en enucleated cellelinje eller blodplater19, som bærer mtDNA-varianter eller mutasjoner av interesse. Den første utfordringen som skal løses når man prøver å generere cybrider, er tilgjengeligheten av ρ0-celler som har den valgte nukleære bakgrunnen. Obtention av disse cellene innebærer langvarig behandling med ethidiumbromid, en kjemisk forbindelse som hemmer mtDNA-replikasjon. Det kan imidlertid også indusere genereringen av mutasjoner i det nukleære genomet som kan maskere effekten av mitokondrielle endringer som skal studeres. Derfor foreslår vi i dette arbeidet eliminering av hele mitokondrier i kjernedonorcellelinjer ved behandling med rhodamin 6G, et stoff som irreversibelt skader mitokondrier og vil drepe cellene med mindre friske mitokondrier blir introdusert i deres cytoplasma21,22,49.
En annen utfordring i tradisjonelle cybridgenereringsmetoder er relatert til enukleasjonsprosessen til mitokondrielle donorceller. Til dette formål sentrifugeres adherente celler i nærvær av cytochalasin B, som tillater isolering av enucleated cytoplaster18 ved å fremme disorganisering av cytoskelettet. Hvis celler vokser i suspensjon (for eksempel hematologiske linjer) eller har mistet cellecelle- og celle-ekstracellulær matriksadhesjon (som kan skje med de med et høyere metastatisk potensial50,51,52), vil denne enukleasjonsprotokollen bli kompromittert, siden cytoplaster ville løsne fra platen under sentrifugeringen for å fjerne kjernene, og i stor grad redusere bassenget for den påfølgende fusjonsprosedyren. For å omgå begge utfordringene, foreslår vi her en protokoll der isolerte mitokondrier smeltes sammen med rhodamine 6G forbehandlede celler i nærvær av PEG, som har vist seg å være tidsbesparende og effektiv21,22,49.
Når de transmitokondrielle cellelinjene er generert, er det avgjørende å vurdere renheten til både mitokondrielle og nukleære genomer. Derfor er det viktig å velge donorcellelinjer med sekvensforskjeller i deres mitokondrielle DNA og med særegne egenskaper, for eksempel antibiotikaresistens eller differensielle mikrosatellitter. Som beskrevet ovenfor har noen kreftformer blitt rapportert å modulere deres mtDNA-kopinummer47, noe som viser viktigheten av å analysere mtDNA-belastningen i både originale og transmitokondrielle cellelinjer og studere deres OXPHOS-ytelse under lignende forhold.
De viktigste fallgruvene skjult i denne prosedyren er knyttet til prosessen med mitokondrieliminering med rhodamine 6G. Hvert cybridiseringseksperiment bør innledes med analyser for å etablere de optimale forholdene for legemiddelkonsentrasjon og behandlingstid for den valgte kjernedonorcellelinjen. Hvis rhodamine 6G-konsentrasjonen eller eksposisjonstiden ikke er tilstrekkelig, vil den nye cellelinjen ha bidrag fra to forskjellige mtDNAer, noe som vil legge til mer kompleksitet i den fenotypiske analysen. Videre, hvis tiden eller dosen overstiger de optimale, vil cellene ikke overleve selv etter mitokondrier repopulasjon. Til slutt er det viktig å være forsiktig under mitokondrieisolasjonsprosessen for å unngå forurensning med ubrutte celler, noe som kan endre fenotypisk karakterisering.
Til tross for de tekniske vanskelighetene er genereringen av transmitokondrielle cybrider et kraftig verktøy for å avdekke mitokondrielt bidrag til kreft- og metastaseprosesser og generere cellemodeller der potensielle kreftbehandlinger ved bruk av mitokondrier som terapeutisk mål kan testes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av tilskuddsnummer PID2019-105128RB-I00 til RSA, JMB og AA, og PGC2018-095795-B-I00 til PFS og RML, begge finansiert av MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 og tilskuddsnumre B31_20R (RSA, JMA og AA) og E35_17R (PFS og RML) og finansiert av Gobierno de Aragón. RSAs arbeid ble støttet av et stipend fra Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Forfatterne ønsker å anerkjenne bruken av Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D.
- Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O.
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C.
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T.
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A.
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S.
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C.
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V.
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
